BR102013001324A2 - Dispositivo de ensaio tendo tamanho de amostra controlável e método para controlar o tamanho da amostra em um dispositivo de ensaio - Google Patents

Abstract

Dispositivo de ensaio tendo tamanho de amostra controlável e método para controlar o tamanho da amostra em um dispositivo de ensaio. A presente invenção refere-se a um dispositivo de ensaio que compreende uma zona de adição de amostra de líquido, uma zona de reagente, uma zona de detecção, e uma zona de absorção por efeito capilar, todas definindo uma trajetória de fluxo de fluido. O dispositivo compreende, ainda, uma zona de adição de reagente junto e em comunicação fluida com a trajetória de fluxo de fluido a jusante da zona de adição de amostra e a montante da zona de detecção. Uma lavagem de interrupção é adicionada nessa zona de adição de reagente de acordo com o método da invenção objeto para ontrolar o volume da amostra. O fluido de lavagem de interrupção é adicionado em um volume de enchimento predeterminado no dispositivo circuito integrado e também serve para lavar o canal de detecção e preencher o volume de circuito integrado remanescente

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "DISPOSITIVO DE ENSAIO TENDO TAMANHO DE AMOSTRA CONTROLÁVEL E MÉTODO PARA CONTROLAR O TAMANHO DA AMOSTRA EM UM DISPOSITIVO DE ENSAIO".

REFERÊNCIA REMISSIVA A PEDIDOS DE DEPÓSITO CORRELATOS O presente pedido de patente reivindica a prioridade sob o pedido provisório US n° 61/588.899, depositado em 20 de janeiro de 2012, cuja descrição está aqui incorporada por referência, em sua totalidade.

CAMPO DA INVENÇÃO

A presente invenção refere-se ao campo de ensaios diagnósticos e, em particular, aos ensaios de fluxo lateral, onde um analito a ser detectado está presente em uma amostra biológica ou não biológica. ANTECEDENTES

Os ensaios diagnósticos são amplamente distribuídos e importantes para o diagnóstico, tratamento e controle de muitas doenças. Diferentes tipos de ensaios diagnósticos foram desenvolvidos ao longo dos anos de modo a simplificar a detecção de vários analitos em amostras clínicas como sangue, soro, plasma, urina, saliva, biópsias de tecido, fezes, escarro, pele ou esfregaços de garganta e amostras de tecido ou amostras de tecido processadas. Espera-se que estes ensaios forneçam um resultado rápido e confiável, mas é fácil de usar e de fabricação barata. De forma compreensível, é difícil satisfazer todos estes requisitos em apenas um ensaio. Na prática, muitos ensaios são limitados por sua velocidade. Outro parâmetro importante é a sensibilidade. Desenvolvimentos recentes na tecnologia dos ensaios levaram a testes progressivamente mais sensíveis que permitem a detecção de um analito em quantidades traço, assim como a detecção de indicadores de doença em uma amostra no menor tempo possível.

Um tipo comum de dispositivo de ensaio descartável inclui uma zona ou área para receber a amostra de líquido, uma zona conjugada, também, conhecida como uma zona de reagente, e uma zona de reação também conhecida como uma zona de detecção Estes dispositivos de ensaio são comumente conhecidos como tiras de teste de fluxo lateral. Elas empre- gam um material poroso, por exemplo, nitrocelulose, definindo uma trajetória para o fluxo de fluidos capaz de suportar o fluxo capilar. Exemplos incluem aqueles mostrados nas patentes US n°s 5.559.041, 5.714.389, 5.120.643, e 6.228.660 que estão aqui incorporadas a título de referência nas suas totali-dades. A zona de adição da amostra consiste frequentemente em um material mais poroso, capaz de absorver a amostra, e, quando se deseja separar as células do sangue, também é eficaz para aprisionar os eritrócitos. Exemplos destes materiais são materiais fibrosos, como papel, velocino (fle-ece), gel ou tecido, compreendendo, por exemplo, celulose, lã, fibra de vidro, asbesto, fibras sintéticas, polímeros, ou misturas dos mesmos.

Outro tipo de dispositivo de ensaio é um dispositivo de ensaio não poroso que tem projeções para induzir o fluxo capilar. Exemplos destes dispositivos de ensaio incluem o dispositivo de fluxo lateral aberto, como a-presentado nas publicações internacionais PCT n°s WO 2003/103835, WO 2005/089082, WO 2005/118139, e WO 2006/137785, que estão aqui incorporadas a título de referência nas suas totalidades.

Um dispositivo de ensaio não poroso conhecido é mostrado na Figura 1. O dispositivo de ensaio 1 tem pelo menos uma zona de adição de amostra 2, uma zona de reagente 3, pelo menos uma zona de detecção 4, e pelo menos uma zona de absorção por efeito capilar 5. As zonas formam uma trajetória de fluxo pela qual a amostra fluí da zona de adição de amostra até a zona de absorção por efeito capilar. Também são incluídos elementos de captura, como anticorpos, na zona de detecção 4, capazes de se ligar ao analito, opcionalmente, depositado sobre o dispositivo (tal como por revestimento); e um material conjugado marcado, também, capaz de participar nas reações que irão permitir a determinação da concentração do analito, depositado sobre o dispositivo na zona de reagente, sendo que o material conjugado marcado carrega um marcador para detecção na zona de detecção. O material conjugado é dissolvido conforme a amostra flui através da zona de reagente formando uma pluma de conjugado de material conjugado marcado dissolvido e amostra que flui à jusante para a zona de detecção. Conforme a pluma de conjugado flui para a zona de detecção, o material conjugado será capturado pelos elementos de captura, tal como através de um complexo de material conjugado e analito (como em um ensaio "sanduíche") ou diretamente (como em um ensaio "competitivo"). O material conjugado dissolvido não ligado será arrastado após a zona de detecção para dentro da pelo menos uma zona de absorção por efeito capilar 5. Também são mostradas na Figura 1 projeções ou micropilares 7.

Um instrumento como aquele apresentado nas publicações de patente US n°s US20060289787A1 e US 20070231883A1 e patentes US n°s US 7.416.700 e US 6.139.800, todas incorporadas por referência nas suas totalidades, é capaz de detectar o material conjugado ligado na zona de reação. Os marcadores comuns incluem corantes fluorescentes que podem ser detectados por instrumentos que excitam os corantes fluorescentes e incorporam um detector capaz de detectar os corantes fluorescentes. O tamanho da amostra para tais dispositivos de ensaio típicos, conforme mostrado na Figura 1, são geralmente da ordem de 200 pl. Tal tamanho de amostra exige uma coleta de sangue venoso feita por um profissional médico, tal como um flebotomista. Há uma necessidade crescente por dispositivos de fluxo lateral que sejam capazes de funcionar com um tamanho de amostra muito menor para acomodar a quantidade de sangue disponível a partir de uma coleta de sangue da "ponta do dedo", que é da ordem de 25 pl ou menos. Tal pequena quantidade de amostra é a quantidade de sangue em uma gota de sangue após uma picada da ponta do dedo com uma lanceta. Os medidores de glicose sanguínea caseiros usam tipicamente uma gota de sangue obtida de tal forma para fornecer os níveis de glicose no sangue. Este tamanho de amostra menor não exigiría um profissional médico para coletar o sangue e fornecería mais conforto aos pacientes que fornecem a amostra para análise.

Para reduzir o tamanho de amostra necessário, as dimensões dos dispositivos de ensaio de fluxo lateral são reduzidos para acomodar o menor tamanho de amostra. Entretanto, descobriu-se que a redução do tamanho de amostra e das dimensões do dispositivo fornece conjugado ina- dequado na zona de detecção e, consequentemente, menos sinal pode ser lido pelo instrumento (em alguns casos um sinal até 5x inferior) e baixa sensibilidade. Acredita-se que o conjugado inadequado na zona de detecção seja devido ao tamanho reduzido da amostra e ao uso ineficiente da amostra no dispositivo, dentre outras condições. Outra desvantagem da redução das dimensões é que a largura da zona de detecção também será reduzida, novamente disponibilizando menos sinal do que pode ser lido pelo instrumento. Além disso, descobriu-se que um dispositivo menor tem tempo de fluxo e tempo de contato com o material conjugado reduzido, resultando em menos ligação entre o analito na amostra e o material conjugado.

Ainda há uma necessidade por dispositivos de ensaio com menor volume de amostra que possam acomodar tamanhos de amostra cada vez menores, possam acomodar várias amostras (tal como sangue total), e possam fornecer resultados com a sensibilidade e especificidade necessárias. SUMÁRIO DA INVENÇÃO A presente invenção refere-se a tal dispositivo de ensaio. Uma vantagem do dispositivo de amostra menor de acordo com a presente invenção é a capacidade de controlar o volume da amostra usando uma "lavagem de interrupção". No seu conceito mais amplo, a lavagem de interrupção pode ser qualquer fluido. Os fluidos incluem fluidos reagentes (fluidos contendo um reagente) com um fluido de interrupção preferencial sendo um fluido de lavagem. Um fluido de lavagem de interrupção é adicionado em um volume de enchimento predeterminado no dispositivo circuito integrado que controla o volume da amostra e também serve para lavar o canal de detecção e preencher o volume de circuito integrado remanescente.

