DE8805565U1

DE8805565U1 - Analytisches Testgerät

Info

Publication number: DE8805565U1
Application number: DE8805565U
Authority: DE
Original assignee: Unilever NV
Current assignee: Unilever NV
Priority date: 1987-04-27
Filing date: 1988-04-27
Publication date: 1988-08-18
Also published as: EP1248112A3; DE3856421T2; EP0560410A2; JP2705768B2; EP0560411B1; ES2050704T3; ES2184734T3; US6228660B1; US20010008774A1; AU1622888A; JPH09178748A; EP0560410B1; JP2919392B2; IT214285Z2; AU8048994A; ES2150428T3; US6818455B2; JPH06180320A; ES2050704T5; HK140995A

Description

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Unilever N.V. München,

u.Z.: GM 600/29-88 18.07.88

Analytisches Testgerät

Die Erfindung bezieht sich auf ein analytisches Testgerät
turn Gebrauch zu Hause, in der Klinik oder in der Arztpraxis. Das Testgerät soll ein Analyseergebnis in kurzer Zeit liefern, wobei von dem Renutzer nur ein Minimum an Geschicklichkeit und Arbeitsaufwand verlangt werden soll. Der Gebrauch von Testgeräten im privaten Bereich ium Zwecke der Feststeilung einer Schwangerschaft und der Empfängnisbereitschaft (Ovulation) ist derzeit allgemein üblich. Eine Vielzahl von Testgeräten und Testsätzen sind im Handel erhältlich. Bei allen handelsüblichen Geräten muß der Benutzer jedoch ausnahmslos eine Reihe von Arbeitsschritten durchführen, bevor das Testergebnis ablesbar ist. Diese Arbeitsschritte erfordern notwendigerweise Zeit und stellen mögliche Fehlerquellen dar.

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein Testgerät zu schaffen, das leicht von einer ungeübten Person benutzt werden kann und das vorzugsweise lediglich erfordert, daß ein Teil des Gerätes mit einer Probe (beispielsweise einem Urinstrahl im Falle eines Schwangerschafts- oder Ovulationstests) in Verbindung gebracht wird und danach keine weiteren Arbeitsschritte von dem Benutzer vorgenommen werden müssen, bis das analytische Ergebnis erkennbar wird. Idealerweise sollte das Ergebnis innerhalb von Minuten nach dem Probenauftrag, beispielsweise in 10 Minuten oder weniger ablesbar sein.

Der Gebrauch von reagenz-imprägnierten Teststreifen bei spezifischen Bindungsassays, wie Immunoassays, wurde kürzlich vorgeschlagen. Bei diesem Verfahren wird eine Probe auf einen Teil des Teststreifens aufge-

tragen, so daß sie das Streifenmaterial durchdringen kann, üblicherweise mit ein"iv· "c'Mpr^en l..ösnr>p,smittel, wie etwa Wasser. Auf diese W°ise bewegt sich die Probe in einen Bereich in dem Teststreifen oder durch diesen hindurch, wo ein spezifischen Bindungsreagenz für eine in der Probe erwartete zu analysierende Substanz (Nachweissubstanz) immobilisiert ist. Die in der Probe vorhandene zu analysierende Substanz kann innerhalb des spezifischen Bereiches gebunden werden. Das Ausmaß, in dem die nachzuweisende Substanz in diesem Bereich gebunden wird, kann mit Hilfe von markierten Reagenzien bestimmt werden, die in den Test-&eegr; streifen einbezosen oder nachfolcend auf diesen auffffttraeen werden.

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Beispiele früherer Vorschläge, nach denen diese Prinzipien angewandt worden sind, finden ->ich in Thyroid Diagnostics Inc. GB 1589234, Boots-Celltech Diagnostics Limited EP 0 225 054, Syntex (USA) Inc. EP 0 183 442 und Behringwerke AG EP 0 186 799.

Die vorliegende Erfindung befaßt sich mit der Anpassung und

Verbesserungen der bekannten Techniken, wie sie in den oben genannten Veröffentlichungen beschrieben sind, um ein diagnostisches Testgerät zu schaffen, das insbesondere für den privaten Gebrauch geeignet und 2Q schnell und bequem zu handhaben ist. Der Benutzer soll so wenig wie

möglich Arbeitsschritte durchführen müssen.

Gemäß der Erfindung wird ein Gerät zum Gebrauch in einem Assay für eine Nachweissubstanz geschaffen, welches Gerät ein poröses Feststoffphasenmaterial enthält, das in einem ersten Bereich ein markiertes Reagenz trägt, das in dem ersten Bereich festgehalten ist, während das poröse Material sich im trockenen Zustand befindet, das jedoch frei durch das poröse "a^erial wandern kann, wenn das poröse Material befeuchtet ist, beispielsweise durch Auftragen einer wäßrigen, flüssigen

QQ Probe, die möglicherweise die Nachweissubstanz enthält. Das poröse

Material trägt in einem zweiten Bereich, der räumlich von dem ersten Bereich getrennt ist, ein unmarkiertes spezifisches Bindungsreagenz, das spezifisch für die Nachweissubstanz ist und das in der Lage ist, mit dem markierten Reagenz entweder in einer "Sandwichreaktion" ode:

nc kompetitiven Reaktion zu reagieren, wobei das unmarkierte spezifische

Bindungsreagenz fest auf dem porösen Material immobilisiert ist, so daß es nicht frei wandern kann, wenn das poröse Material sich in dem

- 3-feuchten Zustand befindet.

Die Erfindung schafft auch ein analytisches Verfahren bei dem ein Gerät, wie in dem vorausgegangenen Abschnitt beschrieben, mit einer wäßrigen, flüssigen lösung in Kontakt gebracht wird, von der vermutet wird, daß sie die Nachweissubstanz enthält, wobei die Probe durch Kapillarwirkung durch das poröse Feststoffphasenmaterial über den ersten Bereich in den zweiten Bereich eindringt und das markierte Reagenz zusammen mit diesem aus dem ersten Bereich in den zweiten Bereich wandert, wobei die Anwesenheit der Nachweissubstanz in der Probe durch Beobachtung des Ausmaßes bestimmt wird, in welchem das markierte Reagenz gegebenenfalls in dem zweiten Bereich gebunden wird.

Bei einer Ausführungsform der Erfindung ist das markierte Reagenz ein spezifischer Bindungspartner für die Nachweissubstanz. Das markierte Reagenz, die Nachweissubstanz (falls vorhanden) und das immobilisierte unmarkierte spezifische Bindungsreagenz wirken in einer "Sandwichreaktion" zusammen. Dies führt dazu, daß das markierte Reagenz in dem zweiten Bereich gebunden wird, falls Nachweissubstanz in der Probe vorhanden ist. Die zwei Bindungsreagenzien müssen Spezifitäten für verschiedene Epitope der Nachweissubstanz haben.

Bei einer anderen Ausführungsform der Erfindung ist das markierte Reagenz entweder selbst die Nachweissubstanz, die mit einer

ok Markierungssubstanz versehen worden ist, oder es besteht das markierte

Reagenz aus einer Analogsubstanz, d. h. einer chemischen Gesamtheit, die die identischen spezifischen Bindungscharakteristiken für die Nachweissubstanz hat und die in ähnlicher Weise mit einer Markierungssubstanz versehen worden ist. Im letzteren Fall ist es vorzuziehen, daß

&ldquor;Q die Eigenschaften der der Nachweissubstanz analogen Substanz, die die

Löslichkeit und die Dispersionsfähigkeit in einer wäßrigen Flüssiglösung und ihre Fähigkeit durch das feuchte Feststoffphasenmaterial zu wandern, beeinflussen, identisch mit den Eigenschaften der Nachweissubstanz selbst sein sollten, oder zumindest sehr ähnlich. Bei dieser

&ldquor;_r zweiten Ausführungsform wandert die markierte Nachweissubstanz oder

deren Analogsubstanz durch das poröse Festphasenmaterial in den zweiten Bereich und bindet dort mit dem immobilisierten Reagenz. In der

Probe vorhandene Nachweissubstanz tritt bei dieser Bindungsreaktion in Wettbewerb mit dem markierten Reagenz. Dieser Wettbewerb führt zu einer Reduzierung der Menge von markiertem Reagenz, das in dem zweiten Bereich bindet und folglich zu einem Abnehmen der Intensität des in dem zweiten Bereich beobachteten Signales im Vergleich zu dem Signal, das bei Nichtvorhandensein der Nachweissubstanz in der Probe auftritt.

Gemäß einer besonders vorteilhaften bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird Nitrozellulose als Trägermaterial ausgewählt. Dies hat beträchtliche Vorteile gegenüber konventionellen Streifenmaterialien, wie etwa Papier, weil Nitrozellulose eine natürliche Fähigkeit zur Bindung von Proteinen aufweist, ohne daß eine vorherige Sensibilisierung erforderlich wäre. Spezifische Bindungsreagenzien, wie Immunoglobuline, können direkt auf Nitrozellulose gebracht und dort immobilisiert werden· Keine chemische Behandlung ist erforderlich, die mit der wesentlichen spezifischen Bindungsaktivität des Reagenz in Wechselwirkung treten könnte. Unbenutzte Bindungsstellen der Nitrozellulose können danach durch Verwendung einfacher Materialien, wie beispielsweise Polyvinylalkohol blockiert werden. Darüber hinaus steht Nitrozellulose mit einem Bereiche von Porengrößen zur Verfügung, so daß ein Trägermaterial ausgesucht werden kann, das auch bestimmte Anforderungen, wie beispielsweise Anforderungen an die Strömungsgeschwindigkeit der Probe, erfüllen kann.

Gemäß einer weiteren besonders bevorzugten Ausführungsform der Erfindung werden sogenannte "Direktmarkierungen" (direct labels) verwendet, mit denen eines der spezifischen Bindungsreagenzien versenen wird. Direktmarkierungssubstanzen, wie e-twa Gold-Sole und Farb-Sole,

QQ sind an sich bekannt. Sie können benutzt werden, um ein sofortiges

analytisches Ergebnis zu erzeugen, ohne daß andere Reagenzien zur Entwicklung des Nachweissignales hinzugefügt werden müßten. Sie sind robust und stabil und können daher einfach in einem Analysegerät |

verwendet werden, das im trockenen Zustand gelagert wird. Ihre Frei-

gg setzung bei Kontakt mit einer wäßrigen Probe kann moduliert werden,

beispielsweise durch Verwendung einer löslichen Glasur.

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Ein wesentlicher Aspekt der Erfindung liegt in der Auswahl der technischen Merkmale, die die Verwendung eines direktmarkierten spezifischen Bindungsreagenz in einem Analysengerät mit Trägersubstanz ermöglichen, beispielsweise in einem Analysengerät in Form eines Streifens, um ein rasches und klares Ergebnis herbeizuführen. Im Idealfall sollte das Assay-Ergebnis mit dem Auge erkennbar sein und um dies zu begünstigen, muß die Direktmarkierung in dem Nachweisbereich konzentriert werden. Zu diesem Zweck sollte das direktmarkierte Reagenz leicht und schnell durch die Entwicklungsflüssigkeit transportierbar sein. Es ist des weiteren vorzuziehen, daß die Gesamtmenge der Sntwicklungs-Probenflüssigkeit durch einen vergleichsweise kleinen Nachweisbereich geleitet wird, so daß die Wahrscheinlichkeit für das Erhalten eines beobachtbaren Ergebnisses gesteigert wird.

Ein weiterer wichtiger Aspekt der Erfindung ist die Verwendung eines direktmarkierten Bindungsreagenz auf einem Nitrozellulose enthaltenden Trägermaterial. Vorzugsweise weist die Nitrozellulose eine Porengröße von mindestens 1 Mkron auf. Vorzugsweise ist die Porengröße der Nitrozellulose nicht größer als etwa 20 Mikron. Gemäß einer besonders bevorzugten Ausführungsform besteht die Direktmarkierungssubstanz aus einem gefärbten Latexteilchen von kugelförmiger oder fast-kugelförmiger Gestalt, dessen Maximaldurchmesser nicht größer als etwa 0,5 Mikror, ist. Der ideale Größenbereich für solche Partikel liegt zwischen etwa 0_sÜ5 bis etwa 0,5 Mikron.

