CN101243321A - 用于检测抗-类脂抗体的方法、免疫测定法和装置 - Google Patents

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Abstract

本申请描述了用于检测抗－类脂抗体和诊断疾病(例如梅毒)的组合物、方法和装置。尤其是，描述了用于将类脂抗原(包括心磷脂、卵磷脂、和胆固醇)固定在固相支持体(例如，硝化纤维膜)上的方法。将类脂抗原固定在膜上的能力满足了对用于检测抗－类脂抗体的基于膜的试验法的长久已知的需要。还描述了用于同时进行梅毒密螺旋体和非密螺旋体检验的免疫测定装置。

Description

用于检测抗-类脂抗体的方法、免疫测定法和装置
相关申请的交叉引用
本申请要求2005年6月21日提交的美国临时专利申请No.60/693,120的优先权，该申请被全文并入本文作为参考。
对政府支持的感谢
本发明是由National Center for HIV，STD and TB Prevention，Division of AIDS，STD，and TB Laboratory Research，LaboratoryReference and Research Branch Centers for Disease Control andPrevention(美国政府的机构)作出的。
技术领域
本公开涉及使类脂抗原固定于固相支持体的方法和相关的免疫测定法和免疫测定装置(例如，检测条、流通装置、或横向流动装置)，该测定法和装置可用于例如检测抗-类脂抗体和/或诊断疾病(例如，梅毒)。
发明背景
梅毒是由梅毒螺旋体(Treponema pallidum)引起的性传播疾病(STD)。全世界每年报告超过100,000例成年人梅毒病例。另外，该疾病先天传播并且每年影响3,000名或更多的婴儿。梅毒感染的进程跨越许多年并且可以产生多种临床表现，通过四个阶段对其进行表征。
梅毒感染的初期发生在细菌感染之后的10-100天，并且特征在于出现一处或多处下疳(红色、不流血、无痛性溃疡，一般直径小于1cm)。下疳可以出现在生殖器或身体的其它地方上。下疳持续3-6周并且不经治疗而痊愈，留下小的疤痕。感染者在这个阶段是有传染性的。
梅毒感染的第二阶段特征在于可以覆盖身体的部分或全部的皮疹样皮肤损伤。皮肤损伤通常是不痛的并且在最初的下疳发作之后的1-6月出现。皮肤损伤可与疣、脓疮、或者溃疡相似。不经治疗，它们在2-12周痊愈，无疤痕。在感染的这个阶段中也可发生发烧、咽喉痛、虚弱、体重损失、淋巴结肿胀、和睫毛和/或部分眉毛的损失。另外，症状可以发展为脑脊膜血管性梅毒，其特征在于遍布脑和脊髓的炎症和/或脑脉管系统的变化。感染者在第二阶段也是有传染性的。
这种疾病的下一个阶段是潜伏梅毒或隐藏阶段。在这个阶段过程中，感染者看起来已经病愈并且是无症状的。这个阶段在没有进行梅毒治疗的人中有大约三分之二持续终身。在潜伏状态的第一年过程中，可以发生第二阶段症状的复发。除了在复发过程中之外，感染者在这个阶段过程中没有传染性；然而，在出现初期下疳的四年内潜伏感染的母亲所生的小孩可能感染先天梅毒。
第三级或晚期梅毒是未经治疗的感染的最后阶段。这个阶段可以早在感染之后的一年发生，或者在其后的任何时候发生，10到20年是最常见的。以被称为梅毒瘤的损伤为特征的良性梅毒可以发生在骨、皮肤、和内脏中。罕见死亡，但是可发生严重的毁容和疼痛。心血管梅毒的特征在于主动脉的动脉瘤以及其它心血管问题，并且经常导致死亡。神经病学并发症可以发生在梅毒的早期阶段以及表现为晚期阶段的症状。在晚期阶段疾病中，神经梅毒可能是无症状的，或者患者可具有严重的神经病学问题，例如可能的痴呆、精神错乱、活动性受损、盲、聋、甚至死亡。
梅毒的免疫应答包括产生以下物质：(i)密螺旋体抗体，其是对梅毒螺旋体(T.pallidum)抗原特异性的，和(ii)抗-类脂抗体，其识别从受损的宿主细胞释放的类脂物质、脂蛋白样物质和可能的从密螺旋体释放的心磷脂。梅毒筛选和诊断的主要依据是针对这两种抗体的任一种或其二者的血清学检验。
对于抗-类脂抗体的检验(经常称为“非密螺旋体检验”)一般地基于由天然存在的心磷脂、胆固醇和卵磷脂(lethicin)组成的抗原。广泛使用的非密螺旋体检验(例如，Venereal Disease Research Laboratory(VDRL)检验和Rapid Plasma Reagin(RPR)检验)在显微镜下监测(例如，VDRL检验)或肉眼监测(例如，RPR检验)包括抗原-抗体配合物的絮状沉淀的形成。非密螺旋体检验的优点在于广泛可用、便宜和便于对大量样品进行检验。此外，因为抗-类脂抗体滴度随梅毒的成功治疗而降低，最终在大多数患者中消失，而密螺旋体抗体滴度在数年甚至终生保持很高，因此认为非密螺旋体检验是监测治疗或检验再感染的更好的选择。
密螺旋体检验基于衍生白T.pallidum的抗原，并且包括梅毒螺旋体颗粒凝集(TP-PA)、荧光密螺旋体抗体吸收检验(FTA-ABS)和酶免疫测定。密螺旋体检验主要用于验证非密螺旋体检验中的反应性。密螺旋体检验也可用于确认其中非密螺旋体检验不起反应的梅毒的临床印象。进行密螺旋体检验在技术上更困难、费时、和昂贵，并且不能用于监测治疗治疗，因为该检验在大约85％的成功治疗梅毒的人中在数年或终生保持有反应性。
上述的每一种抗体检验都使用在临床背景下得到并且送到实验室进行分析的血清样品进行。因此，一般地在收集样品之后的几天都不能得到检验结果。由于跟踪STD患者的时常发生的困难，需要开发快速的、床边检验(point-of-care test)，以帮助临床医师作出判断，最好在检验的当天作出。
提供快速的现场结果的免疫测定装置(例如检测条、流通装置、横向流动装置)可用于定性地检验密螺旋体抗体的血清水平(例如，DiaSys Corporation；ACON Laboratories，Inc.；Biokit，S.A.；GenixTechnology；Standard Diagnostics；Cortez Diagnostics，Inc.；和PhoenixBio-Tech Corp)。然而，更难以开发用于抗-类脂抗体的类似检验，至少部分是因为抗-类脂抗体的疏水性抗原(例如，VDRL，USR或RPR抗原、或心磷脂)抵抗连接于作为免疫测定装置的一个元件的固相支持体。
根据一些专家的观点，梅毒检测可以通过用于筛选和诊断目的的非密螺旋体检验和密螺旋体检验的组合得到进一步的帮助。这是WorldHealth Organization，Treponemal Infections，Technical Report Series 674，Geneva：WHO，1982所提倡的方法。能够同时检测非密螺旋体和密螺旋体抗体的易用、快速、床边检验将有助于满足这个长久已知的需要。
发明内容
开发用于非密螺旋体检验(或组合的非密螺旋体和密螺旋体检验)的非溶液免疫测定法的努力已经受到难以将抗-类脂抗体特异性识别的抗原(称为“类脂抗原”)，例如心磷脂、VDRL抗原、USR抗原等连接于固体底物例如硝化纤维条的阻挠。例如，心磷脂分子的极小尺寸导致难以将这些分子定位在固体底物上。尽管可以通过使心磷脂与更大分子(例如蛋白质)结合而增加心磷脂分子的大小，但是这种结合导致心磷脂抗原性的丧失。一般地说，类脂抗原的高度疏水性使得难以使这种抗原结合于许多固体表面，例如硝化纤维和其它微孔膜。
本公开提供了可以可靠地使类脂抗原(其至少由心磷脂、磷脂酰胆碱(也称为卵磷脂)、和胆固醇组成)连接于固体底物(例如微孔膜)同时维持用于抗-类脂抗体的抗原的抗原性和特异性的方法。使用本文中所述的方法，现在有可能将类脂抗原连接于多种固相支持体。用这样的方式连接类脂抗原的能力使得允许将其用于例如用于快速、现场检验非密螺旋体抗体的免疫测定装置。在某些实施方案中，公开的免疫测定装置还并入由密螺旋体抗体识别的梅毒螺旋体抗原，使得该装置方便地和同时检测非密螺旋体(即，抗-类脂)和密螺旋体(即，抗-梅毒螺旋体)抗体。
在一个具体实例中，使包括心磷脂、卵磷脂和胆固醇的类脂抗原与类脂抗原特异性的Fab片段群接触，以提供类脂抗原-Fab配合物，该配合物可容易地连接于固相支持体，例如流通或横向流动装置的可渗透性底物。
前述和其它特点和优点可以从参考附图进行的对几个实施方案的以下详细说明变得显而易见。
附图说明
图1是得自A蛋白柱的洗脱液在280nm的吸光度的描图，所述A蛋白柱加载了木瓜蛋白酶消化的纯化IgG。使用设置为灵敏度2和图移速率1.5的ISCO UA-5吸光度/荧光检测器收集数据。在洗脱峰I之后，在洗脱液280nm的吸光度回到基线时，向柱中加入甘氨酸洗脱缓冲液。
图2显示了SDS梯度凝胶的数字图像。泳道(1)分子重量标准(从上开始：203、135、83、41、31、17和7kD)；(2)得自人梅毒血清的硫酸铵沉淀物；(3)没有被A蛋白保留的硫酸铵沉淀的蛋白质(峰I)；(4)得自硫酸铵沉淀物的A蛋白-纯化的IgG(峰II)；(5)在木瓜蛋白酶消化之前由A蛋白-纯化的IgG；(6)木瓜蛋白酶消化之后由A蛋白-纯化的IgG；(7)没有被A蛋白保留的得自木瓜蛋白酶IgG消化的蛋白(峰I)(主要是Fab片段)；(8)得自木瓜蛋白酶IgG消化的A蛋白-保留的蛋白(包括Fc片段)；和(9)分子重量标准(从上开始：207、116、98、55、37、30、20和7kD)。
图3显示了如实施例7所述制备的一系列硝化纤维浸量尺(dipstick)。如图所示，该浸量尺用IgG或Fab或Fc片段点样，并且随后浸入包含金缀合的A蛋白的溶液。
图4显示了如实施例8所述制备的一系列硝化纤维浸量尺。该浸量尺用USR抗原点样，并且随后浸入包含金缀合的A蛋白和反应性的梅毒血清(R)或非反应性梅毒血清(NR)的溶液中。
图5为兔抗-人IgG(Fc)与胶态金的混合物的OD580作为pH的函数的图。如实施例9所述，用于这些试剂的得到稳定的金缀合物的pH是对应于最低OD580的pH。
图6为兔抗-人IgG(Fc)与胶态金的混合物的OD580作为兔抗-人IgG(Fc)浓度的函数的图。如实施例10所述，产生最低OD580的蛋白浓度表示与金颗粒结合的有用的兔抗-人IgG(Fc)的浓度。
图7显示了本公开方法可使用的横向流动装置的五个不同的物理实施方案的数字图像。(A)、(B)和(E)中所示的装置实施方案配置为使得各自可被浸入或部分淹没在样品或包含样品的溶液中。(C)和(D)中所示的装置实施方案配置为使得接受大量样品(或包含样品的溶液)滴入到进样口中。
图8为横向流动装置的物理实施方案的透视图，外壳的一部分被去掉，以显示装置的基本组件和它们的彼此关系。
图9是固定的类脂抗原的一个实施方案和捕获抗-类脂抗体分析物的示意图。
图10提供了用于同时检测梅毒中的密螺旋体和非密螺旋体抗体的示例性流通装置的实例。该装置配置为接受滴加到进样口(位于装置的中央)中的大量样品。
详细说明
I.引言
本文公开的是用于测定流体样品中，例如人血清中的抗-类脂抗体的存在和/或量的免疫测定装置。这种装置包括微孔性基底(例如硝化纤维、尼龙、聚偏二氟乙烯(PVDF)、聚醚砜、聚碳酸酯、聚酯、醋酸纤维素、混合的纤维素酯、或其组合)。底物尤其包括其中固定类脂抗原-锚定抗体配合物的抗-类脂捕获区域。这种配合物具有固定在基底上的锚定抗体组分，和被锚定抗体特异性结合从而被锚定在基底上的类脂抗原组分。类脂抗原组分包括心磷脂、卵磷脂和胆固醇，并且可以被抗-类脂抗体(例如存在于感染梅毒螺旋体的主体中的反应素抗体)特异性结合。
其它装置实施方案还包括样品实施区域和从样品实施区域到抗-类脂捕获区域的流动通道。样品实施区域与抗-类脂捕获区域为流体连续接触，使得置于样品实施区域的流体样品样品可以流过或沿着膜(例如通过毛细管作用或色谱流动)流动到抗-类脂抗体捕获区域。可以通过抗-类脂抗体与固定的类脂抗原-锚定抗体配合物之间形成配合物检测流体样品中抗-类脂抗体的存在和/或量。某些公开的装置还包括吸收剂衬垫，其与膜接触并且在样品接触捕获区域之后起到样品储库的作用。在特定的实例中，公开的装置是横向流动装置或流通装置。
在某些实施方案中，锚定抗体为心磷脂特异性Fab片段。在其它情况中，将从一个或多个感染梅毒螺旋体的主体分离的免疫球蛋白所产生的多种Fab片段用作锚定抗体。某些装置实施方案包括类脂抗原，即，USR抗原、VDRL抗原、或合成的VDRL抗原。在某些情况中(例如，对于流通装置)，底物(例如，硝化纤维膜)的孔径大小为约0.2μm到约8μm。在其它情况中(例如，对于横向流动装置)，基底(例如硝化纤维膜)的孔径大小最大为约12μm。在其它装置实施方案中，抗-类脂抗体捕获区域包括一个或多个线(lines)，在某些实例中，其可具有约8mm到约15mm的宽度。
在示例性的装置中，类脂抗原-锚定抗体配合物通过包括以下步骤的方法固定在膜上：(a)使类脂抗原与对于心磷脂、卵磷脂或胆固醇中至少一种具有特异性的一种或多种锚定抗体接触，以形成类脂抗原-锚定抗体配合物；和(b)对膜施加类脂抗原-锚定抗体配合物。在更具体的实例中，类脂抗原-锚定抗体配合物通过包括以下步骤的方法固定在膜上：(i)将对心磷脂、卵磷脂、或胆固醇中至少一种具有特异性的锚定抗体固定在膜上；(ii)封闭膜上的非特异性结合部位；(iii)使固定的锚定抗体与类脂抗原接触，以形成类脂抗原-锚定抗体配合物；和(iv)洗涤该膜，以除去任何未结合的类脂抗原。
公开的装置的实例提供了如下的锚定抗体：其与在类脂抗原的组分(例如，心磷脂或胆固醇)中天然存在的表位结合，而不与被引入到抗原中用于提供锚定抗体结合部位的衍生基团结合。例如，锚定抗体不与类脂抗原的生物素酰化的组分(例如生物素酰化的卵磷脂或心磷脂)结合。
在某些实施方案中，公开的免疫测定装置还包括密螺旋体捕获区域，其具有(a)能够被抗-梅毒螺旋体抗体特异性结合的固定的密螺旋体抗原，或(b)特异性地结合移动的密螺旋体抗原的固定的抗-梅毒螺旋体抗体。在这些实施方案中，施加在样品施加区域的流体样品可以流过或沿着膜流动到抗-类脂抗体捕获区域和到密螺旋体捕获区域。
另外，本文公开的是用于测定流体样品中抗-类脂抗体的存在和/或量的横向流动装置。这些装置一般包括样品施加区域和单独的其中提供固定的锚定抗体-类脂抗原配合物的抗-类脂抗体捕获区域，所述配合物对于流动相抗-类脂抗体具有特异性结合亲和力。施加在样品施加区域的任何流体(例如流体生物样品)沿着从样品施加区域到抗-类脂抗体捕获区域的流动通道流动。流动通道可以延伸到与横向流动装置结合的下游的吸收剂衬垫，所述吸收剂衬垫至少部分地起到流体储库的作用。可以检测在抗-类脂抗体和固定的类脂抗原配合物之间形成的配合物，以测定流体样品中抗-类脂抗体的存在和/或量。
在横向流动装置的某些实施方案中，缀合物衬垫(conjugate pad)处于从样品施加区域到抗-类脂抗体捕获区域的流动通道中。缀合物衬垫包括移动的或可移动的用于抗-类脂抗体的检测剂试剂，使得通过衬垫的流体流动使检测剂试剂移动到抗-类脂抗体捕获区域。在检测剂试剂、抗-类脂抗体、和锚定抗体-类脂抗原配合物之间形成的配合物提供可见的或以其它方式指示生物标本中存在抗-类脂抗体的可检测的指示剂。在可供选择的实施方案中，检测剂试剂不是在缀合物衬垫中提供，但是代之以施加于微孔膜，例如从展开剂瓶施加。
检测剂试剂的例子包括被标记的A蛋白、G蛋白、或抗-人抗体，其中标记是酶、胶态金颗粒、彩色乳胶颗粒、吸收蛋白的银颗粒、吸收蛋白的铁颗粒、吸收蛋白的铜颗粒、吸收蛋白的硒颗粒、吸收蛋白的硫颗粒、吸收蛋白的碲颗粒、吸收蛋白的碳颗粒、或结合蛋白的染料袋中的一种或者多种。
横向流动装置的某些实施方案还包括从样品施加区域开始的流动通道中的密螺旋体捕获区域。这种密螺旋体捕获区域可以包括，例如，对于移动的抗-梅毒螺旋体抗体具有结合亲和力的固定的密螺旋体抗原或对移动的梅毒螺旋体生物体或梅毒螺旋体抗原具有结合亲和力的固定的抗-梅毒螺旋体抗体。横向流动装置还可以具有对缀合物衬垫中的密螺旋体抗体有特异性的移动的或可移动的检测剂试剂。用于密螺旋体抗体的检测剂试剂可与用于抗-类脂抗体的检测剂试剂中在相同或不同的衬垫中。在具体的实施方案中，对于抗-梅毒螺旋体抗体具有特异性检测剂试剂包括金缀合的A蛋白、金缀合的Fc-特异性G蛋白、或金缀合的抗-人抗体(Fc部分)。在其它实施方案中，密螺旋体捕获区域可以包括抗-密螺旋体抗体，用于捕获存在于流体样品中的移动的密螺旋体抗原。在这种实施方案中，用于移动的密螺旋体抗原的检测剂试剂可为金标记的抗密螺旋体抗原抗体。
公开的免疫测定装置(例如，流通或横向流动装置)可用于检测抗-类脂抗体和/或诊断主体中梅毒的方法，通过将得自主体的生物样品(例如血液、血清、皮肤溃疡渗出液、尿、唾液或唾沫)施用于公开的装置，并且检测捕获区域中的在抗-类脂抗体、锚定抗体-类脂抗原配合物和抗-类脂抗体检测剂试剂之间形成的配合物。检测捕获区域中配合物的形成检测与梅毒螺旋体感染或疾病梅毒有关的抗-类脂抗体。在其中装置包括在样品施加区域到心磷脂捕获区域的流动通路中的缀合物衬垫的那些方案中，检测的配合物包括移动的或可移动的检测剂。在其中从外部来源将检测剂试剂施用于装置的其它实施方案中，被检测的配合物包括外部施用的检测剂。在一些实施方案中，检测剂试剂是被标记的A蛋白、Fc特异性的G蛋白、或抗-人抗体。