Consequentemente, um aspecto da invenção se refere a dispositivo de ensaio que compreende: uma zona de adição de amostra de líquido; uma zona de reagente a jusante e em comunicação fluida com a zona de adição de amostra que contém um material reagente; uma zona de detecção em comunicação fluida com a zona de reagente tendo elementos de captura ligados a ela; e uma zona de absorção por efeito capilar em comunicação fluida com a zona de detecção tendo uma capacidade para receber a amos tra de líquido que flui a partir da zona de detecção. No dispositivo, a zona de adição de amostra, a zona de reagente, a zona de detecção e a zona de absorção por efeito capilar definem uma trajetória de fluxo de fluido. O dispositivo compreende, ainda, uma zona de adição de reagente junto e em comunicação fluida com a trajetória de fluxo de fluido a jusante da zona de adição de amostra e a montante da zona de detecção. A "lavagem de interrupção" é adicionada nessa zona de adição de reagente (uma zona de adição de fluidos no seu conceito mais amplo) de acordo com o método da presente invenção.

Um outro aspecto da invenção é, desta forma, direcionado a um método para controle do tamanho da amostra em um dispositivo de ensaio. O método compreende: fornecer uma zona de adição de amostra de líquido; fornecer uma zona de reagente a jusante e em comunicação fluida com a zona de adição de amostra contendo um material reagente; fornecer uma zona de detecção em comunicação fluida com a zona de reagente; e fornecer uma zona de absorção por efeito capilar em comunicação fluida com a zona de detecção que tem uma capacidade para receber amostra de líquido que flui a partir da zona de detecção. A zona de adição de amostra, a zona de reagente, a zona de detecção e a zona de absorção por efeito capilar definem uma trajetória de fluxo de fluido. O método inclui, ainda, fornecer uma zona de adição de reagente junto e em comunicação fluida com a trajetória de fluxo de fluido a jusante da zona de adição de amostra e a montante da zona de detecção. O método compreende, adicionalmente, adicionar a a-mostra à zona de adição de amostra, sendo que a amostra se move através da trajetória de fluxo de fluido; e adicionar um reagente à zona de adição de reagente, sendo que o reagente interrompe o fluxo da amostra através da trajetória de fluxo de fluido, desse modo controlando o tamanho da amostra na trajetória de fluxo de fluido. De preferência, reagente adicionado é um fluido de lavagem.

Ainda outro aspecto da invenção é direcionado a um método para fazer um ensaio em uma amostra de líquido para a detecção de um ou mais analitos de interesse. O método compreende; fornecer uma zona de adição de amostra de líquido; fornecer uma zona de reagente a jusante e em comunicação fluida com a zona de adição de amostra contendo um material reagente; fornecer uma zona de detecção em comunicação fluida com a zona de reagente; fornecer uma zona de absorção por efeito capilar em comunicação fluida com a zona de detecção tendo uma capacidade para receber a amostra fluida fluindo a partir da zona de detecção, em que a zona de adição de amostra, a zona de reagente, a zona de detecção e a zona de absorção por efeito capilar definem uma trajetória de fluxo de fluido; e fornecer ainda uma zona de adição de reagente junto e em comunicação fluida com a trajetória de fluxo de fluido a jusante da zona de adição de amostra e a montante da zona de detecção. O método compreende, adicionalmente, adicionar uma amostra de líquido contendo o analito de interesse na zona de adição de amostra; mover a amostra por ação capilar para dentro da zona de reagente, sendo que a mostra dissolve o material reagente; descarregar a amostra da zona de reagente com o material reagente dissolvido dentro da zona de detecção para dentro da zona de detecção, por ação capilar, em que o analito de interesse é detectado na zona de detecção por leitura de um sinal que é gerado; e fazer fluir a amostra e qualquer material não ligado para dentro da zona de absorção por efeito capilar. O método compreende, ainda, a adição de um reagente na zona de adição de reagente, sendo que o reagente interrompe o fluxo da amostra através da trajetória de fluxo de fluido, desse modo controlando o tamanho da amostra na trajetória de fluxo de fluido. De preferência, reagente adicionado é um fluido de lavagem.

Outros objetivos, recursos e vantagens da presente invenção ficarão evidentes aos versados na técnica, a partir da consideração detalhada das modalidades preferenciais que são apresentadas a seguir.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS A Figura 1 mostra um dispositivo de ensaio conhecido. A Figura 2 mostra uma vista esquemática de um dispositivo de ensaio de acordo com uma modalidade da presente invenção. A Figura 3 mostra uma vista esquemática de um dispositivo de ensaio de acordo com outra modalidade da presente invenção. A Figura 4 mostra uma vista explodida da construção em camadas de uma embalagem do dispositivo de ensaio de acordo com a presente invenção. A Figura 5 mostra os tempos de fluxo médios para sangue total no dispositivo de ensaio de acordo com uma modalidade da presente invenção, com vários tensoativos depositados na zona de adição de amostras. A Figura 6 mostra uma comparação de curvas de resposta à dosagem de carbamazepína usando sangue total com protocolo de lavagem de interrupção para resultados obtidos com plasma. A Figura 7 mostra uma comparação de curvas de resposta à dosagem de fenobarbital usando sangue total com protocolo de lavagem de interrupção para resultados obtidos com plasma. A Figura 8 mostra os tempos de fluxo médios para sangue total com uma lavagem subsequente no dispositivo de ensaio de acordo com uma modalidade da presente invenção, com vários níveis de NTproBNP. A Figura 9 mostra a área de pico média da resposta fluorescente em função da concentração de NTproBNP para cada amostra de teste, assim como a curva de resposta à dosagem obtida para amostras de sangue total em comparação a amostras de soro com concentração de NTproBNP similar, com uma lavagem subsequente em um dispositivo de ensaio de a-cordo com uma modalidade da presente invenção.

As Figuras 10 e 11 mostram a sensibilidade de diferentes de-signs de dispositivo de ensaio com NTproBNP como o analito. A Figura 12 é um gráfico da concentração de pró-catcítonina em função da área de pico média usando uma amostra de sangue total e uma lavagem.

A Figura 13 é um gráfico da concentração de pró-calcitonina em função da área de pico média usando uma amostra de sangue total. DESCRIÇÃO DETALHADA DAS MODALIDADES PREFERENCIAIS

Conforme usado neste relatório descritivo e nas reivindicações em anexo, as formas no singular "o", "a”, "um", "uma" incluem referências no plural a menos que o contexto claramente determinar de outro modo. O termo "cerca de" para uso com relação a um valor numérico ao longo da descrição e das reivindicação denota um intervalo de precisão, familiar e aceitável para um versado na técnica. O intervalo é, de preferência, ±10 %. O termo "amostra" na presente invenção significa um volume de um líquido, solução ou suspensão, destinado a ser submetido à determinação qualitativa ou quantitativa de qualquer uma de suas propriedades, tal como a presença ou ausência de um componente, a concentração de um componente, etc. As amostras típicas no contexto da presente invenção são fluidos corporais humanos ou animais, como sangue, plasma, soro, linfa, urina, saliva, sêmen, fluido amniótico, fluido gástrico, flegma, escarro, muco, lágrimas, fezes, etc. Outros tipos de amostras são derivadas de amostras de tecido humano ou animal onde a amostra de tecido foi processada em um líquido, solução, ou suspensão para revelar componentes particulares do tecido para exame. As modalidades da presente invenção são aplicáveis a todas as amostras corporais, mas de preferência a amostras de sangue total, urina ou escarro.

Em outros casos, a amostra pode ser relacionada a testes de a-limentos, testes ambientais, testes de ameaças biológicas ou risco biológico, etc. Este é apenas um pequeno exemplo de amostras que podem ser usadas na presente invenção.

Na presente invenção, a determinação com base no fluxo lateral de uma amostra e a interação dos componentes presentes na amostra com reagentes presentes no dispositivo ou adicionados ao dispositivo durante o procedimento e a detecção de tal interação, qualitativamente ou quantitativamente, podem ser para qualquer propósito, como fins de diagnóstico. Tais testes são frequentemente chamados de ensaios de fluxo lateral.

Exemplos de determinações diagnosticas incluem, mas não se limitam à determinação de analitos, também chamados de marcadores, específicos para diferentes distúrbios, por exemplo, transtornos metabólicos crônicos, como glicose sanguínea, cetonas no sangue, glicose na urina (diabetes), colesterol sanguíneo (aterosclerose, obesidade, etc); marcadores de outras doenças específicas, por exemplo, doenças agudas, como marcadores de infarto coronariano (por exemplo, troponina-T, NT-ProBNP), marcadores da função da tireoide (por exemplo, determinação do hormônio estimulante da tireoide (TSH)), marcadores de infecções virais (o uso de imunoen-saios de fluxo lateral para a detecção de anticorpos virais específicos); etc.

Ainda outro campo importante é o campo de diagnósticos de a-companhamento onde um agente terapêutico, tal como um fármaco, é administrado a um indivíduo precisando de tal fármaco. Um ensaio adequado é então conduzido para determinar o nível de um marcador adequado para determinar se o fármaco está tendo seu efeito desejado. Alternativamente, o dispositivo de ensaio da presente invenção pode ser usado antes da administração de um agente terapêutico para determinar se o agente irá ajudar o indivíduo em necessidade.