Bei einer anderen Ausführungsform der Erfindung ist das poröse Festkörperphasenmaterial an ein poröses Aufnahmeteil gebunden, auf das die Flüssigprobe aufgetragen werden kann und von dem die Probe in das poröse Festkörperphasenmaterial wandern kann. Vorzugsweise ist das

QQ poröse Festkörperphasenmaterial in einem feuchtigkeitsdichten Gehäuse

untergebracht und das poröse Aufnahmeteil mit dem das poröse Festkörperphasenmaterial verbunden ist, erstreckt sich aus dem Gehäuse hinaus und wirkt als Mittel, um eine Flüssigprobe in das Gehäuse einzuleiten und in das poröse Festkörperphasenmaterial eindringen zu

oc lassen. Das Gehäuse sollte mit Mitteln, wie beispielsweise geeignet angebrachten Öffnungen, versehen sein, die ermöglichen, daß der zweite Bereich des porösen Festkörperphasenmaterials (der das immobilisierte

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f_t 1 unmarkierte spezifische Bindungsreagenz trägt) von der Außenseite des

L- Gehäuses beobachtbar ist, so daß das Ergebnis des Assays festgestellt

'· werden kann. Gewünschtenfalls kann das Gehäuse mit weiteren Mitteln

versehen sein, die ermöglichen, daß der weitere Bereich des porösen Festkörperphasenmaterials von der Außenseite des Gehäuses aus beobachtbar

^ ist, wobei der weitere Bereich Kontrollreagenzien enthält, die eine

t Anzeige darüber ermöglichen, ob das Assay-Verfahren beendet ist.

■ Vorzugsweise ist das Gehäuse mit einer entfernbaren Kappe oder einer

Umhüllung versehen, die das vorstehende poröse Aufnahmeteil während ^der Lagerung vor dem Gebrauch schützt. Gewünschtenfalls kann die Kappe oder die Umhüllung wieder auf das vorstehende poröse Ao*oahmeteil nach dem Auftragen der Probe gesetzt werden, während das Assay-Verfahren durchgeführt wird.

Eine wichtige Ausführungsform der Erfindung ist ein Schwangerschaftstestgerät mit einem länglichen Hohlgehäuse, das einen trockenen pcrösen Nitrozellulose-Träger enthält, der indirekt mit der Außenseite des Gehäuses über ein saugfähiges Urin-Aufnahmeteil in Verbindung steht, das über das Gehäuse hinausragt und als Speicher dient, von welchem ^^r*ⁿ *ⁿ ^^en P^or°sen Träger freigegeben wird. Der Träger enthält in einem ersten Bereich einen hochspezifischen Anti-hCG-Antikörper, der eine gefärbte "Direkf-Markierungssubstanz trägt, wobei der markierte Antikörper innerhalb des porösen Trägers frei beweglich ist, wenn diese»- sich im feuchten Zustand befindet. In einem zweiten Bereich, der räumlich entfernt von dem ersten Bereich ist, befindet sich ein hochspezifischer unmarkierk'r Anti-hCG-Antikörper, der permanent auf dem Trägermaterial immobilisiert ist und der daher im feuchten Zustand nicht beweglich ist. Die markierten und unmarkierten Antikörper weisen Spezifitäten für verschiedene hCG-Epitope auf. Die beiden Bereiche sind so

QQ angeordnet, daß eine auf den porösen Träger aufgebrachte Urinprobe über

den ersten Bereich in den zweiten Bereich vordringen kann. Das Gehäuse besteht aus undurchsichtigem oder durchscheinendem Material mit mindestens einer Öffnung, durch die das Analyseergebnis beobachtet werden kann. Zu dem Gehäuse gehört auch ein entfernbarer und wieder aufsetz-

₃g barer Deckel für das vorstehende saugfähige Urinaufnahmeteil. Ein

Ovulationstestgerät, im wesentlichen wie oben beschrieben, mit der Ausnahme, daß die Nachweissubstanz LH ist, ist eine wichtige

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Das poröse Probenaufnahmdteil kann aus jedem saugfähigen, porösen oder faserigen Material bestehen, das geeignet ist, Flüssigkeit rasch zu absorbieren. Die Porosität des Materials kann unidirektional sein (d. h.

die Poren der Faisern verlaufen gänzlich oder vorzugsweise parallel zu einer Achse des Teiles) oder mulidirektional (so daß das Teil eine amorphe, schwammähnlich«: Struktur hat). Poröse Kunststoffmaterialien, wie etwa Polypropylen, Polyethylen (vorzugsweise mit sehr hohem MoIe-

^q kulargewicht), Polyvinylidenfluorid, Ethyien-Vinyiacetat-Copoiymerisat,

Polyacrylnitril und Polytetrafluorethylen können verwendet werden. Es kann von Vorteil sein, das Teil mit einem oberflächenaktiven Mittel während der Herstellung vorzubehandeln, da hierdurch jegliche inherente Hydrophobie des Aufnahmeteils reduziert wird, wodurch seine Fähigkeit, eine feuchte Probe aufzunehmen und weiterzulf'.ten, schnell und wirksam gesteigert wird. Poröse Probenaufnahmeteile können auch aus Papier oder anderen Zellulosematerialien, wie etwa Nitrozellulose, gefertigt sein. Materialien, die zur Zeit als Schreibspitzen von Faserschreibern verwendet werden, sind besonders geeignet. Diese Materialien können in einer Vielzahl von Längen- und Querschnittsformen geformt oder extrudiert werden, die im Zusammenhang mit der Erfindung verwendet werden können. Vorzugsweise sollte das Material des porösen Aufnahmeteils so gewählt werden, daß das poröse Teil in wenigen Sekunden mit wäßriger Flüssigkeit gesättigt werden kann. Das Material sollte auch im feuchten Zustand stabil bleiben, weswegen Papier und ähnliche Materialien bei solchen Ausführungsformen weniger geeignet sind, bei denen das poröse Aufnahmeteil aus dem Gehäuse vorsteht. Die Flüssigkeit muß danach frei von dem porösen Probenaufnahmeteil in das poröse Festkörperphasenmaterial wandern.

Falls vorhanden, kann der Kontrollbereich so aufgebaut sein, daß er ein

Signal an den Benutzer liefert, das anzeigt, daß das Gerät gearbeitet hat. Beispielsweise kann der Kontrollbereich mit einem Antikörper beladen sein, der an den markierten Antikörper aus dem ersten Bereich bindet, oc beispielsweise ein "Anti-Maus"-Antikörper, wenn der markierte Körper

ein solcher ist, der unter Verwendung einer Murine-Hybridoma abgeleitet worden ist. um zu bestätigen, daß die Probe den Teststreifen durchlaufen

hat. Alternativ kann der Kontrollbereich ein wasserfreies Reagenz enthalten, das, wenn es befeuchtet wird, eine Farbänderung oder Farbbildung hervorruft, wie beispielsweise wasserfreies Kupfersulfat, das sich blau verfärbt, wenn es mit einer wäßrigen Flüssigkeit in Berührung kommt. Nach einer weiteren Alternative kann der Kontrolibereich immobilisierte Nachweissubstanz enthalten, die mit überschüssigem markierten Reagenz aus dem ersten Bereich reagiert. Da der Zweck des Kontrollbereichs die Anzeige ist, daß der Testvorgang beendet ist, muß der Kontrollbereich stromabwärts des zweiten Bereich angeordnet sein, in ^Q dem lids gewünschte Teilergebnis verzeichnet wird. Eine positive

Kontrollanzeige teilt dem Benutzer folglich mit, daß die Probe die erforderliche Distanz durch das Testgerät gewandert ist.

Die Markierungssubstanz kann jede Zusammensetzung sein, deren ^g Anwesenheit leicht festgestellt werden kann. Vorzugsweise ist die

Markierungssubstanz eine Direktmarkierungssubstanz, d. h. eine Zusammensetzung, die in ihrem natürlichen Zustand leicht entweder mit dem bloßem Auge oder mit Hilfe eines optischen Filters und/oder Anregung, wie beispielsweise durch UV-Licht zur Hervorrufung einer 2Q Fluoreszenz, beobachtet werden kann. Beispielsweise sind winzige

gefärbte Partikel, wie beispielsweise Farb-5ole, Metall-Sole (beispielsweise Gold), gefärbte Latex (Polymer-)Partikel, sehr geeignet. Die Konzentration des Markierungsstoffes auf einem kleinen Bereich oder einem kleinen Volumen sollte ein leicht nachweisbares Signal entstehen lassen, wie beispielsweise einen stark gefärbten Bereich. Dies kann mit dem Auge oder - falls gewünscht - mit Instrumenten festgestellt werden.

Indirekte Markierungsstoffe, wie Enzyme, beispielsweise alkalische Phosphatase und Meerettich-Peroxidase können verwendet werden, aber

2Q diese erfordern gewöhnlich das Hinzufügen von einem oder mehreren |

Entwicklungsreagenzien, wie etwa Substraten, bevor ein sichtbares Signal festgestellt werden kann. Aus diesen Gründen sind diese weniger bevorzugt. Solche zusätzlichen Reagenzien können in das poröse Festkörperphasenmaterial oder in das Probenaufnahmeteil - falls vorhanden - '|

g₅ eingefügt sein, so daß sie sich in die wäßrige Flüssigkeitsprobe hinein- ■

lösen oder dispergieren. Alternativ hierzu können die Entwicklungsreagenzien der Probe vor dem Kontakt mit dem porösen Material hinzu-

gefügt werden, oder es kann das poröse Material den Entwicklungsreagenzien ausgesetzt werden, nachdem die Bindungsreaktion stattgefunden hat.

Bei allen Ausführungsformen der Erfindung ist es wesentlich, daß das markierte Reagenz in dem ersten Bereich zusammen mit der Flüssigprobe aus dem ersten Bereich in den zweiten Bereich wandert. Vorzugsweise geht der Fluß der Probe über den zweiten Bereich hinaus, und eine ausreichende Menge der Probe wird auf das poröse Material aufgetragen,

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Reagenz aus dem ersten Bereich, das nicht an einer Bindungsreaktion in dem zweiten Bereich teilnimmt, durch diesen kontinuierlichen Fluß aus dem zweiten Bereich herausgespült wird. Falls gewünscht, kann eine Absorptionssenke an dem außenliegenden Ende des Trägermaterials vorgesehen werden. Diese Absorptionssenke kann beispielsweise aus Whatman-3MM-Chromatographie-Papier bestehen und sollte eine genügende Absorptionskapazität aufweisen, so daß jegliches ungebundene Konjugat aus dem zweiten Bereich herausgewaschen wird. Alternativ zu einer solchen Senke kann es auch ausreichen, eine Länge von porösen Festkörperphasenmaterial vorzusehen, die sich über den zweiten Bereich hinauserstreckt.

Das Vorliegen oder die Intensität des Signales der Markierungssubstanz, die in dem zweiten Bereich gebunden wird, kann eine qualitative oder quantitative Messung der Nachweissubstanz in der Probe liefern. Eine Vielzahl von Nachweisbereichen auf dem porösen Festkörperphasenmaterial durch die die wäßrige Flüssigprobe progressiv passieren kann, kann ebenfalls verwendet werden, um eine quantitative Messung der Nachweissubstanz zu ermöglichen, oder es können die Nachweisbereiche

gQ individuell mit unterschiedlichen spezifischen Bindungsagenzien beladen

werden, um ein Mehrfachanaiysentestgerät zu schaffen.