在该方法的特别有利的实施方案中，公开的装置能够检测抗-类脂抗体(例如，活性感染(active infection)的指示剂)和抗密螺旋体抗体(例如，验证非密螺旋体检验的反应性)。在包括密螺旋体抗原的装置的那些实施方案中，该方法包括检测捕获区域中在抗-梅毒螺旋体抗体、固定的密螺旋体抗原、和检测剂试剂之间形成配合物。与用于抗-类脂抗体的检测剂试剂的情况一样，用于密螺旋体抗体的检测剂试剂可以在装置上提供，或者从外部来源施加。
另外，本文公开的是用于将免疫活性的心磷脂固定在固相支持体(例如，硝化纤维)上的方法。这种方法包括(a)使类脂抗原(包括免疫活性的心磷脂)与对于类脂抗原的至少一种组分为特异性的一种或多种抗体接触，以形成类脂抗原-抗体配合物；和(b)将类脂抗原-抗体配合物施加到固相支持体；其中对固相支持体施加类脂抗原-抗体配合物使免疫活性的心磷脂固定在固相支持体上。在具体的实例中，类脂抗原为USR抗原、VDRL抗原、或合成的VDRL抗原。在其它实例中，抗体是实质上不与A蛋白、Fc特异性的G蛋白、或抗-人抗体(Fc部分)(例如，Fab片段)反应的抗体片段。在其它实例中，从梅毒螺旋体感染的或梅毒螺旋体接种的主体的血清分离抗体。
用于使免疫活性的心磷脂固定在固相支持体上的其它示例性方法包括(a)将对于心磷脂、卵磷脂和/或胆固醇为特异性的一种或多种抗体固定在固相支持体上；(b)封闭固相支持体上的非特异性结合部位；(c)对固相支持体施加包括免疫活性的心磷脂、卵磷脂和/或胆固醇的类脂抗原，以形成类脂抗原-固定的抗体配合物；和(d)洗涤固相支持体以除去没有被一种或多种固定抗体特异性结合的任何类脂抗原。
本文还公开了用于诊断梅毒的试剂盒。这些试剂盒包括公开的装置(例如流通装置或横向流动装置)和用于对样品施加区域或装置施加生物样品的说明书。试剂盒也可包括用于解释检验结果的说明书。
公开的装置也可用于通过分析得自主体的生物样品诊断主体狼疮(lupus)的方法，通过对装置施加生物样品并且检测在捕获区域中在抗-类脂抗体、锚定抗体-类脂抗原配合物、和检测剂试剂之间形成配合物。检测捕获区域中配合物形成检测与狼疮相关的抗-类脂抗体。在有些情况中，对于检测狼疮而言，有一种或多种辅因子(例如，β2-糖蛋白I)存在(例如，被加入到样品中)。
II.缩写和术语
Ab    抗体
HPLC  高压液相色谱
LFD   横向流动装置
PEG   聚乙二醇
PVA   聚乙烯醇
PVDF  聚偏二氟乙烯
PVP   聚乙烯基吡咯烷酮
SDS   十二烷基硫酸钠
USR   未受热的血清反应素(unheated serum regain)
除非另作说明，术语根据常规的用法使用。分子生物学中常见术语的定义可见Benjamin Lewin，Genes V，由Oxford University Press出版，1994(ISBN 0-19-854287-9)；Kendrew等人(eds.)，The Encyclopediaof Molecular Biology，由Blackwell Science Ltd.出版，1994(ISBN0-632-02182-9)；和Robert A.Meyers(ed.)，Molecular Biology andBiotechnology：a Comprehensive Desk Reference，由VCH Publishers，Inc.出版，1995(ISBN 1-56081-569-8)。
为了便于对本发明的各个实施方案进行评论，提供以下专用名词的说明：
被分析物：试图进行检测或测量能够特异性结合本文中所述的被固定的类脂抗原的对象，例如原子、分子、分子组或天然或合成来源的化合物(例如，药物、激素、酶、生长因子、抗原、抗体、半抗原、外源凝集素、脱辅基蛋白、或辅因子)。被分析物可包括但不限于生物学被分析物、抗体、药物、激素、抗原、半抗原、外源凝集素、脱辅基蛋白、或辅因子。在一些实施方案中，被分析物包括响应于梅毒螺旋体感染产生的抗体，例如抗-类脂抗体(例如，抗心磷脂抗体)。在其它实施方案中，被分析物包括响应于任何以下因素所产生的抗-类脂抗体：(i)自身免疫性疾病，例如狼疮，(ii)各种静脉和动脉血栓性病症，包括脑梗塞，(iii)深静脉血栓形成，(iv)血小板减少。
抗体：由一种或多种多肽组成的蛋白质基本上由免疫球蛋白基因或免疫球蛋白基因的片段编码。已识别的免疫球蛋白基因包括κ、λ、α、γ、δ、ε和μ恒定区基因，以及无数的免疫球蛋白可变区基因。轻链被分类为κ或者或λ。重链分类为γ、μ、α、δ、或ε，其又分别定义免疫球蛋白类型IgG、IgM、IgA、IgD和IgE。
基本的免疫球蛋白(抗体)结构单位通常是四聚体。每个四聚体由两个相同的多肽链对组成，每对各有一个轻链(约25kD)和一个重链(约50-70kD)。每个链的N-末端定义主要负责抗原识别的约100到110或更多个氨基酸的可变区。术语“可变的轻链”(VL)和“可变的重链”(VH)分别是指这些轻链和重链。
抗体是响应于呈递给免疫系统的抗原而在植物和动物中天然产生的。天然产生的抗体可以在例如动物的血清中发现。例如，感染梅毒螺旋体的人一般地从感染破坏的宿主细胞产生至少针对梅毒螺旋体抗原的抗体和针对由密螺旋体感染产生的类脂物质的抗体(例如，抗-类脂抗体)。
抗体可以作为完整的免疫球蛋白或者作为通过使用各种肽酶消化或通过重组DNA方法产生的许多明确表征的片段存在。示例性的抗体片段包括例如，Fab、Fab’、F(ab’)2、Fv、Fd、dAb、互补决定区(CDR)、和单链抗体(scFv)。Fab片段是由VL、VH、CL和CH1结构域组成的单价片段；F(ab’)2片段是包括通过绞链区的二硫键连接的两个Fab片段的二价片段；Fd片段由VH和CH1结构域组成；Fv片段由抗体的单个臂的VL和VH结构域组成；dAb片段由VH结构域组成(参见，例如，Ward等人，Nature，341：544-546，1989；Fundamental Immunology，W.E.Paul，ed.，Raven Press，N.Y.，1993)。
尽管某些抗体片段是根据对完整抗体的消化而定义的，但是应该理解，Fab片段或其它抗体片段可化学上或通过利用重组DNA方法重新合成。因此，如本文中使用的术语抗体还包括通过修饰整个抗体产生的或使用重组DNA方法重新合成的抗体片段。
抗原：可以在动物中刺激产生或T细胞应答的化学或生物化学的化合物、组合物、结构、决定簇、抗原或其部分，包括被注射或吸收到动物中的组合物。抗原与特异性的体液或细胞免疫的产物反应，包括由异源免疫原诱导的那些。术语“抗原”包括所有的相关抗原表位。
[抗原特异性]超免疫血清：对特定的抗原(例如，类脂抗原和/或心磷脂)有特异性的多克隆抗血清，该抗血清是响应于用所关注的抗原(或包含或产生所关注抗原的生物体或其它组合物)重复攻击(例如，通过注射、感染或其它途径)而在主体中产生的。
抗-类脂抗体：对类脂抗原有特异性的抗体(例如IgM或IgG)(参见下文)。在有些情况中，抗-类脂抗体是响应于疾病状态，例如微生物(例如，细菌)感染而由主体(例如，人)的免疫系统产生的。例如，这个术语考虑了由于梅毒螺旋体感染产生的抗-类脂抗体。尽管不束缚于理论，但是认为感染梅毒螺旋体的主体的抗-类脂抗体是因为从宿主细胞释放的脂质和/或从密螺旋体释放的脂蛋白样物质和可能的心磷脂而产生的。抗-类脂抗体也可响应于非密螺旋体疾病而产生，包括例如(i)自身免疫性疾病，例如狼疮(Harris等人，Clin.Rheum.Dis.，11：591-609，1985)，(ii)各种静脉和动脉血栓性病症，包括脑梗塞(Harris等人，Clin.Exp.Rheumatol.，2：47-51，1984)，(iii)深静脉血栓形成(Mueh等人，Ann.Intern.Med.，92：156-159，1980)，(iv)血小板减少(Harris等人，Clin.Rheum.Dis.，11：591-609，1985)，(v)肺栓塞(Anderson and Ali，Ann.Rheum.Dis.，43：760-763，1984)，或(vi)伴有胎盘梗塞的复发性胎儿死亡(Derue等人，J.Obstet.Gynaecol.，5：207-209，1985)。在非密螺旋体疾病中发现的抗-类脂抗体可以在一种或多种辅因子(例如β2-糖蛋白I)的存在下特异性结合类脂抗原。
用于本文公开的方法和组合物(例如，装置)的某些实施方案的抗-类脂抗体可进行任何衍化，但是经常在主体的血清中发现。
结合亲和力：该术语是指一个分子在分子的一个位点结合另一个分子的强度。如果一个特定的分子结合于另一个特定的分子或者特异性地与其结合，则可以说这两个分子彼此表现出结合亲和力。结合亲和力与一对分子的缔合常数和离解常数有关，但是测量或测定这些常数对于本发明来说不是关键。相反地，如本文中使用的用于描述所述方法和装置中的分子之间相互作用亲和力通常为在实验研究中观察到的表观亲和力(除非另作说明)，其可用于比较一个分子(例如，抗体或其它特异性结合配偶体)结合两个其它分子(例如，被分析物和被分析物示踪剂缀合物)的相对强度。结合亲和力、缔合常数、和离解常数的概念是公知的。
生物样品：是指直接或间接得自主体的任何样品，包括全血、血浆、血清、眼泪、粘液、唾液、尿、胸膜液、脊髓液、胃液、汗液、精液、阴道分泌物、唾沫、得自溃疡和/或其它表面发疹(例如水泡、或脓疮)的流体、羊水、滑液、脑脊髓液、和/或组织、细胞或器官的提出物。生物样品也可为实验室研究样品，例如细胞培养上清液。样品是使用本领域技术人员公知的方法收集或获得的。
捕获区域：免疫测定装置(例如流通装置或横向流动装置)的、其中固定捕获试剂(例如锚定抗体-类脂抗原配合物)的区域。免疫测定装置可具有超过一个的捕获区域，例如“第一捕获区域”、“第二捕获区域”等等。经常将不同的捕获试剂固定在第一、第二、或其它捕获区域中。多个捕获区域在基底上可具有相对于彼此的任何取向；例如，第一捕获区域可在第二(或其它)捕获区域的远端或近端，反之亦然。或者，第一捕获区域和第二(或其它)捕获区域可彼此垂直取向，使得两个(或多个)捕获区域形成交叉或加号或其它符号。
抗-类脂抗体捕获区域：其中将能够被抗-类脂抗体(例如类脂抗原-锚定抗体配合物)特异性结合的抗原固定作为捕获试剂的捕获区域。
缀合物：当以动词形式使用时，术语“缀合”是指一个分子(例如，A蛋白、G蛋白、或抗-人IgG(Fc)抗体)对另一个分子(例如，胶态金)的偶联。这种偶联可以包括缀合物组分之间的共价或非共价(例如静电的或其它)相互作用。这种偶联可通过化学方法使用或不用连接基团实现。当以名词形式使用时，术语“缀合物”是指通过缀合形成的偶联的分子配合物。
检测：是指定量地或定量地测定研究的被分析物(例如，抗-类脂抗体和/或抗-梅毒螺旋体抗体或密螺旋体抗原)的存在。“检测配合物的形成”是指通过适合于观察与检测剂试剂结合的特定标记的任何方法检测包括检测剂试剂的配合物；例如目视观察彩色(或以其它方式可见的)标记、测量或目测检测荧光、化学发光或放射性标记。
检测剂试剂(或检测剂)：允许特异性检测被分析物(例如抗-类脂抗体)和捕获试剂(例如锚定抗体-类脂抗原配合物)之间的配合物的试剂(或一系列试剂)。关于检测剂试剂和具体的示例性检测剂试剂的进一步描述在以下提供。
乳液：两种不混溶流体的混合物，其中一相作为胶态分散体存在于被称为连续相、分散相或溶剂相的另一相中。某些乳液在静置无干扰时容易地分离。其它乳液可以在相当长的时间保持混合。
表位(或抗原决定簇)：抗体分子与之结合的抗原分子表面上的位点；通常，抗原具有几个或许多不同的抗原决定簇并且与许多不同特异性的抗体反应。“外源表位”是在所关注的抗原分子中非天然存在的表位，其一般地被加入到抗原分子中作为对外源表位特异性的抗体(或其它特异性结合配偶体)的结合位点。抗原分子可以化学地或以其它方式进行修饰，以包括外源表位。例如，抗原分子可以被生物素酰化(即，用生物素衍生)，从而产生可以被抗生物素抗体或其它生物素特异性结合配偶体(例如抗生物素蛋白或链霉抗生物素)特异性结合的外源生物素表位。在有些情况中，外源表位为“表位标记”。表位标记包括抗体可以特异性结合的肽序列(一般地少于约15个氨基酸，但是可以甚至是全长的蛋白序列)。通常已知的表位标记包括6-His、8-His、FLAG、HA、以及许多其它的。
免疫原性：能够引发生物体内免疫应答的性质。例如，当抗-类脂抗体具有结合心磷脂中存在的表位的能力时，心磷脂保持免疫原性。
标记：可通过光谱学、光化学、生物化学、免疫化学、电学、光学或化学的方法检测的结合于被分析物、被分析物类似物、检测剂试剂、或结合配偶体的任何分子或组合物。已经公开了标记的例子，包括酶、胶态金颗粒、彩色的乳胶颗粒(美国专利4,275,149、4,313,734、4,373,932和4,954,452，各自被并入本文作为参考)。有用的标记的另外的例子包括但不限于放射性同位素、辅因子、配体、化学发光或荧光剂、吸收蛋白的银颗粒、吸收蛋白的铁颗粒、吸收蛋白的铜颗粒、吸收蛋白的硒颗粒、吸收蛋白的硫颗粒、吸收蛋白的碲颗粒、吸收蛋白的碳颗粒、和吸收蛋白的染料袋。化合物(例如，检测剂试剂)对标记的连接可以如在螯合物等中那样通过共价键、吸附过程、疏水和/或静电结合、或这些键和相互作用的组合进行，和/或可以包括连接基团。
类脂抗原：能够被抗-类脂抗体特异性结合的包括(但不限于)心磷脂、卵磷脂和胆固醇的抗原。术语“类脂抗原”所考虑的心磷脂、卵磷脂和胆固醇的性质在说明书的其它地方详细论述。
微孔膜：具有微观大小的孔的薄膜或结构。微孔膜至少允许流体和可溶解的被分析物沿着膜移动或通过该膜，例如通过毛细管作用。膜用多种材料或原料的复合物制成，包括例如聚醚砜、尼龙、聚碳酸酯、聚酯、醋酸纤维素、混合的纤维素酯、聚偏二氟乙烯、和/或硝化纤维。非限制性的适合的孔径可为最大约0.22微米、约0.22微米到约0.45微米、约0.22微米到约0.65微米、约0.22微米到约0.8微米、约0.22微米到约1.2微米、约0.65微米到约3微米、约0.65微米到约5微米、约0.65微米到约8微米、约5微米到约10微米、或约5微米到约20微米。在具体的情况中，孔径大可为约0.22微米、约0.45微米、约0.65微米、约0.8微米、约1.2微米、约3微米、约5微米、约8微米、约10微米、或约20微米。本领域技术人员已知适合于横向流动或流通装置的任何膜都被考虑在术语“微孔膜”的范围内。
A蛋白和G蛋白：A蛋白是从金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)分离的蛋白。G蛋白是从链球菌分离的蛋白。两种蛋白都具有哺乳动物IgG的Fc部分的结合部位。天然的G蛋白还包含用于白蛋白的结合部位Ig的Fab区域、和膜结合区域，其可以导致非特异性结合；然而，重组的G蛋白已经被工程化以除去白蛋白、Fab、和膜结合位点，而保留Fc结合位点，这使得其对于IgG的Fc部分为特异性的。如本文中使用的，“G蛋白”是指的Fc特异性重组形式G蛋白(也称为“Fc特异性G蛋白”)。
特异性结合配偶体(或结合配偶体)：能够识别和结合另一个分子或组合物的特异性结构形态的分子或组合物。典型的特异性结合配偶体对包括抗原/抗体、半抗原/抗体、激素/受体、核酸链/互补核酸链、底物/酶、抑制剂/酶、碳水化合物/外源凝集素、生物素/(链霉)抗生物素蛋白、和病毒/细胞受体。
短语“特异性结合于”是指，与其它非特异性分子种类相比，第一分子种类(例如抗体)优先结合第二分子种类(例如该抗体识别的抗原)的能力。因此，短语“能够被…特异性结合”是指，与其它非特异性分子种类相比，第一分子种类(例如抗原)优先被第二分子种类(例如对于该抗原为特异性的抗体)识别和结合的能力。
主体：活的多细胞生物体，包括脊椎动物生物体，包括人和非人哺乳动物的种类。
除非另外说明，本文中使用的所有的技术和科学名词具有与本发明所述技术领域技术人员通常理解的相同的含义。单数的术语包括复数对象，除非上下文清楚地表明不是这样。同样地，词语“或”意在包括“和”，除非上下文清楚地表明不是这样。因此，“包括A或B”表示“包括A或B”或“包括A和B”。应该理解，所有的分子重量或分子质量数值是近似的，并且只用于描述。用于实践或检验公开的主题的适合的方法和材料描述如下；然而，这种材料和方法只是说明性的而非限制性的。还可以使用与本文中所述那些相似或相等的方法和材料。本文中提及的所有的出版物、专利申请、专利和其它参考文献都以适当规则允许的程度全文并入本文作为参考。在发生抵触的情况中，以本发明的说明书(包括对术语的说明)为准。
III.类脂抗原
