SE533176C2 - Antigenexponerande micell - Google Patents

Description

533 TYE ras därför inte särskilt bra av antikroppar i ELISA. För att kringgå dessa problem har hydrofoba molekyler lösts i organiska lösningsmedel, såsom etanol, och torkats i multi- brunnsplattor. Torkningen av hydrofoba molekyler på en yta ger emellertid ofta multilageradsorption.

Vidare kan konformationen för en molekyl, som är ett antigen, skilja sig från dess naturliga konformationen när den är bunden till en yta. Denna icke-naturliga konforma- tion kanske inte känns igen av antikroppen eftersom speci- ficiteten och affiniteten för antikroppar mot antigen beror på konformationen hos antigenet. Under de olika inkuba- tions- och tvättstegen i en ELISA kommer molekylerna som avsatts på ytan, åtminstone i någon utsträckning, att fri- sättas till det omgivande mediet. Detta kommer att påverka kvaliteten hos analysen och introducera stora inter- och intraanalysskillnader.

Tvättstegen i immunoanalyser, såsom i en ELISA är nödvändiga för att reducera bakgrunden som ges av ospecifik bindning av andra molekyler än analyterna.

Vidare kommer ett sådant förfarande såsom beskrivs ovan inte att möjliggöra pålitlig detektion av låga mängder av autoantikroppar.

US 5 776 487 avser immunoanalyser som utnyttjar nya liposomreagens vilka har en ligand associerad med eller in- korporerad i liposomen för att underlätta detektionen av analyten i ett patientprov.

Liposomer är känsliga strukturer, vilka lätt bryts upp av detergenter, såsom de detergenter som vanligen an- vänds i tvättstegen i immunoanalyser, till exempel ELISA.

Följaktligen kan detergenter inte användas i tvättstegen när liposomer används i immunoanalyser. Därför kommer mole- kyler andra än analyten som ospecifikt absorberas i en li- posombaserad analys inte att avlägsnas under tvättstegen om man inte utnyttjar detergenter. 10 l5 20 25 30 533 175 Följaktligen föreligger där en brist på analyser för att detektera och/eller kvantifiera autoantikroppar mot li- pofila antigen, vilka inte lider av de begränsningar som diskuteras ovan.

Sammanfattning av uppfinningen Den föreliggande uppfinningen eftersträvar att dämpa, hindra eller eliminera en av de ovan nämnda bristerna i teknikområdet och nackdelar ensamma eller i någon kombina- tion och löser åtminstone de ovan nämnda problemen genom att tillhandahålla en antigenexponerande micell. Denna an- tigenexponerande micell innefattar åtminstone en bärare, åtminstone ett epitop och åtminstone en förankrande mole- kyl, där den förankrande molekylen innefattar åtminstone en förankrande del, avsedd att förankra den antigenexponerande micellen till en yta.

I en första aspekt tillhandahålls ett kit som inne- fattar en antigenexponerande micell och åtminstone en an- ordning som innefattar åtminstone en yta till vilken den förankrande delen i den antigenexponerande micellen har af- finitet.

I en annan aspekt tillhandahålls en metod för att tillverka en antigenexponerande micell. En sådan metod in- nefattar stegen att: lösa upp åtminstone en bärare, åtmin- stone en förankrande molekyl i ett lösningsmedel, vilket innefattar ett icke-polärt lösningsmedel; indunsta lös- ningsmedlet; dispergera återstoden i ett vattenhaltigt lös- ningsmedel; och sonikera den resulterande blandningen.

I en annan aspekt kan en antigenexponerande micell eller ett kit som innefattar antigenexponerande micell och åtminstone tn anordning som innefattar åtminstone en yta till vilken den förankrande delen i en antigenexponerande micell har affinitet användas för att detektera och/eller 10 15 20 25 30 35 533 1?E kvantifiera en analyt, såsom en autoantikropp, vilken har affinitet för epitopet.

I en annan aspekt kan en analyt, såsom en autoanti- kropp, vilken har affinitet för epitopet, detekteras och/eller kvantifieras genom att; tillhandahålla antigenex- ponerande micell; binda denna micell till en yta; exponera den bundna micellen för ett prov, vilket prov innefattar en analyt, vilken analyt har affinitet för detta epitop; och detektera och/eller kvantifiera denna analyt.

Ytterligare aspekter av uppfinningen framgår av be- skrivningen och de bifogade kraven.

Kortfattad beskrivning av ritningarna Dessa och andra aspekter, egenskaper och fördelar till vilka uppfinningen är kapabel kommer att framgå av följande beskrivning av illustrativa utföringsformer och exempel på den föreliggande uppfinningen, referens görs till de bifogade ritningarna i vilka Fig. 1 avbildar hur förhållandet mellan bäraren, till exem- pel lysofosfatidylkolin, och antigenet, till exempel GM-1, enligt en utföringsform av uppfinningen, kan påverka käns- ligheten hos analysmetoden.

Fig. 2 avbildar den förankrande effekten med den förankran- de delen.

Fig. 3 avbildar titreringen av ett kaninanti-GM-1-serum.

Fig. 4 avbildar detektionen av antikroppar i serum.

Fig. 5 avbildar detektionen av en antigen associerad med en fosfolipid.

Detaljerad beskrivning av uppfinningen Definitioner I den föreliggande ansökan och uppfinningen tillämpas följande definitioner: 10 15 20 25 30 533 'H95 Termen "bärare" avser att betyda en molekyl, vilken innefattar en lipofil del och hydrofil del och vilken mole- kyl kan bilda miceller i vatten.

