DE3856351T2

DE3856351T2 - Verfahren zur immunologischen Bestimmung einer Komponente in einer Probe

Info

Publication number: DE3856351T2
Application number: DE3856351T
Authority: DE
Inventors: Johann Berger; Harvey Buck; Fern Delacroix; Juergen Schrenk
Original assignee: Roche Diagnostics Corp
Current assignee: Roche Diagnostics Operations Inc
Priority date: 1988-01-21
Filing date: 1988-12-29
Publication date: 2002-05-16
Anticipated expiration: 2008-12-30
Also published as: CA1336064C; WO1989006799A1; EP0397775A1; EP0596867B1; JP2694469B2; EP0397775B1; EP0596867A1; US4891313A; EP0397775A4; DE3856351D1; DE3852040T2; ATE113722T1; JPH03503928A; DE3852040D1; ES2138628T3

Description

Gebiet der Erfindung

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Bestimmung eines Analyten in einer Probe unter Verwendung eines viergliedrigen oder "quaternären" Komplexes unter Beteiligung des Analyten, eines kompletten monoklonalen Antikörpers, der an den Analyten bindet, eines markierten Fab-Fragments eines monoklonalen Antfkörpers, das ebenfalls an den Analyten bindet, wobei diese beiden aus der gleichen Tierspezies erhalten werden, sowie eines an eine feste Phase gebundenen Antikörpers, der monoklonal sein kann oder nicht und der an den Fc-Teil eines monoklonalen Antikörpers bindet aber nicht an dessen Fab- Teil.

Hintergrund und Stand der Technik

Die Bildung von Sandwiches aus Antigen und Antikörper und deren Verwendung bei Immungssays wird schon über 15 Jahre lang angewandt. Die Fachwelt hat zwei unterschiedliche Trends auf diesem Gebiet erlebt. Der erste Trend ging in Richtung auf die Bildung ternärer Komplexe, d. h., Komplexe der Form Ak&sub1;-Ag-Ak&sub2;*, wobei Ak&sub2;* irgendeine Markierung trägt. Der spätere Trend geht hin zu Multikomponentensystemen, gewöhnlich quaternären, wobei bisweilen allerdings fünf oder mehr Komponenten beteiligt sind. Bei der Diskussion des Standes der Technik wird diese Unterscheidung beibehalten.