Ainda outro campo importante é o de testes de drogas, para a detecção fácil e rápida de drogas e metabólitos de drogas que indicam abuso de drogas; como a determinação de drogas e metabólitos de drogas (por exemplo, THC) em amostras de urina etc. O termo "analito" é usado como um sinônimo do termo "marcador" e se destina a abranger qualquer substância química ou biológica que é medida quantitativamente ou qualitativamente e pode incluir pequenas moléculas, proteínas, anticorpos, DNA, RNA, ácidos nucleicos, componentes virais ou vírus intactos, componentes de bactérias ou bactérias intactas, componentes celulares ou células intactas e complexos e derivados dessas substâncias.

Os termos "zona", "área" e "sítio” são usados no contexto de desta descrição, exemplos e reivindicações para definir partes da trajetória do fluxo de fluidos em um substrato, em dispositivos da técnica anterior ou em um dispositivo de acordo com uma modalidade da invenção. O termo "reação" é usado para definir qualquer reação que ocorre entre os componentes de uma amostra e pelo menos um reagente ou re-agentes sobre ou no substrato, ou entre dois ou mais componentes presentes na amostra. O termo "reação" é usado, em particular, para definir a rea- ção que ocorre entre um analito e um reagente como parte da determinação qualitativa ou quantitativa do analito. O termo "substrato" significa o veículo ou matriz à qual uma a-mostra é adicionada, e sobre ou na qual a determinação é feita, ou onde a reação entre o analito e o reagente ocorre. A presente invenção se refere a um dispositivo de ensaio de fluxo lateral para determinar a presença ou a quantidade de ao menos um analito. As Figuras 2 e 3 mostram vistas esquemáticas de modalidades preferenciais de tais dispositivos de acordo com a invenção. O dispositivo de ensaio 10, tem pelo menos uma zona de adição de amostra 20, uma zona de reagente 30, pelo menos uma zona de detecção 40, e pelo menos uma zona de absorção por efeito capilar 50. As zonas formam uma trajetória de fluxo pela qual a amostra flui da zona de adição de amostra até a zona de absorção por efeito capilar. O dispositivo de ensaio inclui também pelo menos uma zona de adição de reagentes 35 localizada, de preferência, entre a zona de reagente e a zona de detecção.

Os componentes do dispositivo de ensaio (isto é, uma estrutura física do dispositivo, seja ela uma peça separada de outras partes do dispositivo ou não) podem ser preparados a partir de copolímeros, blendas, laminado, folhas metalizadas, filmes metalizados ou metais. Alternativamente, os componentes do dispositivo podem ser preparados a partir de copolímeros, blendas, laminados, folhas metalizadas, filmes metalizados ou metais depositados sobre um dos seguintes materiais: polioiefinas, poliésteres, polímeros contendo estireno, policarbonato, polímeros acrílicos, polímeros contendo cloro, homopolímeros e copolímeros de acetal, celulósicos e seus éste-res, nitrato de celulose, polímeros contendo flúor, poliamidas, poli-imidas, polimetiimetacrilatos, polímeros contendo enxofre, poliuretanos, polímeros contendo silício, vidro, e materiais cerâmicos. Alternativamente, os componentes do dispositivo são produzidos com um plástico, elastômero, látex, pastilha de silício, ou metal; o elastômero pode compreender polietileno, po-lipropileno, poliestireno, poliacrilatos, elastômeros de silício, ou látex. Alternativamente, os componentes do dispositivo podem ser preparados a partir de látex, poliestireno látex ou polímeros hidrofóbicos; o polímero hidrofóbico pode compreender polipropileno, polietileno, ou poliéster. Alternativamente, os componentes do dispositivo podem compreender TEFLON®, poliestireno, poliacrilato, ou policarbonato. Alternativamente, os componentes do dispositivo são produzidos a partir de plásticos que são capazes de serem gofra-dos, triturados ou moldados por injeção ou a partir de superfícies de filmes de cobre, prata e ouro sobre os quais vários alcanotiois de cadeia longa podem ser adsorvidos. As estruturas de plástico que são capazes de serem trituradas ou moldadas por injeção podem compreender um poliestireno, um policarbonato, ou um poliacrilato. Em uma modalidade particularmente preferencial, o dispositivo de ensaio é moldado por injeção a partir de um polímero de ciclo olefina, como os vendidos sob o nome Zeonor®. As técnicas de modelagem por injeção preferenciais são descritas nas patentes U.S. N° 6.372.542, 6.733.682, 6.811.736, 6.884.370, e 6.733.682, todas as quais estão aqui incorporadas a título de referência nas suas totalidades. A trajetória de fluxo pode incluir trajetórias abertas ou fechadas, sulcos, e capilares. De preferência, a trajetória de fluxo compreende uma trajetória de fluxo lateral de projeções adjacentes, que têm um tamanho, formato e espaçamento mútuo para que o fluxo capilar seja suportado através da trajetória de fluxo. Em uma modalidade, a trajetória de fluxo é em um canal dentro do substrato que tem uma superfície de fundo e paredes laterais. Nesta modalidade, as projeções se projetam da superfície de fundo do canal. As paredes laterais podem contribuir ou não para a ação capilar do líquido. Se as paredes laterais não contribuírem para a ação capilar do líquido, então, um vão pode ser fornecido entre as projeções mais externas e as paredes laterais para manter o líquido contido na trajetória de fluxo definida pelas projeções. A Figura 1 mostra as projeções 7.

Em uma modalidade, a trajetória de fluxo é ao menos parcialmente aberta. Em outra modalidade, a trajetória de fluxo é completamente aberta. Aberto significa que não há tampa ou cobertura em uma distância capilar. Desta forma, a tampa, se estiver presente como uma proteção física da trajetória de fluxo, não contribui para o fluxo capilar na trajetória de fluxo.

Uma trajetória de fluxo lateral aberta é descrita, por exemplo, nas seguintes publicações internacionais PCT N°s WO 2003/103835, WO 2005/089082; WO 2005/118139; WO 2006/137785; e WO 2007/149042, que estão aqui incorporadas a título de referência nas suas totalidades. As projeções têm uma altura (H), um diâmetro (D) e uma distância ou distâncias entre as projeções (t1, t2) para que o fluxo capilar lateral do fluido, como plasma, de preferência, plasma humano, na zona seja obtido. Estas dimensões são mostradas na publicação de patente U.S. n° 2006/0285996, que está aqui integralmente incorporada, por referência. Além de otimizar a altura acima mencionada, o diâmetro e uma distância ou distâncias entre as projeções, as projeções podem ter uma funcionalidade química, biológica ou física desejada, por exemplo, pela modificação da superfície das projeções. Em uma modalidade, as projeções têm uma altura no intervalo de cerca de 15 a cerca de 150 pm, de preferência, cerca de 30 a cerca de 100 pm, um diâmetro de cerca de 10 a cerca de 160 pm, de preferência, cerca de 40 a cerca de 100 pm, e um vão ou vãos entre as projeções de cerca de 3 a cerca de 200 pm, de preferência, cerca de 5 a cerca de 50 pm ou cerca de 10 a cerca de 50 pm uns dos outros. O canal de fluxo pode ter um comprimento de cerca de 5 a cerca de 500 mm, de preferência, cerca de 10 a cerca de 100 mm, e uma largura de cerca de 0,3 a cerca de 10 mm, de preferência, cerca de 0,3 a cerca de 3 mm, de preferência, cerca de 0,5 a cerca de 1,5 mm, e de preferência, cerca de 0,5 a cerca de 1,2 mm.

Embora a maior parte da detecção ocorra na porção da zona de detecção da trajetória do fluxo de fluidos, também é possível que a detecção possa ocorrer em outras partes do dispositivo. Por exemplo, medições de integridade da amostra não invasívas e não reativas podem ocorrer entre a zona de amostragem e a zona de reagente ou a zona de adição de reagen-te, de preferência, após um elemento de filtro, se estiver presente. Outras medições podem incluir leituras em branco, uma sequência de reação de uma parte ou de duas partes para medir hemoglobina e hemoglobina glicada para a determinação de HbA1c, etc. A zona de amostragem de líquido, também chamada de zona de adição de amostra de líquido, recebe uma amostra a partir de um dispensa-dor de amostras, como uma pipeta. A amostra é tipicamente depositada sobre o topo da zona. A zona de adição de amostras é capaz de transportar a amostra de líquido do ponto onde a amostra é depositada até a zona de rea-gente, através de um filtro opcional e da zona de adição de reagente, de preferência, através de fluxo capilar. A estrutura que induz o fluxo capilar pode incluir materiais porosos, como nitrocelulose, ou de preferência, através de projeções, como micropilares, conforme mostrado na Figura 1. Nestes dispositivos que podem usar volumes de sangue obtidos a partir de picadas no dedo, a amostra pode ser tocada diretamente a partir do dedo, ou por uma pipeta capilar conforme descrito no pedido co-pendente intitulado "Control-ling Fluid Flow Through An Assay Device” (pedido provisório US n° 61/588.772, depositado em 20 de janeiro de 2012, n° da súmula do procurador CDS5112USPSP, primeiro inventor mencionado: James Kanaley), aqui incorporado na íntegra, a título de referência.

Um material filtrante (Figura 4) pode ser colocado na zona de a-dição de amostras para filtrar particulados da amostra ou para filtrar eritróci-tos para que o plasma possa se deslocar mais através do dispositivo.