Termen "förankrande molekyl“ avser att betyda en mo- lekyl, vilken innefattar en lipofil del och en förankrande del.

Termen "förankrande del" avser att betyda en del, vilken har affinitet för en specifik grupp eller en speci- fik typ av yta.

Termerna "lipofil" och "hydrofil" har upptagits från "IUPAC Compendium of Chemical Terminology - the Gold Book" (http //goldbook.iupac.org/index.html) och avser att inne- fatta karaktären hos interaktion mellan en särskild atomàr grupp/grupper och mediet. I detta sammanhang avser termen "lipofil" att betyda fettföredragande och vattenskyende och termen "hydrofil" avser att betyda vattenföredragande och fettskyende.

Termen "gangliosid“ avser att betyda en ceramid och en oligosackarid som bildar en glykosfingolipid.

Termen "biotinanaloger" avser att betyda molekyler som har förmågan att binda till avidin eller streptavidin och vilka har väsentligen samma bindningsfunktion med avse- ende på avidin eller streptavidin som biotin, såsom att de har en dissociationskonstant på lika med eller mindre än io”.

Termen "kit" avser att betyda en samling av artiklar som används för att utföra en analys.

Termen "nukleotidsekvens" avser att betyda en nukleo- tidsekvens med enkelstrângade nukleotider.

Termen "derivat" avser att betyda en molekyl som lik- nar den ursprungliga molekylen, där åtminstone en del som finns i den ursprungliga molekylen saknas och/eller där åt- minstone en del som inte finns i ursprunget finns i detta derivat. 10 15 20 25 30 35 533 178 Termen "biotinylerad“ avser att betyda att biotin har bundits kovalent till en molekyl, fakultativt via en lin- ker.

Termen "belagd yta" eller liknande formuleringar av- ser att betyda att ytan har modifierats genom icke-kovalent eller kovalent bindning av molekyler och/eller atomer till denna yta.

Termen "autoantikropp" avser att betyda en antikropp specifik för ett självantigen.

Termen "självantigen“ avser att betyda antigen mot en organisms egna celler och cellprodukter.

Termen "bindningspar" avser att betyda ett par där de två medlemmarna i paret har affinitet för varandra.

Antigenexponerande micell Den föreliggande uppfinningen avser en antigenexpone- rande micell som innefattar åtminstone en bärare, åtminsto- ne ett epitop och åtminstone en förankrad molekyl, där den förankrade molekylen innefattar en förankrande del avsedd att förankra strukturen till en yta. Bäraren kan innefatta epitopet, men är huvudsakligen avsedd att ge micellen sta- bilitet och epitopet är då del av ett lipofilt antigen som är åtskilt från denna bärare. Överraskande har det befunnits möjligt att inkorpore- ra två olika lipofila strukturer, dvs. ett lipofilt antigen som innefattar detta epitop och en förankrande molekyl i samma micell. Detta fynd står i motsats till den gängse kunskapen inom teknikomrádet.

Bäraren kan vara av naturligt, syntetiskt eller semi- syntetiskt ursprung eller en blandning därav. Strukturer såsom miceller är, av fackmanenn, kända för att kunna bil- das i vatten av molekyler som innefattar både lipofil(a) del(ar) och hydrofil(a) del(ar), till exempel antifila mo- lekyler. 10 15 20 25 30 533 *IÉFG Jämfört med andra strukturer, såsom liposomer har mi- cellerna fördelen att de är mer stabila strukturer med en definierad form och struktur. En micell kommer att exponera ett innefattat lipofilt antigen i dess nativa konfiguration och är därför en lämplig struktur för att presentera ett epitop i lipofila antigen till ett omgivande hydrofilt me- dium. Det är också lämpligt, med avseende på bindningen av den antigenexponerande strukturen till en yta, att struktu- ren är definierad och relativt stabil.

Vidare är en micell, när den väl bildats, en relativt stabil struktur och inget eller mycket litet utbyte av med- lemmar i micellen med det omgivande mediet äger rum. Denna egenskap är till exempel viktig när den antigenpresenteran- de micellen används för att detektera analyter i serum som innehåller lipofila komponenter. I motsats till liposomer som innefattar lipofila antigener, där ett utbyte äger rum mellan liposomer och lipidaggregat i serumet, befanns inget eller mycket litet utbyte att äga rum mellan en micell som innefattar lipofila antigener och lipidaggregat i serumet.

I motsats till den liposom som innefattar ett lipo- filt antigen, där det lipofila antigenet kan presentera sitt epitop både för det omgivande mediet och till det inre av liposomen, kommer en micell som innefattar ett lipofilt antigen alltid att presentera epitopet för det omgivande mediet. Följaktligen kommer alla antigen som tillsätts till micellen att presentera sina epitop till det omgivande me- diet.

Miceller, såsom de som beskrivs häri, till andra typer av strukturer, kan, i motsats såsom liposomer, lamillära strukturer, vilka enkelt bryts upp, motstå standardtvåttbe- tingelser som används vid immunoanalyser, till exempel vid ELISA. Dessa tvättbetingelser innefattar normalt en deter- gent, såsom tvätt med en vattenlösning som innefattar 0,05 96 Twêen. 10 15 20 25 30 35 533 1?E De fördelar som diskuteras ovan och andra fördelar kommer att förklaras vidare nedan.

Storleken på micellen kan skilja sig åt. I en utfö- ringsform har micellen en diameter på omkring 5 nm till om- kring 300 nm. I en annan utföringsform har micellen en dia- meter på omkring 5 nm till 100 nm.