I. Die Bildung ternärer Komplexe

Die Patentliteratur enthält viele Beispiele für Erfindungen auf diesem Gebiet. Ein frühes Beispiel für einen solchen Assay ist zu finden bei Schuurs et al., US-Patent Nr. 3 654 090 (1972), das nicht nur als historischer Hintergrund von Nutzen ist, sondern auch für das Verständnis einiger Schlüsselbereiche auf diesem Gebiet.
Schuurs et al. lehren den Nachweis eines Antigens unter Verwendung eines an eine feste Phase gebundenen Antikörpers gegen ein Epitop oder eine Bindungsstelle des Antigens sowie eines löslichen, enzymmarkierten Antikörpers, der an einen zweiten Teil des Antigens bindet. Bei der bei Schuurs et al. offenbarten Methode wird die Enzymmarkierung nach Bildung des Sandwichs aus gebundenem Antikörper, Antigen und markiertem Antikörper bestimmt. Dies geschieht entweder in fester Phase oder in flüssiger Phase durch Zugabe eines Substrats für die Enzymmarkierung. Gewöhnlich erzeugt die Enzym-Substrat-Reaktion eine Färbung oder eine Farbänderung, die sich in "Ja/- Nein"-Tests erkennen läßt oder quantifiziert werden kann, wenn die vorhandene Substanzmenge bestimmt werden soll.
Was bei Schuurs et al. völlig fehlt, ist eine Erörterung der monoklonalen Antikörper oder der Antikörperfragmente, und dies ist nicht überraschend, da die Einreichung von Schuurs et al. 1968 und die Ausgabe 1972 erfolgte, d. h., viel früher als der Durchbruch in der Hybridom-Technik, der nach der Entwicklung der Köhler-Milstein-Methode zur Herstellung monoklonaler Antikörper einsetzte.
Schuurs et al. erhielten 1974 noch ein anderes Patent, US- Patent Nr. 3 791 932, dessen Gegenstand wiederum Sandwich- Assays waren. Dieses Patent beschreibt einen sogenannten "vorwärtsgerichteten" Sandwich-Immungssay. Bei dieser Art von Assay ist eine bestimmte Reihenfolge von Schritten einzuhalten, d. h., die zu prüfende Probe wird zunächst mit dem unlöslichen Bindungspartner zusammengebracht, und man läßt die Reaktion zwischen beiden bis zur Vollständigkeit ablaufen. Die Festphasenkomplexe werden von der Lösung abgetrennt, und der zweite, eine Enzymmarkierung enthaltende Bindungspartner wird dann der festen Phase zugegeben. Nach Bindung an den Komplex wird die Enzymkonzentration in Anlehnung an die vorstehend beschriebenen Standardmethoden bestimmt. Wiederum werden keine monoklonalen Antikörper oder Antikörperfragmente erwähnt.
Ling lehrt in US-Patent Nr. 3 867 517 (1975), daß Enzyme nicht die einzigen Markierungen sind, die sich bei Sandwich- Assays anwenden lassen. Dieses Patent beschreibt einen vorwärtsgerichteten Sandwich-Assay unter Verwendung eines radioaktiven Antikörpers als Markierung. Bei der radioaktiven Markierung handelte es sich um 125I, ein übliches Radioisotop. Die Radiomarkierung von Antikörpern ist eine Standardtechnik, setzt aber das Vorhandensein der passenden Aminosäuren im Antikörpermolekül zum Binden des radioaktiven Iods voraus. Ansonsten hält die Markierung nicht.
Schuurs et al. erhielten 1977 noch ein weiteres Patent, US- Patent Nr. 4 016 043. Dieses Patent beansprucht die Lehre einer einfacheren Version grundlegender Sandwich-Assays. Es lehrt die Verwendung einer unlöslichen Komponente einer Antigen-Antikörper-Reaktion und einer markierten Probe der gleichen Komponente. Bei dieser Methode wird angenommen, daß das nachzuweisende Antigen zwei identische epitopische Stellen aufweist. Des weiteren wird durch Verwendung zweier identischer Rezeptoren die Anwendung "simultaner" Assays ausgeschlossen, die nachstehend erörtert werden. Als Konsequenz ergibt sich daraus, daß der '043-Assay von Schuurs bis zu 60 Stunden bis zum Abschluß dauern kann. In klinischen oder diagnostischen Laboratorien ist diese erforderliche lange Zeitspanne unannehmbar.
Piasio et al., US-Patent Nr. 4 098 876 (1978), lehren einen "umgekehrten" Sandwich-Assay. Dieses Patent ist von Bedeutung, da es zum ersten Mal zeigte, daß die zu bestimmende Komponente erstens an den löslichen, markierten Antikörper und zweitens an den immobilisierten Antikörper gebunden werden konnte. Auch war es insofern eine Verbesserung als ein Waschgang herausgenommen wurde, was bedeutet, daß bei der Durchführung des Assays Zeit gespart wurde. Piasio et al. lehren, daß ihr Assay im Idealfall in weniger als einer halben Stunde vollendet sei. Dieses Musterbeispiel für ein System konnte in ihren Beispielen nicht verwirklicht werden, aber die Zeit war wesentlich kürzer als die vorstehend erörterten 60 Stunden bei Schuurs et al.. Ein deutlicher Nachteil dieser Methode ist, daß dabei enorme Mengen an immobilisiertem Antikörper benötigt werden.
Bei Niswender, US-Patent Nr. 4 048 298 (1977), handelt es sich in Wirklichkeit nicht um einen Sandwich-Assay, sondern um eine Erfindung, bei der ein immobilisierter Antikörper verwendet wurde, um einen anderen Antikörper zu binden. Dieses Patent lehrt eine interessante Abart älterer kompetitiver Immungssays. Niswender bringt einen an eine feste Phase gebundenen Antikörper mit der zu analysierenden Probe sowie mit einem zweiten, radiomarkierten Antikörper zusammen, der an den ersten bindet, aber nicht an die zu bestimmende Komponente. Die Folge davon ist, daß es dem Untersuchenden ermöglicht wird, eine vorhandene Substanz zu bestimmen, indem festgestellt wird, wieviel radiomarkierter Antikörper an die feste Phase bindet.