Das immobilisierte spezifische Bindungsreagenz in dem zweiten Bereich ist vorzugsweise ein hochspezifischer Antikörper und insbesondere ein og monoklonaler Antikörper. Bei der Ausführungsform der Erfindung mit der

Sandwichreaktion ist das markierte Reagenz ebenfalls vorzugsweise ein hochspezifischer Antikörper, insbesondere ein monoklonaler Antikörper.

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VorzugsweJ.-.^ 'v^i^t r'a^ Tr?g°rmaterial aie Form eines Streifens od-r Blattes auf, auf das die Reagenzien in räumlich getrennten Bereichen aufgetragen werden, und die Flüssigprobe durchwandert das Blatt oder den Streifen von einer Seite zur anderen.

Gewünschtenfalls kann ein Gerät gemäß der Erfindung zwei oder mehrere gesonderte Körper aus porösem Festkörperphasenmaterial, wie beispielsweise gesonderte Streifen oder Blätter, aufweisen, von denen jeder

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können parallel angeordnet sein, beispielsweise so, daß ein einziges Auftragen der Flüssigprobe auf das Gerät gleichzeitig den Probenfluß in den beiden getrennten Körpern auslöst. Die gesonderten analytischen Ergebnisse, 'lie auf diese Weise gewonnen werden, können als Kontroll-Jg ergebnisse oder - falls unterschiedliche Reagenzien auf den verschiedenen

Trägern eingesetzt werden - zur gleichzeitigen Bestimmung einer Vielzahl von Nachweissubstanzen in einer einzigen Probe herangezogen werden. Alternativ hierzu können mehrere Proben individuell auf eine Reihe von Trägern aufgetragen und gleichzeitig analysiert werden.

Das Material mit der porösen Festkörperphase ist vorzugsweise Nitrozellulose. Dies weist den Vorteil auf, daß der Antikörper ir dem zweiton Bereich ohne vorhergehende chemische Behandlung fest immobilisiert werden kann. Wenn das poröse Festkörperphasenmaterial beispielsweise Papier enthält, muß die Immobilisierung des Antikörpers in dem zweiten Bereich durch chemische Koppelung, beispielsweise unter Verwendung von CNBr, Carbonyldiimidazol oder Tresylchlorid durchgeführt werden.

Nach dem Auftragen des Antikörpers auf den uachweisbereich sollte der QQ Rest des porösen Festkörperphasenmaterials behandelt werden, um

verbleibende Bindungsstellen zu blockieren. Die Blockierung kann beispielsweise durch Behandlung mit Protein (beispielsweise Rinderserumalbumin oder Milchprotein) oder mit Polyvinylalkohol oder Ethanolamin oder mit einer beliebigen Kombination dieser Agenzien erzielt wer
&ldquor;,- Das markierte Reagenz für den ersten Bereich kann dann auf den

trockenen Träger gebracht werden und wird in dem Träger beweglich, wenn dieser in den feuchten Zustand gelangt. Zwischen jedem dieser ver-

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schiedenen Verfahrensschritte (Sensitivierung, Auftragen von unmarkiertem Reagenz, Blockierung und Auftragen von markiertem Reagenz) sollte das poröse Festkörperphasenmaterial getrocknet werden.

Um die freie Beweglichkeit des markierten Reagenz zu unterstützen, wenn der poröse Träger mit der Probe befeuchtet wird, sollte vorzugsweise das markierte Reagenz auf den Träger als Schicht aufgetragen werden anstatt einer Imprägnierung des Trägers über seine ganze Dicke. Hierdurch kann eine Wechselwirkung zwischen dem Trägermaterial und dem markierten Reagenz minimiert werden. Nach einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird der Träger mit einem Glasurmaterial in dem Bereich, in dem cas Reagenz aufgetragen werden soll, vorbehandelt. Das Glasieren kann beispielsweise du»-ch Aufbringen einer wäßrigen Zucker- oder Zelluloselösung, beispielsweise Sucrose oder Lactose, auf den Träger an den wichtigen Stellen und durch Trocknung erzielt werden. Das markierte Reagenz kann dann auf den giarierten Teil aufgetragen werden. Der Rest des Träger materials sollte nicht glasiert werden.

Vorzugsweise ist das poröse Festkörperphasenmaterial ein Nitrozelluloseblatt einer Porengröße von mindestens 1 Mikron, wobei eine Porengröße von mehr als 5 Mikron vorzuziehen ist und eine Größe von etwa 8 bis 12 Mikron noch günstiger erscheint. Ein sehr geeignetes Nitrozelluloseblatt mit einer Nominal-Porengröße von bis zu etwa 12 Mikron ist im Handel erwerblich von Schleicher und Schüll GmbH.

Vorzugsweise wird das Nitrozelluloseblatt beispielsweise durch Kunststoffblätter verstärkt oder gestützt, so daß seine Festigkeit für die Handhabung gesteigert wird. Dies kann herstellungstecdnisch leicht dadurch erreicht werden, daß eine dünne Schicht von Nitrozellulose auf einem Blattgrundmaterial gebildet wird. Die tatsächliche Porengröße des in dieser Weise abgestützten Zellulosematerials ist in der Regel kleiner als diejenige des nicht abgestützten Materials.

Alternativ hierzu kann das vorgeformte Blatt aus Nitrozellulose fest zwischen zwei Trägerplatten aus Festmaterial, wie beispielsweise Kunststoffblättern, eingeschlossen werden.

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Bei einer wäßrigen Probe sollte die Strömungsgeschwindigkeit durch das poröse Festkörperphasenmaterial so sein, daß bei dem unbehandelten Material die wäßrige Flüssigkeit mit einer Geschwindigkeit von 1 cm in nicht mehr als 2 Minuten wandert. Es kann jedoch auch gewünschtenfalls mit kleineren Strömungsgeschwindigkeiten gearbeitet werden.

Der räumliche Abstand zwischen den Bereichen und die Strömungscharakteristiken des porösen Trägermaterials können so gewählt werden, daß ausreichende Reaktionszeiten ermöglicht werden, während deren die notwendigen spezifischen Bindungsreaktionen stattfinden können und daß das markierte Reagenz in dem ersten Bereich sich in der Flüssigprobe auflösen oder disperigieren und durch den Träger wandern kann. Eine weitere Beeinflussung dieser Parameter kann durch das Einbeziehen eines Viskositätsmodifikators (beispielsweise Zucker und modifizierte Zellulose) in die Probe erzielt werden, um die Reagenzwanderung zu verlangsamen.

Vorzugsweise ist das immobilisierte Reagenz in dem zweiten Bereich durch die Dicke des Trägers hindurch imprägniert (beispielsweise durch die ganze Dicke des Blattes oder Streifens, falls der Träger in dieser Form vorliegt). Eine solche Imprägnierung kann das Ausmaß, zu welchem das immobilisierte Reagenz jegliche Nachweissubstanz aus der wandernden Probe einfangen kann, verstärken.

Die Reagenzien können auf das Trägermaterial in verschiedenen Weisen gebracht werden. Verschiedene Drucktechiniken sind früher vorgeschlagen worden für das Aufbringen der Flüssigreagenzien auf die Träger, beispielsweise Mikrospritzen, Federn mit Meßpumpen, Direktdruck sowie Tir>censtrahldruck. Jede dieser Techniken kann im vorliegenden Zusammenhang

gO eingesetzt werden. Zur Vereinfachung der Herstellung kann der Träger

(beispielsweise ein Blatt) mit den Reagenzien behandelt und dann in kleinere Abschnitte unterteilt werden (beispielsweise kleine schmale Streifen, von denen jeder die die erforderlichen Reagenzien enthaltenden Bereiche aufweist), um eine Vielzahl von identischen Trägereinheiten

gc herzustellen.

Lediglich zu Beispielszwecken werden nachfolgend bevorzugte Aus-

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- &Pgr;&Igr; führungsformen der Erfindung im Detail beschrieben unter Bezugnahme auf die beigefügten Zeichnungen.

Ausführungsform 1

Die Figuren 1 und 2 zeigen einen typischen Streifen aus porösem Festkörperphasenmaterial zur Verwendung in einem Assay-Test gemäß der Erfindung und illustrieren die Grundprinzipien, nach denen die Erfindung arbeitet.

In Figur 1 ist der Assay-Teststreifen 10 als rechteckiger Streifen zu sehen, dessen (zum Zwecke dieser Beschreibung) Längsachse in vertikaler Richtung verläuft. Im Bereich des unteren Endes 11 des Streifens 10 ist ein schmales Band oder ein Bereich 12, der sich über die ganze Breite des Streifens erstreckt. Ein kleiner Bereich 13 des Streifens 10 liegt vertikal unterhalb des Bereiches 12. Oberhalb des Bereiches 12 befindet sich ein zweiter Bereich \k, der eine bestimmte Entfernung weiter oben auf dem Streifen JO liegt und sich ähnlich über die gesamte Breite des Streifens erstreckt. Die Region 15 des Streifens 10 zwischen den Bereichen 12 und K kann eine beliebige Höhe aufweisen, solange nur die beiden genannten Bereiche getrennt sind. Eine weitere Region 16 des Streifens erstreckt sich oberhalb des Bereiches l(f. Am oberen E)?!e 17 des Streifens befindet sich ein poröses Kissen 18, das fest mii dem Streifen 10 verbunden ist, so daß das Kissen 18 als "Senke" für Probenflüssigkeit wirkt, die durch Kapillarwirkung durch den Streifen 10 aufsteigt.

Der Bereich 12 ist mit einem ersten Antikörper beladen, der eine sichtbare (direkte) Markierung (beispielsweise gefärbte Latexpartikel, ein

QQ Farb-Sol oder ein Gold-Sol) trägt. Dieses Reagenz kann bei Anwesenheit

einer Flüssigprobe frei durch den Streifen wandern. Im Bereich Ik ist der Streifen mit einem zweiten Antikörper imprägniert, der eine Spezifität für unterschiedliche Epitope derselben Nachweissubstanz wie der erste Antikörper aufweist. Der zweite Antikörper ist fest auf dem Streifen immobilisiert.

Figur 2 zeigt, was geschieht, wenn der Assay-Streifen in einem ana-

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lytischen Verfahren verwendet wird. Das untere Ende 11 des trockenen Streifens wird mit einer Flüssigprobe (nicht gezeigt) in Kontakt gebracht, die die zu bestimmende Nachweissubstanz enthalten kann. Durch Kapillarwirkung steigt die Flüssigkeit in dem Streifen nach oben und erreicht eventuell das Kissen 18. Dabei durchquert die Probe den Bereich 12 und der markierte Antikörper wird sich in der Probe lösen oder dispergieren und mit ihr zusammen durch den Streifen wandern. Bei der Wanderung in Richtung auf den Bereich 14 kann der markierte Antikörper an Nachweissubstanz, die in der Probe vorhanden ist, gebunden werde: &igr;. Beim Erreichen des Bereiches 14 sollte jedes Molekül der Nachweissubstanz an den zweiten Antikörper gebunden werden, um auf diese Weise d^ "Sandwich", das so hergestellt worden ist, zu immobilisieren. Wenn eine signifikante Konzentration der zu bestimmenden Nachweissubstanz in der Flüssigprobe vorhanden ist, sollte sich ir: kurzer Zeit eine gesonderte Anhäufung von sichtbarer Markierungssubstanz in dem Bereich 14 finden.

Als Analysenbeispiel, für das die Ausführungsform eingesetzt werden kann, kann die Nachweissubstanz hCG sein, die Reagenzien in den Bereichen 12 und 14 können monoklonale Antikörper zu hCG sein, die an einer Sandwich-Reaktion mit hCG teilnehmen, und die Markierungssubstanz kann ein besonderer Farbstoff, ein Gold-Sol, oder gefärbte Latexpartikel sein.