Bäraren kan väljas från en eller flera typer av mole- kyler som valts från gruppen som innefattar fettsyror, så- som stearinsyra, beheninsyra, sfingolipider, linolsyra, arkedonsyra, såsom lysosfingolipider, lysofosfolipider, glykolipider, gangliosider, såsom GM-1, och GM-3, fosfolipider, såsom såsom cerebrosider och GM-2, asialo-GM-2 såsom kolesterol och fytosteroler, och surfaktanter såsom detergenter. asialo-GM-1, steroider, I en utföringsform väljs bäraren som bildar struktu- ren från molekyler som är kända för att bilda miceller i koncentrationer över 1 mikromolar (pM). Sådana molekyler kan hittas både bland naturliga och syntetiska lysofosfoli- pider.

I en annan utföringsform används mer än en typ av mo- lekyler som bärare. Genom att använda mer än en typ av bä- rare kan egenskaperna för den antigenpresenterande micellen justeras, vilket kan vara fördelaktigt.

I en annan utföringsform innefattar strukturen natur- lig eller syntetisk lysofosfatidylkolin.

Epitopet kan vara en del av ett lipofilt antigen som är svagt vattenlösligt. Genom att inkorporera ett antigen som är åtskilt från båraren i den antigenexponerande micel- len, som bildas av båraren och beskrivits häri, kan dess synbara löslighet i vatten ökas och aggregering av lipofila antigener kan därigenom undvikas.

Epitopet finns typiskt i en hydrofil del av det lipo- fila antigenet. Genom att inkorporera det lipofila antige- net i en micell såsom beskrivits häri, kan antigenet pre- sentera epitopet till det omgivande mediet i dess naturliga 10 15 20 25 30 35 533 1?6 konfiguration. Därigenom kan antikroppar och andra moleky- ler med affinitet för antigenet och vilka föreligger i det omgivande mediet känna igen och binda till antigenet.

I en utföringsform är epitopet en del av bäraren, som bildar den antigenpresenterande micellen. Utan begränsning är ett exempel på molekyler som kan fungera både som bärare och lipofila antigen gangliodider, såsom GM-l. Men, som diskuterats ovan, är bäraren fördelaktigt åtskild från an- tigenet. Den antigenpresenterande micellen innefattar då åtminstone tre olika komponenter, en bärare, en förankrande molekyl och ett lipofilt antigen. I en sådan utföringsform tjänar bäraren till att bilda en stabil micell i vilken den förankrande molekylen och det lipofila antigenet kan inkor- poreras.

Epitopet kan väljas från hydrofila antigen mot vilka antikroppar som bildas vid autoimmuna sjukdomar eller rubb- ningar är riktade. Utan att vara begränsad till dessa, är exempel pà sådana antigen gangliosider, sàsom GM-l, asialo- GM-l, GM-2, asialo-GM-2 och GM-3, kardiolipin, fosfolipi- der, sfingolipider och derivat därav.

I en annan utföringsform år epitopet del av en hapten såsom DNP (dinitrofenyl). Denna hapten kopplas till en mo- lekyl som innefattar en lipofil del, såsom fosfatidyletano- lamid, för att möjliggöra inkorporering i micellen, vilken kommer att exponera haptenen. På detta sätt elimineras de förvarande nackdelarna med att använda haptener som antigen i immunoanalyser. Dessa nackdelar liknar de som diskuterats ovan för lipofila antigener. V Den förankrande delen, avsedd att förankra den anti- genexponerande micellen till en yta, kan väljas från med- lemmar av specifika bindningspar, såsom biotin, biotinana- loger såsom norbiotin, homobiotin, oxybiotin, iminobiotin, destiobiotin, diaminobiotin, biotin sulfoxid, biotin sulfon eller andra biotinmolekyler som har förmågan att binda till avidin, streptavidin och derivat därav, avidin, streptavi- 10 15 20 25 30 din, tioler, antigen, antikroppar, haptener, nukleotidsek- venser och derivat eller delar därav. Andra exempel pä med- lemmar i specifika bindningspar kan också användas.

Genom att använda en medlem av ett specifikt bind- ningspar som förankringsdel, kan det bli möjligt att för- ankra strukturen till en yta, speciellt om ytan, åtminstone delvis, är belagd med den motsvarande medlemmen i bind- ningsparet. I motsats till en ospecifik interaktion, såsom en hydrofob interaktion, till exempel mellan ett lipidanti- gen och en polymeryta, kommer förankring av strukturen via specifikt bindningspar att göra förankringen mindre känslig för de tvättbetingelser som används vid immunoanalyser. Ge- nom att använda en förankrande del kommer det lipofila an- tigenet som finns i den antigenpresenterande strukturen som bundet till ytan med hjälp av den förankrande delen inte att enkelt tvättas bort. Därigenom kan obundet material som finns i provet tvättas bort.

Vidare kan, såsom diskuterats ovan detergenter använ- das för att göra denna tvätt mer effektiv och även materi- al, vilket ospecifikt har bundit till den fasta ytan kan tvättas bort. Sådan tvätt kommer att öka känsligheten och sänka detektionsgränsen när den antigenpresenterande struk- turen används i immunoanalyser, till exempel ELISA.

I en annan utföringsform är den förankrande delen bi- otin. Biotin är en välkänd medlem i ett specifikt bind- ningspar. Den motsvarande medlemmen kan vara avidin eller streptavidin. Eftersom biotin ofta har använts vid specifi- ka bindningspar är fackmannen bekannt med användningen av biotinkonjugat och hur man konjugerar biotin med andra mo- lekyler.