Dieses Patent zeigt, daß Antikörper auch an andere Antikörper und nicht nur an Antigene binden können. Diese Eigenschaft ist von Bedeutung bei neueren Assays, von denen einige nachstehend erörtert werden.
Schwarzberg, US-Patent Nr. 4 235 689 (1980), erkannte, daß Antikörper zwei unterschiedliche Teile besitzen, den Fc-Teil oder die "konstante" Region, und den Fab-Teil, welcher der Teil des Antikörpers ist, der an eine epitopische Stelle bindet. Schwarzberg stellte Komplexe aus markierten, an einen Liganden wie etwa ein Polypeptid gebundenen Fab-Fragmenten her. Dieser Komplex wird dann bei sogenannten "kompetitiven" Assays verwendet. Nicht beschrieben sind Festphasen-Bindung oder Sandwich-Assays.
Jeong et al., US-Patent Nr. 4 244 940 (1981), lehren einen "simultanen" Sandwich-Immungssay. Ein solcher Assay erfordert ein Antigen mit verschiedenen epitopischen Stellen, weil aus Gründen, auf die nachstehend eingegangen wird, zwei verschiedene Antikörper oder Rezeptoren verwendet werden müssen.
Bei Jeong et al. ist festzustellen, daß der Stand der Technik von 1981 bereits vorwärtsgerichtete, umgekehrte und simultane Assays lehrte, wobei stets ternäre Komplexe (d. h., Komplexe aus drei Spezies) gebildet wurden. Die Fachwelt hatte begonnen, die Verwendung von Fab-Fragmenten als "Linker"-Molekül (Schwarzberg) zu erkennen, doch wurden diese nicht als wesentlicher Teil eines Immungssay-Systems verwendet und es wurden auch keine monoklonalen Antikörper eingesetzt.
Diese beiden Ideen wurden in Patenten gelehrt, die 1983 ausgegeben wurden. David et al., US-Patent Nr. 4 376 110 (1983), überwand das Vorurteil in der Fachwelt, daß monoklonale Antikörper nicht "haftfähig" genug seien, d. h., unzureichende Affinität für die Verwendung bei Sandwich-Assays besäßen. David et al. lehren, daß sich alle drei Formen ternärer Sandwich-Assays mit monoklonalen Antikörpern durchführen lassen, solange sie beide Affinitäten von wenigstens 10&sup8; l/mol aufweisen. Moussebois et al. lehren in US-Patent Nr. 4 397 060 (1983), daß sich ein Agglutinationsassay durchführen läßt unter Verwendung von Fab-Fragmenten, die an einen festen Träger gebunden sind. Dieses Patent zeigt abermals, daß man Fab-Fragmente nicht als Teilnehmer in Immungssays erachtete, auch wenn monoklonale Antikörper selbst nunmehr verwendet wurden.
Gallati et al., US-Patent Nr. 4 467 031 (1984), lehren einen spezifischen Sandwich-Assay zur Bestimmung von carcinoembryonalem Antigen (CEA). Das zentrale Merkmal dieser Erfindung ist die Verwendung unterschiedlicher Salzkonzentrationen zur Verbesserung der Komplexbildung. Es handelt sich um einen "vorwärtsgerichteten" Sandwich-Assay, wie der Begriff hierin definiert ist, und es wird die Möglichkeit der Verwendung von zwei monoklonalen Antikörpern bei dem Assay erörtert. Wie man sieht, ist auch dies ein ternärer Komplex, und es wird kein Fab-Fragment verwendet.
Woods et al., US-Patent Nr. 4 469 787 (1984), lehren einen Sandwich-Assay, bei dem das Binden einer Markierung an den Fc-Teil eines zweiten Antikörpers erforderlich ist. Die Markierung ist nicht direkt am zweiten Antikörper gebunden, vielmehr halten Woods et al. ihre Erfindung damit aufrecht, daß die Markierung an den Fc-Teil des Antikörpers gebunden wird, nachdem sich der ternäre Komplex gebildet hat. Dies geschieht, um gegenseitige Beeinflussung zwischen der Markierung und dem immobilisierten ersten Antikörper zu verhindern.
Das US-Patent Nr. 4 486 530 (1984), das ausgegeben wurde an David et al. und eine Teilfortführungsanmeldung (CIP) des vorstehend erörterten US-Patents Nr. 4 376 110 darstellt, lehrt wiederum ternäre Sandwiches monoklonaler Antikörper und ihren Nachweis. Dieses Patent trägt zum Fachgebiet bei, indem es zeigt, daß Sandwich-Assays in homogener Phase durchgeführt werden können, d. h., ohne Phasentrennung. Die Durchführung erfolgt, indem die monoklonalen Antikörper-Komponenten des ternären Komplexes mit Markierungen versehen werden, die nicht reagieren, solange sie nicht durch das "Haftmittel" eines multiepitopischen Antigens zusammengebracht werden.
Carro et al., US-Patent Nr. 4 522 922 (1985), kombinieren Sandwich-Assays mit einer älteren Form von Immungssays, dem sogenannten "Präzipitationstest". Diese Erfindung lehrt die Bildung eines ternären Sandwichs, gefolgt von Zugabe eines Präzipitationsmittels, um den Komplex aus der Lösung auszufällen. Es ist ein Radioimmungssay, bei dem polyklonale Antiseren eingesetzt werden.
Die neuesten Patente auf diesem Gebiet zeigen Abänderungen zum grundlegenden Sandwich-Prinzip. Petska lehrt in US-Patent Nr. 4 623 621 (1986), daß ein oligomeres Protein gemessen werden kann durch Verwendung eines an eine feste Phase gebundenen monoklonalen Antikörpers, der spezifisch ist für ein Epitop, das einmal am repetitiven Proteinteil des Moleküls vorhanden ist. Nach dem Binden an die feste Phase wird eine zweite Probe des gleichen monoklonalen Antikörpers, nunmehr markiert, gebunden. Wiederum wird ein ternärer Komplex gebildet, jedoch mit kompletten Antikörpern, und simultanes Analysieren ist nicht möglich.