Localizada entre a zona de adição de amostras e a zona de detecção está uma zona de reagente. A zona de reagente pode incluir reagen-te(s) integrado(s) no elemento analítico e são geralmente reagentes úteis na reação (parceiros de ligação como anticorpos ou antígenos para imunoen-saios, substratos para ensaios enzimáticos, sondas para ensaios diagnósticos moleculares), ou são materiais auxiliares como materiais que estabilizam os reagentes integrados, materiais que suprimem reações de interferência, etc. Geralmente um dos reagentes úteis na reação carrega um sinal detectá-vel, conforme discutido abaixo. Em alguns casos, os reagentes podem reagir com o analito diretamente ou através de uma cascata de reações para formar um sinal detectável como, por exemplo, mas sem restrição, uma molécula detectável que usa espectroscopia, como uma molécula colorida ou fluorescente. A quantidade de reagente na zona de reagente pode ser ajustada pelo comprimento do reagente depositado no dispositivo, mas mantendo a mesma largura do reagente. A quantidade de reagente também pode ser ajustada por mudar a largura, porém mantendo o comprimento. A quantidade de reagente pode ser adicionalmente ajustada pela alteração da largura e do comprimento simultaneamente. Em uma modalidade preferencial, a zona de reagente inclui material conjugado. O termo conjugado significa qualquer porção que carrega um elemento de detecção e um parceiro de ligação. O elemento de detecção é um agente que é detectável com relação a sua distribuição física ou/e a intensidade do sinal que ele libera, por exemplo, mas não se limitando a moléculas luminescentes (por exemplo, agentes fluorescentes, agentes fosforescentes, agentes quimioluminescen-tes, agentes bioluminescentes e similares), moléculas coloridas, moléculas que produzem cores mediante reação, enzimas, radioisótopos, ligantes que exibem ligação específica e similares. O elemento de detecção também chamado de marcador é escolhido, de preferência, a partir de cromóforos, fluoróforos, marcações radioativas, e enzimas. Os marcadores adequados estão disponíveis junto a fornecedores comerciais, fornecendo uma ampla gama de corantes para a marcação de anticorpos, proteínas, e ácidos nucle-icos. Há, por exemplo, fluoróforos ocupando praticamente todo o espectro visível e infravermelho. Os marcadores fluorescentes ou fosforescentes adequados incluem, por exemplo, mas não se limitam a, fluoresceínas, Cy3, Cy5 e similares. Os marcadores quimioluminescentes adequados são, por exemplo, mas não se limitam a, luminol, cialume e similares.

De maneira similar, marcações radioativas estão disponíveis para comercialização, ou elementos de detecção podem ser sintetizados de modo a incorporar um marcador radioativo. As marcações radioativas adequadas são, por exemplo, mas não se limitam a iodo radioativo e fósforo; por exemplo, 125l e 32P.

Os marcadores enzimáticos adequados são, por exemplo, mas não se limitam a peroxidase de raiz-forte, beta-galactosidase, luciferase, fos-fatase alcalina e similares.

Dois marcadores são "distinguíveis" quando eles podem ser detectados individualmente e quantificados, de preferência, simultaneamente, sem perturbar, interferir ou arrefecer significativamente um ao outro. Dois ou mais marcadores podem ser usados, por exemplo, quando múltiplos analitos ou marcadores estão sendo detectados. O parceiro de ligação é um material que pode formar um complexo que pode ser usado para determinar a presença ou a quantidade de um analito. Por exemplo, em um ensaio ''sanduíche", o parceiro de ligação no conjugado pode formar um complexo que inclui o analito e o conjugado e este complexo pode se ligar adicionalmente a outro parceiro de ligação, também chamado de um elemento de captura, integrado na zona de detecção. Em um imunoensaio competitivo, o analito irá interferir com a ligação do parceiro de ligação no conjugado a outro parceiro de ligação, também chamado de elemento de captura, integrado na zona de detecção. Exemplos de parceiros de ligação incluídos nos conjugados incluem anticorpos, antíge-nos, analitos ou miméticos de analito, proteína, etc.

Localizada na trajetória de fluxo de fluidos, antes ou após a zona de reagente e antes da zona de detecção está uma zona de adição de rea-gentes. A zona de adição de reagentes 35 é mostrada na Figura 3. No seu conceito mais amplo, a zona de adição de reagentes é uma zona de adição de fluidos. Tal fluido podería ser um fluido reagente e, de preferência, é um fluido de lavagem. A zona de adição de reagentes pode permitir a adição de um reagente externamente ao dispositivo. Mais particularmente, a zona de adição de reagentes é usada para adicionar um reagente de interrupção que pode ser usado para lavar a amostra e outros componentes não ligados presentes na trajetória de fluxo de fluidos dentro da zona de absorção por efeito capilar. Em uma modalidade preferencial, a zona de adição de reagentes 35 está situada após a zona de reagente 30 (vide Figura 3). A pluma de reagente da zona de reagente deve ser a mais ampla possível para cobrir o máximo possível da largura da zona de detecção. Um método para aumentar a largura da pluma de reagente é descrito no pedido copendente intitulado "Assay Device Having Multiple Reagent Cells" (pedido provisório US n° 61/588.738, depositado em 20 de janeiro de 2012, n° da súmula do procurador CDS5104USPSP, primeiro inventor menciona- do: Zhong Ding) que está aqui integralmente incorporado, por referência. Em resumo, múltiplas áreas que têm material reagente (deste ponto em diante no presente documento chamadas de "células de reagente") em uma zona de reagente junto com elementos para recombinar múltiplas correntes de fluxo que são causadas pelas múltiplas células de reagente dentro de uma corrente de fluxo resulta em uma pluma de reagente mais desejavelmente misturada e mais larga, quando ela sai da zona de reagente e entra na zona de detecção. A jusante da zona de amostragem de líquido e da zona de reagente está a zona de detecção que está em comunicação fluida com a zona de adição de amostras. A zona de detecção pode incluir projeções como aquelas descritas acima. Conforme também observado acima, estas projeções são, de preferência, moldadas integralmente no substrato a partir de um material plástico óptico como Zeonor, tal como modelagem por injeção ou gofragem. A largura do canal de fluxo na zona de detecção é tipicamente da ordem de 2 mm para dispositivos de tamanho convencional, entretanto, alguns dispositivos de volume menor, como aqueles descritos acima e no pedido co-pendente intitulado "Lower Volume Assay Device Having Increa-sed Sensitivity" (pedido provisório US n° 61/588.758, depositado em 20 de janeiro de 2012, n° da Súmula do Procurador CDS5111USPSP, primeiro inventor mencionado: Phil Hosimer) aqui incorporado na íntegra, a título de referência, são significativamente mais estreitos, por exemplo, 1,5 mm ou menos. A zona de detecção é onde qualquer sinal detectável é lido. Em uma modalidade preferencial, elementos de captura estão fixados às projeções na zona de detecção. Os elementos de captura podem incluir parceiros de ligação para o conjugado ou complexos contendo o conjugado, conforme descrito acima. Por exemplo, se o analito for uma proteína específica, o conjugado pode ser um anticorpo que irá se ligar especificamente àquela proteína acoplada a um elemento de detecção como uma sonda de fluorescência. O elemento de captura podería ser então outro anticorpo que também se liga especificamente àquela proteína. Em outro exemplo, se o marcador ou anali- to for DNA, a molécula de captura pode ser, mas não se limita a oligonucleo-tídeos sintéticos, análogos dos mesmos, ou anticorpos específicos. Outros elementos de captura adequados incluem anticorpos, fragmentos de anticorpo, aptâmeros, e sequências de ácidos nucleicos, específicas para o analito a ser detectado. Um exemplo não limitador de um elemento de captura adequado é uma molécula que carrega funcionalidade por avidina que se ligaria a um conjugado contendo uma funcionalidade de bíotina. A zona de detecção pode incluir múltiplas zonas de detecção. As múltiplas zonas de detecção podem ser usadas para ensaios que incluem um ou mais marcadores. No caso de múltiplas zonas de detecção, os elementos de captura podem incluir múltiplos elementos de captura, tal como o primeiro e o segundo elementos de captura. O conjugado pode ser pré-depositado sobre o dispositivo de ensaio, tal como por revestimento na zona de reagente. De maneira similar, os elementos de captura podem ser pré-depositados no dispositivo de ensaio sobre a zona de detecção. De preferência, tanto os elementos de detecção quanto os de captura são pré-depositados no dispositivo de ensaio, na zona de reagente e na zona de detecção, respectivamente.

Após a amostra ter sido aplicada à zona de amostragem, ela encontrará a zona de reagente. Após a amostra ter fluido através de e interagido com a zona de reagente e, opcionalmente, a zona de adição de reagen-tes, a amostra e uma pluma de reagente estará contida no fluxo de fluidos. A pluma de reagente pode conter qualquer um dos materiais reagentes que foram dissolvidos na zona de reação ou os adicionados através da zona de adição de reagentes. A pluma de reagente pode incluir o conjugado que tem o elemento de detecção e o parceiro de ligação, e neste caso ela é frequentemente chamada de pluma de conjugado. A jusante da zona de detecção está uma zona de absorção por efeito capilar em comunicação fluida com a zona de detecção. A zona de absorção por efeito capilar é uma área do dispositivo de ensaio com a capacidade de receber amostra de líquido e qualquer outro material na trajetória de fluxo, por exemplo, reagentes não ligados, fluidos de lavagem, etc. A zo- na de absorção por efeito capilar fornece uma força capilar para continuar a mover a amostra de líquido através e para fora da zona de detecção. A zona de absorção por efeito capilar pode incluir um material poroso como nitroce-lulose ou pode ser uma estrutura não porosa como as projeções aqui descritas. A zona de absorção por efeito capilar também pode incluir instrumentos de direcionamento de fluido não capilares, como aqueles que usam aquecimento de evaporação ou uma bomba. Detalhes adicionais sobre zonas de absorção por efeito capilar, para uso nos dispositivos de ensaio, de acordo com a presente invenção, podem ser encontrados nas publicações de patente US 2005/0042766 e US 2006/0239859, as quais estão aqui incorporadas a título de referência nas suas totalidades. As zonas de absorção por efeito capilar também são descritas no pedido de patente copendente intitulado "Controlling Fluid Flow Through An Assay Device" (pedido provisório US n° 61/588.772, depositado em 20 de janeiro de 2012, n° da súmula do procurador CDS5112USPSP, primeiro inventor mencionado: James Kanaley), aqui incorporado na íntegra, a título de referência.