Biotinkonjugat av amfifila molekyler är kommersiellt tillgängliga (Avanti polar lipids (Alabaster, AL) och akti- verad biotin, vilken är enkel att koppla till andra moleky- ler, är kommersiellt tillgänglig (BioRad, Richmond, PA). 10 15 20 25 30 35 533 1?E ll I en annan utföringsform är den förankrande molekylen biotinylerad fosfatidyletanolamin, vilken är kommersiellt tillgänglig (Invitrogen, Carlsbad, CA).

I ytterligare en annan utföringsform är den förank- rande molekyl GM-1. Den motsvarande bindningsmedlemmen till GM-1 kan vara koleratoxin.

I ytterligare en annan utföringsform är den förank- rande delen en hapten konjugerad till en lipofil molekyl.

Den motsvarande bindningsmedlemmen till haptenen kan då vara en antikropp.

I ytterligare en annan utföringsform är den antigen- exponerande micellen en micell som innefattar åtminstone en bärare vald från lysofosfatidylkolin, gangliosider, såsom GM-1, ett lipofilt antigen såsom en gangliosid, till exem- pel GM-1, GM-2, asilio GM-1, eller ett antigen, där epito- pet är en del av en hapten och i vilken den hydrofoba delen är en fosfolipid, såsom en dinitrofenyl- fosfatidyletanolamin (DNP-PE) och en biotinylerad förank- ringsmolekyl, såsom biotinylerad fosfatidyletanolamin.

I ytterligare en annan utföringsform innefattar den antigenexponerande micellen från omkring 1 till omkring 95 viktprocent av en bärare och från 1 till omkring 50 vikt- procent av en förankringsmolekyl.

I ytterligare en annan utföringsform innefattar den antigenexponerande micellen från omkring 1 till omkring 95 viktprocent av en bärare, från omkring 1 till omkring 50 viktprocent av en förankrande molekyl och från omkring 1 till omkring 80 procent av ett lipofilt antigen som är åt- skilt från denna bärare och denna förankrande molekyl.

I ytterligare en annan utföringsform innefattar den antigenexponerande micellen från omkring 20 till omkring 80 viktprocent av en bärare, från omkring 5 till omkring 20 viktprocent av en förankrande molekyl och från omkring 10 till omkring 70 procent av ett lipofilt antigen som är åt- skilt från denna bärare och denna förankrande molekyl. lO 15 20 25 30 35 533 1?B 12 I ytterligare en annan utföringsform innefattar den antigenexponerande micellen från omkring 20 till omkring 80 viktprocent av en första bärare, från omkring 5 till om- kring 20 viktprocent av en andra bärare, från omkring 5 till omkring 20 viktprocent av en förankrande molekyl och från omkring 20 till omkring 70 viktprocent av ett lipofilt antigen som är àtskilt från denna första och andra bärare och denna förankrande molekyl. I en sådan utföringsform kan den andra bäraren användas för att öka inkorporering av det lipofila antigenet i den antigenpresenterande micellen, för att öka stabiliteten hos den antigenpresenterande micellen eller för att stabilisera antigenets struktur.

Ett kit som innefattar en antigenexponerande micell Ett kit kan innefatta en antigenexponerande micell såsom beskrivits ovan och en anordning som innefattar åt- minstone en yta till vilken den förankrande delen av den antigenexponerande micellen har affinitet.

I en utföringsform tillhandahålls ett kit som inne- fattar en antigenexponerande micell, såsom beskrivits ovan, och en anordning som innefattar åtminstone en yta. Anord- ningen kan väljas från plattor med multibrunnar, såsom 96-, 382- eller 536-hálsplattor, provrör, MALDI-TOF-plattor, pappersremsor, täckglas, kulor, partiklar eller andra ytor som används vid immunoanalyser såväl som vid gruppanalys (eng. “array performance").

Ytan hos anordningen ska ha sådana egenskaper att den förankrande delen i den antigenexponerande micellen har af- finitet för den. Ett av många sätt att ge en yta sådana egenskaper är att belägga den. Medlemmar i olika typer av specifika bindningspar kan användas för att belägga anord- ningsytan och därigenom möjliggöra förankring av antigenex- ponerande micell. Därigenom kan olika förankringsdelar an- vändas beroende på de specifika behoven i ett specifikt 10 15 20 25 30 533 175 13 fall. Om en sådan belagd yta exponeras för en framställning som innefattar en antigenexponerande micell, såsom beskri- vits ovan, kan strukturen binda till ytan och lösningen kan avlägsnas utan att avlägsna den antigenexponerande micel- len. Därefter kan andra lösningar appliceras till kitet med den bundna antigenexponerande micellen. Dessa lösningar kan innefatta molekyler, såsom antikroppar, specifika för det exponerade epitopet. Därigenom kan dessa molekyler bindas till ytan av ett antigenexponerande system och vilket obun- det material som kan tvättas bort utan att påverka det an- tigenbundna exponeringssystemet eller molekylen bunden till det.