II. Die Bildung mehrgliedriger Komplexe

Das früheste Beispiel für ein quaternäres System zeigt US- Patent Nr. 4 343 896, ausgegeben an Wolters et al.. Dieses Patent, das auf einer 1976 eingereichten Offenbarung beruht, lehrt den an eine feste Phase gebundenen Komplex Ak&sub1;-Ak&sub2;-Ag- Ak&sub3;*. Eine wesentliche Einschränkung beim Patent von Wolters ist, daß Ak&sub2; und Ak&sub3;* aus verschiedenen Tierspezies stammen. Der Grund dafür ist der, daß Ak&sub1; gegen die konstante Region, d. h., den "Fc"-Teil von Ak&sub2; gerichtet sein muß. Alle Antikörper einer speziellen immunologischen Klasse, die von der gleichen Tierspezies stammen, weisen identische Fc-Teile auf. Wären Ak&sub2; und Ak&sub3; von der gleichen Tierspezies, so lehrte das Fachwissen, daß man nicht nur Ak&sub1;-Ak&sub2;-Ag-Ak&sub3;* sondern auch Ak&sub1;-Ak&sub3;* erhielte, die beide an die feste Phase bänden, woraus sich gegenseitige Beeinflussung und falsche Resultate ergäben.
Axen et al., US-Patent Nr. 4 469 796 (1984), lehren, daß mehr als drei Komponenten an einer Immunreaktion beteiligt sein können, doch der einzige gelehrte vierteilige Komplex ist ein an eine feste Phase gebundener Komplex Ag-Ak&sub1;-Ak&sub2;-Ak&sub3;*. Bemerkenswert ist, daß in der in Spalte 1, Zeile 41-60 gegebenen Beschreibung der Reaktionspartner Fab-Fragmente von Axen et al. nie erwähnt werden.
Tanswell et al., US-Patent Nr. 4 624 930 (1986), lehren Komplexe aus vier Komponenten, wobei ein erster und ein dritter Rezeptor in Lösung an das Antigen binden, während ein zweiter Festphasen-Antikörper an den ersten Antikörper bindet. Tanswells Lehre bezieht sich allgemein auf die Verwendung eines Doppelantikörpersystems, und monoklonale Antikörper werden nicht speziell offenbart.
Forrest et al., US-Patent Nr. 4 659 678 (1987), geht über die vorstehend erörterte vierteilige Bindung hinaus und bildet tatsächlich einen pentavalenten Komplex aus Antikörper-Hapten-Antikörper-Antigen-Antikörper. Das Schwanzende des Komplexes ist ein radioaktiv markierter Antikörper. Wenigstens ein Antikörper muß ein monoklonaler Antikörper sein.
Forrest et al. beschreiben ausführlich und recht umfangreich die Vorteile und Nachteile von Assays, bei denen mehrgliedrige Komplexe gebildet werden. Die Lösung der z. B. in Spalte 2, Zeile 1-5 ausgeführten Probleme besteht in der Verwendung eines an eine feste Phase gebundenen mAk, um einen Komplex Ak-Ag-Fab* zu binden. Das einzige Mal, wo ein an eine feste Phase gebundener mAk verwendet wird, um den Komplex mAk&sub2;-Ag- Fab* zu binden, ist es bei Forrest allerdings erforderlich, daß der mAk&sub2; an ein anderes Antigen gebunden wird, so daß der Festphasen-Komplex mAk&sub1;-Ag&sub2;-mAk&sub2;-Ag&sub1;-Fab* gebildet wird. Es muß in diesem Zusammenhang jedoch klar sein, daß "Ag&sub2;" tatsächlich für einen Linker steht, da mAk&sub2; keine zwei Ag-Bindungsstellen besitzen kann.

Kurzbeschreibung der Erfindung

Die Anmeldung betrifft ein Verfahren zur Bestimmung einer Komponente einer flüssigen Probe, umfassend das Zusammenbringen der Probe mit einem festen Träger, der einen entfernbaren ersten monoklonalen Antikörper in sich eingearbeitet aufweist, der an die Komponente bindet, und einen markierten monoklonalen Antikörper oder ein solches Fragment eines monoklonalen Antikörpers, der/das an die Komponente unter Bedingungen bindet, die die Bildung eines Komplexes aus erstem monoklonalen Antikörper, der Komponente und dem markierten monoklonalen Antikörper oder dem Fragment begünstigen, wobei der erste monoklonale Antikörper und der markierte monoklonale Antikörper oder das Fragment des monoklonalen Antikörpers von der gleichen Spezies stammen, Zusammenbringen des Komplexes mit einem immobilisierten zweiten Rezeptor, der an den ersten monoklonalen Antikörper aber nicht an den markierten monoklonalen Antikörper oder das Fragment unter Bedingungen bindet, die die Bildung eines quaternären Komplexes zwischen dem ersten Komplex und dem immobilisierten Rezeptor begünstigen, und Messen der Markierung entweder in dem quaternären Komplex oder in einem Rückstand der Probe als Maß für diese Komponente.
Wie dieser und andere Aspekte der Erfindung gelöst werden wird beim Durchlesen der nun folgenden Offenbarung deutlich.