Wenngleich das obige Ausführungsbeispiel in Bezug auf eine "Sandwich"-Reaktion beschrieben worden ist, versteht es sich für den Fachmann, daß das Ausführungsbeispiel auch für eine "Wettbewerbs"-Reaktion (kompetitive Reaktion) modifiziert werden kann, wobei das markierte Reagenz in dem Bereich 12 die Nachweissubstanz oder eine Analogsubstanz zur Nachweissubstanz ist.

Ein Assay auf der Grundlage der oben genannten Prinzipien kann zur Bestimmung einer Vielzahl von Nachweissubstanzen durch Wahl von geeigneten spezifischen Bindungsreagenzien benutzt werden. Die Nachweissubstanzen können beispielsweise Proteine, Haptene, Immunglobuline,

gg Hormone, Polynukleotide, Steroide, Drogen, Krankheitserreger für

Infektionskrankheiten (bakteriellen oder viralen Ursprungs), wie beispielsweise Streptococcus, Neisseria und Chlamydia s~in. Sandwich-Assays

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kör.!-.".··, beispielsweise für Nachweisstoffe wie hCG, LH, und Infektionskrankheitserreger durchgeführt werden, während kompetitive Assays beispielsweise für Nachweisstoffe, wie etwa E-3-G und P-3-G durchgeführt, werden können.

Die Bestimmung von mehr als einer eventuell anwesenden Nachweissubstanz in der Probe kann beachtlichen klinischen Wert haben. Beispielsweise kann der Verhältnis; der Pegel von Apolipoproteinen A. und B eine Anzeige für die Empfänglichkeit von Korronarherzkrankeiten sein. In

Q ähnlicher Weise kann das Verhältnis der Pegel von giyciertem Hämoglobin

(HbH) zu unglyciertem (HbAo) oder zum Gesamthämoglobin (Hb) bei der Behandlung von Diabetes unterstützen. Zusätzlich ist es möglich, Tests auszuarbeiten, um zwei Steroide gleichzeitig zu bestimmen, beispielsweise E-3-G und P-3-G. Beispielsweise kann ein Dualtest, d. h. ein Test für den Nachweis von zwei Nachweissubstan?' n, für die Apolipoproteine

A. und B dadurch präpariert wet den, daß in zwei räumlich getrennten Bereichen Antikörper spezifisch für Apolipoprotein A₍ in einem ersten Bereich und ein Antikörper spezifisch für Apolipoprotein B in einem gesamten zweiten Bereich einer porösen Trägermatrix aufgetragen wird.

Nach dem Auftragen der beiden Antikörper in den jeweiligen Bereichen durch eine geeignete Auftragmethode (beispielsweise Tintenstrahldrucker Meßpumpe und Schreibfeder oder Luftbürste (airbrush)) sollte der Rest des porösen Material mit einem Reagenz, beispielsweise Rinderserumalbumin, Polyvinylalkohol oder Ethanolamin behandelt werden, um jegliche verbleibende Bindungsstellen zu blockieren. Ein drittes und viertes Reagenz, das einen Markierungsstoff trägt, kann dann auf den trockenen Träger in einem oder in mehreren Bereichen in der Nähe eines Endes des Streifens aufgebracht werden, wobei der Streifen zwischen den Auftragungen der beiden Reagenzien in dem gleichen Bereich getrocknet

OQ wird. Reagenz 3 und 4 können Konjugate von Anti-Apolipo-

protein-A j-Antikörper und Anti-Apolipoprotein-B-Antikörper enthalten. Diese beiden Konjugate werden in und auf dem Träger beweglich, wenn sie in den feuchten Zustand gelangen. Die Reagenzien 3 und ^ können mit dem Lösungsmittelstrom wandern, wenn eine wäßrige Probe auf das

&ldquor;5- erste Ende des Trägerstreifens aufgetragen wird. Während der Wanderung

in Richtung auf die beiden Bereiche entlang des Streifens kann das Reagenz 3 in der Probe vorhandenes Apolipoprotein A. und das Reagenz

k in der Probe vorhandenes Apolipoprotein B binden. Beim Erreichen des ersten Bereiches mit dem zweiten Antikörper (Anti-Apolipoprotein-A --Antikörperbereich) sollten Anti-Apolipoprotein-A.-Moleküle an den zweiten Antikörper gebunden werden, wodurch das auf diese Weise erzeugte, markierte Sandwich immobilisiert wird. Keine markierten Apolipoprotein-S-Moleküle werden an diesen ersten Bereich gebunden. Beim Erreichen des zweiten Bereichs mit dem zweiten Antikörper (Anti-Apolipoprotein-B-Antikörperbereich) sollten die Apolipoprotein-B-Moleküle an den zweiten Antikörper (Festphasenantikörper) gebunden werden, wobei

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Kein markiertes Apolipoprotein-A.-Molekül wird an den zweiten Bereich binden. Eine Ansammlung eines jeden der Direktmarkierungsstoffe kann bei beiden oder an einer von beiden der Bereiche zu einem schwächeren oder stärkeren Maß stattfinden, woraus ein sichtbares Signal an einer oder an beiden der Festkörperphasen-Antikörperbereiche erhalten wird.

Überschüssiges ungebundenes Konjugat (sowohl von Reagenz 3 als auch von Reagenz k) kann frei über die beiden Antikörperbereiche passieren und wird in das außenliegende Ende des Streifens gewaschen.

on Die Entwicklung einer quantifizierbaren Farbe in beiden der Bereiche für

den zweiten Antikörper kann mit geeigneten Instrumenten festgestellt werden, die ein Verhältnis der Farbdichte zwischen den beiden Stellen liefern.

ok Die Bestimmung der Anwesenheit von mehr als zwei Nachweissubstanzen

(multiples System) in einer Probe kann beachtlichen klinischen Wert haben. Beispielsweise der Nachweis der Anwesenheit von verschiedenen Serotypen eines Bakteriums oder der Nachweis der Anwesenheit von löslichen serologischen Markierungssubstanzen beim Menschen kann

&ogr;« hilfreich sein. Beispielsweise kann ein multipler Test für den Nachweis

der Anwesenheit von verschiedenen Serotypen von Streptococcus für die Gruppen A, B, C und D erstellt werden. Eine Mischung aus monokionalen Antikörpern, von denen jeder spezifisch für verschiedene pathologisch wichtige Gruppen-Serotypen ist, oder ein polyklonales Antiserum, das gegen eine bestimmte Streptococcengruppe hervorgerufen worden ist, können auf eine porösen Trägerstreifen in Linie über die Breite des Streifens von etwa 1 mm aufgetragen werden. Mehrfache Linien sollten

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- 17-

in räumlich getrennten Bereichen aufgetragen herden, wobei jeder Bereich eine oder mehrere immunchemisch reaktive Komponenten enthält, die geeignet sind, die interessierende Nachweissubstanz zu binden. Nach dem Auftragen der Mehrfachbereiche nach einem geeigneten Auftragverfahren (beispielsweise Tintenstrahldruck, Meßpumpe und Schreibfeder, Luftbürste (airbrush)) sollte der Rest des porösen Materials mit einem Reagenz (z.B. Rinderserumalbumin, Polyvinylalkohol, Ethanolamin) behandelt werden, um eventuell verbleibende Bindungsstellen zu blockieren. Markierungskonjugate, beispielsweise ein Farb-Sol,

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Bakteriengruppe ist, können dann entweder auf einen einzigen Bereich am unteren Ende des Streifens, in der Nähe des Probenauftragbereichs, oder als Serie von getrennten Bereichen aufgetragen werden.

Die Figuren 3, k und 5 der Zeichnungen zeigen ein vollständiges Gerät, das mit einem porösen Streifen, wie soeben beschrieben, arbeitet. Figur 3 zeigt das vollständige Gerät von vorne gesehen, Figur k zeigt das gleiche Gerät mit teilweise weggebrochener Vorderwand, um die Einzelheiten des innen befindlichen Streifens zu zeigen und Figur 5 zeigt das Gerät von unten.

Das Gerät gemäß Figur 3 weist einen flachen rechteckigen Körper 30 auf, dessen Frontseite 31 mit einem Loch oder Fenster 32 versehen ist das die Sicht auf den porösen Teststreifen 10 innerhalb des Körpers freigibt. Die durch das Fenster 32 zu sehende Region des Teststreifens 10 enthält einen schmalen horizontalen Bereich l*f.

Wie in Figur 4 zu sehen ist, weist das Gerät einen trockenen rechteckigen Teststreifen auf, der aus einem porösen Material besteht und

QQ sich von dem unteren Ende 33 des Körpers 30 innerhalb des Körpers

zwischen der Frontplatte 31 und der Rückplatte 34 des Körpers erstreckt, !n der Nähe des unteren Endes 11 des Streifens 10 befindet sich ein horizontaler Bereich 12, der ein markiertes spezifisches Bindungsreagenz für einen Nachweisstoff trägt, welches Bindungsreagenz in dem

ok Teststreifen im feuchten Zustand beweglich ist. Weiter oberhalb in dem

Teststreifen befindet sich ein schmaler horizontaler Bereich Ik, der durch das Fenster 32 sichtbar ist. Am oberen Ende 17 des Teststreifens

10 ist eine poröse "Senke" 18, die Probenfiüssigkeit absorbieren kann, die in dem Streifen aufwärts gewandert ist.

Wie in Figur 5 erkennbar, weist die Unterkante 35 des Körpers 30 eine seitliche Öffnung auf, in der das untere Ende 11 des Streifens liegt.

Beim Gebrauch wird das untere Ende 32 des Körpers 30 in eine Flüssigprobe (beispielsweise Urin) eingetaucht, so daß die Flüssigprobe durch das untere Ende 11 des Teststreifens 10 absorbiert wird und durch Kapillarwirkung zum oberen Ende 17 des Teststreifens und zur Senke 18 aufsteigt. Dabei bewegt sich die Flüssigprobe über den Bereich 12 zum Bereich 14. Es finden spezifische Bindungsreaktionen wie oben beschrieben statt und das Testergebnis ist für den Benutzer durch das Fenster 32 sichtbar.

Ausführungsform 2

Die Figuren 6 und 7 zeigen ein weiteres Testgerät gemäß der Erfindung.

Figur 6 zeigt das vollständige Gerät von vorne gesehen und Figur 7 zeigt 20

dasselbe Gerät mit teilweise weggebrochenen Teilen, um Einzelheiten des in dem Gerätekörper enthaltenden Teststreifens sichtbar zu machen.

Gemäß Fig. 6 weist das Gerät einen länglichen Körper 200 auf, der an

seinem unteren Ende 201 in ein kleines integrales Aufnahmegefäß 202 25

übergeht, das eine vorgegebene Menge einer Flüssigprobe, wie beispielsweise Urin, aufnehmen kann. Die Frontplatte weist zwei kleine quadratische Fenster 204 und 205 auf, die übereinander angeordnet sind.

Wie aus Fig. 7 hervorgeht, ist der längliche Teil des Körpers 200 hohl 30

und enthält einen Teststreifen 206, der sich fast über die gesamte Länge des Körpers erstreckt. Dieser Teststreifen ist ähnlich aufgebaut wie der im Zusammenhang mit der Ausführungsform 1 beschriebene und enthält in der Nähe seines unteren Endes 207 einen horizontalen Bereich ?ⁿ*. el·

ein markiertes spezifisches Bindungsreagenz trägt, welches in dem 5

Streifen im feuchten Zustand frei wandern kann. Im Bereich der Fenster 204 und sichtbar durch diese befinden sich zwei kreisförmige Bereiche

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- 19-

^ 209 und 210. Der Streifen endet an seinem oberen Ende 211 in einer

porösen Senke 212. An dem unteren Ende des Testgerätes steht das Aufnahmegefäß 202 mit dem Hohlraum des Körpers über eine seitliche Öffnung 213 in Verbindung. '

Im Betrieb wird eine Flüssigprobe an das untere Ende des Gerätes gebracht und ein vorgegebenes Volumen der Probe füllt das Aufnahmegefäß 202. Aus dem Aufnahmegefäß 202 steigt die Flüssigkeit durch Kapillarwirkung durch den Teststreifen 206 und fördert das markierte Reagenz von dem Bereich 2OS zu den beiden kreisförmigen Bereichen 209 und 210. Eine Serie von spezifischen Bindungsreaktionen wie unter Bezugnahme auf das Ausführungsbeispiel 1 beschrieben, finden statt. Bei dieser Ausführungsform kann der zweite kreisförmige Bereich 210 als Kontrollbereich dienen (der beispielsweise ein Farbsignal erzeugt, unabhängig davon, ob die Probe die zu bestimmende Nachweissubstanz enthält oder nicht) während die Bestimmung dar Nachweissubstanz in dem ersten kreisförmigen Bereich 209 stattfindet. Der Benutzer kann feststellen, ob die Nachweissubstanz in der Probe vorliegt, indem er die in den beiden Bereichen erzeugten Signale vergleicht.