I en annan utföringsform innefattar beläggningen avi- din eller streptavidin. Avidin eller streptavidin är väl- kända medlemmar av specifika bindningspar. Den motsvarande medlemmen kan vara biotin, biotinanaloger såsom norbiotin, homobiotin, oxybiotin, biotin, iminobiotin, destiobiotin, diamino- biotin sulfoxid, biotin sulfon eller andra biotin- molekyler som har förmågan att binda till avidin, vidin eller derivat därav. Eftersom avidin och streptavidin ofta har använts vid specifika bindningspar är fackmannen bekant med hur man ska belägga ytor med avidin eller strep- tavidin, såsom polystyrenplattor. strepta- I en annan utföringsform innefattar beläggningen bio- tin eller ett protein eller en polymer kovalent bunden med biotin, biotinanaloger såsom norbiotin, homobiotin, oxybio- tin, iminobiotin, destiobiotin, diaminobiotin, biotin sul- foxid, biotin sulfon eller andra biotinmolekyler som har förmågan att binda till avidin, streptavidin eller derivat därav. Andra exempel på medlemmar av specifika bindningspar såsom antigen, haptener, antikroppar, nukleotidsekvenser och derivat eller delar därav kan också användas. Såsom nämnt ovan finns det särskilda fördelar med att använda en sådan medlem av ett bindningspar. 10 15 20 25 30 14 I en annan utföringsform innefattar beläggningen ko- leratoxin.

I en annan utföringsform används multibrunnsplattor som ytan till vilken antingen exponerande miceller binds.

I en annan utföringsform används kulor eller partik- lar för att tillhandahålla en yta till vilken de antigenex- ponerande micellerna binds.

I en annan utföringsform innefattar kitet den anti- genexponerande micellen bunden till en yta eller belägg- ningen pà en anordning. Ytan eller beläggningen kan vara av de typer som diskuterats ovan. Ett sådant kit är användbart direkt utan några vidare steg, för detektion och kvantifie- ring av analyter, till exempel av antikroppar i serum, vil- ka har affinitet för det exponerade antigenet.

Ett sådan kit som har beskrivits ovan kan vidare in- nefatta ett detektionsreagens, såsom en antikropp. Detta detektionsreagens kan ha affinitet för en analyt, såsom en antikropp, vilken antikropp kan vara en autoantikropp, där denna analyt har affinitet för det antigen som exponeras av den antigenpresenterande strukturen. Detektionsantikroppen kan vara en antihuman antikropp med affinitet för humana antikroppar. Vidare kan detektionsantikroppen vara en anti- kropp med affinitet för antikroppar från specier till vilka antikroppar med affinitet mot det lipofila antigenet hör.

I en annan utföringsform innefattar detektionsanti- kroppen en del för att möjliggöra detektion av analyten till vilken detektionsantikroppen kan vara bunden. Detta innebär att analyten bunden till den antígenexponerande mi- cellen kan detekteras och att mängden som föreligger kvan- tifieras. Eftersom, vilket obundet material i provet som, vilket innefattar analyten, såväl som material ospecifikt bundet till den fasta ytan kan tvättas bort såsom beskri- vits ovan, reduceras brus, vilket skulle påverka detektio- nen och/eller kvantifieringen negativt. lO l5 20 25 30 35 533 ¶?E 15 I en annan utföringsform kan denna del som möjliggör detektion av bundna antikroppar väljas frán gruppen som be- stàr av fluorescenta grupper, såsom FITC, radioaktiva grup- per såsom MSI, enzymer, sásom pepparrotsperoxidas eller fosfats, biotin, avidin. Användning av sådana grupper bety- der att mängden bunden analyt automatiskt kan detekteras och/eller kvantifieras, med exempelvis en plattläsare, så- som är känt för fackmannen.

I andra utföringsformer kan detektionsreagenset vara protein A eller protein G.

Metod för att tillverka en antigenexpgnerande micell En antigenexponerande micell kan tillverkas genom att: a) lösa en bärare, antigen, en förankringsmolekyl och ett lipofilt fakultativt detsamma som bäraren, i ett lösnings- medel som innefattar ett opolärt lösningsmedel, såsom klo- roform; b) avdunsta lösningsmedlet; och c) dispergera återstoden i ett vattenhaltigt lösningsmedel, såsom fosfatbuffrat salin (PBS), och ultraljudsbehandla den resulterande blandningen.

Exempel på bärare, lipider som innefattar epitoper och förankringsmolekyler beskrivs i de föregående styckena.

På samma sätt som förhållande för delarna som ska dela strukturerna görs.

Metod för att tillverka ett kit Ett kit som innefattar den antigenexponerande micel- len kan tillverkas genom att exponera en anordning, vilken belagts med en medlem av det bindningspar som används för att förankra antigenexponerande micellen, exempel på dylika har givits ovan, för en lösning som innefattar den antigen- 10 15 20 25 30 35 533 175 16 exponerande micellen. Detta kit kan sedan inkapslas. Sådan inkapsling betyder att kitet kommer att vara enklare att transportera och skänker också längre hållbarhet till ki- tet. Vidare minimerar inkapsling risken för kontaminering före användning av kitet.

I en annan utföringsform kan kitet tillverkas genom att exponera en anordning, som belagts med en medlem av bindningsparet som används för att förankra den antigenex- ponerande micellen, exempel på dessa har givits ovan, till en lösning som innefattar denna antigenexponerande micell.

Obundet material kan fakultativt tvättas bort. Ett sådant tvättsteg kommer att avlägsna strukturer, vilka inte har bundit korrekt till ytan och därigenom kan störa den efter- följande användningen av kitet. Eftersom micellerna är re- lativt stabila strukturer, kan detergenter, såsom Tween, användas för att göra detta tvättsteg mer effektivt. Sedan kan en andra lösning som innefattar vatten, kolhydrater, såsom manitol, dextran och laktos eller andra stabiliseran- de molekyler tillsättas. En sådan lösning kan förse den an- tigenpresenterande strukturen som föreligger kitet med sta- bilitet och därigenom ge kitet längre hållbarhet. Före in- kapslingen kan anordningen som innefattar de absorberade antigenexponerande micellerna torkas, såsom lyofiliseras (frystorkas) för att ge en väsentligen torr anordning.