Kurze Beschreibung der Figuren

Fig. 1 zeigt eine Ausführungsform der Erfindung, die als "1¹/&sub2;-Dochtstreifen" bezeichnet wird.
Fig. 2 zeigt eine weitere Ausführungsform der Erfindung, die als "Doppeldochtstreifen" bezeichnet wird.
Fig. 3 zeigt eine weitere Ausführungsform der Erfindung, die als "System mit verzögertem physikalischen Auftrag" bezeichnet wird.
Fig. 4 zeigt eine Ausführungsform der Erfindung, die als "Auftragesystem mit verzögerter Diffusion" bezeichnet wird.
Fig. 5 ist eine Ausführungsform, die als "Schlaufenstreifen" geläufig ist.
Fig. 6 zeigt eine Ausführungsarm der Erfindung, die "Integralmatrixstreifen" genannt wird.
Fig. 7 zeigt ein erfindungsgemäßes Modell, das als "Streifen mit äußerem Druck" geläufig ist.

Ausführliche Beschreibung der bevorzugten Ausführungsformen

In Fig. 1 ist ein durch diese Erfindung bereitgestellter Teststreifen 11 gezeigt. Es ist eine stabile Trägerfolie 12 bereitgestellt, die der gesamten Vorrichtung Halt gibt. Gezeigt ist ein fakultativer Schwamm 13, der z. B. einen Puffer oder andere Reagenzien enthalten kann, die zur Vorbereitung der Probe für die Analyse hilfreich sind. Die Probe kann beispielsweise mit einer Pipette auf eine erste Zone 14 aufgetragen werden, und der Schwamm kann direkt in eine Flüssigkeit eingetaucht werden, oder eine Flüssigkeit kann direkt z. B. mit einer Pipette aufgetragen werden.
Die "erste Zone" ist bei 14 gezeigt und enthält wenigstens eines der folgenden: den zu bestimmenden Analyten, ein Analogon dieses Analyten oder einen nicht an eine feste Phase gebundenen Rezeptor, der an den zu bestimmenden Analyten bindet. Verschiedene Substanzen sind möglich. Zwar wird es häufig der Fall sein, daß der zu bestimmende Analyt ein Antigen ist, etwa ein Virusprotein, ein Arzneimittel oder ein Arzneimittel-Rückstand etc., doch können auch andere Substanzen bestimmt werden, besonders wenn die zu analysierende Probe keine biologische Flüssigkeit ist. Bei einem Sandwich- Assay kann die erste Zone 14 auch die beiden monoklonalen Antikörper der gleichen Spezies enthalten, die an den zu bestimmenden Analyten binden. Wird ein Sandwich-Assay durchgeführt, so trägt einer der beiden in der ersten Zone 14 enthaltenen monoklonalen Antikörper eine Markierung wie z. B. ein Enzym.
Die "dritte Zone" 15 enthält ein Substrat für die von der ersten Zone 14 getragenen Markierung. Bei diesem Substrat kann es sich z. B. um ein solches Substrat handeln, auf das ein Enzym einwirkt, etwa ein β-Galactosid, wenn das Enzym β-Galactosidase ist. Es kann eine Substanz sein, die für die Funktion der Markierung erforderlich ist. Zum Beispiel kann das Substrat der dritten Zone eine Substanz sein, die mit der Markierung der ersten Zone unter Bildung einer fluoreszierenden Komponente oder eines Funktionsmoleküls kombiniert. Zum Beispiel kann es sich bei Markierung und Substrat um die Hälften eines kompletten Enzyms handeln, die erst dann katalytische Wirksamkeit besitzen, wenn sie zusammengebracht werden.
Die erste und dritte Zone müssen getrennt voneinander gehalten werden, so daß keine vorzeitige Reaktion zwischen Markierung und Substrat eintritt. Dies wird durch die Blockiereinrichtung 16 erreicht, die sich zwischen erster und dritter Zone 14 bzw. 15 befindet. Diese Blockiereinrichtung muß nicht aus irgendeinem besonderen Material bestehen, solange sie die Diffusion zwischen den Zonen 14 und 15 verhindert, bis die Probe in die zweite Zone gelangt ist.
Die zweite Zone 17 enthält einen an eine feste Phase gebundenen Rezeptor, der an ein beliebiges Reagens in der ersten Zone 16 bindet, das nicht mit dem Analyten aus der Probe reagiert; wird hingegen ein Sandwich-Assay durchgeführt, so enthält diese zweite Zone einen an eine feste Phase gebundenen Rezeptor, der nur an den Fc-Teil eines monoklonalen Antikörpers bindet.
Bei einem alternativen Aufbau ist diese zweite Zone in zwei Teile geteilt, von denen der eine Fc-spezifisch ist und der andere nicht. In diesem Fall hängt die Erzeugung eines Signals natürlich davon ab, ob sich der quaternäre Komplex gebildet hat oder nicht. Der nichtspezifische matrixgebundene Antikörper dient somit als Negativkontrolle.
Es sei darauf hingewiesen, daß die erste Zone 16 und die zweite Zone 17 in wenigstens teilweisem Flüssigkeitskontakt miteinander stehen müssen. Die zweite Zone 17 und die dritte Zone 15 können in Flüssigkeitskontakt stehen, müssen aber nicht. Tatsächlich zeigt die Ausführungsform in Fig. 1 keinen Flüssigkeitskontakt zwischen der zweiten und dritten Zone, weil die Sperrfolie 18 vorhanden ist. Diese Sperrfolie dient dazu, den Übergang von Substrat von der dritten Zone in die zweite Zone zu verzögern. Dies ermöglicht - welche Reaktionen auch immer zwischen der an die feste Phase gebundenen Komponente und dem unumgesetzten Reagens der ersten Zone oder den Sandwiches aus mAk-Ag-Fab* eintreten sollen -, daß diese ohne vorzeitige Erzeugung eines Signals eintreten. Da das Substrat schließlich in die zweite Zone gelangen muß, besteht die Sperre 18 aus einem flüssigkeitsdurchlässigen Material, vorzugsweise einem Polyvinylalkohol, oder einem Material, das auf Kontakt mit einem Tensid oder einem oberflächenaktiven Mittel flüssigkeitsdurchlässig gemacht wird.
Die vierte Zone 19 steht in Kontakt mit der zweiten Zone 17 und nimmt überschüssige Probe und Reagenzien von dort auf. Sie fungiert als "Abfallbehälter" für die gesamte Vorrichtung.
Bereitgestellt ist auch ein fakultativer Abdeckstreifen 20. Er verleiht der Vorrichtung zusätzliche Stabilität.
In Fig. 2 ist eine Abwandlung der Vorrichtung aus Fig. 1 gezeigt. Bei der Vorrichtung 21 sind alle Komponenten die gleichen wie in Vorrichtung 11, außer daß hier festzustellen ist, daß der Schwamm 13 nunmehr mit der ersten Zone 14 in direktem Kontakt steht und mit der dritten Zone 15 nicht in direktem Kontakt steht. Vielmehr besteht ein teilweiser Flüssigkeitskontakt zwischen der ersten und dritten Zone. Vorzeitiger Kontakt von Markierung und Substrat wird dadurch vermieden, daß diese z. B. an den abgedeckten Stellen 22 und 23 positioniert sind, die voneinander durch die Sperre 16 getrennt sind.
Fig. 3 zeigt eine Ausführungsform, bei der der fakultative Schwamm 13 aus Fig. 1 und 2 nicht verwendet wird. Hier enthält die Vorrichtung 31 die erste Zone 32, der die Probe direkt zugesetzt wird. Die erste Zone 32 arbeitet so wie die erste Zone 14 in den Fig. 1 und 2. Sie steht in teilweisem Flüssigkeitskontakt mit der zweiten Zone 33, die natürlich in der gleichen Weise arbeitet wie die zweite Zone 17 in den Fig. 1 und 2. Ein zentraler Unterschied zwischen der Vorrichtung von Fig. 3 und der in den Fig. 1 und 2 besteht in der Lage und dem Aufbau der dritten Zone, die das Substrat enthält. Wie aus Fig. 3 ersichtlich ist, befindet sich die dritte Zone, welche die Teile 34 und 35 enthält, unter der zweiten Zone und steht in Flüssigkeitskontakt damit. Die dritte Zone enthält Substrat in Region 35 und wird von Schicht 34 getragen.
