ES2282733T3 - Procedimiento de deteccion de la prp que utiliza un ligando adyuvante macrociclico. - Google Patents
Procedimiento de deteccion de la prp que utiliza un ligando adyuvante macrociclico. Download PDFInfo
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Abstract
Procedimiento de detección de PrP, y particularmente de PrPsc, caracterizado porque se añade en una muestra biológica susceptible de contener PrPsc un ligando coadyuvante macrocíclico (LCM) libre o unido a un soporte, después se hace reaccionar la suspensión resultante con un anticuerpo anti-PrPsc, y se detecta la presencia de PrP.
Description
Procedimiento de detección de la PrP que utiliza
un ligando adyuvante macrocíclico.
La presente invención se refiere a un
procedimiento de detección de formas de prión patogénicas
responsables de encefalopatías espongiformes subagudas
transmisibles.
La proteína priónica nativa o normal, designada
PrP o PrP^{c} por proteína priónica celular, es una glicoproteína
expresada ampliamente en células linfoides y neuronales de
mamíferos.
Los cambios conformacionales de PrP^{c}
conducen a la aparición y la propagación de la proteína patogénica
PrP^{sc}, que es resistente a la proteinasa K. Esta proteína
patogénica puede denominarse indiferentemente PrP^{sc} o
PrP^{res}. La acumulación de PrP^{sc} en los órganos de los
animales está en el origen de numerosas enfermedades y
especialmente de la tembladera en pequeños rumiantes, de la
enfermedad caquectizante crónica (o chronic wasting disease
"CWD") de alce y antílope, de la encefalopatía espongiforme
bovina (EEB) y de la enfermedad de Creutzfeld-Jakob
(ECJ) en el hombre.
La aparición tardía después de un periodo de
incubación de 2 a 6 años y el lento desarrollo de los síntomas en
el ganado infectado por EEB ha ralentizado considerablemente el
desarrollo de modelos epidemiológicos. La EEB es transmisible por
ingestión al hombre y ha conducido a la aparición de una nueva forma
de la enfermedad de Creutzfeld-Jakob (ECJv).
La detección de la proteína patogénica
PrP^{sc} es difícil en los animales infectados sanos antes del
desarrollo de la enfermedad y, sobre todo, en la sangre y la orina
de animales enfermos. Se ha establecido actualmente que la
PrP^{sc} presente en los animales destinados a la alimentación
humana se transmite al hombre con la ingestión de tejidos
infectados. Es por tanto un objetivo importante de salud pública
evitar esta transmisión detectando la presencia de PrP^{sc}:
- -
- en animales destinados al consumo humano con fines de retirarlos de la cadena alimentaria,
- -
- en donaciones de sangre y derivados sanguíneos destinados a la transfusión en el hombre. Efectivamente, como muestra la presencia de proteína patogénica PrP^{sc} en la sangre y los líquidos linfoides bastante antes de la afectación cerebral, y por tanto bastante antes de la posibilidad de descubrir signos neurológicos evocatorios de enfermedad por priones clínicamente declarada, la fisiopatología en el hombre es desconocida y, al no poder realizar infecciones experimentales como en la oveja, la ausencia de un ensayo de detección en la sangre u otros fluidos biológicos no permite estudiar y por tanto prevenir una transmisión interhumana mediante donación de sangre, ni tratar a las personas infectadas antes de que hayan empezado las lesiones cerebrales; y
- -
- en los rebaños animales antes del estado neurológico, permitiendo así eliminar a los animales infectados precozmente, antes de llegar a los mataderos.
La detección de la presencia de PrP^{sc} en
muestras biológicas o en animales se vuelve por tanto de una
importancia extrema, y varios equipos de investigadores desarrollan
métodos de detección inmunológica (documento WO 02/086511). Por
otra parte, los métodos para complejar con PrP^{sc} péptidos,
moléculas pequeñas o inhibidores con fines de tratamiento de la
ECJv son el objeto de investigaciones activas. Sin embargo, los
métodos del estado de la técnica chocan sin cesar con la dificultad
de identificar la PrP^{sc} de manera fiable cuando está en baja
cantidad en una muestra biológica, y especialmente en fluidos
biológicos.
La presente invención tiene por lo tanto como
objeto un procedimiento que permite detectar la proteína PrP, y
especialmente PrP^{sc}, a diluciones a las que no es detectable
con los métodos utilizados actualmente, siendo esta detección de
una fiabilidad de 100% en las 119 muestras ensayadas por los
inventores. Ventajosamente, el procedimiento según la invención
permite amplificar por un factor de 4 la detección de
PrP^{sc}.