I motsats till andra strukturer, såsom liposomer, är miceller tillräckligt stabila för att motstå de nedfrys- ningsbetingelser som används under frystorkning.

En torr anordning kan vara enklare att hantera och transportera. Vidare kan den vara mer robust än en anord- ning som innefattar ett flytande medium. Den kan också ha längre hållbarhet.

Slutligen inkapslas kitet och tiilhandahålls som de- lar, en som innehåller anordningen med de absorberade anti- genexpressorerna och en del som innehåller detektionsrea- gens. Såsom nämnts ovan kan inkapsling göra det enklare att 10 15 20 25 30 35 533 1?G 17 transportera och kan också ge kitet längre hållbarhet. Vi- dare minimerar inkapsling risken för kontaminering före an- vändning av kitet.

Detektion och/eller kvantifiering av en analyt genom att använda en antigenpresenterande struktur eller ett kit som innefattar en En antigenpresenterande micell eller ett kit som in- nefattar en sådan micell och vilken har beskrivits ovan, kan användas för att detektera och/eller kvantifiera en analyt, vilken har affinitet för det presenterade epitopet, och föreligger i komplexa prov, såsom plasma eller serum från ett däggdjur.

I en utföringsform är provet ett däggdjursserum, så- som ett humant serum från en patient som möjligen innefat- tar autoantikroppar. Genom att använda den antigenpresente- rande strukturen eller ett kit såsom beskrivits häri kan förekomsten av autoantikroppar detekteras och slutligen an- vändas för att diagnosticera en autoimmun sjukdom eller rubbning. Exempel på sjukdomar och rubbningar som kan de- tekteras med detta är perifer neuropati, såsom Guillian Barres syndrom, antifosfolipidsyndrom och arterioskleros.

Beroende på känsligheten, vilket delvis är en följd av stabiliteten hos micellerna, vilken möjliggör använd- ningen av detergenter i tvättstegen, hos detektionsmetoden som beskrivs häri blir diagnosen av autoimmuna sjukdomar i ett tidigt skede möjlig. Tidig detektion är viktig för att möjliggör päbörjandet av behandling av sjukdomen eller rubbningen så tidigt som möjligt för att undvika och mini- mera organskador.

Vidare är detektionen av vissa lipofila antigen inte möjlig med metoder inom det nuvarande teknikområdet. Omfat- tande provbehandling före detektionen och/eller kvantifie- ringen har utnyttjats i försök att minska komplexiteten för 10 15 20 25 30 533 QTE 18 proven, såsom serum, för att reducera behovet av tvättste- ge. Sådana förbehandlingar av proven ger upphov till mer tidskrävande analyser, vilka vanligtvis förknippas med re- ducerad precision och tillförlitlighet. Dessa nackdelar lö- ses av den föreliggande uppfinningen.

I andra utföringsformer avser den föreliggande upp- finningen en metod för att detektera och/eller kvantifiera en analyt, såsom en autoantikropp. Förekomsten av dessa au- toantikroppar i ett prov, såsom serum, från en patient kan indikera att patienten lider av en autoimmun sjukdom eller rubbning. En sådan metod innefattar stegen att; tillhanda- hålla en micell av någon sort som beskrivits här; binda denna micell till en yta; fakultativt tvätta iväg några obundna miceller; exponera den bundna micellen för ett prov, vilket prov innefattar en analyt, vilken analyt har affinitet för detta epitop; fakultativt tvätta iväg någon del av provet som inte bundit till detta epitop och delar som ospecifikt bundet epitop genom att använda en lösning som innefattar en detergent, såsom en vattenlösning som in- nefattar 0,05 % Tween; och detektera och/eller kvantifiera denna analyt. Även om den föreliggande uppfinningen har beskrivits ovan med hänvisning till specifika illustrativa utförings- former avses den inte begränsas till de specifika formerna som läggs fram häri. Andra utföringsformer är möjliga om- fattningen för de bifogade kraven.

Exempel De exempel som ges nedan avser bara att vidare illu- strera uppfinningen och är på intet vis avsedda att begrän- sa omfattningen för uppfinningen såsom definierad av de bi- fogade kraven.

Material lO 15 20 25 30 35 533 1?E 19 Lysofosfatidylkolin (L-a-lysofosfatidylkolin från hönsägg), gangliosider; monosialo gangliosid GM-1, asialo- gangliosid GM-1, diasialogangliosid GD1a och diasialogang- liosid GD1b (nötkreaturshjärna) kom från Sigma-Aldrich (St Louis, MO). Biotinylerad fosfoetanolamin (N-((6- (biotinoyl)amino)hexanoyl)-1,2-dihexadekanoyl-sn-glycero-3- fosfoetanolamin (biotin-PE) kom från Invitrogen (Carlsbad, CA).

Exempel 1 Framställning av antigenpresenterande miceller Bärare, såsom lysofosfolipider, förankringsmolekyler, såsom biotin-PE, och lipofila antigener såsom gangliosider till exempel GM-1, DNP-fosfatidyletanolamin blandade i oli- ka molära förhållanden, löstes i kloroform eller en bland- ning av kloroform metanol 1:1. Den resulterande blandningen torkades under kväve. Återstoden dispergerades i en fosfat- buffrad salin (PBS) till en slutlig koncentration på 200 pg/ml och sonikerades vid 50°C under 10 minuter till lös- ningen föreföll klar. Framställningen med antigenpresente- rande miceller förvarades vid 4°C. Före användning sonike- rades de igen vid 50°C under 10 minuter tills att de till- sattes till ELISA-plattor.