Wenn die Schicht 34 Flüssigkeit aufnimmt, die durch Komponente 43 gewandert ist, dann bringt sie das Substrat 35 in Kontakt mit der zweiten Zone. Die Sperrschicht 44 verhindert Flüssigkeitskontakt zwischen Zone 1 und Komponente 43. Komponente 34 kann beispielsweise ein zusammengepreßter Schwamm sein, der bei Kontakt mit Flüssigkeit quillt.
Bei diesem Aufbau ist die vorzeitige Reaktion von Markierung und Substrat kein Thema, weil zu dem Zeitpunkt, an dem die Flüssigkeit die dritte Zone erreicht und das Substrat freisetzt, eine etwaige Reaktion zwischen dem markierten Reaktionspartner der ersten Zone und dem an eine feste Phase gebundenen Reaktionspartner der dritten Zone bereits stattgefunden hat. Das Substrat diffundiert in die zweite Zone, wo die nachweisbare Komponente gebildet wird. Überschüssige Probe und Reagenzien werden wie in der Ausführungsform von Fig. 1 in die vierte Zone 19 transportiert, und die ganze Vorrichtung wird wiederum durch eine Trägerfolie ·12 zusammengehalten.
Ein wahlfreies, in dieser Vorrichtung dargestelltes Merkmal ist die Abdeckeinrichtung 36. Die Abdeckeinrichtung ermöglicht ein genaueres Beobachten der im Teststreifen ablaufenden Reaktion. Im allgemeinen erlaubt diese Abdeckeinrichtung nur ein selektives Betrachten, indem Einblickeinrichtungen oder "Fenster" an verschiedenen Stellen bereitgestellt werden. Eigentlich ist nur eine Einblickeinrichtung notwendig, und diese sollte sich über der zweiten Zone 33 befinden, so daß die Bildung der nachweisbaren Komponente dort beobachtet werden kann. Umfaßt die Abdeckeinrichtung 36 zusätzliche Einblickeinrichtungen über der vierten Zone 19, so kann man die Reaktion zwischen Substrat und markiertem Bindungspartner, z. B. unumgesetztem markierten Fab-Fragment, beobachten. Ebenso kann, falls die Abdeckeinrichtung 36 für die Verwendung z. B. in der Vorrichtung der Fig. 1 und 2 angepaßt ist, eine Einblickeinrichtung an einem Punkt bereitgestellt werden, wo sich die Zonen 1 und 3 treffen. Dadurch wird es dem Untersuchenden möglich, festzustellen, ob vorzeitiges Mischen von Markierung und Substrat eingetreten ist. Die Abdeckeinrichtung kann aus verschiedenen Materialien bestehen, einschließlich Folien. Es kann auch ein spritzgegossener Deckel oder eine solche Abdeckung sein, die Teil einer spritzgegossenen Gehäuse- oder Behältereinrichtung ist.
Fig. 4 unterscheidet sich von der Vorrichtung in Fig. 3, daß die Schutzschicht 37 das Substrat 35 in der dritten Zone bedeckt, und die Substratdiffusion in die Zone 2 ausgelöst wird durch Flüssigkeit aus Zone 2, die in die Schutzschicht 37 eindringt. Hierdurch wird in stärkerem Maße sichergestellt, daß vorzeitiges Vermischen von Substrat nicht eintritt. Die Abdeckeinrichtung 36, die - wie bereits erwähnt - fakultativ ist, ist in dieser Ausführungsform nicht enthalten, könnte es aber sein.
Fig. 5, die "Ausführungsform mit Schlaufe", zeigt die Ausführungsform der Vorrichtung, bei der der Schwamm 13 wie in der obigen Fig. 2 für das Auftragen der Probe verwendet wird. Die Probe gelangt in die erste Zone 14, wo die Reaktion beispielsweise zwischen Analyt und Bindungspartner oder mAk, Fab* und Ag stattfindet. Der gesamte Inhalt der ersten Zone 14 gelangt in die zweite Zone 17, wo entweder unumgesetzte markierte Substanz oder Sandwiches durch den hier befindlichen, an eine feste Phase gebundenen Reaktionspartner aufgenommen werden. Alles in der zweiten Zone 17 nicht Gebundene wird über die Einrichtung 38 durch 39 transportiert, wo sämtliche Markierung zurückgehalten wird. Der überschüssige Teil der flüssigen Probe gelangt in den Abfallbereich 19, wird aber hier nicht festgehalten, sondern der Aufbau der Vorrichtung ist derart, daß die Probe in die dritte Zone 15 gedrückt wird, die das Markierungssubstrat enthält. Da dieser Aufbau das Weiterlaufen in die dritte Zone 15 erzwingt, ist so auch ein Rücklaufen nach 19 ausgeschlossen. Über die Einrichtung 52 läuft das Substrat enthaltende Material nun durch die Sperre 53 zurück in die zweite Zone 17, wo die Reaktion des an eine feste Phase gebundenen Reaktionspartners mit dem Substrat stattfindet. Die Sperre 53 ist so ausgewählt, daß die Probe zwar aus Einrichtung 52 diese durchdringen kann, die Probe aber nicht aus der zweiten Zone 17 nach oben gelangen kann.
Fig. 6 zeigt die "Integralmatrix"-Ausführungsform der Vorrichtung. Bei dieser Ausführungsform sind zweite und dritte Zone im wesentlichen in Matrix 42 vereint. Das Substrat wird in diese Matrix eingebracht mit Hilfe von Maßnahmen, zu denen das Einkapseln zählt, die aber nicht darauf beschränkt sind. Das Kombinieren der beiden Zonen in einer Matrix erfordert, daß das Substrat erst dann freigesetzt wird, wenn der markierte Reaktionspartner aus der ersten Zone 14 mit dem darin enthaltenen, an die feste Phase gebundenen Material reagiert hat.
Die letzte abgebildete Ausführungsform in Fig. 7 zeigt die Vorrichtung 71. Alle bildlich dargestellten Elemente sind hier wie in den Fig. 1 und 2, außer daß in dieser Ausführungsform die das Substrat enthaltende dritte Zone 15 von der zweiten Zone 17 getrennt ist. Nur durch Ausüben einer äußeren Kraft auf 15 kann das Substrat mit der an eine feste Phase gebundenen Markierung in Kontakt gebracht werden.
Es können unterschiedliche Assays in jeder beliebigen der in den Fig. 1-7 gezeigten bevorzugten Ausführungsformen durchgeführt werden. Zur Erläuterung werden die mechanischen Abläufe eines anderen Assays unter Verwendung der Vorrichtungen der Fig. 1, 4 und 5 dargelegt, obwohl dem versierten Fachmann klar sein wird, daß diese allesamt für die Verwendung in einer jeden dieser Vorrichtungen angepaßt werden können.
Zur Durchführung eines Tests auf Anwesenheit von Thyroxin (auch T4 genannt) in Blut wird z. B. eine Probe auf die erste Zone 14 der Vorrichtung von Fig. 1 aufgetragen. Leitungswasser wird auf den Schwamm 13 aufgegeben und wandert in die dritte Zone 15. Die erste Zone enthält T4-spezifische Antikörper, welche die Enzymmarkierung Meerrettichperoxidase tragen, während die Zone 15 irgendeines der üblichen Meerrettichperoxidase-Substrate, etwa o-Phenylendiamin, enthält. Die Probe beginnt, sich auf die zweite Zone 17 zuzubewegen, die entweder T4 selbst oder das verwandte Molekül T3 in einer festphasengebundenen und immobilisierten Form enthält. Beim Durchlaufen der Zone 14 reagiert etwaiges T4 in der Probe mit den Meerrettichperoxidase-markierten T4-spezifischen Antikörpern unter Bildung von Komplexen. Diese werden zusammen mit nichtkomplexierten Antikörpern vor der Flüssigkeit, die die Zone 15 durchwandert hat, in die zweite Zone 17 gespült. Die differentielle Diffusion tritt aufgrund der Sperre 18 ein.