De preferência, a totalidade da trajetória de fluxo, incluindo a zona de adição de amostras, a zona de detecção e a zona de absorção por efeito capilar, inclui projeções substancialmente verticais em relação ao substrato, e que possuem uma altura, diâmetro e espaçamento recíproco capaz de criar fluxo lateral da amostra na trajetória de fluxo.

Em qualquer uma das modalidades acima, o dispositivo é, de preferência, um dispositivo de ensaio descartável. O dispositivo de ensaio pode estar contido em um compartimento para facilidade de manuseio e proteção. Se o dispositivo de ensaio estiver contido em tal compartimento, o compartimento incluirá, de preferência, uma porta para adicionar amostra ao dispositivo de ensaio. O dispositivo de ensaio da presente invenção pode ser usado com um dispositivo para leitura (um leitor) do resultado de um ensaio feito no dispositivo de ensaio da presente invenção. O leitor inclui meios para leitura do sinal emitido ou refletido a partir do elemento de detecção, tal como um fotodetector, e meios para calcular o sinal e apresentar um resultado, tal co- mo um microprocessador que pode estar incluído dentro de um leitor integrado ou em um computador separado. Os leitores adequados são descritos, por exemplo, na publicação de patente US n° US 2007/0231883 e na patente US n° 7.416.700, ambas estão aqui incorporadas a título de referência nas suas totalidades.

Outra modalidade é um dispositivo para ler o resultado de um ensaio feito em um dispositivo de ensaio, sendo que o dispositivo compreende um detector capaz de ler um sinal emitido ou refletido a partir de pelo menos um elemento de detecção presente em um local definido do dispositivo de ensaio. Em qualquer uma das modalidades acima, a leitura é escolhida, de preferência, a partir da detecção e/ou quantificação de cor, fluorescência, radioatividade ou atividade enzimátíca.

Um outro aspecto da invenção é direcionado a um método para fazer um ensaio em uma amostra de líquido para a detecção de um ou mais analitos de interesse. Uma amostra de líquido contendo o(s) analito(s) de interesse é depositada sobre a zona de adição de amostra do dispositivo de ensaio, tal como através de uma porta no compartimento do dispositivo, ou por encostar o dedo diretamente sobre a zona de adição de amostra no caso de uma coleta de sangue por picada do dedo. A amostra se move por ação capilar através de um filtro opcional, e para dentro da zona de reagente onde ela se dissolve com o material reagente. Em uma modalidade preferencial, a amostra é reagida com um elemento de detecção no caso de um ensaio do tipo sanduíche, diretamente ou indiretamente, tal como através de um anticorpo. A amostra flui para longe da zona de reagente que tem uma pluma de reagente dissolvida quando ela flui para dentro da zona de detecção. A seguir, a amostra se move por ação capilar para dentro da zona de detecção. Na zona de detecção, um sinal representativo de um analito ou controle é produzido. Em uma modalidade preferencial, a amostra ou um ou mais reagentes que têm um elemento de detecção é capturada na zona de detecção, tal como por anticorpos sobre a superfície da zona de detecção, e um sinal representativo da presença ou da concentração do(s) anali-to(s) ou controle(s) é produzido. O leitor ou instrumento de detecção, con- forme descrito acima, é então usado para ler o sinal que é produzido na zona de detecção para determinar a presença ou a concentração do(s) anali-to(s) ou controle(s). A amostra se move da zona de detecção para dentro da zona de absorção por efeito capilar. O leitor pode ler o sinal imediatamente ou em um curto período de tempo após a amostra ter se movido pela zona de detecção. Além disso, uma ou mais lavagens podem seguir a amostra através do dispositivo para remover quaisquer reagentes não ligados, como elementos de detecção, distante da zona de detecção. O método, o dispositivo de ensaio, e o leitor de acordo com uma modalidade da invenção têm muitas vantagens. O conceito de "lavagem de interrupção" pode ser utilizado com vários dispositivos de ensaio como os descritos nos pedidos copendentes intitulados "Low Volume Assay Device Having Increased Sensitivity" (pedido provisório US n° 61/588.758, n° da súmula do procurador CDS5111USPSP, primeiro inventor mencionado: Phil Hosimer), "Assay Device Having Multiple Reagent Ceíls" (pedido provisório US n° 61/588.738, n° da Súmula do Procurador CDS5104USPSP, primeiro inventor mencionado: Zhong Ding), "Assay Device Having Uniform Flow A-round Corners" (pedido provisório US n° 61/588.745, n° da súmula do procurador CDS5110USPSP, primeiro inventor mencionado: James Kanaley), "Controlling Fluid Flow Through An Assay Device" (pedido provisório US n° 61/588.772, n° da súmula do procurador CDS5112USPSP, primeiro inventor mencionado James Kanaley), e "Assay Device Having Multiplexing” (pedido provisório US n° 61/588.779, n° da súmula do procurador CDS5113USPSP, primeiro inventor mencionado: Sue Danielson), todos depositados em 20 de janeiro de 2012 e todos aqui incorporados, a título de referência nas suas totalidades. O dispositivo de ensaio de acordo com a presente invenção pode ser embalado conforme mostrado na Figura 4. A embalagem 100 inclui todos os elementos funcionais necessários para o desempenho do ensaio, como: tampa superior 120, filtro 130, fita hidrofílica 140, dispositivo de ensaio (circuito integrado) 150, e tampa da base 160.

Deve ser compreendido que esta invenção não é limitada pelas modalidades específicas mostradas aqui. Os exemplos a seguir são fornecidos para fins ilustrativos e não se destinam a limitar o escopo da invenção uma vez que o escopo da presente invenção se limita apenas pelas reivindicação em anexo e seus equivalentes.

Exemplos Exemplo 1 Circuito integrados de substrato plásticos produzidos pela Zeo-nor (Zeon, Japão) que têm dextrano oxidado sobre a superfície para ímobili-zação covalente de proteínas através de acoplamento de base de Schiff foram usados. Para circuito integrados de NTproBNP, o anticorpo monoclonal anti-NT-proBNP marcado fluorescentemente foi depositado e seco para criar uma zona de reagente. O anticorpo monoclonal anti-NT-proBNP foi depositado e seco para criar uma zona de detecção. Uma pequena quantidade de Triton X-45 foi depositada sobre o dispositivo para aumentar a molhabilidade da amostra para melhor fluxo capilar. A amostra foi adicionada à zona de amostragem do dispositivo e a ação capilar do arranjo micropilar distribuiu a amostra através do canal de fluxo e dentro da zona de absorção por efeito capilar. Um tempo de ensaio típico foi de cerca de 10 minutos. As intensida-des do sinal dos complexos marcados fluorescentemente na zona de detecção foram registradas em um digitalizador de fluorescência de iluminação em linha protótipo. Para circuito integrados de carbamazepina, o reagente de detecção de carbamazepina foi preparado por ligar covalentemente um hap-teno de carbamazepina e um marcador fluorescente à albumina sérica bovina (BSA). O reagente de detecção de fenobarbital foi preparado por ligar covalentemente um hapteno de fenobarbital e um marcador fluorescente à BSA. Os anticorpos Monoclonais para carbamazepina e fenobarbital foram depositados e secos para criar as zonas de detecção. Diferentes níveis de NTproBNP, carbamazepina, e fenobarbital foram adicionados a soro humano para gerar os dados. Os experimentos usaram designs de circuito integrado de volume reduzido (como mostrado na Figura 2) e designs de circuito integrado com área de projeção reduzida e volume reduzido (como mostrado na Figura 3).

Na primeira modalidade da invenção, sangue total de amostras obtidas por picada do dedo é aplicado diretamente a um filtro sobre o dispo sitivo de teste para separar os eritrócitos do plasma. O plasma flui do filtro para os espaços capilares dentro da zona de amostragem de micropilar e prossegue por fluxo capilar até o final da trajetória de fluxo de fluidos. O contato da membrana de filtro com a superfície do micropilar da zona de amostragem é importante para o plasma fluir a partir da membrana. Quando o contato é feito, as forças capilares dentro da estrutura de micropilar absor vem por efeito capilar o plasma da membrana para criar um fluxo de plasma.