类脂抗原是包含(但不限于)心磷脂、卵磷脂和胆固醇的任何抗原，该抗原能够特异性地结合抗-类脂抗体。在某些实例中，类脂抗原特异性地结合存在于梅毒螺旋体感染的主体(例如，人)中的抗-类脂抗体(例如，抗心磷脂抗体)。包括心磷脂(CL)、卵磷脂(L)和胆固醇(Ch)的类脂抗原已经长时间用于溶液分析以检测血清中的抗-类脂抗体(参见，例如，参见，例如，关于梅毒诊断的“非密螺旋体检验”的前述讨论)。先前用于溶液分析的具体的示例性的含CL/L/Ch的类脂抗原包括通常已知的VDRL、RPR、和USR抗原(例如，Venereal Disease ResearchLaboratory(VDRL)玻片检验，在Larsen等人(ed.)，A Manual of Testsfor Syphilis，9th Edition，Washington D.C.：American Public HealthAssociation，1998，pp.157-178；Pettit等人，“Unheated serum reagin[USR]test as a quantitative test for syphilis，”J.Clin.Microbiol.，15(2)：238-242，1982)，和Castro等人(Clin.Diagn.Lab.Immunol.，7(4)：658-661，2000)所述的VDRL抗原的合成形式(“合成的VDRL”)。不幸的是，这种抗原的类脂性质使其难以使任何这些抗原可靠地连接于固相支持体，例如吸水性(例如，微孔)膜，如硝化纤维或其它物质。因此，对于提供用于检测例如生物样品中的抗-类脂抗体的、基于膜的测定法(例如流通或横向流动免疫测定装置)有长久已知(但是以前未得到满足的)需要。这种免疫测定装置将改革例如以存在抗-类脂抗体为特征的梅毒和其它疾病的床边诊断。除了别的之外，本公开描述了用于固定类脂抗原(例如VDRL、USR、或合成的VDRL抗原)到膜支持体的方法；因此提供了满足本领域中长久已知的需要的方法。
正如以上的讨论，本文中所述的方法和组合物考虑了包括(包含或基本上由…组成)心磷脂、胆固醇和卵磷脂的类脂抗原。类脂抗原的这些示例性组分在以下更详细地描述。
A.心磷脂
心磷脂是具有由通过两个磷酸二酯桥连接的三个甘油分子组成的主链的心磷脂(具体地，1，3-双磷脂酰甘油)。心磷脂的外部的甘油部分的四个羟基各自被饱和或不饱和脂肪酸链(一般地长度为14到18碳)酯化。如本文中使用的，术语“心磷脂”考虑了具有任何分布的脂肪酸侧链的1，3-双磷脂酰甘油。因此，心磷脂的四个脂肪酸侧链可以具有独立变化的长度(例如，从约14到约25个碳、从约14到约22个碳、从约14到约20个碳、从约14到约18个碳、或从约14到约16个碳)和/或饱和度(例如，从完全饱和到约6个双键、从完全饱和到约4个双键、或从完全饱和到约2个双键)。本文中考虑的示例性脂肪酸侧链独立地包括肉豆蔻酰基(14:0)；棕榈酰基(16:0)；硬脂酰基(18:0)；油酰基(18:1)；肉豆蔻脑酰基(14:1)；棕榈油酰基(16:1)；岩芹酰基(18:1)；亚油酰基(18:2)；亚麻酰基(18:3)；二十碳烯酰基(20:1)；花生四烯酰基(20:4)；芥酰基(22:1)；DHA(22:6)；或神经酰基(24:1)。
在一些实施方案中，心磷脂是心磷脂的天然存在的形式。天然存在的心磷脂的脂肪酸组成通常根据各种天然存在的脂肪酸分布，例如棕榈酰基(16:0)；硬脂酰基(18:0)；油酰基(18:1)；和亚油酰基(18:2)。心磷脂的天然存在形式中最丰富的脂肪酸分子种类为90％亚油酸、随后是5％的油酸、和1％的棕榈酸。在其它实施方案中，心磷脂是非天然存在的形式(也称为“合成的心磷脂”)。合成的心磷脂的非限制性例子包括例如，四肉豆蔻酰基心磷脂、四油酰基心磷脂、四肉豆蔻酰基-双-(L-α-甘油基)磷酸、双(二棕榈酰基D，L-α-甘油基磷酰基)-1，3-甘油苄基醚二钠盐、双(二棕榈酰基D，L-α-甘油基磷酰基)-1，5-戊烷二醇二钠盐、双(二棕榈酰基D，L-α-甘油基磷酰基)-1，3-丙烷二醇二钠盐、双(二棕榈酰基D，L-α-甘油基磷酰基)-1，4-丁烷二醇二钠盐、双(二棕榈酰基D，L-α-甘油基磷酰基)-1，2-乙烷二醇二钠盐、双(二棕榈酰基D，L-α-甘油基磷酰基)-甲烷二醇二钠盐、双(二棕榈酰基D，L-α-甘油基磷酰基)-1，3-甘油二钠盐、双(苄基磷酰基)-1，3-丙烷二醇二钠盐、或D，L-α-二棕榈酰基双-磷脂酸。
“免疫活性的心磷脂”为特异性地与抗-类脂抗体(例如存在于患有梅毒或者感染有梅毒螺旋体的主体中的抗-类脂抗体)反应的心磷脂的任何形式(例如，天然存在的或合成的心磷脂)。
B.卵磷脂
卵磷脂是磷脂酰胆碱的通用名。磷脂酰胆碱是甘油磷脂，其通常是动植物中最丰富的磷脂。它是膜双层的关键结构单元，并且还是血浆中循环的主要磷脂。磷脂酰胆碱包含两个脂肪酸侧链。如本文中使用的，术语“卵磷脂”考虑了具有任何脂肪酸侧链分布的磷脂酰胆碱。因此，心磷脂的二个脂肪酸侧链可以具有独立变化的长度(例如，从约14到约25个碳、从约14到约22个碳、从约14到约20个碳、从约14到约18个碳、或从约14到约16个碳)和/或饱和度(例如，从完全饱和到约6个双键、从完全饱和到约4个双键、或从完全饱和到约2个双键)。本文中考虑的示例性脂肪酸侧链独立地包括肉豆蔻酰基(14:0)；棕榈酰基(16:0)；硬脂酰基(18:0)；油酰基(18:1)；肉豆蔻脑酰基(14:1)；棕榈油酰基(16:1)；岩芹酰基(18:1)；亚油酰基(18:2)；亚麻酰基(18:3)；二十碳烯酰基(20:1)；花生四烯酰基(20:4)；芥酰基(22:1)；DHA(22:6)；或神经酰基(24:1)。
在一些实施方案中，卵磷脂是卵磷脂的天然存在的形式。天然存在的卵磷脂的脂肪酸组成包括棕榈酰基(16:0)、棕榈油酰基(16:1)、亚油酰基(18:2)、硬脂酰基(18:0)、花生四烯酰基(20:4)、肉豆蔻酰基(14:0)、油酰基(18:1)、和亚麻酰基(18:3)。天然存在的卵磷脂中脂肪酸的相对百分比取决于卵磷脂的来源而改变(例如，Balint等人，J.Lipid Res.，6(1)：96，1965)。例如，据报导，人胆囊胆汁中的卵磷脂为约45％16:0、4％16:1、4％18:0、16％18:1、23％18:2、4％20:4，以及微量的18:3和14:0；并且据报道，人血浆中的卵磷脂为约35％16:0、1％16:1、14％18:0、17％18:1、17％18:2、14％20:4，以及微量的18:3和14:0。在其它实施方案中，卵磷脂是非天然存在的形式(也称为“合成的卵磷脂”)。
卵磷脂的非限制性例子包括例如：
  碳数   1-酰基   2-酰基
  14:0-14:0   肉豆蔻酰基   肉豆蔻酰基
  14:0-16:0   肉豆蔻酰基   棕榈酰基
  14:0-18:0   肉豆蔻酰基   硬脂酰基
  16:0-14:0   棕榈酰基   肉豆蔻酰基
  碳数   1-酰基   2-酰基
  16:0-16:0   棕榈酰基   棕榈酰基
  16:0-18:0   棕榈酰基   硬脂酰基
  16:0-18:1   棕榈酰基   油酰基
  16:0-18:2   棕榈酰基   亚油酰基
  16:0-20:4   棕榈酰基   花生四烯酰基
  16:0-22:6   棕榈酰基   二十二碳六烯酰基
  18:0-14:0   硬脂酰基   肉豆蔻酰基
  18:0-16:0   硬脂酰基   棕榈酰基
  18:0-18:0   硬脂酰基   硬脂酰基
  18:0-18:1   硬脂酰基   油酰基
  18:0-18:2   硬脂酰基   亚油酰基
  18:0-20:4   硬脂酰基   花生四烯酰基
  18:0-22:6   硬脂酰基   二十二碳六烯酰基
  18:1-14:0   油酰基   肉豆蔻酰基
  18:1-16:0   油酰基   棕榈酰基
  18:1-18:0   油酰基   硬脂酰基
  14:1-14:1   肉豆蔻脑酰基   肉豆蔻脑酰基
  14:1-14:1   肉豆蔻反油酰基   肉豆蔻反油酰基
  16:1-16:1   棕榈油酰基   棕榈油酰基
  16:1-16:1   棕榈反油酰基   棕榈反油酰基
  18:1-18:1   岩芹酰基   岩芹酰基
  18:1-18:1   油酰基   油酰基
  18:1-18:1   反油酰基   反油酰基
  18:2-18:2   亚油酰基   亚油酰基
  18:3-18:3   亚麻酰基   亚麻酰基
  20:1-20:1   二十碳烯酰基   二十碳烯酰基
  20:4-20:4   花生四烯酰基   花生四烯酰基
  22:1-22:1   芥酰基   芥酰基
  碳数   1-酰基   2-酰基
  22:6-22:6   DHA   DHA
  24:1-24:1   神经酰基   神经酰基
其它特定的卵磷脂实例包括但不限于DL-α-二肉豆蔻酰基卵磷脂、L-α-二肉豆蔻酰基脑磷脂、L-α-二棕榈酰基卵磷脂、二棕榈酰基L-α-甘油磷酸单胆碱盐、L-α-二肉豆蔻酰基卵磷脂、D-α-二肉豆蔻酰基卵磷脂、L-α-二硬脂酰基卵磷脂、硬脂酰基甘油卵磷脂、1，2-二油酰基-sn-甘油-3-胆碱磷酸(18:1)、1，2-二亚油酰基-sn-甘油-3-胆碱磷酸(18:2)、1，2-二肉豆蔻酰基-sn-甘油-3-胆碱磷酸(14:0)、1，2-二十五烷酰基-sn-甘油-3-胆碱磷酸(15:0)、1，2-二植烷酰基-sn-甘油-3-胆碱磷酸(16:0)、1，2-二棕榈酰基-sn-甘油-3-胆碱磷酸(16:0)、和1-棕榈酰基-2-油酰基-sn-甘油-3-胆碱磷酸。
C.胆固醇
在一个实施方案中，胆固醇是具有以下结构的类固醇：
Figure S2006800302626D00231
类固醇
已知胆固醇与膜或膜样结构(例如脂质体或胶束)中的磷脂(例如，心磷脂和卵磷脂)相互作用。在这些情况中，认为胆固醇分子是与磷脂的脂肪酸链平行取向的，并且胆固醇羟基与磷脂的头基相互作用。
在形成本文中公开的类脂抗原时，认为胆固醇稳定乳液(例如，胶束)。因此，对于本公开的目的，术语“胆固醇”包括能够稳定包含类脂抗原的乳液的胆固醇或其它胆固醇衍生物的任何形式。在某些实例中，稳定包含类脂抗原的乳液是指延长乳化的类脂抗原保持在溶液中的时间。例如，与包含较少或没有胆固醇的可比较的抗原相比，将胆固醇加到类脂抗原中可以使这种抗原保持分散在乳液的连续相中(例如，在乙醇溶液中)的时间延长5％、10％、15％或25％。
胆固醇衍生物的非限制性实例包括胆甾-5-烯-3β-基-6-氨基己基醚(AH-Chol；Zimmer等人，Eur.J.Pharm.Biopharm.，47(2)：175-8，1999)；聚(乙二醇)胆甾烯基醚(PEG(n)-Chols；Baba等人，Traffic，2(7)：501-12，2001；Ishiwata等人，Biochim.Biophys.Acta，1359(2)：123-35，1997)；由Nakanishi和Noguchi描述的具有羟乙基氨基头基的阳离子性胆固醇衍生物(Adv.Drug Deliv.Rev.，52(3)：197-207，2001)；胆固醇半琥珀酸盐(Meuillet等人，Eur.J.Pharmacol.，377(2-3)：241-52，1999；脱氢麦角甾醇(DHE)，其不同于具有三个另外的双键和额外的甲基的胆固醇(Mukherjee，Biophys.J.，75(4)：1915-1925，1998)；包含具有不同间隔臂的叔胺头基的胆固醇的阳离子性衍生物(Takeuchi等人，FEBS Lett.，397(2-3)：207-9，1996)；胆甾烯基-3β-羧酰胺基亚乙基二甲基胺(Noguchi等人，FEBS Lett.，433(1-2)：169-173，1998)；和N-[三[(β-D-半乳糖吡喃糖基氧基)甲基]甲基]-Nα-[4-(5-胆甾烯-3β-基氧基)琥珀酰基]甘氨酰胺(Kempen等人，J.Medicin.Chem.，27：1306-1312，1984)。可用于形成膜和膜样(例如，脂质体或胶束)结构(如公开的类脂抗原)的胆固醇衍生物的另外的例子在美国专利5,888,821、5,043,164、4,900,549、4,442,037、4,157,391、和4,544,545，和欧洲专利EP0606613中描述。
D.类脂抗原的制备
在CL/L/Ch类脂抗原实施方案中，心磷脂、卵磷脂和胆固醇可以任何比例合并，形成能够被抗-类脂抗体(例如，抗心磷脂抗体)特异性结合的抗原。在有些情况中，类脂抗原为胶束、脂质体、膜筏、或其它膜样结构的形式。在这些结构中，疏水性相互作用引起非极性组分(例如，脂肪酸链)聚集并且从“核心”排除水分子。如本领域技术人员理解的，胶束实质上为球状的(或以其它方式闭合的)非双层结构，具有由脂肪酸链组成的疏水性内部(并且不包括含水的中心)。比较起来，脂质体是比胶束更大的实质上球状排列的双分子层结构，并且环绕含水的中心。由CL/L/Ch混合物形成的结构类型取决于例如心磷脂和卵磷脂的脂肪酸链的长度和饱和度、温度、含水介质的离子组成、和将磷脂分散在溶液中的方式。在特定的实施方案中，CL/L/Ch类脂抗原(例如，VDRL、RPR、USR或合成的VDRL抗原)在含水溶液(例如乙醇溶液)中形成胶束。在更特定的实施方案中，类脂抗原在含水溶液(例如乙醇溶液)中形成胶束但是不形成脂质体。
用于公开的组合物或方法的类脂抗原可以商业上获得(例如，Fisher(Cat.No.B40765)、Fisher(Cat.No.22-415-132)、Fisher(Cat.No.23-038010)、True-Medix、IPX Overseas Corporation(Miami，FL，USA)、Cenogenics Corporation(Morganville，NJ，USA)、Nova Century Scientific(Niagara Falls，NY，USA)以及其它供应商)或者通过本领域通常已知的任何方法生产。在一个实施方案中，如实施例1所述生产类脂抗原。
在一些实施方案中，包含心磷脂、卵磷脂和胆固醇(CL/L/Ch)的非含水溶液与含水溶液混合，以形成乳液。可以使用其中心磷脂、卵磷脂和胆固醇各自是可溶解的(或部分可溶解的)任何非含水溶液，包括例如乙醇(例如无水乙醇、95％乙醇、或70％乙醇)、氯仿、己烷∶乙醇(例如，9∶1)、甲苯(例如，95％)、二氯甲烷、或苯。在一个实例中，在无水乙醇中制备CL/L/Ch。
在一些实施方案中，可用于制备类脂抗原的CL/L/Ch溶液可包括从约0.001％到约0.1％的心磷脂(例如，从约0.005％到约0.07％、从约0.008％到约0.05％、从约0.01％到约0.04％、或从约0.025％到约0.035％)；从约0.05％到约0.5％的卵磷脂(例如，从约0.07％到约0.4％、从约0.09％到约0.3％、从约0.1％到约0.25％、或从约0.14％到约0.21％)；和/或从约0.2％到约5％的胆固醇(例如，从约0.4％到约3％、从约0.7％到约2％、从约0.8％到约1％)。在特定的实例中，用于制备类脂抗原的CL/L/Ch溶液包括约0.03％心磷脂(例如，天然存在的心磷脂)、约0.21％卵磷脂(例如，天然存在的卵磷脂)、和约0.9％胆固醇。在另一个实例中，用于制备类脂抗原的CL/L/Ch溶液包括约0.03％四肉豆蔻酰基心磷脂、约0.14％1-棕榈酰基-2-油酰基-sn-甘油-3-胆碱磷酸和约0.9％胆固醇。
将用于制备类脂抗原的CL/L/Ch溶液与含水溶液混合以形成类脂抗原的乳液。含水溶液可以包括其中CL/L/溶液不混溶的任何溶液，例如盐溶液(例如，包括0.1-1.0M NaCl，例如0.55M NaCl)。一种示例性的含水溶液包括0.55M NaCl、0.05％(v/v)甲醛、0.26mM，0.35mM到0.66mM磷酸氢二钠(分别用于十二水合物(12·H2O)、七水合物(7·H2O)、或无水形式)、和1.2mM钾。
CL/L/Ch溶液与含水溶液的比例可为导致形成类脂抗原乳液(例如，包含CL/L/Ch的胶束)的任何比例。在某些实例中，CL/L/Ch溶液与含水溶液的比例为约1∶10、约1∶15、约2∶33、或约1∶20。在其它实例中，乳液中CL/L/Ch溶液的百分比为约3％(v/v)、约5％(v/v)、约8％(v/v)、约10％(v/v)、或约12％(v/v)。
IV.固定类脂抗原的方法
已知人血清中的抗-类脂抗体(例如，反应素)与包含心磷脂、卵磷脂和胆固醇的脂质抗原(例如，RPR、VDRL、USR、或合成的VDRL抗原)反应。正如以上的讨论，这个知识形成了基于溶液的非密螺旋体血清学检验的基础。尽管对用于梅毒检验的基于膜的测定法有长久已知的需要，但是以前没有人认识到可以使用，作为一个实例，抗-类脂抗体，将包含CL/L/Ch的类脂抗原固定在膜(或其它固相支持体)上，所述抗体是针对用于检测的抗原特定地设计的。与只有一个用于被检测抗体的结合部位的许多其它抗原不同，类脂抗原具有许多用于抗-类脂抗体的结合位点。因此，如本文中公开的，可以特异性结合类脂抗原的抗-类脂抗体或其它抗体(或者，在特定的实例中，这种抗体的片段，例如Fab片段)的不饱和量可用于将类脂抗原与例如膜表面(包括硝化纤维、尼龙和其它)的固相支持体锚定，而不会不利地影响固定的类脂抗原进一步特异性结合存在于流动相(例如生物样品)中的抗-类脂抗体的能力。
A.锚定抗体