Wenn beispielsweise der Test dazu bestimmt ist, die Anwesenheit von

hCG im Urin im Rahmen eines Schwangerschaftstests festzustellen, kann der kreisförmige Kontrollbereich 210 immobilisiertes hCG enthalten, das einen markierten Antikörper bindet, der von dem Bereich 208 mit der _K wandernden Flüssigkeitsprobe nach oben getragen wird. Der gleiche

markierte Antikörper kann an einer Sandwich-Reaktion mit hCG in der Probe teilnehmen und wird in dem ersten kreisförmigen Bereich 209 durch einen anderen spezifischen Anti-hCG-Antikörper gebunden, der dort immobilisiert ist. Falls gewünscht, kann der Kontrollbereich auch

alternativ hierzu lediglich ein unspezifisches Signal an den Benutzer 30

abgeben, das zeigt, daß das Gerät gearbeitet hat. Beispielsweise kann der zweite kreisförmige Bereich mit einem Antikörper beladen werden, der an den markierten Antikörper aus dem Bereich 208, beispielsweise einen "Anti-Maus" Antikörper bindet, falls der markierte Antikörper ein solcher

ist, der unter Verwendung eines Murinftybridoma hergeleitet worden ist, 35

um zu bestätigen, daß die Probe den Teststreifen durchlaufen hat.

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- 20-, Ausführungsform 3

Fig. 8 der Zeichnungen zeigt eine isometrische Darstellung eines Assay-Gerätes gemäß der Erfindung und Fig. 9 zeigt das in Fig. 8 dar-,_ gestellte Gerät geschnitten parallel zu einer Schmalseite.

Wie in Fig. 8 erkennbar, weist das Gerät ein Gehäuse 500 von länglich rechteckiger Form auf, das an einem Ende 501 einen Teil 502 mit verringerter Querschnittsfläche hat. Eine Kappe 503 kann auf den Abschnitt 502 gesetzt werden und schlägt an der Schulter 504 am Ende 501 des Gehäuses an. Die Kappe 503 ist getrennt von dem Gehäuse 500 gezeigt. Über das Ende 505 des Abschnitts 502 hinaus erstreckt sich ein poröses Teil 506. Wenn die Kappe 503 auf den Abschnitt 502 des Gehäuses gesteckt ist, bedeckt sie das poröse Teil 506. Die obere Wand

507 des Gehäuses 500 enthält zwei Öffnungen 508 und 509.
15

Wie in Fig. 9 zu erkennen ist, ist das Gehäuse 500 hohl. Das poröse Teil 506 erstreckt sich in das Gehäuse 500 und steht mit einem Streifen aus porösem Trägermaterial 510 in Verbindung. Das poröse Teil 506 und der

Streifen 510 überlappen sich, so daß sichergestellt ist, daß eine 20

ausreichende Kontaktfläche zwischen diesen Materialien vorhanden ist, und daß die Flüssigprobe, die auf das Teil 506 aufgetragen wird, dieses Teil 506 durchlaufen und in den Streifen 510 eintreten kann. Der Streifen 510 erstreckt sich weiter in das Gehäuse 500. Der Streifen 510 ist durch

einen Stützstreifen 511 verstärkt, der aus transparentem, feuchtigkeits-25

undurchlässigem Kunststoff material gefertigt ist. Der Streifen 510 erstreckt sich über die Öffnungen 508 und 509 hinaus. Durch Stege 512 und 513 in dem Gehäuse 500 wird der Streifen 510 fest an seinem Ort gehalten. Die internen konstruktiven Details des Gehäuses stellen keinen signifikanten Aspekt der Erfindung dar, wichtig ist, daß der Streifen fest f

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an seinem Platz innerhalb des Gehäuses gehalten und das poröse Teil 506 f

in dem Gehäuse ebenfalls festgehalten wird, und daß ein ausreichender |

Flüssigkeitsdurchlaßkontakt zwischen dem Teil 506 und dem Streifen 510 gewährleistet ist. Der transparente Verstärkungsstreifen 511 liegt

zwischen dem 5treifen 510 und den Öffnungen 508 und 509 und kann als 35

Dichtung dienen und das Eindringen von Feuchtigkeit von außen in das Gehäuse über diese Öffnungen verhindern. Gewünschtenfalls kann der

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- 21-

^ Restraum 51^ innerhalb des Gehäuses feuchtigkeitsabsorbierendes

Material, wie etwa Silikagel enthalten, um den Streifen 510 bei der Lagerung trocken zu halten. Die Reagenz enthaltenden Bereiche des Streifens 510 sind in Fig. 8 nicht dargestellt, jedoch der erste Bereich

g mit dem markierten Reagenz, das beweglich ist, wenn der Streifen

befeuchtet wird, liegt innerhalb des Bereichs zwischen dem porösen Teil 506 und der Öffnung 508. Der zweite Bereich, der das immobilisierte unmarkierte Reagenz enthält, liegt in dem Bereich, der durch die Öffnung 508 sichtbar ist, damit beim Gebrauch des Gerätes in einem Assay das Ergebnis durch die Öffnung 508 beobachtet werden kann. Die Öffnung 509 stel't ein Mittel dar, durch das ein Kontrollbereich, der weitere Reagenzien enthält, die das angemessene Durchlaufen der Probe durch den Streifen ermöglichen, beobachtet werden kann.

Beim Gebrauch wüd die Schutzkappe 503 von dem Halter abgezogen und das Teil 506 wird einer Flüssigprobe ausgesetzt, beispielsweise in einen Urinstrahl gehalten im Falle eines Schwangerschaftstests. Nachdem das Teil 506 der Flüssigprobe für eine Zeit ausgesetzt worden ist, die ausreicht, um das Teil 506 mit der Probe zu sättigen, kann die Kappe 503 wieder aufgedeckt und das Gerät durch den Benutzer für eine angemessene Zeit (beispielsweise 2 oder 3 min) zur Seite gelegt werden, während die Probe den Teststreifen 510 durchläuft, um das analytische Ergebnis zu liefern. Nach der geeigneten Zeit kann der Benutzer den Teststreifen durch die Öffnungen 508 und 509 beobachten und durch

Beobachtung des Kontrollbereichs durch die Öffnung 509 feststellen, ob 25

der Assay abgeschlossen ist. Er kann das Ergebnis des Assay durch Beobachtung des zweiten Bereichs durch die Öffnung 508 ablesen.

Bei der Herstellung kann das Gerät einfach aus beispielsweise Kunststoffmaterial zusammengesetzt werden, wobei das Gehäuse 500 in zwei Teilen (beispielsweise die obere und die untere Hälfte 515) gegossen wird. Diese Hälften können sicher aneinander befestigt werden (beispielsweise durch Ultraschallschweißung), nachdem das poröse Teil und der Teststreifen in eine der Hälften eingesetzt und dann von den beiden Hälften umschlossen wird. Bei dieser Herstellungsweise in Sandwich-Konstruktion kann das poröse Teil und der Teststreifen gegeneinander gepreßt werden, um einen ausreichenden Kontakt zwischen den beiden Teilen

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- 22-

sicherzustellen. Die Kappe 503 kann als separates komplettes Bauteil gegossen werden. Gewünschtenfalls können die Öffnungen 508 und 509 mit transparenten Einsätzen versehen werden, die eine größere Sicherheit gegen das Eindringen von Frerndfeuchtigkeit von der Außenseite des Gehäuses bieten. Durch einen dichten Sitz zwischen dem Ende 505 des 5

Gehäuses 500 und dem vorstehenden porösen Teil 506 wird gewährleistet, daß eine auf das vorstehende Teil aufgetragene Probe nicht direkt in das Gerät eintritt und das Teil 506 umgeht. Das Teil 506 stellt demnach den einzigen Zugangsweg für die Probe zu dem Streifen innerhalb des

Gehäuses dar und liefert die Probe an den Streifen in kontrollierter 10

Weise. Das Gerät verbindet als ganzes somit die Funktion des Probenehmens und Analysierens.

Bei der Verwendung der Teststreifenmaterialien und Reagenzien wie im

folgenden beschrieben, kann entsprechend den Fig. 8 und 9 ein Gerät 15

hergestellt werden, das besonders als Schwangerschaftstest-Satz oder Ovulationszyklustestsatz zum Gebrauch zu Hause oder in der Klinik geeignet ist. Der Benutzer muß nur eine Urinprobe auf das exponierte poröse Teil auftragen und dann (vorzugsweise nach dem Wiederaufsetzen

der Kappe) das Testergebnis durch die Öffnung 508 innerhalb von wenigen 20

Minuten beobachten.

Wenngleich das Gerät unter Bezugnahme auf Schwangerschaft- und Ovulationszyklustests beschrieben woi den ist, kann es zur Bestimmü ig

einer Vielzahl von Nachweissubstanzen verwendet werden, wenn 25

geeignete Reagenzien in den Teststreifen eingebracht werden. Die öffnung 509 ist. redundant und kann weggelassen werden, wenn der Teststreifen keine Kontrollmittel enthält. Die allgemeine Form des Gehäuses und der Kappe sowohl hinsichtlich ihrer Länge als auch hinsichtlich ihres

Querschnitts und anderer physikalischer Merkmale können beträchtlich 30

variiert werden, ohne daß vom Geist de^r Erfindung abgewichen wird.

Ebenso kann das markierte Reagenz von dem Teststreifen weggelassen werden, wenn dieses Reagenz der Probe vor dem Auftragen der Probe auf das Testgerät zugegeben wird. Alternativ hierzu kann das markierte

Reagenz in dem vorstehenden porösen Teil 506 enthalten sein.

Fig. 10 zeigt in vergrößertem Maßstab das poröse Aufnahmeteil und den Teststreifen in dem in den Fig. 8 und 9 dargestellten Gerät.

Das poröse Aufnahmrteil 506 ist mit dem porösen Teststreilen ¹JlO, der durch ein transparentes Kunststoff blatt 511 verstärkt ist, verbunden, so daß Flüssigkeit in Richtung der eingezeichneten Pfeile durch das poröse A'jfnahmeteil in den porösen Streifen fließen kann. Der Testbereich 517 enthält das immobilisierte spezifische Bindungsreagenz und der Kontrollbereich 518 enthält ein Reagenz, das anzeigt, daß die Probe ein , ,_N ausreichendes Stück entlang des Teststreifens durchlaufen hat. Ein Teil

der Oberfläche des Teststreifens gegenüber dem Verstärkungsstreifen 511 und in der Nähe des porösen Aufnahmeteils 506 trägt eine Glasur 519 auf der eine Schicht 520 eines markierten spezifischen Bindungsreagenz angebracht ist. Die Dicke dieser beiden Schichten, wie sie in Fig. 10

gezeigt ist, ist stark übertrieben zum Zwecke der Illustration. In der 15

Praxis stellt die Glasur nicht eine Oberflächenschicht dar, sondern das

Glasurmaterial wird in die Dicke des Streifens in einem gewissen Maß eindringen. In gleicher Weise wird das danach aufgetragene markierte Reagenz ebenfalls in den Streifen eindringen. Gleichwohl wird das wesentliche Ziel der Reduzierung von Wechselwirkungen zwischen dem ZO

markierten Reagenz und dem Trägermaterial, das den Streifen bildet, erreicht. Eine wässrige Probe die auf das Aufnahmeteil 506 gebracht wird, fließt von dort in Längsrichtung des Streifens 510 und löst dabei die Glasur 519 auf, mobilisiert das markierte Reagenz und trägt das

markierte Reagens entlang dem Streifen durch den Bereich 517.
25

Ausführungsform k

Die Fig. 11 und 12 zeigen eine weitere Ausführungsform der Erfindung, die in Fig. 11 in der Draufsicht und in Fig. 12 im Schnitt gezeigt ist, wobei der Schnitt längs der Linie A in Fig. 11 vorgenommen ist.