Nos designs de circuito integrado da técnica anterior, 200 uL de sangue total são aplicados ao filtro embora apenas cerca de 35 uL de plasma sejam necessários para um ensaio. A eficiência de uso total da amostra é de apenas 17,5%. A presente invenção se destina ao uso com apenas 25 uL de sangue total em designs de circuito integrado com volume reduzido e designs de circuito integrado de área de projeção reduzida com volume reduzido. De modo a obter os 9 uL necessários de plasma para o ensaio, a eficiência de filtração deve ser de pelo menos 36% para uma amostra de sangue integral de 25 uL com 45% de hematócrito.

Em outra modalidade do dispositivo, o sangue total pode ser a-plicado diretamente à superfície do micropilar sem usar uma membrana de filtro para separar o plasma dos eritrócitos. Uma vez que a viscosidade do sangue total é muito maior que o soro ou plasma, a resistência ao fluxo dentro do espaço do micropilar também é muito maior, o que resulta em um fluxo muito lento ou obstruções de fluxo. Além disso, a viscosidade do sangue total pode variar muito devido às grandes diferenças de hematócrito entre os pacientes. De modo a alcançar um fluxo consistente de sangue total dentro do espaço do micropilar, métodos para reduzir a resistência ao fluxo ou aumentar a força capilar foram necessários.

Nesta modalidade, o fluxo de sangue total dentro dos espaços do micropilar foi facilitado pela adição de um pequeno volume (1 pl_ ou menos) de uma solução contendo um tensoativo não hemolítico, não iônico e bom umectante dentro ou próximo da zona de adição de amostras dos de-signs de circuito integrado de volume reduzido e dos designs de circuito integrado com área de projeção reduzida e volume reduzido. Imediatamente após a adição desta solução pré-umedecída, 10 a 15 pL de sangue total são adicionados diretamente à zona de adição de amostras. A solução contendo tensoativo age para reduzir a tensão superficial e evita o acúmulo de eritróci-tos na frente do fluido. As forças capilares dentro da estrutura do micropilar deslocam o fluxo de sangue total através da zona de reagente (conjugado), para baixo até o canal de detecção (reação) e para dentro da zona de absorção por efeito capilar. A adição de uma fita hidrofílica sobre o canal de detecção (reação) aumenta as forças capilares dentro do espaço do micropilar e serve para aprimorar ainda mais o fluxo de sangue total através do circuito integrado. A reação do conjugado de detecção e os imunomateriais de captura com o analito alvo ocorre na presença de sangue total. Entretanto, uma vez que os eritrócitos interferem com a medição óptica dos conjugados de detecção, eles devem ser removidos antes da leitura ser feita. Isto é feito pela adição de uma etapa de lavagem antes da leitura final. O método, de acordo com a presente invenção, usa uma lavagem de interrupção para controlar o volume da amostra assim como para remover eritrócitos e outras substâncias que interferem com a zona de detecção (canal). O volume da amostra é controlado pela adição do fluido de lavagem no ponto onde a amostra de sangue tiver enchido a zona de absorção por efeito capilar até um nível predeterminado. Uma vez que as estruturas do micropilar são projetadas para preencher coluna por coluna de uma forma uniforme, o fluxo pode ser monitorado manualmente ou pelo instrumento para determinar quando a amostra tiver preenchido o circuito integrado até o volume pretendido. Quando o volume da amostra pretendido for obtido, um fluido de lavagem é adicionado ao canal do micropilar em uma posição a montante do canal de detecção, conforme mostrado na Figura 2 para um design de circuito integrado de volume reduzido ou na Figura 3 para um design de circuito integrado de área de projeção reduzida e volume re- duzido de acordo com a presente invenção.

Uma gotícula de fluido de lavagem de 10 a 15 pl_ é aplicada para criar uma gotícula com formato de redoma, que flui em ambas as direções para remover de modo eficaz a tomar amostras do canal de detecção a jusante (reação) e impede que a amostra no espaço de pilar a montante entre no canal de detecção (reação). O fluido de lavagem é composto tipicamente por fosfato de sódio a 0,1 M, 1% de albumina séríca bovina e 0,1% de tensoativo. Os tensoativos são necessários por todo o espaço de micropilar para reduzir a tensão superficial para permitir o fluxo de fluido por força capilar. Para os designs de circuito integrado da técnica anterior, Triton X-45 era o tensoativo preferencial que é depositado e seco na zona de amostragem do circuito integrado de micropilar. Fazer com que o sangue total flua de forma consistente na deposição do circuito integrado de TX-45 na zona de amostragem não é o mais eficiente. Mostrou-se que vários outros tensoativos não iônicos melhoram a taxa de fluxo do sangue total nos circuito integrados de micropilar. A Figura 5 mostra os tempos de fluxo médios para o sangue total alcançar o início da zona de absorção por efeito capilar e o tempo para alcançar o final da zona de absorção por efeito capilar em designs de circuito integrado de volume reduzido com vários tensoativos depositados na zona de adição de amostras. Os resultados mostram que o sangue total flui mais rápido com todos os tensoativos testados em comparação ao TX-45.

Estes resultados foram obtidos com uma única amostra de sangue total. Uma vez que o sangue total pode variar muito de pessoa para pessoa, espera-se uma grande variação nas taxas de fluxo. Taxas de fluxo mais lentas foram observadas com o aumento do nível de hematócrito das amostras e obstruções de fluxo foram observadas em amostras com hematócrito elevado. O fluxo contínuo do sangue total foi obtido pelo uso do tensoativo preferencial na zona de adição de amostras e pela adição da solução pré-umectante contendo o mesmo tensoativo antes da adição da amostra. A solução pré-umectante e de lavagem preferencial contém o tensoativo Surfynol®485 ou Surfynol®465. Outros tensoativos preferenciais incluem Silwet®L7600, Tween®20, Pluronic®L64, tensoativo 10G, Triton® X-305, Triton® X-45, e Triton® X-100. Os teores de tensoativo de 0,05% a 1% são preferenciais.

Sangue total com resultados de teste de lavagem de interrupção: O sangue total com EDTA foi obtido por coleta venosa e carbamazepína e fenobarbital foram adicionados até os níveis indicados na tabela 1. Um de-sign de circuito integrado de volume reduzido com fita cobrindo a zona de absorção por efeito capilar e aproximadamente 2/3 da zona de detecção (vi de Figura 2) foi usado para avaliar o protocolo de lavagem de interrupção. Cada circuito integrado multiplex continha zonas de detecção (reação) consistindo em um anticorpo de captura imobilizado para carbamazepína e uma segunda zona de detecção (reação) imobilizada com um anticorpo de captura de fenobarbital. Os conjugados de BSA e fluoróforos de cada fármaco foram depositados na zona de reagente (conjugado).

Um microlitro de fluido de lavagem contendo 1% de BSA, 0,1% de TX-100, em solução salina tamponada com fosfato foi aplicado na zona de amostragem e deixado entrar completamente no espaço micropilar e, então, imediatamente seguido pela aplicação de quinze microlitros da amostra de sangue integral. A frente do fluido foi monitorada por inspeção visual até o fluido encher 50% da zona de absorção por efeito capilar. Quinze microlitros do mesmo fluido de lavagem foram então aplicados diretamente sobre o canal (na zona de adição de reagentes) e a frente do fluido foi monitorada até a zona de absorção por efeito capilar estar completamente cheia. O circuito integrado foi montado no cartucho e lido no leitor fluorescente.

Tabela 1 Amostras de sangue total com CRBM/PHBR adicionado.

Tabela 1-continuação- Uma alíquota de cada amostra de sangue integral foi centrifugada para separar o plasma do sangue total. O plasma de cada alíquota foi coletado e avaliado com o mesmo design de circuito integrado. Quinze mi-crolitros de plasma foram adicionados diretamente à zona de amostragem. O circuito integrado foi monitorado por inspeção visual e lido no leitor fluorescente imediatamente após a zona de absorção por efeito capilar ter determinado estar completamente cheia.

As curvas de resposta à dosagem resultantes nas Figuras 6 e 7 demonstram que o sangue total pode ser aplicado diretamente ao circuito integrado micropilar em pequenos volumes usando o protocolo de lavagem de interrupção descrito e gera resultados similares aos obtidos com plasma. Ambos os ensaios competitivos de carbamazepina e fenobarbital descritos foram conduzidos na presença de sangue total e geraram os resultados de teste esperados.

Sangue total com filtro e lavagem de interrupção: Em outra modalidade da invenção, pequenos volumes de sangue total podem ser usados em um dispositivo micropilar pela combinação dos conceitos de filtração e lavagem de interrupção acima. Filtros foram usados para separar eritrócitos do plasma a partir de apenas 25 microlitros ou menos de sangue total. O volume de plasma transferido para as estruturas de micropilar podem ser muito menores quando usados em combinação com um protocolo de lavagem de interrupção. Nesta modalidade, o volume de plasma necessário precisa ser suficiente para produzir sinal de detecção adequado para o ensaio, mas não tão grande quanto um volume necessário para encher o volume total do circuito integrado. Volumes de plasma de apenas 2 a 6 microlitros podem ser usados quando combinados com uma lavagem.