Más precisamente, la presente invención tiene
como objeto un procedimiento de detección de PrP, y particularmente
de PrP^{sc}, caracterizado porque se añade a una muestra biológica
susceptible de contener PrP un ligando coadyuvante macrocíclico
(LCM) libre o unido a un soporte, después se hace reaccionar la
suspensión resultante con un anticuerpo anti-PrP y
después se identifica la presencia de PrP.
El enlace del ligando macrocíclico al soporte
puede ponerse en práctica de forma conocida por el experto en la
técnica, tal como mediante adsorción o enlace covalente,
prefiriéndose el enlace covalente, denominado de otro modo
injerto.
Cuando se procura detectar la Prp^{sc}, la
presente invención puede comprender igualmente la etapa
suplementaria de tratamiento de la muestra con la proteinasa K
antes o después del contacto con el LCM.
La presencia de PrP puede ponerse en evidencia
mediante la detección de la reacción anticuerpo
anti-PrP/PrP, y esto mediante cualquier medio
conocido por el experto en la técnica, y particularmente mediante
métodos sándwich tales como ELISA, inmunotransferencia,
inmunodetección por micropalanca, espectrometría de masas o
mediante análisis ópticos y espectroscópicos. La identificación del
complejo LCM-PrP se efectúa mediante técnicas de
barrido perfilométrico tales como microscopía de barrido por
reflectancia, microscopía de barrido de campo próximo o microscopía
de barrido confocal.
Según un modo de realización preferido de la
invención, la muestra biológica proviene de un animal incluyendo el
hombre. Preferiblemente, esta muestra proviene del cerebro, de
tejidos del sistema nervioso central o de órganos y, especialmente,
el bazo o el intestino. Según un modo de realización preferido de la
invención, esta muestra es un fluido biológico, especialmente
líquido cefalorraquídeo o suero.
Por ligando macrocíclico se entiende un
compuesto capaz de unirse a la PrP, y particularmente, a la
PrP^{sc}, y que está constituido por una sucesión de ciclos que
forman un macrociclo. Los ligandos macrocíclicos son conocidos por
el experto en la técnica. A modo de ejemplos no limitantes, se
pueden citar los ciclofanos, los metaciclofanos, las
ciclodextrinas, los ácidos tetraciclocromotrópicos, los esferandos y
los ciclo[n]veratrilenos.
Ventajosamente, el ligando coadyuvante
macrocíclico es capaz de unirse a sitios contiguos, o próximos en el
espacio, a sitios de enlace con un anticuerpo, y tiene como acción
aumentar el enlace anticuerpo-PrP^{sc}.
Ventajosamente, el ligando coadyuvante
macrocíclico se elige de la familia de los metaciclofanos. Entre los
metaciclofanos, son particularmente ventajosos los
parasulfonatocalixarenos funcionalizados por la cara fenólica.
Estos compuestos pueden obtenerse según la metodología descrita en
Da Silva et al., J. Supramol. Chem. 1, (2001),
135-138.
Ventajosamente, el ligando coadyuvante
macrocíclico responde a la fórmula general (I) siguiente
en la
que
R_{1} representa un átomo de hidrógeno, un
grupo hidroxilo, un grupo OR o un grupo OCOR, siendo R tal como se
define a continuación,
R_{2} representa un átomo de hidrógeno, un
grupo R, COR, Pol, CH_{2}Pol, en los que Pol representa un grupo
fosfato, sulfato, amina, amonio, ácido carboxílico y R es tal como
se define a continuación,
R_{3} representa un átomo de hidrógeno, un
grupo hidroxilo, un grupo OH o un grupo OCOR, en los que R es tal
como se define a continuación,
R_{4} representa un átomo de hidrógeno, un
grupo hidroxilo, un grupo OR, un grupo OCH_{2}R o un grupo OCOR,
en los que R es tal como se define a continuación,
Y es un átomo de carbono, nitrógeno o un átomo
de azufre,
R_{5} y R_{6}, cada uno independientemente,
están ausentes o representan un átomo de hidrógeno, un agrupamiento
CH_{2} o R tal como se define a continuación, o bien
R_{5} y R_{6} representan conjuntamente un
átomo de oxígeno o de azufre,
X representa un agrupamiento CH_{2} o un átomo
de oxígeno o de azufre,
m representa un número entero igual a 0 ó 1,
R representa un átomo de hidrógeno o una cadena
hidrocarburo, saturada o no, ramificada o no, cíclica o no cíclica,
sustituida o no por un agrupamiento halógeno, y que porta funciones
polares o no polares,
n es un número entero comprendido entre 3 y
15,
pudiendo ser los sustituyentes R_{1} a
R_{5}, R, X, Y y el número entero m de naturaleza diferente según
los motivos.