Während die Sperre 18 sich auflöst, reagieren etwaige nichtkomplexierte Antikörper mit den an die feste Phase gebundenen T3 oder T4 in der zweiten Zone 17, und der vorher gebildete T4/Antikörper-Komplex gelangt in die Abfallzone 19. Das Substrat für die Meerrettichperoxidase gelangt nun in die zweite Zone 17, wo es mit dem auf der festen Phase immobilisierten Enzym reagiert. Wie der Fachmann erkennen wird, entsteht dadurch ein quantifizierbares Signal. Die Menge des durch die feste Phase eingefangenen Enzyms ist ein Maß dafür, wieviel T3 oder T4 sich in der Probe befand.
In ähnlicher Weise läßt sich ein Sandwich-Assay z. B. auf carcinoembryonales Antigen (CEA), eine multiepitopische Substanz, unter Verwendung der Vorrichtung von Fig. 4 durchführen. Bei einem solchen Test enthält die erste Zone 32 sowohl monoklonale Maus-Anti-Human-CEA-Antikörper als auch mit β-Galactosidase markierte monoklonale Maus-Anti-Human- CEA-Antikörper-Fab-Fragmente. Bei Kontakt der ersten Zone 32 mit der Probe bildet sich ein Sandwich aus dem kompletten Antikörper (mAk), dem CEA (Ag) und dem Fragment (Fab*). Dieses mAk-Ag-Fab*-Sandwich gelangt zusammen mit unumgesetztem mAk und Fab* in die zweite Zone 33, die einen Fc-spezifischen Schaf-Antimaus-Antikörper an eine feste Phase gebunden und immobilisiert enthält. Diese feste Phase bindet sowohl das vorstehend beschriebene Sandwich als auch einen etwaigen mAk- Überschuß. Da Fab* jedoch keinen Fc-Teil enthält, wird es nicht gebunden und gelangt in die Abfallzone. In der Zwischenzeit wird durch einen Teil der Probe das Substrat Resorufin-β-galactopyranosid freigesetzt, das sich in die zweite Zone 33 bewegt. Dieses Substrat reagiert mit den in dieser Region gebundenen Fab*-Fragmenten und liefert so einen Hinweis auf die Anwesenheit und Menge von CEA in der Probe.
Mit der Vorrichtung von Fig. 5 läßt sich ein kompetitiver Assay durchführen, um zu bestimmen, ob ein Proband sich dem HI-Virus ausgesetzt hat. Bei dieser Art von Test wird auf Antikörper und nicht auf Antigen geprüft, womit sich zeigt, daß diese für den erfindungsgemäßen Zweck gleichwertig sind.
Der Antikörper gegen gp120 von HIV, konjugiert an ein Enzym wie etwa eine Peroxidase, wird in die erste Zone 14 der Vorrichtung 51 eingebracht. Eine Serumprobe, die Antikörper gegen HIV enthalten kann, wird bei Schwamm 13 eingeführt und diffundiert in 14 hinein. Die Mischung aus Probe und Konjugat gelangt in die zweite Zone 17, die ausreichend HIV gp120 in fester Phase immobilisiert enthält, um alles markierte IgG zu binden, falls kein anderer Antikörper vorhanden ist. Nichtgebundenes Konjugat gelangt über die Einrichtung 38 in die Abfangeinrichtung 39, die etwaige freie Markierung aus der Probe entfernt. Die übrige Lösung läuft durch die dritte Zone 15 und setzt Substrat frei, das über die Einwegsperre in die Matrix gelangt, wo es mit gebundener Markierung reagiert. Es besteht eine indirekte Korrelation, d. h., je mehr Markierung gebunden wird, desto weniger Antikörper befanden sich in der Probe und umgekehrt.
In jedem Bereich der Erfindung können unterschiedliche Materialien verwendet werden. Zwar sind Antikörper bevorzugt, doch können weitere Materialien wie u. a. Protein A und Biotin/Avidin-Komplexe als Rezeptoren verwendet werden.
Der ixmnobilisierte Rezeptor, der den vierten Teil des quaternären Komplexes bildet, kann irgendeiner der vorstehend aufgezählten Stoffe sein, solange er den ersten monoklonalen Antikörper und keine Fragmente monoklonaler Antikörper bindet. Besonders bevorzugt sind Antikörper, die an den Fc-Teil von anderen Antikörpern, aber keine Fragmente binden.
Wird ein Antikörper als feste Phase verwendet, so wird ein monoklonaler Antikörper bevorzugt, obgleich auch polyklonale Antiseren verwendet werden können. Die Spezies, in der die festphasengebundenen Antikörper erzeugt werden, ist nicht von Bedeutung, solange keine Kreuzreaktivität zwischen dem ersten Rezeptor und dem Fab-Fragment des monoklonalen Antikörpers besteht. Allerdings stammt der an das Antigen bindende monoklonale Antikörper wie auch das Fab-Fragment des monoklonalen Antikörpers aus der gleichen Spezies.
Bei der am Fab-Fragment verwendeten Markierung kann es sich um irgendeine derjenigen Markierungen handeln, die üblicherweise bei Immungssays verwendet werden, doch besonders bevorzugt sind Enzyme, die mit ihren Substraten unter Bildung gefärbter Substrate reagieren. Beispiele für solche Enzyme sind β-Galactosidase, Meerrettichperoxidase, alkalische Phosphatase, Urease und Amylase, wobei jedoch klar sein sollte, daß dies nur Beispiele sind und nicht als Einschränkung für verwendbare Enzyme interpretiert werden dürfen. Ist Avidin der matrixgebundene Rezeptor, so ist für den versierten Fachmann offensichtlich, daß ein biotinylierter monoklonaler Antikörper verwendet werden kann. Ist dies der Fall, so muß die markierte Komponente kein Fab-Fragment, sondern kann ein kompletter mAk sein.
Die Lage des markierten Fab-Fragments oder mAk und des ersten unmarkierten oder Biotin/Avidin-markierten Antikörpers in der ersten Zone ist kein kritisches Merkmal der Erfindung. Diese können sich an solchen Stellen befinden, daß die Probe sie nacheinander erreicht oder gleichzeitiger Kontakt besteht.
Das Material, aus dem die Vorrichtung aufgebaut ist, kann viele verschiedene Dinge umfassen. Natürlich müssen die verschiedenen Zonen Flüssigkeiten aufnehmen können und gute Kapillarität besitzen. Beispiele für solche Materialien sind saugfähiges Papier, Nitrocellulose-Papier, Schwämme und andere aufnahmefähige Materialien. Sie können faserförmig sein oder nicht, und die verschiedenen Zonen können aus verschiedenen Materialien zusammengesetzt sein, die unterschiedliche Kapillarität, Aufnahmefähigkeit und so weiter besitzen.
Der Rezeptor wird mit Hilfe irgendeines der üblichen, in der Fachwelt bekannten Mittel zur Immobilisierung derartiger Rezeptoren z. B. auf einem festen Träger immobilisiert, etwa durch Fixieren mit Bromcyan.
Werden Sperren in der Vorrichtung verwendet, so müssen sie - wie vorstehend erwähnt - so ausgewählt sein, daß Flüssigkeitsdurchgang möglich ist. Bevorzugt sind inerte Polymere, und besonders bevorzugt ist Polyvinylalkohol (PVA). Andere geeignete Materialien sind für den versierten Fachmann offensichtlich.
Wird eine Abdeckeinrichtung verwendet, so müssen deren Öffnungen offen, durchsichtig oder lichtdurchlässig sein. Ein bevorzugtes Material hierfür ist transparentes Mylar, während die übrige Abdeckung ein in angemessener Weise stabiles Material umfassen kann, etwa eine Metallfolie, die mit einem durchsichtigen Material überzogen sein kann oder nicht.
Die weiteren Merkmale der Erfindung, etwa der Träger und die undurchlässige Sperre zwischen der ersten Zone und der Substratzone, umfassen die üblichen, in der Fachwelt bekannten Materialien.
Das folgende Beispiel erläutert die Arbeitsweise der Erfindung, soll aber nicht als Einschränkung der obigen Erörterung interpretiert werden.