在公开的组合物和方法用于将类脂抗原固定于固相支持体(例如微孔膜)的抗体包括能够特异性结合类脂抗原的任何抗体，包括例如得自梅毒螺旋体感染的或梅毒螺旋体接种的主体(例如，人或兔)的抗-类脂抗体、抗胆固醇抗体、抗心磷脂抗体、或抗卵磷脂抗体。如以下更详细地描述的，具有前述特异性的抗体的抗原结合片段(例如，Fab片段)也可用作公开的组合物和方法中的锚定抗体。锚定抗体可为单克隆的或多克隆的。在具体的实施方案中，锚定抗体为多克隆的(例如，从梅毒螺旋体感染的人或兔的超免疫血清分离的那些抗体)。
得自梅毒螺旋体感染的或梅毒螺旋体接种的主体的多克隆抗-类脂抗体可以通过例如从市售的血清分离这种抗体或使用本领域中通常已知的方法生产并且分离这种多克隆抗体而得到。得自梅毒螺旋体感染的人的血液制品(例如，血清)的商业供应商包括New York BloodCenter(New York，NY，USA)；Biomedical Resources(Hatboro，PA，USA)；Life Diagnostics，Life Therapeutics的分部(原来的Serologicals)(Clarkston，GA，USA)；和Teragenix(原来的Millennium Biotech，Inc)(Ft.Lauderdale，FL，USA)。在其它实施方案中，可以通过用梅毒螺旋体和/或类脂抗原(例如，VDRL抗原)使宿主动物(例如兔、小鼠、马、山羊和其它)免疫生产包含抗-类脂抗体的多克隆抗血清。用于单克隆或多克隆抗体生产的详细步骤在Harlow和Lane(antibodies，A LaboratoryManual，CSHL，New York，1988)中描述。用于使用包含免疫原的CL/L/Ch在宿主动物中生产抗体的具体的非限制性方法已经由例如，Inoue和Nojima(Biochim.Biophys.Acta，144(2)：409-414，1967)描述。有具体的非限制性流程可用于通过用梅毒螺旋体感染宿主动物生产抗-类脂抗体(参见，例如，Perine等人，Infect.Immun.，8(5)：787-790，1973)。此外，有定制的抗体生产服务(参见，例如，Spring Valley Laboratories(Woodbine，MD，USA)；Maine Biotechnology Services(Portland，ME，USA)；CovalAb UK(Cambridge，United Kingdom)；21st CenturyBiochemicals(Marlboro，MA，USA)和许多其它来源)。这种商业服务可用于生产类脂-抗原特异性多克隆或单克隆的抗体。
在涉及包含抗-类脂抗体的抗血清的实施方案中，可以使用公知的方法从血清分离抗体级分。市售的试剂盒适合用于从血清分离抗体(包括抗-类脂抗体)。这种试剂盒得自例如Millipore(Billerica，MA，USA)，Pierce(Rockford，IL，USA)；BioRad(Hercules，CA，USA)和许多其它来源。从血清分离抗-类脂抗体的一个具体的非限制性方法在实施例2-3中描述。
可用于公开的组合物和方法方法中的其它示例性锚定抗体包括抗胆固醇抗体和抗-心磷脂抗体。抗胆固醇抗体存在于人血清中并且可以如上对于抗-类脂抗体所述进行分离。用于生产和/或分离抗-胆固醇抗体的具体的抗-胆固醇抗体和/或流程可以在Kruth等人(J.Lipid Res.，42：1492-1500，2001)、Alving等人(Biochem.Soc.Trans.，17：637-639，1989)、Swartz等人(Proc.Natl.Acad.Sci.USA，85：1902，1988)、Stollar等人(Mol.Immunol.，26(1)：73-79，1989)、和PCT公开WO 00/06200、WO 97/21099、和WO 02/083100中发现。纯化的抗-心磷脂抗体为市售的，例如购自United States Biological(Swampscott，MA，USA；例如，Cat.No.C1375)。
优选用于本发明组合物和方法的锚定抗体(i)不与其它抗原结合的锚定抗体凝集，和(ii)不显著地与用于检测所关注的被分析物(例如，存在于样品中的抗-类脂抗体)的试剂(或一系列试剂)结合(或与之反应)。
凝集是其中多价的多价抗体通过它们相应的抗原桥接形成交联网络的过程，所述抗原必须具有至少两个用于所关注抗体的结合部位(称为“多价抗原”)。在这种情况下，单个的抗体可以结合于两个不同的抗原，两个不同的抗体可以结合于相同的抗原。多价抗体在某些浓度下与多价抗原发生凝集。避免锚定抗体与类脂抗原(性质上是多价的)凝集的一个示例性方法是使用Fab(或其它单价的)抗体片段来锚定类脂抗原。单价的抗体片段不能结合两个抗原，从而不能交联两个不同的抗原。生产单价抗体片段的方法为本领域中公知的。用于生产和分离Fab片段的一个非限制性方法在实施例5中提供。
用于避免凝集的可供选择的非限制性方法是在不存在类脂抗原的情况下对固体表面(例如，基于膜的免疫测定装置的膜)施加锚定抗体(无论化合价如何)；然后使类脂抗原结合于固定的抗体。在这个可供选择的方法中，抗体和抗原被物理上阻止实质上的交联。
B.固相支持体
固相支持体(或底物)为不溶性的、或者可通过随后的反应使其为不溶性的任何物质。本文中公开的固定类脂抗原的方法可使用任何固相支持体，锚定抗体以这样的方式与所述固相支持体连接，即，当用水溶液洗涤时(例如与流体样品(例如生物样品)接触时)，所述连接实质上阻止分离。用于公开的免疫测定装置的优选固相支持体实施方案包括微孔膜，例如硝化纤维、尼龙、聚偏二氟乙烯(PVDF)、聚醚砜、聚碳酸酯、聚酯、醋酸纤维素、混合的纤维素酯、或其组合。
固相支持体的表面可通过化学处理以引起试剂(例如，锚定抗体或锚定抗体-类脂抗原配合物)对支持体的共价连接而活化。然而，任何其它适合的方法都可以用于将试剂(例如，锚定抗体或锚定抗体-类脂抗原配合物)固定于固相支持体，包括但不限于离子相互作用、疏水性相互作用、共价相互作用等。引起试剂固定在固相上的特定的力对于本文中所述的方法和装置不是决定性的。
可以根据吸引和固定试剂例如捕获试剂的固有能力选择固相。或者，固相可具有能够吸引和固定试剂例如锚定抗体或锚定抗体-类脂抗原配合物的因子。因子可以包括带电的物质，其带有与例如锚定抗体或锚定抗体-类脂抗原配合物、或与锚定抗体或锚定抗体-类脂抗原配合物缀合的带电物质相反的电荷。
许多和各种固相支持体为本领域中已知的那些，包括但不限于吸水性膜或者微孔膜(例如，硝化纤维、尼龙或PVDF)、反应托盘的孔壁、试管、聚苯乙烯珠、磁珠、和微粒(例如乳胶颗粒)。对于某些膜的实施方案，硝化纤维的多孔结构对于多种试剂(例如，锚定抗体或锚定抗体-类脂抗原配合物)有优异的吸收和吸附性质。尼龙具有相似的特征，也是适合的。微孔结构也有用，如在水合状态具有凝胶结构的材料。
有用的固相支持体的另外的实例包括：天然的聚合物碳水化合物和它们的经合成修饰的、交联的或取代的衍生物，例如琼脂、琼脂糖、交联的海藻酸、取代和交联的瓜尔胶、纤维素酯(特别是与硝酸和羧酸类的酯)、混合的纤维素酯、和纤维素醚；含氮的天然聚合物，例如蛋白质和衍生物，包括交联或修饰的明胶；天然的烃类聚合物，例如乳胶和橡胶；可制备为具有适当多孔结构的合成聚合物，例如乙烯基聚合物，包括聚乙烯、聚丙烯、聚苯乙烯、聚氯乙烯、聚乙酸乙烯酯及其部分水解的衍生物、聚丙烯酰胺、聚甲基丙烯酸酯、上述缩聚物的二元共聚物和三元共聚物，例如聚酯、聚酰胺、和其它聚合物，例如聚氨酯或聚环氧化物；多孔的无机材料，例如碱土金属和镁的硫酸盐或碳酸盐，包括硫酸钡、硫酸钙、碳酸钙，碱金属和碱土金属、铝和镁的硅酸盐；和铝或硅的氧化物或水合物，例如粘土、铝土、滑石、白陶土、沸石、硅胶、或玻璃(这些材料可与上述聚合材料用作过滤器)；和上述类别的混合物或共聚物，例如通过使合成的聚合物与之前存在的天然聚合物聚合得到的接枝共聚物。
除了在其他方面的物理上的限制之外，固相支持体可以任何适合的形状使用，例如薄膜、片、条或板，或者可将其涂布或结合或层压到适当的惰性载体上，例如纸、玻璃、塑料膜、或织物。
C.将锚定抗体-类脂抗原配合物固定
在一些实施方案中，通过在溶液中使类脂抗原与对该类脂抗原为特异性的锚定抗体(例如，抗-类脂抗体、抗-胆固醇抗体、抗-卵磷脂抗体、和/或抗-心磷脂抗体、和/或前述任何的抗原结合片段)接触以形成类脂抗原-锚定抗体配合物(或配合物)而将类脂抗原固定在固相支持体上。在特别的实施方案中，在溶液中使类脂抗原接触对于类脂抗原(例如，从感染有梅毒的人的血清或得自其它梅毒螺旋体感染或接种的主体的血清中的免疫球蛋白分离的Fab片段)为特异性的Fab片段。
类脂抗原-锚定抗体配合物具有多肽组分(即，锚定抗体)和脂质组分(即，类脂抗原)。与脂质相反，本领域中公知多肽(例如，蛋白质)强烈地粘附(通过未完全表征的相互作用)于许多类型的固相支持体，特别是粘附于膜支持体(如硝化纤维、尼龙或PVDF)(参见，例如，Harvey，Optimization of Nitrocellulose Membrane Based Immunoassays，Keene，NH：Schleicher and Schuell，1991；Wallis等人，Ann.Rev.Microbiol.，33：413-437，1979；Presswood，Membrane Filtration：Applications andProblems，New York，NY：Marcel Dekker，1981；Farrah等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，78：1229-1232，1981；Batteiger等人，J.Immunol.Meth.，55：297-307，1982；Tijssen，Practice and Theory of Immunoassays，8th ed，Amsterdam：The Netherlands Elsevier，1993)。因此，通过其与多肽组分(例如，锚定抗体)的结合，现在也有可能将类脂抗原强烈地粘附(例如，固定)于固相支持体(例如，硝化纤维、尼龙、或PVDF)。因此，本发明公开的方法(和生产公开的组合物的方法)考虑了使固相支持体(例如微孔膜)与抗原-抗体配合物的溶液接触，其中通过这种接触，抗原-抗体配合物变得实质上固定在固相支持体上。在某些实例中，在满足以下条件时，锚定抗体-类脂抗原配合物实质上固定在固相支持体上：在支持体接触流体样品足以使流体样品湿润固相支持体的时间(例如，足以使流体样品沿着膜条移动并且接触其中固定类脂抗原的区域的时间)时，有至多约1％、至多约2％、至多约5％、至多约10％、或至多约25％的抗原-抗体配合物从固相支持体分离。
为了使类脂抗原固定于固体表面，还考虑了可以在没有类脂抗原的存在下使固体表面(例如，硝化纤维、尼龙或PVDF)接触锚定抗体(例如，在溶液中)。正如以上的讨论，多肽锚定抗体强烈地粘附于固体表面，并且被固定。其后，使固定的锚定抗体接触类脂抗原(例如，在溶液中)。类脂抗原被固定的锚定抗体特异性结合用以固定抗原。正如以上的讨论，这种抗原固定技术可用于避免在其中锚定抗体是多价的并且能够在多价抗原的存在下介导凝集的情况中的凝集。
在其中期望使用固定的类脂抗原检测类脂-抗原结合的被分析物(例如抗-类脂抗原)的情况中，固定的抗原具有暴露的被分析物结合部位是有利的。因此，在前述情况中，使用不会饱和(例如，封闭)类脂抗原上大多数(或基本上所有)的被分析物结合部位的锚定抗体量以形成锚定抗体-类脂抗原配合物。锚定抗体-类脂抗原配合物中锚定抗体的未饱和量是允许被分析物(例如，流动相中的抗-类脂抗体)可检测地结合配合物的类脂抗原组分的这种抗体的任何量。在某些实例中，可用的抗-类脂抗体结合位点的至多约1％、至多约5％、至多约10％、至多约25％、至多约30％被锚定抗体封闭。在其它实例中，在1μl体积中的从10ng到约1000ng的锚定抗体与等体积的如实施例1中所述制备的类脂抗原反应。在具体的实例中，使用25ng到约750ng、50ng到约600ng、约100ng到约500ng、或约150ng到约400ng的锚定抗体制备锚定抗体-类脂抗原配合物。
图9图解了类脂抗原(例如，USR抗原)通过锚定抗体(例如，抗-类脂Fab)附着于固相支持体(例如，硝化纤维膜)的一个特定实施方案。该图另外图解了来自示例性样品(例如，血清样品)的抗-类脂抗体被固定的类脂抗原捕获和检测剂、被捕获的抗-类脂抗体、抗原和锚定抗体之间的关系。
特定的实例排除了使用对于被加入到类脂抗原组分中用作锚定抗体的表位的衍生物基团(例如，生物素、6-His、FLAG、或其它表位标记)为特异性的锚定抗体使类脂抗原锚定于底物。这种实例没有排除包括衍生化的心磷脂、衍生化的卵磷脂和/或衍生化的胆固醇作为类脂抗原组分；然而，在这种实例中，这种衍生化的组分的衍生基团不起到锚定抗体的表位的作用。
1.对微孔膜施加锚定抗体-类脂抗原配合物
一些公开的方法和组合物考虑了要被连接于微孔膜(例如硝化纤维、尼龙或PVDF)的锚定抗体-类脂抗原配合物(也称为“捕获试剂”)。膜用于固定捕获试剂和提供表面供施加的样品流过或通过。硝化纤维(无论是纯的或以本领域已知的任何方式进行修饰的)是用于公开的装置和方法的优选的膜。认为硝化纤维通过氢键、疏水性相互作用、和通过静电机制结合蛋白质(参见，例如，Millipore Corporation，A ShortGuide Developing Immunochromatographic Test Strips，2nd Edition，pp.1-40，1999，索取电话(800)645-5476)。
对于含蛋白的捕获试剂，例如锚定抗体-类脂抗原配合物，认为硝化纤维的硝酸酯的偶极与蛋白的肽键的强偶极相互作用。施用溶液中的高浓度盐、洗涤剂、和水可以削弱硝化纤维膜和对膜施加的蛋白质之间的静电相互作用，或使其不稳定化。因此，尽管不需要，但是优选使用低摩尔浓度的缓冲液，例如2-10mM的磷酸盐、硼酸盐或碳酸盐缓冲液，用以溶解用于固定在硝化纤维上的含蛋白的捕获试剂。
施用溶液的pH可以(但不必须)进行调节，以增加捕获试剂对硝化纤维膜的结合。例如，在施用溶液的pH为含蛋白的捕获试剂的pI的约+/-1pH单位范围内时，施用溶液中的含蛋白的捕获试剂的溶解度最小。
任选地，可以向施用溶液加入1到5％的甲醇、乙醇或异丙醇。可以手动或自动的方式对膜施加施用溶液。例如，可使用试剂分配模件(例如，Matrix 1600，Kinematic Automation，Twain Harte，CA)对微孔膜(例如，硝化纤维)施加捕获试剂。
一般地，在公开的方法和装置中，将微孔膜封闭不是必要的。例如，存在于可以被加入到例如横向流动装置的样品衬垫或缀合物衬垫中的样品和其它封闭试剂中的蛋白质通常足以防止被分析物非特异性地结合在膜上。如果任选的应用期望任选地将膜封闭，则有用的封闭试剂包括例如明胶(0.1％-0.5％)、脱脂奶粉(0.5％-2％)、酪蛋白(1％-2％)、BSA(1％-2％)、IgG(1％-2％)、PVP 8-10kD(0.5％-1.0％)、和PVA 8-10kD(0.5％-1.0％)。
V.免疫测定装置
本文发现的将类脂抗原(例如，VDRL和/或USR抗原)固定于固相支持体(例如，微孔膜，如硝化纤维、尼龙或PVDF)的方法使得能够生产用于检测结合类脂-抗原的被分析物(例如，得自梅毒螺旋体感染主体的生物样品中的抗-类脂抗体)的免疫测定装置。在某些实例中，公开的免疫测定装置允许检测生物样品中抗-类脂抗体的存在(或不存在)，用以诊断梅毒。
A.典型的免疫测定装置形式和相关信息
免疫测定装置允许进行目测鉴定流体样品中被分析物的存在(或不存在)的便宜的、一次性的、基于膜的测定法。这种装置通常布置为独立的浸量尺(例如，检测条)或作为具有某些外壳的装置。一般地，免疫测定装置可利用少到约200μl的流体样品，并且样品中被分析物的检测可以(但是不必须)在2-5分钟内完成。在临床检验中，样品可为尿、血、血清、唾液、或其它体液。在非临床检验中，样品可为从土壤、灰尘、植物、或食物制备的少量溶液，并且同样直接施用于膜检测条。大多数情况中，不需要辅助的仪器进行这种检验，并且这种装置可被容易地用于诊所、实验室、野外场所、和家中，甚至由无经验的人使用。
已经开发流免疫测定装置用于使用不同的生物样品(例如，尿、血清、血浆、血、唾液)常规鉴定或监测生理学和病理学状况(例如，感染性疾病、怀孕、癌症、内分泌病症)，和用于分析环境样品(例如，天然流体和工厂污水)，例如，污染。这些检验中有许多是基于特异性结合对之间的非常特异性的相互作用。这种结合对的实例包括抗原/抗体、半抗原/抗体、外源凝集素/碳水化合物、脱辅基蛋白/辅因子和生物素/(链霉)抗生物素蛋白。此外，许多这些检验包括如下装置(例如，固相、横向流动检测条、流通检验)，其具有附着于移动的或固定的固相物质例如乳胶珠、玻璃纤维、玻璃珠、纤维素条或硝化纤维膜(美国专利4,703,017、4,743,560、5,073,484)的结合对的一个和多个成员。