Nesta modalidade, o sangue total é aplicado ao filtro. O filtrado de plasma é transferido para o espaço micropilar na zona de adição de a-mostras e continua a fluir através do reagente e das zonas de detecção. A frente do fluxo é monitorada por inspeção visual ou pelo instrumento até alcançar uma distância definida na zona de absorção por efeito capilar. O fluido de lavagem é aplicado ao canal a montante, o que evita ou interrompe a entrada de amostra adicional no canal controlando, desta forma, o volume da amostra. O fluido de lavagem flui em ambas as direções, o que impede que plasma adicional entre no canal e limpe o plasma e conjugado residual do canal de detecção (reação). O fluido de lavagem também serve para encher o volume remanescente do circuito integrado. A frente do fluido é monitorada e lida quando a zona de absorção por efeito capilar é completamente cheia. A lavagem de interrupção pode ser aplicada após um volume de a-mostra consistente ter entrado no circuito integrado. Idealmente, este volume deve permitir a dissolução completa de qualquer material reagente na zona de reagente (como um material conjugado) mas deve deixar espaço suficiente na zona de absorção por efeito capilar para uma lavagem adequada.

Sangue total com a seguinte lavagem: Em outra modalidade, uma curva de resposta à dosagem foi demonstrada no leitor fluorescente usando sangue total com uma lavagem subsequente. O circuito integrado usado foi o design de circuito integrado de volume reduzido, conforme mostrado na Figura 2, depositado com reagentes NT-proBNP (anticorpo de detecção aNT-proBNP na zona de detecção/reação e anticorpo de captura aNT-proBNP na zona de reagente/conjugado) com fita cobrindo a zona de absorção por efeito capilar e o canal da zona de detecção. As amostras consistiram em sangue total com EDTA dentro da qual uma amostra de soro contendo aproximadamente 35000 pg/mL de NTproBNP foi adicionada após remoção de um volume igual de plasma para se obter concentrações de 75, 2220, 4550 e 8942 pg/mL de NTproBNP. Uma solução contendo 1% de al- bumina sérica bovina, 0,1% de Triton X-100, 0,3 mg/ml_ de IgG de camun-dongo, 0,3 mg/mL de gama globulina bovina em solução salina tamponada com fosfato foi usada como um fluido de pré-umectante e de lavagem. O protocolo do ensaio consistiu na adição de 1 uL de fluido de lavagem à zona de adição de amostras para pré-umedecer o canal de fluxo seguido da adição de 4 uL de amostra de sangue total à zona de adição de amostras. A amostra é deixada fluir para dentro do espaço de micropilar do canal de fluxo e então 2 uL de fluido de lavagem são adicionados atrás da zona de adição de amostras. O fluido de lavagem é deixado fluir completamente para o espaço de micropilar e, então, a etapa de lavagem é repetida mais duas vezes. O fluxo de fluidos é monitorado até a zona de absorção por efeito capilar estar completamente cheia quando o circuito integrado é lido no leitor. A Figura 8 mostra os tempos de fluxo médios de três réplicas obtidas para amostras de sangue total com vários níveis de NT-proBNP. Estes resultados mostram que as taxas de fluxo por todo o canal de fluxo para estas amostras de sangue total não variam significatívamente. A Figura 9 plota a área de pico média da resposta fluorescente obtida no leitor fluorescente em função da concentração de NT-proBNP para cada amostra de teste. A Figura 9 também mostra a curva de resposta à dosagem obtida para as a-mostras de sangue total em comparação a amostras de soro com concentração de NT-proBNP similar. Estes resultados demonstram, assim, que uma curva dose-resposta pode ser obtida com um leitor fluorescente pela aplicação de sangue total no canal de fluxo de um circuito integrado de volume reduzido, conforme mostrado na Figura 2 e aplicação de um fluido de lavagem antes da adição de sangue total para facilitar o fluxo e a aplicação de um fluido de lavagem adicional após a adição de sangue total para lavar o canal de fluxo.

Exemplo 2 Dispositivos de ensaio produzidos pela Zeonor (Zeon, Japão) que têm dextrano oxidado sobre a superfície para imobilização covalente de proteínas através de acoplamento de base de Schiff foram usados. O anti- corpo monoclonal anti-NT-proBNP marcado fluorescentemente foi depositado e seco para criar uma zona de reagente. O anticorpo monoclonal anti-NT-proBNP foi depositado e seco para criar uma zona de detecção Uma pequena quantidade de Triton X-45 foi depositada sobre o dispositivo para aumentar a molhabilidade da amostra para melhor fluxo capilar. Soro com NT-proBNP foi adicionado à zona de amostragem do dispositivo e a ação capilar do arranjo micropilar distribuiu a amostra através do canal de fluxo e dentro da zona de absorção por efeito capilar. Volumes de amostra de 15 microli-tros foram empregados nos designs de dispositivo de baixo volume R2.02, R2.04, R2.09 e R3.16. O design de dispositivo R1.02 era um dispositivo de controle, destinado ao uso com 200 microlitros de sangue total, tal como mostrado na Figura 1. Os dispositivos R1.02 foram testados neste exemplo com 45 microlitros de soro. Um tempo de ensaio típico foi de cerca de 10 minutos. As intensidades do sinal dos complexos marcados fluorescentemente na zona de detecção foram registradas em um digitalizador de fluorescência de iluminação em linha protótipo.

Conforme mostrado nas Figuras 10 e 11, a barra e curva A (R2.02) é um dispositivo em miniatura que tem uma única célula de reagente e uma zona de detecção reduzida diretamente que tem uma largura de zona de detecção de 0,5 mm, enquanto a barra e a curva B (R2.09) é um dispositivo em miniatura que tem célula de reagente dupla e uma zona de detecção mais larga, de 1 mm. Os dados para dois designs de dispositivo adicionais também são incluídos para comparação. A barra e curva C (R1.02) é um dispositivo de ensaio convencionalmente dimensionado que tem um volume de amostra de sangue total de 200 uL, e a barra e curva D (R2.04) é um dispositivo de célula de reagente única que tem uma largura da zona de detecção de 1 mm. A curva E (R3.16) inclui células de reagente duplas e uma zona de detecção de 1 mm de largura.

Exemplo 3 Dispositivos de ensaio em miniatura que têm células de reagente duplas produzidas pela Zeonor (Zeon, Japão) que têm dextrano oxidado sobre a superfície para imobilização covalente de proteínas através de aco- plamento de base de Schiff foram usados. O anticorpo monoclonal anti-pró-calcitonina marcado fluorescentemente foi depositado e seco para criar uma zona de reagente. O anticorpo monoclonal anti-pró-calcitonina foi depositado e seco para criar uma zona de detecção. Uma pequena quantidade de Triton X-45 foi depositada sobre o dispositivo para aumentar a molhabilidade da amostra para melhor fluxo capilar. Neste exemplo, 25 microlitros de sangue total contendo pró-calcitonina foram aplicados a um filtro em contato com a zona de adição de amostras do dispositivo de ensaio. O plasma é transferido do filtro para a zona de adição de amostras e, então, se move por força capilar através da trajetória de fluxo até a zona de absorção por efeito capilar. O fluxo de fluidos foi monitorado por inspeção visual e 10 microlitros de um fluido de lavagem contendo 0,01 M de tampão fosfato, 0,0027 M de cloreto de potássio, 0,137 M de cloreto de sódio, 1% de albumina sérica bovina e 0,1% de triton X-100 foi adicionado à zona de adição de reagentes quando a frente do fluxo de fluidos preencheu 20% da zona de absorção por efeito capilar. O dispositivo de ensaio foi inserido em um leitor fluorescente imediatamente após ter sido determinado que a zona de absorção por efeito capilar estava completamente cheia. O sinal fluorescente dentro da zona de detecção foi medido e a área de pico sob a curva de resposta foi determinada para cada amostra. Amostras de sangue total foram recém coletadas de doadores normais em tubos com heparina lítio. Uma amostra de soro concentrada contendo 10 pg/mL de pró-calcitonina foi adicionada a alíquotas de sangue total para criar amostras contendo 0, 0,4, 5, 20 e 35 ng/mL de pró-calcitonina. A Figura 12 plota a área de pico média de cinco resultados em replicata para cada amostra em relação à concentração de pró-calcitonina. Conforme a Figura 12 demonstra, o uso de um pequeno tamanho de amostra (isto é, 25 pL de sangue total/10 pL de lavagem) fornece resultados satisfatórios em uma ampla gama de concentrações de analito.

Exemplo 4 Dispositivos de ensaio em miniatura que têm células de reagente duplas produzidas pela Zeonor (Zeon, Japão) que têm dextrano oxidado sobre a superfície para imobilização covalente de proteínas através de aco- plamento de base de Schiff foram usados. O anticorpo monoclonal anti-pró-calcitonina marcado fluorescentemente foi depositado e seco para criar uma zona de reagente. O anticorpo monoclonal anti-pró-calcitonina foi depositado e seco para criar uma zona de detecção. Uma pequena quantidade de Triton X-45 foi depositada sobre o dispositivo para aumentar a molhabilidade da amostra para melhor fluxo capilar. Neste exemplo, 35 pl de sangue total contendo pró-calcitonina foram aplicados a um filtro em contato com a zona de adição de amostras do dispositivo de ensaio. O plasma é transferido do filtro para a zona de adição de amostras e, então, se move por força capilar através da trajetória de fluxo até a zona de absorção por efeito capilar. O fluxo de fluidos foi monitorado por inspeção visual e inserido no leitor fluorescente imediatamente após ter sido determinado que a zona de absorção por efeito capilar estava completamente cheia. O sinal fluorescente dentro da zona de detecção foi medido e a área de pico sob a curva de resposta foi determinada para cada amostra. Amostras de sangue total foram recém coletadas de doadores normais em tubos com EDTA. Uma amostra de soro concentrada de 10 pg/rnL de pró-calcitonina foi adicionada a alíquotas de sangue total para criar amostras contendo 0, 0,4, 5 e 20 ng/mL de pró-calcitonina. A Figura 13 plota a área de pico média de três resultados em replicata para cada amostra em relação à concentração de pró-calcitonina. Conforme a Figura 13 demonstra, o uso de um pequeno tamanho de amostra (isto é, 35 pL de sangue total) fornece resultados satisfatórios em uma ampla gama de concentrações de analito.