Gemäß Fig. 11 weist die Testvorrichtung ein flaches rechteckiges Gehäuse 600 auf, das eine zentral angeordnete rechteckige Öffnung 601

in der Nähe des linken Endes 602 und zwei weitere Öffnungen 603 und ..

60^ in der Nähe der Mitte des Gerätes enthält, so daß die Öffnungen 601, 603 und 604 auf der zentralen Längsachse des Gerätes entsprechend

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- 24-

der Schnittlinie A liegen. Wenngleich alle drei Öffnungen als rechteckig gezeigt sind, ist ihrr- tatsächliche Form nicht entscheidend.

Nach dem Längsschnitt der Fig. 12 ist das Gerät hohl und enthält ein

poröses Probenaufnahmeteil in der Nähe des Endes 602 des Gehäuses 600, 5

welches direkt unterhalb der Öffnung 601 liegt. Ein Teststreifen mit ähnlichem Aufbau wie derjenige, der unter Bezugnahme auf die Ausführungsform 4 beschrieben worden ist, und der einen porösen Streifen 606, verstärkt durch ein transparentes Kunststoffblatt 607 umfaßt, ist ebenfalls innerhalb des Gehäuses 600 vorhanden und erstreckt

sich von dem porösen Aufnahmeteil 602, mit dem der poröse Träger in Flüssigkeitsaustauschkontakt steht, zu dem anderen Ende des Gehäuses. Das transparente Verstärkungsblatt 607 ist im festen Kontakt mit der oberen Innenfläche 608 des Gehäuses 600 und stellt eine Dichtung gegen die Öffnungen 603 und 604 dar, um das Eindringen von Feuchtigkeit oder

Probenflüssigkeit in das Gehäuse zu verhindern. Wenngleich dies in den Zeichnungen nicht gezeigt ist, enthält der Teststreifen 606 ein markiertes spezifisches Bindungsreagenz, einen Testbereich und einen Kontrollbereich, die in geeigneter Beziehung zu den Öffnungen 603 und

604 liegen, analog wie anhand der Ausführungsform 3 beschrieben.
20

Beim Gebrauch wird eine wässrige Probe durch die Öffnung 601 aufgetragen, beispielsweise mit Hilfe einer Spritze, um das poröse Aufnahmeteil 605 zu sättigen. Danach kann die wässrige Probe den Teststreifen durchlaufen und nach einer geeigneten Zeit kann das Testergebnis durch

die Öffnungen 603 und 604 beobachtet werden.

Ausführungsform 5

Ein weiteres Ausführungsbeispiel der Erfindung ist in den Fig. 13 und 14

dargestellt. Fig. 13 zeigt ein Gerät mit einem rechteckigen Gehäuse 700, das in seiner oberen Fläche 701 eine rechteckige Öffnung 702 aufweist. Eine Stirnwand 703 des Geräts enthält eine Öffnung 704, durch die ein poröses Testelement mit der Außenseite des Gerätes in Verbindung steht. Eine Öffnung 702 ist in der oberen Fläche 701 an einem Punkt angeordnet, der verhältnismäßig weit von dem Ende 703 mit der Öffnung 704 abliegt.

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- 25-

Fig. 14 zeigt das Gerät der Fig. 13 mit teilweise weggebrochenen Teilen. Das hohle Gerät enthält einen porösen Teststreifen 705, der sich fast über die gesamte Länge des Gehäuses 700, ausgehend von der Öffnung c 70V, erstreckt. Der Teststreifen 705 enthält einen ersten Bereich 706 mit

einem markierten spezifischen Bindungsreagenz und einem weiteren Bereich 707, entfernt von der Öffnung 704, der ein immobilisiertes spezifisches Bindungsreagenz enthält. Der Bereich 706 liegt direkt unter der Öffnung 702 und ist daher von der Außenseite des Gehäuses zu _1Q beobachten. Unterhalb des Streifens 705 und in der Nähe des Bereichs

707 liegt ein zerbrechbares Element 708, das ein oder mehrere Substrate oder Reagenzien enthält, die dazu verwendet werden können, urn ein nachweisbares Signal zu erzeugen, wenn sie in den Bereich 707 freigegeben werden, falls markiertes Reagenz von 706 in dem Bereich 707 im Laufe des Gebrauchs der Vorrichtung gebunden worden ist. Die Freigabe der Reagenzien von dem Teil 708 kann durch Anwendung von Druck auf die Außenseite des Gehäuses an diesem Punkt erreicht werden, um das Teil zu zerbrechen und das Reagenz aus diesem auszudrücken.

Beim Betrieb kann das erste Testelement einer wässrigen Probe ausgesetzt werden, beispielsweise dadurch, daß das Ende 703 des Gehäuses 700 in ein die Probe enthaltendes Gefäß eingetaucht wird. Die Flüssigprobe wird dann die Länge des Teststreifens 705 durchlaufen, wobei sie .markiertes Reagenz vom Bereich 706 mitnimmt und durch den Bereich 707 gelangt, wo das markierte Reagenz gebunden wird, beispielsweise durch eine "5andwich"-Reaktion die den in der Probe enthaltenen Nachweisstoff einbezieht. Wenn die Probe den Teststreifen durchlaufen hat, kann Reagenz von dem zerbrechbaren Teil 708 freigesetzt werden und das Ergebnis des Tests kann durch die Öffnung 702

beobachtet werden.
30

Lediglich zu Beispielszwecken werden nachfolgend verschiedene Teststreifenmaterialien, Reagenzien und Verfahren zu ihrer Herstellung beschrieben.

1. Auswahl des flüssigkeitsleitenden Materials

Repräsentative Beispiele von flüssigkeitsleitenden Materialien umfassen Papier, Ni*ro7ell"se und Nvlonmembranen. Wesentliche Eigenschaften der Materialien sind die Fähigkeit Protein zu binden, die Geschwindigkeit der Flüssigkeitsleitung; und - falls notwendig - nach Vorbehandlung, die Fähigkeit markierte Antikörper entlang dem Streifen passieren zu lassen· Wenn es sich um eine Direktmarkierung handelt, kann es wünschenswert sein, daß das Material den Fluß von Partikeln mit einer Größe von bis zu einigen Mikron (normalerweise weniger als 0.5&mgr;) gestattet. Beispiele von Strömungsgeschwindigkeiten, die mit verschiedenen Materialien erzielt worden sind, werden nachstehend wiedergegeben:

Nitrozellulose (unverstärkt) (von Schleicher + Schuell)

Porengröße	Benötigte Zeit
	für 45mm Strömung
	weg (Minuten)
3&mgr;	3,40
5&mgr;	3,30
8&mgr;	3,00
12&mgr;	2,20
8&mgr; (nominal)	3,<«0
5	19,20
3	4,00
5	3,20

polyesterverstärkt

Whatman-Nitrozellulose Pail "Immunodyne" (Nylon)

Die Geschwindigkeit des Testverfahrens wird bestimmt durch die Strömungsgeschwindigkeit des eingesetzten Materials. Wenngleich beliebige der obif ^ Materialien verwendet werden können, führen einige zu rascheren Tests als andere.

Nitrozellulose hatte den Vorteil, daß keine Aktivierung notwendig war und daß sie Proteine stark durch Absorption immobilisiert. "Immunodyne" ist voraktiviert und erfordert keine chemische Behandlung. Papiere, wie etwa Whatman 3MM,erfordern chemische Aktivierung, beispieisv. ·.-.;■■-?. it Carbonyldiimidazol, um den Antikörper mit Erfolg zu immobilisieren.

2. Markierungsstoffe

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-27-

Herstellung der Markierungsstoffe

Eine Auswahl von Markierungsstoffen, die benutzt werden können, wird nachstehend wiedergegeben. Die Liste ist nicht erschöpfend.

A) Goldsolherstellung

Gold-Sole können für die Verwendung bei Immunoassays aus handelsüblich erhältlichem Kolloidal-Gold und einem Antikörperpräparat, wie beispielsweise einem Präparat von Anti-Alpha-Humanchoriongonadotrophin hergestellt werden.

Beispielsweise wird Kollodialgold G20 (20nm Partikelgröße, geliefert von Janssen Life Sciences Products) auf einen pH-Wert von 7 mit 0,22p-gefilterter 0,1 molarer K-CO, eingestellt und 20ml werden in einen sauberen Glasbehälter gegeben. 200&mgr;1 anti-alpha hCG Antikörper, zubereitet in 2mM Boraxpuffer pH9 bei 1 mg/ml und 0,22&mgr; gefiltert wird dem Gold-Sol zugesetzt und die Mischung kontinuierlich 2 min gerührt.

0,1 molare K₂CO, wird zur Einstellung des pH-Wertes der Antikörper-Gold-Sol-Mischung auf 0,9 verwendet und es werden 2ml von 10%iger (Gew./Vol.) BSA (Rinderserum-Albumin) hinzugefügt.

Das Antikörper-Gold wird in einer Reihe von drei Zentrifugationsschritten bei 1200g, 30 min, und ^⁰C gereinigt, wobei nur lose Teile des Pellet erneut für den weiteren Gebrauch suspendiert werden. Das Endpellet wird erneut in l%iger (Gew./Vol.) BSA in 2OmM Tris, 15OmM NaCl pH 8.2 suspendiert.

B) Farbsolherstellung

Farbsole können aus im Handel erhältlichen hydrophoben Farbstoffen, wie Foron Blue SRP (Sandoz) und Resolin Blue BBLS (Bayer) präpariert werden. 50g Farbstoff wird in Ii destillierten Wasser durch Mischung mit einem Magnetrührer über 2 bis 3 min dispergiert. Die Fraktionierung der Farbstoffdispersion kann durch einen Anfangszentrifugationsschritt bei 1500g über 10 min bei Raumtemperatur erfolgen, um größere Solpartikel

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in Form eines festen Pellets (Kugel) zu entfernen, wobei der Überstand (Suspension A) für weitere Zentrifugation zurückbehalten wird.

Die Suspension A wird bei 3000g 10 min bei Raumtemperatur zentrifugiert, der Überstand weggeworfen und das Pellet erneut in 500ml destilliertem Wasser suspendiert. Diese Prozedur wird noch dreimal wiederholt, wobei das letzte Pellet erneut in 10ml destilliertem Wasser suspendiert wird.

Die Spektren der Farb-Sole, die wie oben beschrieben hergestellt werden, können gemessen werden. Ihr Lambda-Max-Wert liegt etwa bei 657nm für Foron Blue und 690nm für Resolin Blue. Die Absorption bei Lambda-Max auf lern Weglänge wird als willkürliches Maß für die Farbstoffkonzentration verwendet.

C) Gefärbte Partikel

Latex (Polymer) Partikel zum Gebrauch in Immunoassays sind im Handel erhältlich. Diese können auf eine Reihe von synthetischen Polymeren, wie Polystyrol, Polyvinyltoluol, Styrol-Acrylsäure-Copolymerisat und PoIyacrolein basieren. Die verwendeten Monomere sind normalerweise wasserunlöslich und werden in wässrigen oberflächenaktiven Stoffen emulgiert, so daß sich Monomer-Mycellen bilden, die dann zur Polymerisation veranlaßt werden, indem ein Initiator der Emulsion zugefügt wird. Im wesentlichen werden sphärische Polymerpartikel produziert.