Exempel 2 Beläggning av ELISA-plattor 96-hàls ELISA-plattor (NUNCmaxisorp) belades med 100 ng streptavidin (Sigma-Aldrich) i PBS per brunn vid 4°C över natt eller under 2 timmar vid 37°C. Plattorna blocke- rades sedan med 2 % BSA (Cohn fraction V Sigma-Aldrich) el- ler 0,5 % gelatin (Sigma-Aldrich) rumstemperatur. i PBS under 1 tim vid Exempel 3 Bärarens betydelse lO 15 20 25 30 533 ¶?5 20 Framställningar med antigenpresenterande miceller, framställda i enlighet med exempel 1, där förhållandet mel- lan bäraren (lysofosfatidylkolin), lipofilt antigen (GM-1) och förankringsmolekylen (biotin-PE) varieras, tillsattes vid olika koncentrationer (se fig. 1), och plattorna inku- berades under 1 tim vid rumstemperatur.

För att detektera GM-1 i de olika antigenpresenteran- de micellerna, inkuberades plattorna med koleratoxin subdel B konjugerad med pepparrotsperoxidas (CTB-HRP, Invitrogen), 2 pg/ml i PBS, under 1 tim vid RT. Plattan framkallades med tetrametylbensidin (TMB substratreagenset, BD Biosciences, San Diego, CA), och absorbansen vid 405 nm mättes genom att använda en ELISA-plattläsare (Powerwave WS, Bio-Tek Instru- ments Inc., Winooski, VT) efter 10-30 minuter. Mellan varje inkuberingssteg tvättades plattan 3 gånger med 0,05 % Twe- en-20 i PBS, om inte annat anges i figuren.

Såsom ses i fig. 1 kan inkorporeringen av en bärarli- pid (lysofosfatidylkolin fig. 1) átskiljd från det lipofila antigenet sänka detektionsgränsen med avseende på det lipo- fila antigenet, dvs. GM-1.

Exempel 4 Förankringseffekt för biotin-PE Antigenpresenterande miceller som innehåller GM-1 framställdes i enlighet med exempel 1 från GM-1, lysofosfa- tidylkolin, biotin-PE och inkuberades i ELISA-plattor med eller utan streptavidinbeläggning. Efter inkuberingen tvät- tades plattorna med PBS som innehåller 0,05 % Tween 20 och bunden GM-1 detekterades med HRP-märkt koleratoxin.

Såsom ses från fig. 2, tvättades i princip allt anti- genpresenterande miceller bort i frånvaro av streptavidin.

Exempel 5 Titrering av kanin-anti-GMl serum 10 15 20 25 30 35 533 1?5 21 Antigenpresenterande miceller som innehåller GM-1 framställdes i enlighet med exempel 1 från GM-1, lysofosfa- tidylkolin, biotin-PE och bands till ELISA-plattor belagda med streptavidin. GM-l detekterades med kanin-anti-GM1 po- lyklonalt serum (Calbiochem), serumet späddes i PBS och in- kuberades i streptavidinbelagda plattor som innehöll adsor- berade antigenexponerande strukturer under 1 tim vid rums- temperatur. Bunden kanin-anti-GM-1-IgG detekterades sedan med get-anti-kanin-IgG-HRP (Zymed Laboratories, San Fransi- sco, CA) under 1 tim och framkallades såsom beskrivits OVân .

Såsom ses från fig. 3, erhölls en titrering av kanin antiserum mot GM-1.

Exempel 6 Detektion av human-anti-GMl antikroppar i pati- entserum Antigenpresenterande miceller som innehåller GM-1 framställdes i enlighet med exempel 1 från GM-1, lysofosfa- tidylkolin, biotin-PE och bands till ELISA-plattor med streptavidinbeläggning.

Patientserum spades ut 1:50 i PBS som innehöll 1 % BSA, och inkuberades under 1 tim vid rumstemperatur på plattor som innehöll bundna GM-1-presenterande miceller.

Gangliosidspecifika IgG eller IgM detekterades med alkalin fosfataskonjugerad anti-human-IgG (IgE-ALP, Sigma-Aldrich) eller IgM (IgE-ALP, Sigma-Aldrich), löstes i PBS som inne- höll 1 % BSA. Plattan framkallades med alkalint fosfatas gult vätskesystem för ELISA (Sigma-Aldrich) och absorbansen vid 405 nm bestämdes efter 10-30 min såsom beskrivits ovan.

Såsom avbildas i fig. 4, innehöll båda patientserana högre nivåer av gangliosidspecifika IgG och IgM än kontrol- len. vidare skilde sig förhållandet mellan IgG och IgM åt mellan patientproverna. 10 15 533 ¶?E 22 Exempel 7 Detektion av ett antigen bundet till en fosfoli- Eid.

Antigenexponerande miceller framställdes genom att blanda lysofosfatidylkolin, biotin-PE och DNP- fosfatidyletanolamin, i kloroform. Efter indunstning av det organiska lösningsmedlet dispergerades lipiderna i PBS och bands till streptavidinbelagda ELISA-plattor. Slutligen in- kuberades de bundna antigenpresenterande micellerna med en utspädningsserie av alkalin fosfataskonjugerad monoklonal musantikropp specifik för DNP. Plattorna utvecklades med alkalin fosfatas gult vätskesystem för ELISA (Sigma- Aldrich) och absorbans vid 405 nm bestämdes såsom beskri- vits ovan.