免疫测定法的一个要素类别是“夹心”测定法。通常，夹心免疫测定方法要求将可以包含所关注的被分析物(例如，抗-类脂抗体)的样品与特异性地识别被分析物检测剂试剂(例如金缀合的A蛋白，金缀合的G蛋白)、或对于抗-类脂抗体为特异性的金缀合的第二抗体(例如，抗-人Ab或抗-人Ab(Fc)第二抗体)混合。检测剂试剂是移动的并且一般地连接于标记或另一种信号试剂，例如染色的乳胶、胶态金属溶胶、或放射性同位素。然后将这个混合物施加给包含被所关注的被分析物识别的固定抗原的谱带或区带的色谱介质(例如微孔性或吸水性膜，如硝化纤维、尼龙或PVDF)。色谱介质经常为与浸量尺相似的条的形式、或者可被并入例如在横向流动装置或流通装置中的外壳中。当被检测的分子与检测剂试剂的配合物到达色谱介质上固定抗原的区带时发生结合并且检测剂试剂被定位在该区带。这表明被检测分子的存在。这项技术可用于得到定量或半定量的结果。在检测条上进行夹心免疫测定法的实例在例如美国专利4,168,146和4,366,241中描述。
在基于膜的免疫测定法的其它常见形式(如由一些家用受孕和排卵检测试剂盒所代表的)中，将检测条(或浸量尺)“浸入”怀疑包含被分析物的样品中。然后同时或在孵育期之后加入酶标记的检测剂试剂。然后将装置洗涤，并插入包含该酶的底物的第二溶液中。如果存在，则酶标记引起形成彩色产物，其或者作为沉淀物沉淀在固相上，或者在底物溶液中生产可见的变色。EP-A 0 125 118描述了这种夹心型浸量尺免疫测定法。EP-A 0 282 192描述了用于竞争型测定法的浸量尺装置。
流通类型免疫测定装置被部分地设计排除对浸量尺测定法所涉及的孵育和洗涤步骤的需要。流通免疫测定装置包括捕获试剂(例如锚定抗体-类脂抗原配合物)，所述捕获试剂结合于用于加入流体样品的多孔膜或过滤器。当流体流过该膜时，目标被分析物(例如，抗-类脂抗体)结合于捕获试剂。加入样品之后，加入检测剂试剂(例如金缀合的A蛋白或金缀合的抗-人IgG(Fc))。或者，可以这样的方式将检测剂试剂置于膜上，使得允许检测剂与样品混合并且从而标记被分析物。检测剂试剂的视觉检测提供样品中存在目标被分析物的指示。典型的流通免疫测定装置在美国专利4,246,339、4,277,560、4,632,901、4,812,293、4,920,046、和5,279,935，和美国专利申请20030049857和20040241876中描述。
迁移测定装置通常在它们内部并入已经附着于彩色标记的试剂，从而允许视觉检测测定结果，而无需加入另外的物质。参见，例如，美国专利4,770,853，PCT申请WO 88/08534和欧洲专利EP-A 0 299 428。
有许多市售的横向流动型检验和专利公开的方法用于检测大的被分析物(MW大于1,000道尔顿)。美国专利5,229,073描述了用于测量血浆脂蛋白水平的半定量的竞争性免疫测定横向流动方法。这种方法利用包含固定的抗体的多个捕获区带或线，用以结合被标记的和自由的脂蛋白，以产生半定量结果。
美国专利5,591,645提供了具有至少两个部分的色谱用检测条。第一个部分包括可移动的示踪剂，第二部分包括能够结合于被分析物的固定的粘合剂。用于大的被分析物的横向流动检验的另外的实例在以下专利文献中公开：美国专利4,168,146、4,366,241、4,855,240、4,861,711、和5,120,643；欧洲专利0296724；WO 97/06439；和WO98/36278。
还有用于检测小的被分析物(MW 100-1,000道尔顿)的横向流动型检验。通常，这些小的被分析物检验包括“典型的”竞争性抑制以生产否定的或间接的报告结果(即，随着被分析物浓度的增加，信号减小)，如美国专利4,703,017所例证的。然而，已经开发了几个方法用于使用产生肯定的或直接的报告结果(即，随着被分析物浓度的增加，信号增加)的横向流动检验检测小的被分析物。这些包括例如美国专利5,451,504、5,451,507、5,798,273和6,001,658。
美国专利5,451,504提供具有三个特异性区带(流通、捕获和检测)的方法，每个区带包含不同的乳胶缀合物以得到阳性的信号。移动区带包含被标记的抗体，以结合样品中的被分析物。在捕获区带中，未被结合的标记抗体则被固定的被分析物类似物捕获。检测区带捕获被标记的被分析物-抗体配合物。
美国专利5,451,507描述了两个区带、不相连的免疫测定方法。第一区带具有非扩散性结合试剂，其与结合于、或能够结合于信号产生系统的成员的组分(例如被分析物类似物)结合。第二区带只有在待检验的被分析物存在时结合于该组分。该组分移动进入第二区带的距离与被分析物浓度直接相关。
美国专利5,798,273公开了横向流动装置，其包括具有固定的被分析物类似物的捕获区带和一个或多个读出区带，以结合被标记的被分析物类似物。
美国专利6,001,658公开了检测条装置，其具有结合被分析物的可扩散的、被标记的结合配偶体，固定的被分析物，和包含固定抗体的检测区。
本文所述的装置通常包括一条吸收性物质(例如微孔膜)，在有些情况下，其由不同的物质制成，所述不同的物质在区带中彼此接合，该接合可为邻接和/或重叠的。在某些实例中，吸收剂条可被固定在支持用非反应性物质(例如无纺的聚酯)上，用于例如为条提供增加的刚性。每个条内部的区带可区别地包含检测和/或定性被检测的特定被分析物(例如，抗-类脂抗体)所需的特异性结合配偶体和/或其它试剂。因此，这些区带可以看作是检验装置内的功能部分或功能区。
通常，通过例如浸渍或点样在条的近端将流体样品(或悬浮在流体中的样品)引入到条中。样品是使用本领域技术人员公知的方法收集或获得的。包含待检测的抗-类脂抗体的样品可得白任何生物学来源。生物学来源的实例包括人或动物的血清、血浆、尿、脊髓液、唾液、发酵液、淋巴液、组织培养液和腹水液。在免疫测定以优化免疫测定结果之前可将样品稀释、纯化、浓缩、过滤、溶解、悬浮或以其它方式处置。流体向远侧移动通过条的所有功能区。流体在单独的功能区中的最终分布取决于所用材料的吸附能力和尺寸。
在一些实施方案中，前述的多孔性固相支持体例如硝化纤维优选为片或条的形式。这种片或条的厚度可以在宽的范围内变化，例如，从约0.01到0.5mm、从约0.02到0.45mm、从约0.05到0.3mm、从约0.075到0.25mm、从约0.1到0.2mm、或从约0.11到0.15mm这种片或条的孔径大小同样可在宽的范围内变化，例如从约0.025到15微米、或者更特定地从约0.1到3微米；然而，孔径大小不是选择固相支持体时的限制因素。在适当时，固相支持体的流动速率也可在宽的范围内变化，例如，从约12.5到90sec/cm(即，50到300sec/4cm)、约22.5到62.5sec/cm(即，90到250sec/4cm)、约25到62.5sec/cm(即，100到250sec/4cm)、约37.5到62.5sec/cm(即，150到250sec/4cm)或约50到62.5sec/cm(即，200到250sec/4cm)。在本文所述装置的具体实施方案中，流速为约62.5sec/cm(即，250sec/4cm)。在本文所述装置的其它实施方案中，流速为约37.5sec/cm(即，150sec/4cm)。
在使用免疫测定装置时要考虑的另一个普通特点是检测被分析物(例如，抗-类脂抗体)和捕获试剂(例如，锚定抗体-类脂抗原配合物)之间形成配合物的方法。将检测剂(也称为检测剂试剂)用于这个目的。可以将检测剂整合到免疫测定装置(例如包括在缀合物衬垫中，如下所述)中，或者可以从外部来源施加给装置。
检测剂可为单种试剂或共同用于检测目的的一系列试剂。在有些情况中，检测剂试剂是对于被分析物为特异性的被标记的结合配偶体(例如，用于抗体被分析物的金缀合的A蛋白、或用于人抗体被分析物的金标记的抗-人Ab(Fc))。在其它情况中，检测剂试剂总起来说包括对于被分析物为特异性的未被标记的第一结合配偶体和对于第一结合配偶体为特异性的被标记的第二结合配偶体等。在各种情况中，检测剂试剂特异性地检测被分析物-捕获试剂配合物的被结合的被分析物，并且因此优选检测剂试剂实质上不与捕获试剂或定位在被分析物捕获区域中的其它组分结合或与之反应。检测剂的这种非特异性结合或反应可能提供假阳性结果。任选地，检测剂试剂可以特异性地识别存在于第二捕获区域中的阳性对照分子(例如，用于被标记的A蛋白检测剂、或被标记的G蛋白检测剂的非特异性的人IgG、或被标记的抗-人Ab(Fc))。
优选地，用于公开方法或装置的检测剂试剂实质上不与固定的锚定抗体-类脂抗原配合物结合或与之反应。本领域技术人员可以容易地确定特定的检测剂试剂和特定的锚定抗体-类脂抗原配合物的组合，用以满足检测特定被分析物的这种优先选择。例如，对于检测人抗-类脂抗体，一些非限制性的示例性组合包括：
  类脂抗原   锚定抗体   检测剂试剂
  CL/L/Ch   人，抗-类脂抗原-结合片段(例如，Fab)   A蛋白、G蛋白、或抗-人Ab(Fc)
  CL/L/Ch   人，抗-胆固醇抗原-结合片段(例如，Fab)   A蛋白、G蛋白、或抗-人Ab(Fc)
  CL/L/Ch   人，抗-心磷脂抗原-结合片段(例如，Fab)   A蛋白、G蛋白、或抗-人Ab(Fc)
  CL/L/Ch   非人，抗-类脂全长Ab   抗-人Ab(任何特异性)
  CL/L/Ch   非人，抗-胆固醇全长Ab   抗-人Ab(任何特异性)
  CL/L/Ch   非人，抗-心磷脂全长Ab   抗-人Ab(任何特异性)
  CL/L/Ch   非人(哺乳动物)，抗-类脂抗原-结合片段(例如，Fab)   A蛋白、G蛋白、抗-人Ab(任何特异性)
  CL/L/Ch   非-人(哺乳动物)，抗-胆固醇抗原-结合片段(例如，Fab)   A蛋白、G蛋白、抗-人Ab(任何特异性)
  CL/L/Ch   非人(哺乳动物)，抗-心磷脂抗原-结合片段(例如，Fab)   A蛋白、G蛋白、抗-人Ab(任何特异性)
B.流通装置的构造和设计
流通装置包括固定在固相支持体(一般地为膜，例如硝化纤维、尼龙、或PVDF)上的捕获试剂(例如，锚定抗体-类脂抗原配合物)。有用的膜的特征在前已有描述；然而，需要指出的是，在流通测定法中，毛细上升不是膜的特别重要的特点，因为在横向流动检验中，样品移动垂直通过膜而非横过。在简单的代表性形式中，流通装置的膜被布置为与吸收剂层功能接触或直接接触(参见，例如，以下对“吸收剂衬垫”的描述)，所述吸收剂层起到储库的作用，用于吸引流体样品通过膜。任选地，在固定捕获试剂之后，可以将膜上的任何保留的蛋白结合部位封闭(在施加样品之前或同时)，以使非特异性相互作用最小化。流通装置的示例性物理实施方案如图10所示。
在操作流通装置时，将流体样品(例如体液样品)布置为与膜接触。一般地，流通装置还包括样品施加区域(或储库)，以接受和临时保持期望体积的流体样品。样品通过膜基质。在这个过程中，样品中的被分析物(例如抗-类脂抗体)可以特异性结合于固定的捕获试剂(例如锚定抗体-类脂抗原配合物)。在期望检测被分析物-捕获试剂配合物时，可以将检测剂试剂(例如，被标记的A蛋白、被标记的G蛋白、或被标记的抗-人IgG(Fc))随样品加入，或者在施加样品之后加入包含检测剂试剂的溶液。如果被分析物被捕获试剂特异性结合，可以观察到膜表面上的可归因于特定的检测剂试剂的视觉表现。可以在工艺的任何时候(例如，施加样品之后、和/或在施加检测剂试剂之后)增加任选的洗涤步骤。
C.横向流动装置的构造和设计
横向流动装置通常是本领域中已知的。简而言之，横向流动装置是具有检测条(被怀疑包含所关注的被分析物的试样流体流动通过该检测条)作为其要素的分析装置。检验流体和任何悬浮的被分析物可以沿着条流动到检测区带，在其中被分析物(如果存在)与捕获试剂和检测剂相互作用，表明被分析物的存在、不存在和/或数量。
已经公开了许多横向流动分析装置，包括在美国专利4,313,734、4,435,504、4,775,636、4,703,017、4,740,468、4,806,311、4,806,312、4,861,711、4,855,240、4,857,453、4,943,522、4,945,042、4,496,654、5,001,049、5,075,078、5,126,241、5,451,504、5,424,193、5,712,172、6,555,390、和6,368,876，EP 0810436、和WO 92/12428、WO 94/01775、WO 95/16207、和WO 97/06439中所示的那些，所述专利文献中的每个都被并入作为参考。
许多横向流动装置是单步横向流动检验，其中将生物流体置于吸水性条上的样品区域中(但是，可使用非吸水性材料，并且通过对该物质施加表面活性剂赋予其吸水性)，并且允许其沿着条移动，直到流体接触到与流体中被分析物相互作用的特异性结合配偶体。一旦被分析物与结合配偶体相互作用，有信号(例如荧光或以其它方式可见的染料)表明发生了相互作用。可以将多种离散的结合配偶体置于条上(例如，为平行线)，用以检测流体中的多种被分析物。检测条也可以结合对照指示剂，其提供已经充分进行该检验的信号，即使在条上没有看见表明被分析物存在(或不存在)的阳性信号。
横向流动装置的构造和设计为本领域中公知的，如在例如以下描述的，Millipore Corporation，A Short Guide DevelopingImmunochromatographic Test Strips，2nd Edition，pp.1-40，1999，索取电话(800)645-5476；和Schleicher & Schuell，Easy to Work withBioScience，Products and Protocols 2003，pp.73-98，2003，2003，索取自，Schleicher & Schuell BioScience，Inc.，10 Optical Avenue，Keene，NH03431，(603)352-3810；二者都被全文并入本文作为参考。
横向流动装置具有本领域中同样公知的多种物理形式。本公开考虑了以适当的功能关系支持和/或容纳横向流动装置的基础组件的任何物理形式。图7显示了横向流动装置的几个实例。这些实例显示了可用于构造横向流动装置的一些物理实施方案。
在图8中说明横向流动装置的特定实施方案的基础组件，其显示的特定实施方案为其中延长的外壳10包含实质上在外壳10的整个长度上延伸的吸水性横向流动条12。横向流动条12分为位于进样口15下的近端点样衬垫14、中间的检验结果膜16、和远端的吸收剂衬垫18。流动条12被包含被标记的缀合物(例如金缀合的A蛋白、金缀合的G蛋白、金缀合的抗-人Ab)的缀合物衬垫20中断。沿着条12的流动通道从近端衬垫14通过、通过缀合物衬垫20、进入检验结果膜16，最终在吸收剂衬垫18中收集。选择性的结合试剂(例如锚定抗体-类脂抗原配合物)被布置在检验结果膜16中的近端检验线22上。在检验结果膜16中检验线22的略远端提供对照线24。
在操作图8中说明的横向流动装置的特定实施方案时，通过样品引入口15将包含所关注的被分析物(例如抗-类脂抗体)的流体样品施用于样品衬垫。在某些实例中，可通过滴加将样品施用于样品引入口15，或者，较不优选地，通过将包含样品引入口15的装置的末端浸入样品中施加样品。在其中样品是全血的其它实例中，向血液样品加入任选的展开剂流体，以引起红细胞溶解，并且在一些情况中对全血样品进行适当的稀释。对于样品衬垫14，样品通过例如毛细管作用流到缀合物衬垫20。在缀合物衬垫20中，所关注的被分析物可以与被移动的或可移动的检测剂试剂结合(或被其结合)。例如，抗-类脂抗体被分析物可以结合于包含在缀合物衬垫中的金缀合的A蛋白检测剂试剂与检测剂试剂配合的被分析物可随后流向检验结果膜16，在其中配合物可以进一步与被固定近端检验线22的被分析物特异性结合配偶体(例如锚定抗体-类脂抗原配合物)相互作用。在某些实例中，与检测剂试剂(例如金缀合的A蛋白、金缀合的G蛋白、或金缀合的抗-人Ab)配合的抗-类脂抗体可以进一步结合于未被标记、固定在近端检验线22的锚定抗体-类脂抗原配合物。在抗-类脂抗体、被标记的(例如，金缀合的)检测剂试剂、和固定的锚定抗体-类脂抗原配合物之间形成免疫配合物可以通过在近端检验线22出现的可见谱线而检测到，所述谱线是由标记(例如，金)积聚在近端检验线22的定位区域中产生的。对照线24可以包含固定的、检测剂试剂特异性的结合配偶体，其可以在有或没有被分析物的存在下结合检测剂试剂。在对照线24的这种结合表明检验的特有性能，甚时在没有所关注的被分析物的存在下。
在横向流动装置的另一个实施方案中，在检验结果膜16中有与检验线22平行或垂直(或以任何其它空间关系)设置的第二检验线。这种特定的实施方案的操作与刚刚前段所述的实施方案相似，需要另外考虑以下：(i)在缀合物衬垫中还可包含对第二被分析物为特异性的第二检测剂试剂，例如抗-梅毒螺旋体抗体，和(ii)第二检验线包含对样品中的第二被分析物有亲和力的第二特异性结合配偶体。例如，第二检验线可以包含特异性地结合存在于样品中的抗-梅毒螺旋体抗体的固定的密螺旋体抗原。
可用于横向流动装置的组件的一些材料如表1中所示。然而，本领域技术人员应该认识到用于特定的横向流动装置的特定材料取决于许多变量，包括例如待检测的被分析物、样品体积、期望的流速和其它变量，因此可以例行选择有用的材料。
表1.