Gefärbte Latexpartikel können produziert werden, wozu entweder ein geeigneter Farbstoff, wie etwa Anthrachinon, der Emulsion vor der Polymerisation zugefügt wird, oder tJadurch, daß die vorgeformten Partikel gefärbt werden. Bei letzterem Weg sollte der Farbstoff in einem nicht mit Wasser mischbaren Lösungsmittel aufgelöst werden, wie beispielsweise Chloroform, das dann einer wässrigen Suspension von Latexpartikeln zugefügt wird. Die Partikel nehmen das nicht-wässrige Lösungsmittel und den Farbstoff an und können dann getrocknet werden.

Vorzugsweise weisen solche Latexpartikel eine maximale Abmessung von weniger als 0,5 Mikron auf.

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Gefärbte Latexpartikel können mit Protein und insbesondere Antikörpern sensitivisiert werden, um Reagenzien zum Gebrauch bei Immunoassays zu schaffen. Beispielsweise können Polystyrolkörner mit etwa 0,3 Mikron Durchmesser (erhältlich durch Polymer Laboratories) mit Anti-Alpha-Human-Choriongonadotrophin in dem nachfolgend beschriebenen Prozeß sensitiviert werden:

0,5ml (12,5mg Feststoffe) einer Suspension werden verdünnt mit ImI 0,1 M Boratpuffer, pH 8,5, in einem Eppendorf Gefäß. Diese Partikel werden viermal in Boratpuffer gewaschen, wobei jeder Waschvorgang aus einer 3-minütigen Zentrifugation bei 13000 U/min in einer MSE-Mikrozentrifuge bei Raumtemperatur besteht. Das restliche Pellet wird erneut in ImI Boratpuffer suspendiert, mit 300Mg Anti-Alpha-hCG-Antikörper gemischt und die Suspension 16 bis 20 h bei Raumtemperatur rotiert (end-over-end). Die Antikörper-Latexsuspension wire" 5 min bei 13000 U/min zentrifugiert, der Überstand weggeschüttet und das Pellet erneut in 1,5ml Boratpuffer, die 0,5mg Rinderserumalbumin enth ;ten, suspendiert. Nach einer Rotation von 30 min bei Raumtemperatur (end-over-end) wird die Suspension dreimal in 5mg/ml BSA in phosphatgepufferter Salzlösung pH 7,2, durch Zentrifugation bei 13000 U/min während 5min gewaschen. Das Pellet wird erneut in Jmg/ml BSA/5% (Gew./Vol.) Glyzerol in phosphatgepufferter Salzlösung pH 7,2 suspendiert und bei 4⁰C bis zum Gebrauch gelagert.

(A) Herstellung des Anti-hCG-Farbsols

Protein kann an ein Farbsol in einem Prozeß gekoppelt werden, der passive Adsorption einschließt. Das Protein kann beispielsweise ein Antikörperpräparat sein, wie anti-alpha humanes Choriongonadotrophin, das in phosphatgepufferter Salzlösung pH 7,*t bei 2mg/ml präpariert ist. Eine Reaktionsmischung wird zubereitet, die &Igr;&Ogr;&Ogr;&mgr;&Igr; Antikörperlösung, 2ml Farbsol, 2ml 0,1 M Phosphatpuffer pH 5,8 und 15,9ml destilliertes Wasser enthält. Nach sanfter Mischung dieser Lösung wird das Präparat für 15 min bei Raumtemperatur stehengelassen. Überschüssige Bindungsstellen können durch Zugabe von beispielsweise Rinderserumalbumin blockiert werden: 4ml von 150mg/ml BSA in 5mM NaCl pH 7,4 wird der Reaktions-

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mischung hinzugefügt und nach 15 min Inkubation bei Raumtemperatur wird die Lösung bei 3000g 10 min zentrifugiert. Das Pellet wird erneut in 10ml von 0,25% (Gew./Vol.) Dextran/0,5% (Gew./Vol.) Lactose in 0,04M Phosphatpuffer suspendiert. Das Antikörper-Farbstoff-Solkonjugat wird am besten in gefriergetrockneter Form gelagert.

B) Herstellung des LH-Farbsols

Infolge der strukturellen Homologie zwischen den Alpha-Untereinheiten von hCG und LH kann Alpha-hCG-Antikörper verwendet werden, um LH

in einem kreuzreaktiven Immunoassay nachzuweisen. Folglich kann ein markierter Antikörper zur Verwendung in einem LH-Assay in der gleichen Weise hergestellt werden, wie dies in Beispiel 1 beschrieben ist, wobei Anti-Alpha-hCG-Antikörper verwendet wird.
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3. Herstellung des Reaftenzstreifens

Bereichsweise Imprägnierung von flüssigkeitsieitenden Materialien

Ein flüssigkeitsleitendes Material mit einem begrenzten Bereich von immobilisiertem Protein, insbesondere einem Antikörper, kann beispielsweise wie folgt präpariert wenden:

Ein rechteckiges Blatt von 8p-Nitrozellulose, verstärkt, (Firma Schleicher und Schueil) mit einer Länge von 25cm und einer Breite von 20cm soll einen Reaktionsbereich dadurch bekommen, daß Material in einer Linie von &Igr;&ggr;&ggr;,,&tgr;&igr; Breite in Intervallen von 5cm in Längsrichtung aufgetragen wird, die sich über die gesamte 20cm-Breite erstreckt. Das Material kann beispielsweise ein geeignet ausgewählt-;* Antikörperpräparat, wie etwa Anti-Beta (Humanes Choriongonadotrophin) mit einer Affinität Ka von

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10 sein, hergestellt in phosphatgepufferter Salzlösung pH 7,4 bei 2mg/ml, welches geeignet für einen Immunoassay für humanes Choriongonadotrophin unter Verwendung eines zweiten (markierten) Anti-hCG-Antikörper in Sandwichformat ist. Diese Lösung kann mit Hilie einer durch einen Mikroprozessor gesteuerten Mikrospritze aufgetragen werden, die präzise Reagenzvolumina durch eine Düse liefert,

voi /Algsweise mit 2mm Durchmesser. Nach dem Troc nen des aufgetragenen Materials über 1 h bei Raumtemperatur werden (JberschußbindungsstHlen der Nitrozellose mit einer inerten Komponente, wie Polyvinylalkohol (1% w/v in 2OmM Tris pH 7,<*) über 30 min bei Raumtemperatur blockiert. Die Blätter werden sorgfältig mit destilliertem Wasser gespült und dann 30 min bei 30⁰C getrocknet.

Bei einer Auiführungsforrn kann das flüssigkeitsleitende Material danach in zahlreiche Streifen mit einer Länge von 5cm und einer Breite von lern geschnitten werden, wobei jeder Streifen einen begrenzten Bereich mit immobilisiertem Antikörper trägt, der als immunoabsorbierender Teilweg (beispielsweise etwa über den halben Weg) seiner Länge wirkt. In diesem Beispiel wird der Teststreifen mit einer Flüssigmarkierung verwendet, die mit der Probe gemischt wird. Beim Gebrauch wird dann dieser begrenzte Bereich ein Testreaktionsbereich, in dem die Immunoassayreaktionen stattfinden.

Gemäß einer anderen Ausführungsform kann die Markierung in einem begrenzten Bereich aufgebracht werden, bevor das flüssigkeitsleitende Material in Streifen geschnitten wird. Beispielsweise kann dieses Reagenz ein Farbsol oder ein Farbstoff-Polymer-konjugierter-Anti-hCG-Antikörper sein, der wie oben unter "Herstellung des Farbsols" beschrieben hergestellt ist. Dieses Reagenz wird in dem Bereich zurückgehalten, wenn sich das Material im trockenen Zustand befindet, es kann jedoch frei durch das Trägermaterial wandern, wenn das Material befeuchtet ist, beispielsweise durch Auftragen der Flüssigprobe, die den zu bestimmenden Nachweisstoff enthält. Dieser Bereich mit dem mobilen Reagenz wird beispielsweise wie folgt aufgebracht:

Ein Blatt 8M-Nitrozellose, verstärkt (Firma Schleicher und Schuell), mit 25cm Länge und 20cm Breite und Bereichen mit immobilisiertem Antikörper in 5cm Abständen in Längsrichtung wird wie oben beschrieben hergestellt. Vor dem Auftragen des farbstoffmarkierten Antikörpers wird eine Zwischenschicht von beispielsweise 60% Gew./Vol. Sucrose in destilliertem Wasser durch Luftbürsten auf das durch Mikroprozessor gesteuerte System in 6cm-Intervallen in Längsrichtung des Blattes aufgetragen. Dann werden in mehreren Durchgängen (beispielsweise in drei

Durchgängen) farbstoff markierter Antikörper, der in 1% Methacel KAM (Warenzeichen für Methylzellulose der Dow Chemical Company) und 0,6% (Gew./Vol.) Polyvinylalkohol durch Luftbürsten oder durch eine Mikrospritze direkt auf die Oberseite der Unterschicht aufgetragen. Die Blätter werden dann getrocknet und in Streifen mit 5cm Länge und lern Breite geschnitten und sind für den Gebrauch in dem fertigen Gerät bereit.

Goldsole oder gefärbte Polystyrolmarkierungen können in einem ähnlichen Verfahren aufgebracht werden.

Zusätzlich zu dem Testbereich können verschiedene Kontrollbereiche je nach Wunsch betrieben werden. Beispielsweise kann ein Bereich mit Anti-Spezies IgG hinter dem Testbereich aufgetragen werden.
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'f. Sandwichassays unter Verwendung des Streifenformats

Eine sandwichartige Reaktion kann zum Nachweis von humanem Choriongonadotrophin (hCG) in einer Flüssigprobe verwendet werden. Der verwendete Markierungsstoff ist vorzugsweise ein Direktmarkierungsstoff, der mit bloßem Auge leicht gesehen werden kann. Farbsole, Goldsole oder gefärbte Latexpartikel können an den Anti-hCG-Antikörper, wie oben beschrieben, gebunden werden.

Bei Direktmarkierungen können Assays durchgeführt werden, in denen frische Urinproben direkt aus dem Urinstrahl oder aus einem geeigneten Volumen (beispielsweise &Igr;&Ogr;&Ogr;&mgr;&Igr;) aus einem Behälter mit Hilfe einer Pipette auf den absorbierenden Docht des Teitg.erätes gebracht werden. Man läßt jede Probe 5 min in dem Gträt laufen und die in dem reaktiven Bereich erzeugte Farbe wird entweder mit dem Auge oder unter Verwendung eines Lichtreflektometers abgelesen.

Indirekte Markierungen, wie Enzyme, beispielsweise alkalische Phosphatase können ebenfalls verwendet werden, erfordern jedoch den Zusatz eines Substrats zur Erzeugung eines gefärbten Endpunktes.

Unter Verwendung konventioneller Techniken können Enzymassays

durchgeführt werden, bei denen der Anti-hCG-Antikörper konjugiert zu alkalischer Phosphatase ist, aufgelöst 1:100 in 0,01M phosphatgepufferter Sa'.zlösung pH 7 mit 3% Polyethylenglykol 6000, 1% (Gew./Vol.) Rinderserumalbumin und 0,02% Triton X305 (Warenzeichen - erhältlich bei Rohm und Haas) vor dem Auftragen auf das Blatt. Frische Urinproben werden dann auf den absorbierenden Docht eines Testgerätes aufgetragen, entweder direkt aus dem Urinstrahl oder durch Bereitstellung eines geeigneten Volumens (beispielsweise &Igr;&Ogr;&Ogr;&mgr;&Igr;) aus einem Behälter unter Verwendung einer Pipette. Man läßt jede Probe 5 min laufen, bevor ein Kissen aus flüssigkeitsquellfähigem Material, das mit BCIP Substrat (bei 1 mg/ml in IM Tris/HCl ph 9,8) vollgesogen, in Kontakt mit dem immobilen Antikörperbereich gebracht wird. Nach weiteren 5 min wird das Kissen entfernt und die erzeugte Farbe mit dem Auge oder unter Verwendung eines Lichtreflektometers abgelesen.