Resultatet avbildas i fig. 5.

Claims (27)

10 15 20 25 30 533 'F95 23 PATENTKRAV

1. En antigenexponerande micell som innefattar -åtminstone en bärare, -åtminstone ett epitop, och -åtminstone en förankrande molekyl, där denna förankrade molekyl innefattar åtminstone en förankrande del, där denna förankrande del valts från biotin, biotinanaloger och andra biotinmolekyler som har förmågan att binda till avidin, streptavidin och derivat därav, och år avsedd att förankra den antigenexponerande micellen till en yta, där micellen innefattar två olika lipofila strukturer, vilka utgörs av ett lipofilt antigen som innefattar epitopet och den förankrande molekylen.

2. Micellen enligt krav 1, där den förankrande delen år biotin.

3. Micellen enligt krav 2, där den förankrande molekylen är biotinylerad fosfatidyletanolamin.

4. Micellen enligt något av de föregående kraven, där bäraren valts från gruppen som består av fosfolipider, fettsyror, sfingolipider och detergenter.

5. Micellen enligt krav 4, där bäraren bildar miceller i vatten vid koncentrationer lägre än 1 pM (mikromolar).

6. Micellen enligt något av de föregående kraven, där bäraren valts från gruppen som består av lysofosfolipider och lysosfingolipider. 10 15 20 25 30 533 ¶?E 24

7. Micellen enligt krav 6, där bäraren är lysofosfatidylkolin.

8. Micellen enligt krav 4, där bäraren är en fettsyra eller ett derivat därav.

9. Micellen enligt krav 4, där bäraren är en tensid.

10. Micellen enligt något av de föregående kraven, där epitopet är en del av ett lipofilt antigen som inte är bäraren eller den förankrande molekylen.

11. Micellen enligt något av kraven 1 till 9, där micellen innefattar mer än en typ av bärare av vilka ingen innefattar epitopet.

12. Micellen enligt krav 10 eller 11, där det lipofila antigenet valts från antigen mot vilka antikroppar som kännetecknar autoimmuna sjukdomar eller rubbningar är riktade.

13. Micellen enligt krav 12, där det lipofila antigenet valts från gruppen som består av gangliosider, kardiolipin och fosfolipider.

14. Micellen enligt något av de föregående kraven, där micellen innefattar från omkring 20 till omkring 95 viktprocent av bäraren och från omkring 5 till omkring 20 viktprocent av den förankrande molekylen.

15. Micellen enligt krav 14, vilken vidare innefattar från omkring 10 till 70 % av ett lipofilt antigen àtskilt från bäraren och den förankrande molekylen. 10 15 20 25 30 35 533 1?E 25

16. Micellen enligt krav 15, vilken vidare innefattar från omkring 5 till omkring 20 % av en andra bärare àtskild från det lipofila antigenet.

17. Ett kit som innefattar en micell enligt något av de föregående kraven och åtminstone en anordning som innefattar åtminstone en yta till vilken den förankrade delen av det antigenexponerande micellen har affinitet.

18. Kitet enligt krav 17, där ytan är belagd och den förankrade delen har affinitet för beläggningen.

19. Kitet enligt krav 18, där beläggningen valts från gruppen som innefattar avidin och streptavidin.

20. Kitet enligt något av kraven 17 till 19, där micellen är bunden till ytan eller beläggningen.

21. Kitet enligt något av kraven 17 till 20, vilket innefattar en detektionsantikropp med affinitet för en analyt, där denna analyt har affinitet för epitopet.

22. Kitet enligt krav 21, där detektionsantikroppen innefattar en del för att möjliggöra detektion av den.

23. En metod för att tillverka en micell enligt något av kraven 1 till 16, vilken innefattar stegen att: a) lösa upp åtminstone en bärare, åtminstone en förankrade molekyl, där denna förankrade molekyl innefattar åtminstone en förankrande del, där denna förankrande del valts från biotin, biotinanaloger och andra biotinmolekyler som har förmågan att binda till avidin, streptavidin och derivat därav, och ett lipofilt antigen, bäraren, fakultativt detsamma som i ett lösningsmedel, som innefattar ett opolärt lösningsmedel, där micellen innefattar två olika lipofila 10 15 20 25 30 533 ¶?E 26 strukturer, vilka utgörs av ett lipofilt antigen som innefattar epitopet och den förankrande molekylen; b) indunsta lösningsmedlet; C) dispergera återstoden i ett vattenhaltigt lösningsmedel; och d) sonikera den resulterade blandningen.

24. Användning av en micell eller ett kit enligt något av kraven 1 till 22 för att detektera och/eller kvantifiera en analyt, vilken har affinitet för epitopet.

25. Användning enligt krav 24 för att diagnostisera en autoimmun sjukdom eller rubbning.

26. , En metod för att detektera och/eller kvantifiera en analyt, vilket innefattar stegen att; a) tillhandahålla en micell enligt något av kraven 1 till 16; b) binda denna micell till en yta; c) exponera den bundna micellen för ett prov, vilket prov innefattar en analyt, vilken analyt har affinitet för epitopet; d) tvätta den bundna micellen med en lösning som innefattar en detergent; och e) detektera och/eller kvantifiera analyten.

27. Metoden enligt krav 26, där analyten är autoantikropp.