  组件   可用的材料
样品衬垫   玻璃纤维织物纤维筛网无纺纤维纤维素过滤器纸
缀合物衬垫   玻璃纤维聚酯纸表面修饰的聚丙烯
膜   硝化纤维(包括纯的硝化纤维和改性的硝化纤维)直接铸造在聚酯支持物上的硝化纤维聚偏二氟乙烯尼龙
吸收剂衬垫   纤维素过滤器纸
1.样品衬垫
样品衬垫(例如，图8中的样品衬垫14)是横向流动装置用于最初接受样品的任选的构件，并且可以用于从样品除去微粒。在可用于构造样品衬垫(参见表1)的各种材料中，如果大的床体积(例如，250μl/cm2)是特定应用中的要素，则纤维素样品衬垫可能是有益的。样品衬垫可用一种或多种脱模剂处理，例如缓冲剂、盐、蛋白质、洗涤剂、和表面活性剂。这种脱模剂可用于例如促进缀合物衬组分的再溶解，和用于封闭横向流动装置的其它组件例如硝化纤维膜中的非特异性结合部位。代表性的脱模剂包括例如海藻糖或葡萄糖(1％-5％)、PVP或PVA(0.5％-2％)、Tween-20或Triton-X-100(0.1％-1％)、酪蛋白(1％-2％)、SDS(0.02％-5％)、和PEG(0.02％-5％)。
2.膜和施用溶液：
可用于横向流动装置的膜的类型(例如硝化纤维、尼龙和PVDF)以及对这种膜施加捕获试剂需要考虑的事项已经在前面有所论述。
3.缀合物衬垫
缀合物衬垫(例如图8中的缀合物衬垫20)尤其是用于容纳检测剂试剂。在一些实施方案中，可从外部施加检测剂试剂，例如，从展开剂瓶，在这种情况中，横向流动装置无须包含缀合物衬垫(参见，例如美国专利4,740,468)。
在施加检验样品时，包含于缀合物衬垫中的检测剂试剂被释放到溶液中。缀合物衬垫可用各种物质处理，以影响检测剂试剂释放到溶液中。例如，缀合物衬垫可用PVA或PVP(0.5％到2％)和/或Triton X-100(0.5％)处理。其它脱模剂包括但不限于羟丙基甲基纤维素、SDS、Brij和β-乳糖。在任何给定应用中，可使用两种或多种脱模剂的混合物。在公开的特定实施方案中，缀合物衬垫20中的检测剂试剂为被标记的A蛋白、G蛋白、或抗-人IgG(Fc)。
4.吸收剂衬垫
在横向流动装置中使用吸收剂衬垫18是任选的。吸收剂衬垫起到增加进入装置的样品总量的作用。这种增加的体积可用于例如从膜洗掉未结合的被分析物。多种材料的任一种都可用于制备吸收剂衬垫，参见例如表1。在一些装置实施方案中，吸收剂衬垫可以是纸(即，纤维素纤维)。本领域技术人员可基于例如厚度、可压缩性、可制造性、和床体积的均匀性选择纸吸收剂衬垫。可通过改变吸收剂衬垫的尺寸(通常为长度)调节生产的吸收剂的体积吸收量(volume uptake)。
D.联合装置
在一些实施方案中，上述讨论到的每一免疫测定装置(例如，浸量尺、流通装置或横向流动装置)可通过增加包含对所关注的其它被分析物为特异性的捕获试剂的第二、第三或更多捕获区域而制成用于检测多种被分析物的形式。具体地，本公开考虑了同时检测流体样品(例如，人血清)中的抗-类脂抗体和密螺旋体或抗-密螺旋体抗体的免疫测定装置。这种联合装置另外包括密螺旋体捕获区域，其包括(a)能够被抗-梅毒螺旋体抗体特异性结合的固定的密螺旋体抗原，或(b)特异性地结合移动的密螺旋体抗原的固定的抗-梅毒螺旋体抗体。如本文中使用的，“密螺旋体抗原”是包含至少一个特异性地结合抗-梅毒螺旋体抗体的抗原决定簇的抗原。本领域中已经描述了许多密螺旋体抗原；参见，例如，美国专利6,479,248、6,248,331、5,681,934、5,578,456、4,868,118和4,740,467。例如，已经描述了至少以下表观分子量的多肽作为梅毒螺旋体抗原：16-20kDa、18kDa、18-23kDa、25kDa、35kDa、37kDa、37-46kDa、38kDa、39kDa、41kDa、43kDa、44kDa、46kDa、47kDa、58kDa、150kDa、和180kDa(关于更具体的细节，参见美国专利4,846,118)。
密螺旋体抗原和抗-梅毒螺旋体抗体是多肽；因此，在用作捕获试剂时，这些分子可以直接地附着于固相支持体(例如，硝化纤维、尼龙或PVDF)。尽管如此，考虑到密螺旋体抗原或抗-梅毒螺旋体抗体可以通过任何可用的方法(直接或间接地)固定在固相支持体上。
检测剂试剂可用于检测密螺旋体捕获试剂和密螺旋体特异性被分析物(例如，密螺旋体、密螺旋体抗原、或抗-密螺旋体抗体)之间形成配合物。在一些实施方案中，检测剂试剂(例如抗-人Ab(Fc))可以特异性地结合密螺旋体特异性被分析物(例如，人抗-密螺旋体抗体)和结合的抗-类脂抗体被分析物(例如，人抗-类脂抗体)。在其它情况中，考虑了用于特异性检测密螺旋体特异性被分析物(例如，抗-密螺旋体抗体或密螺旋体抗原)或结合的抗-类脂抗体被分析物的两种单独的检测剂试剂。
用于进行同时的密螺旋体和非密螺旋体检验的免疫测定装置的操作实质上与本说明书中其它地方所述的装置相似。联合装置的一个特别的特点在于施加于样品施加区域的流体样品能够接触(例如，流向或流过)抗-类脂抗体捕获区域和密螺旋体捕获区域中的每一个。
VI.试剂盒
本文中公开的是用于检测样品(例如，生物样品)中的抗-类脂抗体的试剂盒。这种试剂盒也可用于例如诊断其中存在抗-类脂抗体的存在是该疾病的征兆的疾病(例如，梅毒或狼疮)。公开的试剂盒的某些实施方案通常是便携的，并且提供简单的、快速的、和/或成本有效的检测抗-类脂抗体和/或诊断疾病(例如梅毒)的方法，而无需例如床边设备中的实验室设备。
试剂盒包括一个或多个本文中公开的免疫测定装置和携带设备，例如箱、袋、罩、塑料纸板箱(例如模制塑料或其它透明包装)、封套(例如，密封的或可密封的塑料、纸、或金属封套)、或其它容器。在某些实例中，试剂盒组件被装入单个包装单元中，例如箱或其它容器，该包装单元可具有其中可放置试剂盒的一个或多个组件的隔室。在其它实例中，试剂盒包括一个或多个容器，例如小瓶、管等，其可以保持例如一种或多种待检测的生物样品、阳性和/或阴性对照样品或溶液(例如，包含抗-类脂或密螺旋体抗体的阳性对照血清)、稀释剂(例如，磷酸盐缓冲剂、或盐水缓冲剂)、检测剂试剂(例如，用于外部施加给试剂盒装置)、用于使检测剂试剂酶可视的底物试剂(例如，5-溴-4-氯-3-吲哚基磷酸酯、二甲基甲酰胺中的氮蓝四唑)、和/或洗液(例如Tris缓冲液、盐水缓冲液、或蒸馏水)。
其它试剂盒实施方案包括注射器、手指刺破装置、乙醇药签、纱布块、棉球、绷带、乳胶手套、具有不同数量槽的孵育托盘、粘合板密封物(adhesive plate sealer)、数据报告片(可用于处理、收集和/或处理生物样品)。试剂盒还可以任选包含可用于将样品引入到免疫测定装置的样品室的工具，包括例如滴管、一次性移液管、毛细管、橡胶吸球(例如，用于毛细管)、等等。其它试剂盒实施方案可以包括用于抛弃用过的免疫测定装置的一次性设备和/或与该装置使用的其它物品(例如，患者样品等)。这种一次性设备可以包括但不限于能够包含从所抛弃的材料的漏出物的容器，例如塑料、金属或其它不可渗透的袋、箱或容器。
在某些实例中，公开的试剂盒包括检验该免疫测定装置的说明书。该说明书可以提供关于如何向检验装置施加样品、等待形成结果所需或合理的时间量的指导，和关于如何读取和解释检验结果的详述。这种说明书还可以包含标准，例如用于比较检验结果的标准表格、图表、或图。这些标准样品可以任选地包括使用检验装置定性被分析物所需的信息，例如使信号强度或信号线数与存在于样品中的被分析物的量相关的标准曲线。
实施例
提供以下实施例用以说明某些具体特点和/或实施方案。不应理解这些实施例将本发明限制于所述的具体特点或实施方案。
实施例1
USR类脂抗原的制备
本实施例描述了使用公开的方法制备示例的类脂抗原，USR抗原，其可以连接于固相支持体例如硝化纤维。如本实施例中所述，可以制约备100ml的USR抗原；然而本领域技术人员应该理解，所述的流程可以放大或缩小，以产生分别为更多或更少的USR抗原。此外，除非明确表明，本实施例和以下实施例中的所有方法步骤、反应等在室温下进行(例如，从约20℃到约25℃)。
将八(8)ml的VDRL缓冲盐水(10克NaCl、0.5ml甲醛、0.093克磷酸氢二钠、和0.170克磷酸二氢钾，在1升蒸馏水中)加入到250ml的圆形玻璃塞瓶中。在40到60秒的时间内，在连续转动瓶子的情况下将10ml VDRL抗原(0.9％胆固醇、0.03％牛的心脏心磷脂、和约0.21％卵磷脂，在乙醇中)直接加在缓冲盐水上。在加入VDRL抗原之后继续旋转瓶子约10秒。然后，向反应混合物加入82ml VDRL缓冲盐水。在瓶子带有盖子的情况下，在10秒内将瓶颠倒摇动约30次。将经摇动的混合物的约19ml等分在室温下在斜角离心机(Sorvall SS-3)的不锈钢管中以约2000xg的相对离心力离心15分钟(从离心机达到期望速度时计时)。通过将管反转离开包含沉淀物质的侧面而小心地倾析上清液。在除去上清液之后，将离心管反转并且用棉纱布擦拭，而不扰动沉淀。然后在温和的摇动下将沉淀再悬浮在与离心的抗原悬浮液相等体积(在这种情况中为19ml)的再悬浮溶液(3.72％EDTA、40％氯化胆碱(v/v)、磷酸盐缓冲盐水pH 6.9±0.1)中。将所有再悬浮的沉淀在玻璃塞的瓶子中重组并且温和地涡旋混合，以形成抗原制备物。然后将抗原制备物置于冷藏箱(从约2℃到约8℃)约一周，以使其稳定。
实施例2
梅毒螺旋体感染的人血清的硫酸铵分级分离
这个实施例描述了用于从血清分离包含免疫球蛋白的一个方法。这个实施例的方法(以及本领域通常通常已知的其它免疫球蛋白分离方法)可用于从任何来源的血清(包括得自非人主体，例如兔，的血清)部分纯化免疫球蛋白。
得自感染梅毒螺旋体的人类患者的血清(在本实施例和以下实施例中称为“超免疫抗血清”)得自Biomedical Resources(Hatboro，PA)。将期望量的超免疫抗血清置于容纳超过两倍血清量的容器中。在搅拌下，向血清缓慢滴加等于血清量的70％饱和硫酸铵。将这个混合物在室温搅拌约4小时，然后在约3000rcf离心30分钟。在离心之后，将上清液抛弃并将沉淀的包含免疫球蛋白的级分再悬浮在等于原始血清血清量的蒸馏水中。然后，在搅拌下向再悬浮的包含免疫球蛋白的级分滴加等量的70％饱和硫酸铵溶液，将混合物离心，将上清液倾析掉，并将沉淀物如上所述再悬浮。然后再一次重复这个过程。将最终的包含免疫球蛋白的沉淀物用蒸馏水再悬浮为原来血清量的十分之一。在2-8℃下将再悬浮的包含免疫球蛋白的级分相对三个100x量的0.85％氯化钠pH 8.0透析过夜。根据生产商的说明书说明书通过Bio-RadTM Bradford蛋白测定法测定透析保留物中的总蛋白浓度。
实施例3
使用A蛋白亲和柱纯化IgG
使用A蛋白琼脂糖色谱分离法从包含免疫球蛋白的级分分离IgG。如本领域中已知的已知的，A蛋白特异性地结合于得自各种哺乳动物种类的IgG的Fc区域。
将包含1000ml的20mM磷酸钠缓冲液，pH 7.4(“磷酸盐缓冲液”)的缓冲液储库连接于10ml的A蛋白Sepharose CL-4B柱(Pharmacia)。将柱用200ml的磷酸盐缓冲液洗涤，并且测量洗脱液的pH。直到洗脱液的pH为7.3±0.2的范围内之后，向柱加载包含免疫球蛋白的样品。
在从缓冲液储库断开之后，对柱施加得自实施例2的包含免疫球蛋白的透析保留物，小心不要扰动柱基质的表面。然后，向柱加入20ml磷酸盐缓冲液，将缓冲液储库再连接于柱，并且使用装有80-12×125mm直径管的级分收集器收集级分。在280nm监测柱洗脱液的吸光度。当洗脱液在280nm的吸光度回到基线(表明实质上完成了非特异性蛋白的洗脱)时，将包含500ml的100mM甘氨酸pH 2.7的第二缓冲液储库与柱连接。再次，收集级分，同时在280nm监测洗脱液的吸光度。将具有0.1或更大的280nm吸光度的甘氨酸缓冲液中洗脱的所有级分合并。这种级分包括被A蛋白特异性结合的蛋白，即，存在于梅毒螺旋体感染的人血清中的IgG。使用2.0M Tris缓冲液调节合并的溶液的pH至7.2±0.2，并且如前所述测定总蛋白浓度。
实施例4
A蛋白-纯化的IgG到溶液中USR抗原的特异性结合
测定如实施例3中所述得到的A蛋白纯化的IgG的终点滴度。制备IgG样品在0.9％盐水中的系列稀释物(从1∶2到1∶512)。将每种稀释物的五十(50)μl置于2×3英寸玻璃载片上的10个圈(14mm)的每一个中。
将如实施例1中所述制备的USR抗原温和地再悬浮并且吸入处于垂直位置的分配针和注射器中。分配几滴并且抛弃，以清除针中的空气。然后，将1滴(自由落下的)(约22μl)抗原悬浮液加入到包含IgG的每个圈中。将玻片置于180±2rpm的机械旋转器上4分钟。当在其中蒸发可能是问题的干燥气候中进行这个试验时，有利的是在旋转步骤过程中将玻片置于潮湿的湿润盖罩下。在旋转之后立即将玻片在显微镜下观察，使用10x目镜和10x物镜，以决定其中存在反应絮结物。测定IgG滴度为产生弱的阳性反应的最高稀释度。
将A蛋白纯化的IgG样品的原始量在第一稀释物量的磷酸盐缓冲盐水pH 7.2±0.2(“PBS”)中稀释到1∶2048的有效抗体滴度。因此，在其中样品的终点滴度为1∶32的一种情况中，将一个量的样品用64倍的磷酸盐缓冲盐水pH 7.2±0.2(″PBS″)稀释(在其它实施例中，1∶16终点滴度的血清用128倍的PBS稀释，1∶64终点滴度的血清用32倍PBS稀释，等等)。然后，在温和的混合下，向稀释的IgG样品中加入等于纯化的IgG的原始量的USR胶束(如实施例1所述制备)。允许混合物在2-8℃澄清几天，直到上清液澄清。然后，除去上清液并且用等于第一稀释物量的PBS代替(例如，在前述情况中为64倍PBS)。重复前述步骤，直到上清液澄清。在除去最终的上清液之后，使用量筒测量沉淀物质的量(包含USR胶束-抗体(IgG)配合物，也称为IgG-涂覆的胶束)，并且通过Bradford方法测定IgG-涂覆的胶束的蛋白浓度。
实施例5
Fab片段的制备和分离
使用CentriconTM离心过滤器(Millipore)将A蛋白-纯化的IgG(如实施例3所述制备)浓缩到约20mg/ml，并且相对2×1000ml样品缓冲液(20mM磷酸钠、10mM EDTA，pH 7.0)透析。
通过反转或温和的摇动将固定在6％交联的珠状琼脂糖上的木瓜蛋白酶在50％甘油、0.1M乙酸钠(pH 4.4)和0.05％叠氮化钠(Pierce)中的50％浆状物中混合，以得到均匀的悬浮液。然后向玻璃试管或其它适合的反应容器中加入2.5ml的浆状物。为了使凝胶平衡，向浆状物加入20ml新制备的消化缓冲液(20mM磷酸钠、10mM EDTA、20mM半胱氨酸-HCl，pH 7.0)。然后，通过离心从缓冲液分离凝胶，并且用另外的20ml消化缓冲液重复这个过程。将经过平衡的凝胶再悬浮在2.5ml消化缓冲液中。
将A蛋白纯化的IgG(2.5ml的10mg/ml溶液)用2.5ml消化缓冲液稀释。将IgG溶液加入到包含固定的木瓜蛋白酶的试管或容器中，并将混合物在37℃水浴中在高速的振荡器中孵育五小时到过夜。在孵育过程中保持凝胶的稳定混合。
在孵育之后，向反应混合物中加入7.5ml的10mM Tris-HCl，pH7.5，并通过在300rpm离心25分钟分离混合物。从沉淀的被固定的木瓜蛋白酶除去上清液(其包含免疫球蛋白片段)。
将上清液如实施例3中所述过A蛋白柱。如图1所示，回收了两个蛋白峰。没有特异性地结合A蛋白的峰I是免疫球蛋白片段的Fab级分，特异性地结合A蛋白的峰II是Fc级分。如前所述测定Fab和Fc级分的蛋白浓度。
实施例6
对包含免疫球蛋白的样品的聚丙烯酰胺SDS梯度凝胶分析
本实施例显示了在实施例2、3和5中产生的各个样品的蛋白质含量。使用具有4％积层凝胶的Bio-RadTM预浇铸的10-20％线性聚丙烯酰胺梯度凝胶按大小分离存在于硫酸铵免疫球蛋白级分(参见实施例2)、A蛋白峰I和II(参见实施例3)、在木瓜蛋白酶消化前后用A蛋白纯化的IgG(参见实施例5)、和在木瓜蛋白酶消化之后的IgG峰I(Fab级分)和II(Fc级分)(参见实施例5)中的蛋白质谱带。