Eine ähnliche Ausführungsform kann unter Verwendung von luteinisierendes Hormon (LH) anstelle von hCG hergestellt werden.

5. Kompetitive Assays

Ein Assay vom kompetitiven Typ kann beispielsweise durch Östron-3-glukoronid, einem Urinmetabolit von Östron, durchgeführt werden. Konjugate aus Östron-3-glucoroniden und Rinderserumalbunrin werden wie folgt hergestellt:

Herstellung von BSA-Östron-3-glukoronid

Die Konjugation von E-3-G und BSA kann unter Verwendung eines gemischten Anhydrids erreicht werden. Alle Glasbehälter, Lösungsmittel ^unc* Reagenzien, die bei der Herstellung der aktivierten Spezies verwendet werden, müssen sorgfältig unter Verwendung eines Ofens, eines Exsikkators oder eines Molekularsiebes mindestens 24 h getrocknet werden.

Lösungen von E-3-G (2mM) in trocknem Dimethylformamid (DMF) und Tri-n-butylamin (TnB) (1OnM) in trockenem DMF wurden getrennt bei ^⁰C equilibriert. Unter Verwendung vor, vorgekühlten Glasbehältern wurden

E-3-G in DMF (1,25ml) und TnB in DMF (0,25ml) zu dem vorgekühlten 5ir.l Rt^:-.ti(tiiä^t.Ltiß, das einen Magnetrührer enthält, hinzugefügt. Eine Lösung von Isobutylchloroformat in trockenem DMF (1OnM) würde hergestellt und eine Teilmenge (0,25ml) wurde auf <*°C abgekühlt und dem Reaktionsgefäß hinzugefügt. Die Inhalte des Reaktionsgefäßes wurden 20 min bei ^⁰C gerührt und eine Lösung aus BSA (1 mg/ml) wurde in Dicarbonatpuffer (0,5%) zubereitet. Als die gemischte Anhydridinkubation vervollständigt war, wurden die Inhalte des Reaktionsgefäß der BSA-Lösung (2,5ml) hinzugefügt und mit einem Magnetrührer U h bei 4°C gerührt. Das Konjugatpräparat wurde durch überleiten über einen Tris-Puffer äquilibriert, Pharmacia PD-10 S^phadex G-25 Säule, in einen Braunglasaufbewahrungsbehälter übergeleitet und bei 4°C gelagert.

Herstellung des BSA-E-3-G Farbsols

Eine Dispersion von Farbstoff (5% w/v) in destilliertem Wasser wurde durch sorgfältiges Mischen hergestellt und Teilmengen wurden bei 3850 U/min (1500g) 10 min in einer Tischzentrifuge zentrifugiert. Das Pellet wurde weggeworfen und der Überstand wurde beibehalten und in Teilmengen mit 4850 U/min (3000g) 10 min in einer Tischzentrifuge zentrifugiert. Der überstand wurde abgegossen und das Pellet wurde erneut in der Hälfte des ursprünglichen Volumens in destilliertem Wasser suspendiert. Dieser Schritt wurde viermal wiederholt, um das Pellet zu waschen. Das Pellet wurde schließlich erneut in destilliertem Wasser suspendiert und die Absorption bei Lambda-Max wurde bestimmt.

Lösungen des Farbsols in destilliertem Wasser und E-3-G/BSA-Konjugat, aufgelöst in Phospiiaipuffer, wurden gemischt auf eine Endkonzentration von lOpg/ml Konjugat (auf der Grundlage des BSA-Gehalts) und auf eine extrapolierte optische Dichte des Farbsols von 20 beim Absorptionsmaximum. Die Reaktionsmischung wurde 10 min bei Raumtemperatur inkubiert und 15 min bei Raumtemperatur mit BSA in NaCl-Lösung (5mM, ph 7,k) blockiert, um schließlich eine End-BSA-Xonzentration «on 25mg/ml zu ergeben. Die Reaktionsmischung wurde bei 48>C w.-nin (3000g) 10 min in einer Tischzentrifuge zentrifugiert. Der Überstand wurde abgeschüttet und das Pellet erneut in der Hälfte des ursprünglichen Volumens in Dextran (0,25% Gew./Vol.)/Laktose (0,5%

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-35-Gew./Vol.) Phosphat (0,04M pH 5,8) Puffer suspendiert.

Herstellung der E-3-G-Teststreifen

Antikörper zu E-3-G wurden wie in Beispiel 3 beschrieben aufgetragen.

BSA-E-3-G-Farbsol wurde auf den Streifen wie in 3 beschrieben aufgetragen.

Bestimmung von E-3-G

Bei Verwendung der oben beschriebenen Reagenzien kann eine Standardkurve erzeugt werden, wob*_i die Streifen mit Proben beaufschlagt werden, die bekannte Konzentrationen von E-3-G enthalten. Die Farbe in dem immobilisierten Bereich kann abgelesen werden, beispielsweise unter Verwendung eines Minolta-Chromameters, und die Konzentration von E-3-G kann durch Extrapolation aus dem Reflexionswert berechnet werden.

Die oben beschriebene Erfindung erstreckt sich auf alle diese Modifikationen und Variationen die für den fachkundigen Leser offensichtlich sind, und erstreckt sich auch auf alle Kombinationen und Unterkombinationen der Merkmale dieser Beschreibung und der beigefügten Zeichnungen.

Claims

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UNILEVER N.V. München,

u.Z.: GM 600/29L-88E 27.04.88

SCHUTZANSPRÜCHE

1. Analytisches Testgerät, dadurch gekennzeichnet, daß es ein hohles Gehäuse (500) aus feuchtigkeitsundurchlässigem festen Material aufweist, das einen trockenen porösen Träger (510) enthält, der direkt oder indirekt mit der Außenseite des Gehäuses in Verbindung steht, so daß eine flüssige Testprobe auf den porösen Träger aufgebracht werden kann, welcher Träger in einem ersten Bereich ein markiertes spezifisches Bindup'sreagenz für eine Nachweissubstanz enthält, welches markierte spezifische Bind^ngsreagenz frei in dem Träger beweglich ist, wenn dieser sich im fec-chten Zustand befindet, und welcher Träger in einem zweiten, räumlich von dem ersten Bereich getrennten Bereich ein unmarkiertes spezifisches Bindungsreagenz für denselben Nachweisstoff enthält, welches unmarkierte Reagenz permanent immobilisiert auf dem Trägermaterial und folglich auch im feuchten Zustand unbeweglich ist, daß die beiden Bereiche so angeordnet sind, daß eine Flüssigprobe, die auf den porösen Träger aufgebracht worden ist, über den ersten Bereich in den zweiten Bereich gelangen kann und daß das Gerät Mittel enthält, die gegebenenfalls das Ausmaß, in welchem das markierte Reagenz in dem zweiten Bereich gebunden wird, beobachtbar machen.

2. Testgerät nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der Markierungsstoff an dem ersten spezifischen Bindungsreagenz ein Direktmarkierungsstoff ist.

3. Testgerät nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß das Gehäuse aus undurchsichtigem oder durchscheinendem Material besteht und mindestens mit einer Öffnung (508) versehen ist, durch die das analytische Ergebnis beobachtet werden kann.

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&Iacgr;. Testgerät nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch

gekennzeichnet, daß der poröse Träger (510) mit der Außenseite des Gerätes über ein saugfähiges Probenaufnahmeteil (506) in Verbindung steht, das über das Gehäuse hinaussteht und das als Reservoir für die Aufnahme von Flüssigproben dient und diese an den porösen Träger abgibt.

5. Testgerät nach Anspruch ^, dadurch gekennzeichnet, daß es einen abnehmbaren und wieder aufsetzbaren flüssigkeitsundurchlässigen Deckel

(503) für das vorstehende saugfähige Probenaufnahmeteil (506) <*<jifweist.

6. Testgerät nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß das Gehäuse und gegeuenenfalls der Deckel aus Kunststoff material gegossen ist.

7. Testgerät nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß der poröse Träger einen Streifen oder ein Blatt aus porösem Material (510) umfaßt, das mit einer Schicht (511) aus transparentem, flüssigkeitsundurchlässigem Material verstärkt ist, wobei die transparente Schicht in Kontakt mit der Innenseite des Gehäuses in der Nähe der Öffnung(en) steht, um das Eintreten von Feuchtigkeit oder Probe zu verhindern.

8. Testgerät nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß das poröse Trägermaterial Nitrozellulose ist.

9. Testgerät nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß die Nitrozellulose eine Porengröße größer als etwa 1 Mikron aufweist.

10. Testgerät nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß der Markierungsstoff gefärbte Latexpartikel mit einer maximalen Abmessung aufweist, die nicht größer als etwa 0,5 Mikron ist.

11. Testgerät nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß es einen Kontrollbereich stromabwärts von dem zweiten Bereich in dem porösen Träger aufweist, um anzuzeigen- daß

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über den zweiten Bereich hinaus gewandert ist, welcher Kontrollbereich ebenfalls von der Außenseite des Gehäuses beobachtbar ist.

ö 12. Testgerät nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch

gekennzeichnet, daß die Nachweissubstanz hCG ist.

13. Testgerät nach einem der Ansprüche 1 bis 11, dadurch gekennzeichnet, daß die Nachweissubstanz LH ist.

14. Testgerät in Form eines Streifens zur Verwendung in einem spezifischen Bindungsassay, dadurch gekennzeichnet, daß es eine Schicht (510) aus Nitrozellulose aufweist, die durch eine Schicht (511) aus festem wasserundurchlässigem Material verstärkt ist.

15. Testgerät nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, daß die Verstärkungsschicht transparentes Kunststoffmaterial enthält.

16. Testgerät, insbesondere zum Nachweis einer Schwangerschaft, dadurch gekennzeichnet, daß es ein hohles, längliches Gehäuse aufweist, das einen trockenen porösen Nitrozelluloseträger enthält, der indirekt mit der Außenseite des Gehäuses über ein saugfähiges Urinaufnahmeteil in Verbindung steht, das über das Gehäuse hinaussieht und als Reservoir für Urin dieni, der an den porösen Träger abgegeben wird, daß der Träger in einem ersten Bereich einen hochspezifischen Anti-hCG-Antikörper enthält, der eine gefärbte Direktmarkierung trägt, welcher markierte Antikörper frei beweglich in dem porösen Träger ist, wenn sich dieser im feuchten Zustand befindet, daß der Träger in einem zweiten, räumlich von dem ersten Bereich getrennten Bereich einen hochspezifischen unmarkierten Anti-hCG-Antikörper enthält, der permanent auf dem Trägermaterial immobilisiert ist und daher im feuchten Zustand nicht beweglich ist, daß der markierte und der unmarkierte Antikörper hohe Spezifitäten für unterschiedliche hCG-Epitope aufweisen, daß die beiden Bereiche so angeordnet sind, daß eine Urinprobe, die auf den porösen Träger gebracht worden ist, über den ersten Bereich in den zweiten

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Bereich wandern kann, daß das Gehäuse aus undurchsichtigem oder durchscheinendem Material bestr-ht und mindestens eine Öffnung aufweist, durch die das analytische Ergebnis beobachtet werden kann, und daß das Gehäuse einen entfernbaren und wieder aufsetzbaren Deckel für das vorstehende saiigfähige Urinaufnahmeteil aufweist.

17. Testgerät, insbesondere zum Nachweis der Ovulation wie in Anspruch 16 beansprucht, mit Ausnahme, daß die Nachweissubstanz LH

ist.
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