Beispiel

Eine Vorrichtung zur Bestimmung von menschlichem Choriongonadotropin (hCG) wurde hergestellt und getestet.
Ein Stück 4210-Papier (Firma Kalff) wurde zu einem Streifen von 2,6 cm Länge und 0,6 cm Breite geschnitten (erste Zone). Ein Ende wurde mit 10 ul PBS-Puffer (pH 7,0; 1% BSA; 0,1% Tween 20) imprägniert, und der mittlere Teil wurde mit 7,5 ul einer Lösung imprägniert, die 20 E/ml eines Konjugats aus einem Fab-Teil eines monoklonalen Antikörpers gegen hCG und β-Galactosidase enthielt. Das Fragment des monoklonalen Antikörpers besaß keine Kreuzreaktivität gegen luteinisierendes Hormon. Dieser Teil wurde auch mit 75 ul einer 100 ug/ml-Lösung eines monoklonalen Antikörpers gegen die β-Kette von hCG imprägniert. Das dem pufferimprägnierten Ende gegenüberliegende Ende des Streifens wurde mit 10 ul einer wäßrigen Lösung von 5% Polyvinylalkohol imprägniert. Der resultierende Streifen überlappte 0,5 mm mit einem Streifen aus 3512-Papier von Schleicher & Schüll (zweite Zone), der 1 cm lang und 0,6 cm breit war. Dieses Papier war mit Bromcyan aktiviert, und es wurde ein Schaf-Antikörper gegen den Fc-Teil von Maus-Antikörpern daran fixiert. Dieser Streifen überlappte 0,5 mm mit einem 5 cm langen und 0,6 cm breiten Streifen aus D28-Papier (Whatman), der mit 150 ul einer wäßrigen Lösung von 18% Polyvinylalkohol imprägniert war (Abfallzone). Die drei Streifen, die sich wie angegeben überlappten, um einen zusammenhängenden Streifen zu bilden, wurden mit Klebeband auf einem 10 cm langen, 0,6 cm breiten Streifen aus Polystyrol befestigt. Die so hergestellten Streifen wurden jeweils in Urinproben eingetaucht, die so kalibriert waren, daß sie 0, 100, 250 und 500 mIE/ml hCG enthielten. Nach 5 Minuten wurde ein jeder Streifen in eine Lösung aus 0,8 mmol Resorufin-β-galactopyranosid in 100 mmol Hepes-Puffer (pH 7,5) eingetaucht und 5 Minuten zum Entwickeln belassen. Alle Streifen, die in hCG enthaltenden Urin eingetaucht worden waren, zeigten leuchtende Fuchsin-Färbung in der zweiten und der Abfallzone, während der in die kein hCG enthaltende Probe eingetauchte Streifen in der zweiten Zone gelb und in der dritten Zone fuchsinfarben war. Die Farbänderung zeigt die Wirkung der β-Galactosidase auf Resorufin-β-galactopyranosid in der zweiten Zone und der Abfallzone an.
Wie man sieht, läßt sich das obige Beispiel in einfacher Weise so abwandeln, daß z. B. das Resorufin-β-galactopyranosid in der vorbeschriebenen Weise auf eine getrennte Zone imprägniert wird, wobei die Entwicklung der Farbänderung - wie ebenfalls bereits beschrieben - durch eine Abdeckeinrichtung beobachtet werden kann.
Es wurde beschrieben, was gegenwärtig als bevorzugte Ausführungsformen erachtet werden, doch wird für den Fachmann auf der Hand liegen, daß verschiedene Änderungen und Abwandlungen vorgenommen werden können, ohne von der Erfindung abzuweichen, und all diese Änderungen und Abwandlungen, die in den Umfang der Erfindung fallen, sollen deshalb dadurch abgedeckt sein.

Claims

1. Verfahren zur Bestimmung einer Komponente einer flüssigen Probe, umfassend das Zusammenbringen der Probe mit einem festen Träger, der einen entfernbaren ersten monoklonalen Antikörper in sich eingearbeitet aufweist, der an die Komponente bindet, und einen markierten monoklonalen Antikörper oder ein solches Fragment eines monoklonalen Antikörpers, der/das an die Komponente unter Bedingungen bindet, die die Bildung eines Komplexes aus erstem monoklonalen Antikörper, der Komponente und dem markierten monoklonalen Antikörper oder dem Fragment begünstigen, wobei der erste monoklonale Antikörper und der markierte monoklonale Antikörper oder das Fragment des monoklonalen Antikörpers von der gleichen Spezies stammen, Zusammenbringen des Komplexes mit einem immobilisierten zweiten Rezeptor, der an den ersten monoklonalen Antikörper aber nicht an den markierten monoklonalen Antikörper oder das Fragment unter Bedingungen bindet, die die Bildung eines quaternären Komplexes zwischen dem ersten Komplex und dem immobilisierten Rezeptor begünstigen, und Messen der Markierung entweder in dem quaternären Komplex oder in einem Rückstand der Probe als Maß für diese Komponente.

2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei der zweite Rezeptor ein für den Fc-Teil des ersten monoklonalen Antikörpers spezifischer Antikörper ist und der markierte monoklonale Antikörper oder das markierte Fragment eines monoklonalen Antikörpers ein Fragment eines monoklonalen Antikörpers ist.

3. Verfahren nach Anspruch 2, wobei der zweite Rezeptor ein Antikörper ist und das Fragment ein Fab-Fragment ist.

4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei die Probe gleichzeitig mit dem Fragment des monoklonalen Antikörpers und dem monoklonalen Antikörper zusammengebracht wird.

5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei die Probe nacheinander mit dem ersten monoklonalen Antikörper und dem markierten monoklonalen Antikörper oder dem Fragment des monoklonalen Antikörpers zusammengebracht wird.

6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei die Markierung des Fragments des monoklonalen Antikörpers ein Enzym ist.

7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei die Markierung des Fragments des monoklonalen Antikörpers radioaktiv ist.

8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei die Markierung des Fragments des monoklonalen Antikörpers fluoreszierend ist.

9. Verfahren nach Anspruch 6, wobei das Enzym β-Galactosidase ist.

10. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9, wobei die Messung das Zusammenbringen des quaternären Komplexes mit einem farbbildenden Substrat der Markierung und das Messen der so gebildeten Färbung als Maß für die Komponente umfaßt.

11. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 10, wobei der erste monoklonale Antikörper ein Element eines Biotin/- Avidin-Komplexes trägt und der immobilisierte zweite Rezeptor ein Bindungspartner dieses Komplexes ist.