将样品(2.5μg/μl)在Laemmli样品缓冲液(62.5mM Tris-HCl、2％SDS，pH 6.8、2％SDS和25％甘油(不含β巯基乙醇))中1∶1稀释。将样品加热并且加载在各自的孔中。槽缓冲液是Tris-甘氨酸-SDS(25mM Tris-HCl，pH 8.3、192mM甘氨酸、0.1％SDS)。凝胶在200伏特下运行45分钟。在用H2O洗涤三次之后，将凝胶用Pierce Gel Code BlueTM染色30分钟，然后通过用水重复洗涤洗净。
如图2所示，人超免疫(梅毒)血清(泳道2)的硫酸铵沉淀级分包含显著高分子量的蛋白谱带的混合物。如图2所示，泳道4为相对纯的IgG级分，被A蛋白柱结合并且从柱洗脱。对A蛋白纯化的IgG进行木瓜蛋白酶消化产生蛋白质的混合物(泳道6)，其可通过在A蛋白柱上的分级分离分为两个蛋白质群。图2的泳道7表明，约54kD的一个主要的木瓜蛋白酶消化的IgG片段没有被A蛋白柱保留。这个表观分子量是期望的Fab片段大小。在泳道7中实质上没有观察到更高分子量的蛋白质谱带(代表例如Fab2或Fc片段或未消化的IgG)。具有期望的Fc片段和未消化的IgG的分子量的蛋白质被A蛋白柱保留(泳道8)。
实施例7
A蛋白胶态金缀合物不检测Fab片段
将IgG的一(1)μl的木瓜蛋白酶消化级分(如实施例5中所述制备)在5mm×4cm硝化纤维膜上点样并且干燥过夜。将在具有0.25M氯化钠的10mM磷酸盐缓冲液，pH 7.4中的一百(100)μl的1％酪蛋白置于微量滴定板的相应孔中。将与胶态金缀合的二(2)μl的A蛋白混合到各个孔中并将相应的条置于各个孔中。
如图3所示，胶态金A蛋白缀合物检测IgG和Fc级分而不检测Fab级分。
实施例8
测定用于连接于USR胶束的Fab的有用量
将实施例5中所述制备的Fab片段在PBS中稀释到1000μg/μl、100μg/μl、10μg/μl、1μg/μl、100ng/μl和10ng/μl。将各个Fab级分稀释物与等量的如实施例1中所述制备的USR胶束溶液混合。将一(1)μl的这种Fab-USR胶束混合物点样在5mm×4cm硝化纤维膜上并且在室温干燥过夜。
将人抗血清(其1∶64稀释物在RPR检验中有反应性)在由1％酪蛋白、10mM磷酸盐、0.25m氯化钠pH 7.4组成的缓冲液中1∶400稀释。将类似稀释的RPR-非反应性人血清用作阴性对照。将一百(100)μl抗血清(或非反应性血清)和2μl胶态金A蛋白在微量滴定板的几个孔的每一个中合并。在室温下，将包含与干燥Fab-反应的类脂抗原的单个硝化纤维条置于各个孔中足以使置于孔中的组分沿着膜移动到其中点样Fab-USR胶束混合物的位置的时间。
如图4所示，具有结合于USR抗原的1000、10或0.1μg Fab的硝化纤维条与具有RPR-反应性(R)人血清产生阳性反应。对于包含RPR-不反应性(NR)血清的任何样品都没有观察到反应。
这个实施例证明，至少约100ng到约1mg的Fab片段(例如，约100ng到约450ng)可以与USR抗原制备物反应(参见实施例1)，以促进类脂抗原对硝化纤维膜的连接而对免疫测定试验(例如，检测条、和流通和/或横向流动装置)中USR抗原与血清抗-类脂抗体的反应性没有实质的不利影响。如这个实施例中所述的一个非限制性的有用的Fab片段量为约10μg。
实施例9
测定用于经亲和力纯化的兔抗-人IgG(Fc)结合胶态金的有用的pH
这个实施例说明了代表性方法，用于确定使经亲和力纯化的兔抗-人IgG(Fc)(Rockland，Gilbertsville，Pa.)与胶态金缀合的有用的pH。兔抗-人IgG(Fc)仅仅特异性地结合人IgG的Fc部分，而不结合于人IgG的Fab或其它非Fc区域。具有这种特异性的抗体也称为“抗-人Fc”。胶态金制备物(例如，在这个和其它实施例中描述的那些)可用作公开的免疫测定法(包括，例如，检测条、和流通和/或横向流动装置)中的检测剂试剂。
将约25ml的10mM磷酸盐缓冲液置于50ml烧杯中，并且用0.2M磷酸调节pH 5.0。将pH 5.0的两个0.5ml等分转移到两个12×75mm试管中，一个标记为“检验”，另一个标记为“对照”。然后，继续使用0.2M碳酸钾调节保留在烧杯中的磷酸盐缓冲液的pH到5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、和10.0。在每个pH下，如对于pH5.0样品所述，将两个0.5ml等分转移到“检验”和“对照”试管中。然后，向每个“检验”和“对照”管中加入30μg的经亲和力纯化的兔抗-人IgG(Fc)，并将管的内容物充分混合。将约25ml的40nm胶态金(1％溶液)(British Biocell International，London，England)置于单独的50ml烧杯中，并且如上所述在pH 5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、和10.0生产一系列“对照”和“检验”胶态金样品。
将各个pH的胶态金的一(1)ml胶态金加入到具有相应pH的“检验”和“对照”溶液中。将金/兔抗-人IgG(Fc)溶液充分混合，并且在室温孵育20分钟。然后，向标记“检验”的试管组加入200μl的2MNaCl，而向标记“对照”的试管组加入200μl的蒸馏水。将两组试管的内容物在室温孵育30分钟。
相对于相应的“对照”样品在580nm(OD580)读取各个“检验”样品的光密度。测定具有最低OD580的样品的pH为用于形成金缀合制备物的有利的pH。由于在制造工艺过程中吸附在金颗粒表面上的负离子层，胶态金颗粒具有带负电荷的表面。蛋白质，例如IgG会通过离子性、疏水性、和配价相互作用被吸引向带负电荷的金颗粒。这些相互作用被认为是形成胶态金-蛋白质缀合物的基础。在缀合于金颗粒的蛋白质的pI(即，其中蛋白质具有零净电荷时的pH)，缀合物是最稳定的。
NaCl对未缀合的胶态金颗粒的加成会破坏被吸附在金表面上的负电荷离子层。结果，金颗粒离解并且最终将金离子(即，Au+)释放到溶液中。可以在OD580测量游离的金离子。相反，蛋白-金缀合物在缀合物的蛋白质组分的pI时耐受被NaCl破坏。因此，具有最低OD580的样品pH是进行金缀合反应以得到稳定的金缀合物的有用的pH。
如图5所示，用于使30μg兔抗-人IgG(Fc)与10μg胶态金(即，1ml的1％溶液)缀合的有用的pH为约pH 9.5。在这个实施例中描述的方法广泛地适用于可与金缀合用于公开的免疫测定法的许多其它蛋白质(例如A蛋白或G蛋白)。另外，认为所述反应可根据蛋白质和金缀合物的其它量而改变。
实施例10
测定用于胶态金缀合的有用的蛋白质浓度
这个实施例说明用于测定用于与胶态金的缀合反应的有用的蛋白质浓度的示例性方法。胶态金制备物(例如，在这个和其它实施例中描述的那些)可用作公开的免疫测定法(包括，例如，检测条、和流通和/或横向流动装置)中的检测剂试剂。
将0.5ml的10mM磷酸盐缓冲液(调节到如实施例9中所述产生最低OD580的pH)加入到各5个试管的2个组中。一组试管标记为“检验”，另一组标记为“对照”。将30μg、20μg、10μg、5μg、或2.5μg的兔抗-人IgG(Fc)加入到一系列试管的每一个中，并且充分混合。向每个试管加入1ml的40nm胶态金(1％溶液，调节到与磷酸盐缓冲液相同的pH)。将样品在室温孵育20分钟。然后向标记“检验”的样品加入200μl的2M NaCl，而向标记“对照”的样品加入200μl的蒸馏水。在室温孵育30分钟之后，相对相应的对照样品读取检验样品的OD580。生产最低OD580的兔抗-人IgG(Fc)的最低浓度表示用于形成蛋白质-金缀合物制备物的有用的浓度(或浓度范围)。
在这个实施例中，生产最低OD580的兔抗-人IgG(Fc)的最低浓度表示其中有用量的兔抗-人IgG(Fc)与金颗粒结合的浓度。兔抗-人IgG(Fc)的浓度越高，尽管有用，但是较不优选，因为过量的兔抗-人IgG(Fc)可以通过例如在之前已经与金颗粒结合的兔抗-人IgG(Fc)分子层上分层(layering)而与金颗粒形成较弱的结合。
如图6中所示，约30μg是用于与10μg胶态金缀合的兔抗-人IgG(Fc)的有用量(即，1ml的1％溶液)。这个实施例中所述的方法广泛地适用于可用于公开的免疫测定法中与金缀合的许多其它蛋白质(例如A蛋白或G蛋白)。另外，认为所述反应可根据蛋白质和金缀合物的其它量而改变。
A.金缀合物“小型制备物”的制备
通过将5ml的10mM硼酸盐缓冲液加入到得到如上所述的有用蛋白质浓度(例如，30μg)所需量的兔抗-人IgG(Fc)中制备兔抗-人Fc金缀合物小型制备物。然后，再如上所述将这个蛋白质溶液调节到有用的pH(例如，pH 9.5)。在充分混合下将10ml的40nm胶态金(1％溶液，调节到有用的pH)加入到pH得到调节的蛋白质溶液中。将混合物在室温孵育20分钟。然后，加入1.6ml的10％酪蛋白到1％酪蛋白的最终浓度，并且在室温继续孵育另外的20分钟。将反应混合物在6500xg离心10分钟，并将上清液除去并且抛弃。将团粒(pellet)再悬浮在0.5ml的重悬浮缓冲液(150mM NaCl、20mM Trizma碱、10％蔗糖、5％海藻糖、0.1％酪蛋白、0.05％叠氮化钠)中。
包含金缀合的兔抗-人IgG(Fc)的再悬浮团粒可用于多种目的，包括但不限于在横向流动装置中作为用于人抗-类脂抗体的检测剂试剂。
实施例11
检测人血清中的抗-类脂抗体
这个实施例证明，可通过使用硝化纤维固定的Fab-USR抗原配合物捕获试剂与移动的兔抗-人IgG(Fc)或A蛋白金缀合物检测剂试剂合作检测梅毒血清中的抗-类脂抗体。
如实施例8所述将1μl的Fab-USR抗原配合物施用于单独的硝化纤维膜并允许其在室温干燥过夜。如实施例10所述重复制备胶态金缀合物。将反应性的人梅毒血清和非反应性(无梅毒的)人血清在1％酪蛋白、10mM磷酸盐、0.5M氯化钠pH 7.4中稀释1∶100、1∶200或1∶400。将100μl的每种血清稀释物置于微量滴定板的适当数量的孔中。然后将2μl的金缀合的A蛋白(以类似于实施例10的方式制备)加入到各个孔。然后将包含固定的Fab-USR抗原配合物捕获试剂的一个硝化纤维条置于包含抗体和检测剂试剂溶液的各个孔中。孔中的溶液通过毛细管作用沿着条向上流动。
如表2所示，六十个反应性人梅毒血清中有许多与固定的Fab-USR抗原制备物反应。阳性反应反应的特征在于不同色调强度的可见斑点，从非常微弱(VF)、微弱(F)、弱(W)和强(S)。没有可见反应表示为“N”。对于非反应性(无梅毒)人血清，在任何检验的血清稀释度中都没有观察到反应。
表2.固定的类脂抗体与人梅毒血清的反应性
血清编号 RPR滴度a   血清稀释度
  100   200   400
  12345678910111213141516171819   R4R8R2R16R32NRR64R128R4R64R256NRR512R16R8R1024NRR512R64   VFNNVFSNVFSVFWSNSVFWSNSF   VFVFNNSNFSVFWSNSWWSNSW   NFNWSNWSNWSNSWFSNSW
血清编号 RPR滴度a   血清稀释度
  100   200   400
  20212223242526272829303132333435363738394041424344454647   R256R8R1024NRR32R16R8R32R4NRR1024R32R16NRNRR32R64R8NRR4R32R8R128R2R512R16R1024NR   SVFSNWVFWWNNSSVFNNWFVFNNWFWNSVFSN   SVFSNSFWWNNSSWNNWWFNNSWSNSWSN   SFSNSWWSVFNSSWNNSWWNVFSWSNSWSN
血清编号 RPR滴度a   血清稀释度
  100   200   400
  48495051525354555657585960   R64R512NRR256R4R128R32R2R256NRR64R8R128   VFSNSVFSWNSNWWS   FSNSFSWNSNWWS   WSNSNSSNSNSFS
aRPR滴度是在标准的快速血浆反应素(RPR)检验中产生可见反应的反应性梅毒血清的最高稀释度。
实施例12
人血清或血浆中的非密螺旋体和密螺旋体抗体的同时检测
这个实施例说明流通检验装置，其允许同时检测生物样品(例如，人血清或血浆)中对于密螺旋体或非密螺旋体(类脂)抗原为特异性的抗体。这种装置可用于例如诊断主体中的梅毒。
用于这个实施例的流通检验装置包括点样有重组密螺旋体抗原、VDRL抗原(如上述实施例中所述固定的)和对照的膜。原型装置由SpanDiagnostics Ltd.(173-B，New Industrial Estate，Udhna，Surat-394 210，India)提供。将重组的密螺旋体抗原、固定的VDRL抗原、和对照沿着膜的边缘以三角形结构布置(参见，例如，图10)。进行该研究时使检验装置布置在水平表面上，以确保检验过程中试剂的平均分配。
将100μl的洗涤缓冲液加到检验装置的中心并且允许吸收至少30秒。洗涤缓冲液不含有机溶剂和洗涤剂。然后将100μl的人血清或血浆加到检验装置膜的中心并且允许其与表面反应至少30秒。如果要将样品短期保留，将样品储存在2-8℃。对于较久的储存，将样品储存在-20℃或更低温度。在分析冻结样品之前，将样品完全解冻，温和地混合和经过2,000xg的离心作用10分钟。然后检验得到的澄清的上清液。然后将检验装置经洗涤缓冲液洗涤(150μl，至少30秒，以允许溶液吸收)。为了测定是否有对密螺旋体和/或非密螺旋体(类脂)抗原为特异性的抗体存在于样品中，加入200μl的SIGNAL REAGENT(胶态金A蛋白试剂)并且允许吸入。对于最早的判读，在约2分钟之后读取结果。对于最终的判读，在约10分钟之后读取结果。
如果仅在对照区域出现色斑，则认为样品对于密螺旋体或非密螺旋体(类脂)抗原特异性的抗体是非反应性的。仅在对照区域出现的反应性表明该装置适当地运行，并且另外表示得到样品的主体为梅毒(或梅毒螺旋体感染)阴性诊断。如果对照点和密螺旋体和/或非密螺旋体抗原斑点二者都是反应性的(即，变色)，则进一步考虑主体的梅毒(或梅毒螺旋体感染)的阳性诊断(如以下更详细论述的)。如果，在完成检验时，对照、密螺旋体抗原或非密螺旋体抗原斑点都未表现出反应性，则认为检验无效。
表3说明了处理得自以前从未感染梅毒螺旋体的健康供体的150个样品所得到的结果。
表3
样品数   VDRL检验   TPHA检验   流通检验
  密螺旋体斑点   非密螺旋体斑点
150   +ve：2-ve：148 -ve：150 -ve：150   +ve：2-ve：148
VDRL和TPHA检验为基于溶液的检验，分别用于检测主体样品中对于非密螺旋体抗原和密螺旋体抗原为特异性的抗体。如表3中所示，用于检测患者样品中每种抗体类型的基于膜的(流通)检验提供了与用于相应抗体的基于溶液的检验相同的结果。有利的是，双重检测的流通检验允许在单次试验中既检测抗-密螺旋体又检测抗-非密螺旋体(抗-类脂)抗体。只有两个得自健康主体的样品(1.3％)表现出与VDRL检验和流通装置的非密螺旋体(类脂)抗原的显示阳性反应。因此，当检验得自未感染的梅毒螺旋体的主体的血清时，两种检验都具有相同的和低的假阳性结果发生率、和相同的和为零的假阴性结果发生率。
然后将检验装置分析得自已知(或已经)感染梅毒螺旋体的九名患者的血清(得自这种患者的血清也称为梅毒血清)。如表4A中说明的，对于每个样品，基于膜的(流通)试验提供与基于溶液的检验相同的结果；也就是，在基于溶液的VDRL检验与在膜结合的非密螺旋体抗原中、和在基于溶液的TPHA检验与膜结合的密螺旋体抗原中，每个样品都有相同的反应性。如上对于“健康”主体血清样品所述，流通检验的优点是能够使用单个试验同时检验患者血清对于密螺旋体和非密螺旋体(类脂)抗原分反应性。
表4A.