Os versados na técnica apreciarão que a invenção e suas modalidades aqui descritas são suscetíveis a variações e modificações além daquelas especificamente descritas. Deve ser compreendido que a invenção inclui todas estas variações e modificações. A invenção também inclui todas as etapas e características referidas neste relatório descritivo, individualmente ou coletivamente, e toda e quaisquer combinações de quaisquer duas ou mais das etapas ou características.

Os pedidos copendentes intitulados "Low Volume Assay Device Having Increased Sensitivity" (pedido provisório US n° 61/588.758, n° da súmula do procurador CDS5111USPSP, primeiro inventor mencionado: Phil Hosimer), "Assay Devíce Having Multiple Reagent Cells" (pedido provisório US n° 61/588.738, n° da súmula do procurador CDS5104USPSP, primeiro inventor mencionado: Zhong Ding), "Assay Device Having Uniform Flow A-round Corners" (pedido provisório US n° 61/588.745, n° da súmula do procurador CDS5110USPSP, primeiro inventor mencionado: James Kanaley), "Controlling Fluid Flow Through An Assay Device" (pedido provisório US n° 61/588.772, n° da súmula do procurador CDS5112USPSP, primeiro inventor mencionado James Kanaley), e "Assay Device Having Multíplexing" (pedido provisório US n“ 61/588.779, n° da súmula do procurador CDS5113USPSP, primeiro inventor mencionado: Sue Danielson), todos depositados ao mesmo tempo que o presente pedido estão aqui incorporados, a título de referência nas suas totalidades.

Claims (27)

1. Dispositivo de ensaio, caracterizado pelo fato de que compreende: uma zona de adição de amostra de líquido; uma zona de reagente a jusante e em comunicação fluida com a zona de adição de amostra que contém um material reagente; uma zona de detecção em comunicação fluida com a zona de reagente tendo elementos de captura ligados a ela; e uma zona de absorção por efeito capilar em comunicação fluida com a zona de detecção que tem uma capacidade para receber a amostra de líquido que flui a partir da zona de detecção, sendo que a zona de adição de amostra, a zona de reagente, a zona de detecção e a zona de absorção por efeito capilar definem uma trajetória de fluxo de fluido, e e compreendendo, ainda, a zona de adição de reagente junto e em comunicação fluida com a trajetória de fluxo de fluido a jusante da zona de adição de amostra e a montante da zona de detecção.

2. Dispositivo de ensaio, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que pelo menos uma parte da trajetória de fluxo fluida tem uma superfície de substrato e projeções que se estendem, substancialmente, verticalmente a partir da superfície de substrato, sendo que as projeções têm uma altura, seção transversal e uma distância entre uma e a outra que define um espaço entre as projeções capaz de gerar um fluxo capilar paralelo à superfície de substrato.

3. Dispositivo de ensaio, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a zona de adição de reagente está a jusante da zona de reagente.

4. Dispositivo de ensaio, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a zona de adição de reagente compreende um reservatório.

5. Dispositivo de ensaio, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o material reagente compreende um material rea- gente marcado.

6. Dispositivo de ensaio, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a zona de detecção compreende elementos de captura ligados à mesma.

7. Dispositivo de ensaio, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a zona de adição de amostra compreende um ten-soativo depositado sobre a mesma.

8. Dispositivo de ensaio, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que compreende ainda um filtro na zona de adição de amostra, em que a amostra passa através do filtro antes de entrar na trajetória de fluxo de fluido.

9. Dispositivo de ensaio, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que compreende, ainda, uma fita hidrofílica que cobre, pelo menos parcialmente, a zona de detecção.

10. Método para controlar o tamanho da amostra em um dispositivo de ensaio, caracterizado pelo fato de que compreende: fornecer uma zona de adição de amostra de líquido: fornecer uma zona de reagente a jusante e em comunicação fluida com a zona de adição de amostra contendo um material reagente; fornecer uma zona de detecção em comunicação fluida com a zona de reagente; fornecer uma zona de absorção por efeito capilar em comunicação fluida com a zona de detecção tendo uma capacidade para receber a amostra fluida fluindo a partir da zona de detecção, em que a zona de adição de amostra, a zona de reagente, a zona de detecção e a zona de absorção por efeito capilar definem uma trajetória de fluxo de fluido; fornecer ainda uma zona de adição de reagente junto e em comunicação fluida com a trajetória de fluxo de fluido a jusante da zona de adição de amostra e a montante da zona de detecção; adicionar a amostra à zona de adição de amostra, sendo que a amostra se move através da trajetória de fluxo de fluido; e adicionar um reagente à zona de adição de reagente, sendo que o reagente interrompe o fluxo da amostra através da trajetória de fluxo de fluido, desse modo controlando o tamanho da amostra na trajetória de fluxo de fluido.

11. Método, de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que o reagente é adicionado à zona de adição de reagente quando a amostra se move para dentro da zona de absorção por efeito capilar.

12. Método, de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que a amostra se move para dentro de 50% da zona de absorção por efeito capilar.

13. Método, de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que o reagente adicionado à zona de adição de reagente é um reagente de lavagem.

14. Método, de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que compreende, ainda, o depósito de um tensoativo sobre a zona de adição de amostra.

15. Método, de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelo fato de que o tensoativo é depositado sobre a zona de adição de amostra antes de a amostra ser adicionada à zona de adição de amostra.

16. Método, de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que compreende, ainda, o fornecimento de um filtro na zona de adição de amostra, em que a amostra passa através do filtro antes de entrar na trajetória de fluxo de fluido.

17. Método, de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que compreende, ainda, o fornecimento de uma fita hidrofílica que cobre, pelo menos parcialmente, a zona de detecção.

18. Método para realizar um ensaio em uma amostra de líquido para a detecção de um ou mais analitos de interesse, caracterizado pelo fato de que compreende: fornecer uma zona de adição de amostra de liquido; fornecer uma zona de reagente a jusante e em comunicação fluida com a zona de adição de amostra contendo um material reagente; fornecer uma zona de detecção em comunicação fluida com a zona de reagente; fornecer uma zona de absorção por efeito capilar em comunicação fluida com a zona de detecção tendo uma capacidade para receber a amostra fluida fluindo a partir da zona de detecção, em que a zona de adição de amostra, a zona de reagente, a zona de detecção e a zona de absorção por efeito capilar definem uma trajetória de fluxo de fluido; fornecer ainda uma zona de adição de reagente junto e em comunicação fluida com a trajetória de fluxo de fluido a jusante da zona de adição de amostra e a montante da zona de detecção; adicionar uma amostra de líquido contendo o analito de interesse na zona de adição de amostra; mover a amostra por ação capilar para dentro da zona de reagente, sendo que a mostra dissolve o material reagente; descarregar a amostra da zona de reagente com o material reagente dissolvido dentro da zona de detecção para dentro da zona de detecção, por ação capilar, em que o analito de interesse é detectado na zona de detecção por leitura de um sinal que é gerado; e fazer fluir a amostra e qualquer material não ligado para dentro da zona de absorção por efeito capilar; sendo que o método compreende, ainda, a adição de um reagente na zona de adição de reagente, sendo que o reagente interrompe o fluxo da amostra através da trajetória de fluxo de fluido, desse modo controlando o tamanho da amostra na trajetória de fluxo de fluido.

19. Método, de acordo com a reivindicação 18, caracterizado pelo fato de que o reagente é adicionado à zona de adição de reagente quando a amostra moveu-se para dentro da zona de absorção por efeito capilar.

20. Método, de acordo com a reivindicação 19, caracterizado pelo fato de que a amostra moveu-se para dentro de 50% da zona de absorção por efeito capilar.

21. Método, de acordo com a reivindicação 18, caracterizado pelo fato de que o reagente adicionado à zona de adição de reagente é um reagente de lavagem.

22. Método, de acordo com a reivindicação 18, caracterizado pelo fato de que a amostra se move a partir da zona de detecção e para dentro da zona de absorção por efeito capilar, e o sinal pode ser lido imediatamente ou logo após o movimento da amostra para dentro da zona de detecção.

23. Método, de acordo com a reivindicação 18, caracterizado pelo fato de que uma ou mais lavagens podem seguir a amostra através do dispositivo de ensaio para remover qualquer elemento de detecção não ligado da zona de detecção.

24. Método, de acordo com a reivindicação 18, caracterizado pelo fato de que o material reagente é marcado com um elemento de detecção.

25. Método, de acordo com a reivindicação 18, caracterizado pelo fato de que a zona de detecção contém elementos de captura para capturar o elemento de detecção.

26. Método, de acordo com a reivindicação 25, caracterizado pelo fato de que o sinal é gerado pelo elemento de detecção.

27. Invenção, em quaisquer formas de suas concretizações ou em qualquer categoria aplicável de reivindicação, por exemplo, de produto ou de processo ou uso englobadas pela matéria inicialmente descrita, revelada ou ilustrada no pedido de patente.