样品编号 VDRL检验   TPHA检验   流通
  对照   密螺旋体抗原   非-密螺旋体抗原
  1   +   +   +   +   +
  2   +   +   +   +   +
  3   +   +   +   +   +
  4   +   +   +   +   +
  5   +   +   +   +   +
  6   +   +   +   +   +
  7   +   -   +   -   +
  8   +   -   +   -   +
  9   +   -   +   -   +
为了比较基于溶液的VDRL和TPHA试验与流通检验装置的灵敏度，选择得自上述实施例6的血清，系列稀释，并且如上检验每个稀释度。如表4B中说明的，用于同时检测梅毒血清中的抗-非-密螺旋体(抗-类脂)和抗-密螺旋体抗体的流通装置的灵敏度与用于每种类型抗体的单独检测溶液测定法相似。
表4B.
稀释度   VDRL检验   TPHA检验 流通
  对照   密螺旋体   非-密螺旋体
  1∶10   +   +   +   +   +
  1∶20   +/-   +   +   +   -
  1∶40   -   +   +   +   -
  1∶80   -   +/-   +   +   -
  1:160   -   -   +   +/-   -
  1∶320   -   -   +   -   -
  1∶640   -   -   +   -   -
使用双重检测的流通装置和基于溶液的TPHA和RPR测定法对42个患者样品筛选抗-密螺旋体和抗-非-密螺旋体(抗-类脂)抗体。在梅毒的常规检验中，经常首先筛选患者血清与非-密螺旋体(类脂抗原)抗原的反应性，例如使用RPR检验。RPR检验一般地在实验室中进行，并且可需要几天来完成；其间，被检验的患者离开检验设备。如果RPR检验是阳性的，则推荐随后的用于测定患者血清与密螺旋体抗原的反应性的检验(例如，TPHA检验)，以确定梅毒的阳性诊断。经常难以召回患者进行随后的TPHA检验，该检验还一般地在实验室中进行并且可能需要几天来完成。只检验患者样品对密螺旋体抗原的反应性(例如，使用TPHA检验)也是有局限的，因为一旦患者已经感染梅毒螺旋体(即，已经患有梅毒)，其抗-密螺旋体抗体的滴度一般地保持较高，即使在成功治疗之后。因此，仅仅密螺旋体抗原的阳性检验不能提供充分的信息。
在检验42名患者的群体时，与TPHA或RPR基于溶液试验法相比的流通装置的性能特征分别提供在表5A和5B中。
表5A
  密螺旋体斑点   TPHA   总
  +   -
  +-   201   417   2418
  21   21   42
用于检测抗-密螺旋体抗体的流通装置的灵敏度为95％，特异性为81％。
表5B
非-密螺旋体斑点   RPR   总
  +   -
  +-   131   028   1329
  14   28   42
流通装置检测抗-非-密螺旋体(抗-类脂)抗体的灵敏度为93％，特异性为100％。
对于筛选的42名患者，发现13名患者同时具有RPR和非-密螺旋体斑点-阳性(表5B，左上角的数字)，20名患者同时具有TPHA和密螺旋体斑点-阳性(表5A，左上角的数字)。同时具有RPR和非-密螺旋体斑点-阳性的所有的13名患者也都是TPHA和密螺旋体斑点-阳性。因此，单独根据流通装置的结果，这13名患者需要立即进行梅毒治疗，而无需随后的检验。
在使用本实施例中所述的流通检验装置时，非限制性的一组临床管理建议为：
  密螺旋体斑点   非-密螺旋体斑点   临床建议
  -   -   不需要采取行动，在约3个月后重复流通检验，特别是对于梅毒为高危的群体
  -   +   不需要梅毒治疗；调查提高抗-类脂抗体滴度的可能原因(例如，狼疮)
  +   +   采血用于定量RPR检验并且获得基线测量；对患者治疗梅毒；和在6个月内重复定量RPR检验，以测定治疗效果
  +   -   不需要梅毒治疗；在约3个月之后重复流通检验，以检测活性的感染
虽然已经通过强调具体的实施方案对本公开进行描述，但是对于本领域技术人员显而易见的是，可使用具体实施方案的变体并且意在可以与本文具体描述不同的方式实践本公开。因此，本公开包括在以下权利要求限定的本公开的精神实质和范围内的所有改进。

Claims (44)

1.包括具有抗-类脂抗体捕获区域的微孔性基底的免疫测定装置，包括：
(a)固定在基底上的锚定抗体；和
(b)类脂抗原，包括心磷脂、卵磷脂、和胆固醇，
其中固定的锚定抗体特异性结合于类脂抗原的心磷脂、卵磷脂或胆固醇组分中的一种或多种，从而形成固定的锚定抗体-类脂抗原配合物。
2.权利要求1的免疫测定装置，其中的基质是微孔膜。
3.权利要求1的免疫测定装置，其中锚定抗体不特异性地结合类脂抗原的心磷脂、卵磷脂或胆固醇组分中的一种或多种的外源表位。
4.权利要求1的免疫测定装置，其中类脂抗原包括胶束而非脂质体。
5.权利要求1的免疫测定装置，其中锚定抗体特异性地结合于类脂抗原的心磷脂组分。
6.权利要求1的免疫测定装置，用于测定流体样品中抗-类脂抗体的存在或量中的至少之一，其另外包括样品施加区域和从样品施加区域到抗-类脂抗体捕获区域的流动通道；其中流体样品中抗-类脂抗体的存在或量中的至少之一可以通过流体样品中的抗-类脂抗体与固定的类脂抗原-锚定抗体配合物之间形成配合物进行检测。
7.权利要求1的免疫测定装置，另外包括密螺旋体捕获区域，包括：
(a)能够被抗-梅毒螺旋体抗体特异性结合的固定的密螺旋体抗原，或
(b)特异性地结合移动的密螺旋体抗原的固定的抗-梅毒螺旋体抗体。
8.权利要求1的免疫测定装置，其中的基底包括硝化纤维、尼龙、聚偏二氟乙烯(PVDF)、聚醚砜、聚碳酸酯、聚酯、醋酸纤维素、混合的纤维素酯、或其组合。
9.权利要求1的免疫测定装置，其中锚定抗体是对心磷脂具有特异性的Fab片段。
10.权利要求1的免疫测定装置，其中锚定抗体是由感染梅毒螺旋体的主体的免疫球蛋白级分产生的多个Fab片段。
11.权利要求1的免疫测定装置，其中类脂抗原为USR抗原、VDRL抗原、或合成的VDRL抗原。
12.权利要求1的免疫测定装置，其中抗-类脂抗体捕获区域包括一个或多个线。
13.权利要求12的免疫测定装置，其中一个或多个线具有约8mm到约15mm的宽度。
14.权利要求1或7的免疫测定装置，其中该装置为流通装置。
15.权利要求14的免疫测定装置，另外包括与基底接触的吸收剂衬垫。
16.权利要求14的免疫测定装置，其中基底具有约0.2μm到约8μm的孔径大小。
17.权利要求1或7的免疫测定装置，其中该装置为横向流动装置。
18.权利要求17的免疫测定装置，其中基底具有高达约12μm的孔径大小。
19.权利要求17的免疫测定装置，其中横向流动装置另外包括位于流动通道中的缀合物衬垫，其中缀合物衬垫包括对于抗-类脂抗体具有特异性的移动的或可移动的检测剂试剂。
20.权利要求19的免疫测定装置，其中检测剂试剂包括金缀合的A蛋白、金缀合的Fc特异性G蛋白、或金缀合的抗-人抗体(Fc部分)。
21.权利要求19的免疫测定装置，其中缀合物衬垫另外包括对于抗-梅毒螺旋体抗体或移动的密螺旋体抗原具有特异性的移动的或可移动的检测剂试剂。
22.权利要求21的免疫测定装置，其中对于抗-梅毒螺旋体抗体具有特异性的检测剂试剂包括金缀合的A蛋白、金缀合的Fc-特异性G蛋白、或金缀合的抗-人抗体(Fc部分)、或用于移动的密螺旋体抗原的检测剂试剂包括金标记的抗-密螺旋体抗原抗体。
23.权利要求1的免疫测定装置，其中类脂抗原-锚定抗体配合物通过包括以下步骤的方法固定在基底上：
使类脂抗原接触一种或多种对于心磷脂、卵磷脂、或胆固醇中的至少一种具有特异性的锚定抗体，以形成类脂抗原-锚定抗体配合物；和
对基底施加类脂抗原-锚定抗体配合物。
24.权利要求1的免疫测定装置，其中类脂抗原-锚定抗体配合物通过包括以下步骤的方法固定在基底上：
将对于心磷脂、卵磷脂、或胆固醇中的至少一种具有特异性的锚定抗体固定在基底上；
将基底上的非特异性结合位点封闭；
使固定的锚定抗体接触类脂抗原，以形成类脂抗原-锚定抗体配合物；和
洗涤基底，以除去没有被锚定抗体特异性结合的任何类脂抗原。
25.用于检测主体中抗-类脂抗体的方法，包括：
对权利要求1的免疫测定装置施加得自主体的生物样品；和
检测存在于生物样品中的抗-类脂抗体与固定的类脂抗原-锚定抗体配合物之间配合物的形成，其中检测配合物的形成检测了主体中的抗-类脂抗体。
26.权利要求25的方法，其中抗-类脂抗体的检测用于诊断主体的梅毒。
27.权利要求25的方法，其中生物样品为血液、血清、皮肤溃疡渗出液、尿、唾液、唾沫、或脑脊髓液。
28.权利要求25的方法，另外包括对免疫测定装置施加对抗-类脂抗体具有特异性的检测剂试剂。
29.权利要求25的方法，另外包括在对免疫测定装置施加样品之前或同时向生物样品加入对抗-类脂抗体具有特异性的检测剂试剂。
30.权利要求27或28的方法，其中检测剂试剂是被标记的A蛋白、Fc-特异性G蛋白、或抗-人抗体。
31.权利要求30的方法，其中标记是酶、胶态金颗粒、彩色乳胶粒子、化学发光试剂或荧光剂。
32.用于诊断主体中梅毒的方法，包括：
对权利要求7的装置施加生物样品；
在抗-类脂抗体捕获区域中检测在存在于生物样品中的抗-类脂抗体与固定的类脂抗原-锚定抗体配合物之间第一配合物的形成；和
在密螺旋体捕获区域检测如下第二配合物的形成：
(a)存在于生物样品中的抗-梅毒螺旋体抗体与固定的密螺旋体抗原之间，或
(b)存在于生物样品中的密螺旋体抗原和固定的抗-梅毒螺旋体抗体之间，
其中检测第一配合物和第二配合物的形成用于诊断主体中的梅毒。
33.权利要求32的方法，其中生物样品为人血液样品。
34.权利要求33的方法，其中人血液样品为全血或血清。
35.用于确定流体样品中抗-类脂抗体的存在或量中的至少之一的免疫测定装置，包括：
微孔膜；
样品施加区域；
抗-类脂抗体捕获区域，包括类脂抗原-锚定抗体配合物，该配合物包括锚定抗体和被锚定抗体特异性结合的类脂抗原，并且该配合物通过锚定抗体固定在膜上；其中类脂抗原包括心磷脂、卵磷脂、和胆固醇；和
从样品施加区域到抗-类脂抗体捕获区域的流动通道；其中可以通过抗-类脂抗体和固定的类脂抗原-锚定抗体配合物之间配合物的形成而检测施加到样品施加区域的流体样品中抗-类脂抗体的存在和/或量。
36.将免疫活性的心磷脂固定在基底上的方法，该方法包括：
使包括免疫活性心磷脂的类脂抗原接触一种或多种对类脂抗原的至少一个组分具有特异性的抗体，以形成类脂抗原-抗体配合物；和
对基底施加类脂抗原-抗体配合物，
其中对基底施加类脂抗原-抗体配合物使免疫活性的心磷脂固定在基底上。
37.权利要求36的方法，其中类脂抗原为USR抗原、VDRL抗原、或合成的VDRL抗原。
38.权利要求36的方法，其中抗体是不与A蛋白、Fc-特异性的G蛋白、或抗-人抗体(Fc部分)显著反应的抗体片段。
39.权利要求38的方法，其中的抗体是Fab片段。
40.权利要求36的方法，其中的抗体分离自梅毒螺旋体感染的或梅毒螺旋体接种的主体的血清。
41.权利要求36的方法，其中基底包括硝化纤维。
42.权利要求36的方法，包括：
使包括免疫活性的心磷脂卵磷脂和胆固醇的类脂抗原接触对于心磷脂、卵磷脂、或胆固醇具有特异性的抗体片段，以形成类脂抗原-抗体配合物；其中抗体片段不与A蛋白、Fc-特异性的G蛋白、或抗-人抗体(Fc部分)显著反应；和
对基底施加类脂抗原-抗体配合物，使免疫活性的心磷脂固定在基底上。
43.权利要求42的方法，包括
使包括免疫活性心磷脂的类脂抗原接触对于心磷脂、卵磷脂、或胆固醇具有特异性的Fab片段，以形成类脂抗原-Fab配合物；其中类脂抗原为USR抗原、VDRL抗原、或合成的VDRL抗原；和
对硝化纤维施加类脂抗原-Fab配合物，使免疫活性的心磷脂固定在硝化纤维上。
44.将免疫活性的心磷脂固定在基底上的方法，该方法包括：
将对于心磷脂、卵磷脂、或胆固醇中的至少一种具有特异性的一种或者多种抗体固定在基底上；
将基底上的非特异性结合位点封闭；
对基底施加包括至少一种免疫活性的心磷脂、卵磷脂或胆固醇的类脂抗原，以形成类脂抗原-固定的抗体配合物；和
洗涤基底，以除去没有被一种或多种固定抗体特异性结合的任何类脂抗原。
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