Así, el compuesto de fórmula (I) se presenta en
forma de una sucesión de n motivos caracterizados por la presencia
de un ciclo bencénico, y pudiendo ser variables los sustituyentes de
este ciclo de un motivo a otro, dentro del límite de sus
definiciones anteriores.
Los ligandos macrocíclicos pueden prepararse
según las técnicas conocidas por el experto en la técnica, por
ejemplo, descritas en "Comprehensive Supramolecular Chemistry",
Pergamon, Oxford, 1996.
Las cadenas hidrocarburo, saturadas o no,
ramificadas o no, cíclicas o no cíclicas, sustituidas o no por un
agrupamiento halógeno, y que portan funciones polares o no polares,
son ampliamente conocidas por el experto en la técnica. A modo de
ejemplos, se pueden citar los alquilos, los alquenos, los arilos y
los ciclos saturados tales como ciclohexano. Es un ejemplo de
agrupamiento no polar CF_{3} y son ejemplos de agrupamientos
polares los sustituyentes Pol tales como se definen
anteriormente.
Según un modo de realización particular de la
invención, el ligando coadyuvante macrocíclico responde a la
fórmula general (I) siguiente, y más precisamente a la fórmula
general (Ia) siguiente
en la
que
cada agrupamiento R_{2}, tomado
independientemente, es un agrupamiento sulfato o un agrupamiento
fosfato,
R_{7} es un agrupamiento
(CH_{2})_{r}-Z en el que Z es un
agrupamiento COOEt, COOH, CN o NH_{2},
r es un número entero comprendido entre 1 y
20,
p es un número entero comprendido entre 1 y
10,
n es un número entero comprendido entre 2 y
10.
Según un modo de realización preferido de la
invención, el ligando coadyuvante macrocíclico es
p-sulfonatocalix[4]areno,
p-sulfonatocalix[6]areno,
p-sulfonatocalix[8]areno o uno de sus
derivados.
Según un segundo modo de realización de la
invención, el ligando coadyuvante macrocíclico responde a la fórmula
general (I) siguiente, y más precisamente a la fórmula general (Ib)
siguiente
en la
que
n es un número entero comprendido entre 4 y
8,
cada agrupamiento R_{2}, tomado
independientemente, es un agrupamiento sulfato o un agrupamiento
fosfato,
R_{8} representa un agrupamiento
(CH_{2})_{t}-(CO)_{s}-(NH_{2}) o un
agrupamiento (CH_{2})_{t}-COOH en los
que t es un número entero comprendido entre 0 y 6 y s es un número
entero comprendido entre 0 y 6.
Ventajosamente, el calixareno de fórmula (Ib) es
tal que los dos agrupamientos R_{2} son cada uno un agrupamiento
sulfato, n es 4, 6 u 8 y R_{8} es un átomo de hidrógeno, un
agrupamiento CH_{2}COOH, un agrupamiento CH_{2}CONH_{2} o un
agrupamiento CH_{2}CH_{2}NH_{2}.
Preferiblemente, el calixareno de fórmula (Ib)
es tal que los dos agrupamientos R_{2} son cada uno un
agrupamiento sulfato, n es un entero igual a 6 y R_{8} es un
agrupamiento (CH_{2})_{2}-NH_{2}.
Según un modo de realización particular de la
invención, el ligando según la invención está injertado sobre un
soporte sólido. Este soporte está funcionalizado por una función
susceptible de formar un enlace con una función portada por el
ligando. Según un modo de realización preferido, el soporte sólido
está funcionalizado por un enlace NHS
(N-hidroxisuccinimida) o por una función NE_{2}.
Esta función puede reaccionar con una función portada por el
ligando. En este modo de realización, se prefieren particularmente
los calixarenos que portan una función susceptible de reaccionar
para formar un enlace con el enlace funcional del soporte sólido,
especialmente los calixarenos que portan un enlace NH_{2} o
COOH.
La invención tiene igualmente como objeto un
ligando coadyuvante macrocíclico injertado sobre un soporte
funcionalizado, en el que el ligando responde a la fórmula (Ib) tal
como se define anteriormente, en la que n es un número entero
comprendido entre 4 y 8, y el soporte es del tipo soporte sólido
preferiblemente funcionalizado por un grupo NHS o un grupo
NH_{2}, y es preferiblemente una bola magnética o una microplaca.
Dicho injerto evita la interacción posterior entre la proteína y el
ligando, así como la presentación estereoquímica del epítopo para
la detección por un anticuerpo anti-PrP, siendo los
sitios objetivo del injerto sobre el soporte diferentes de los que
sirven para la interacción con la PrP.
Según otro modo de realización de la invención,
dicho ligando coadyuvante macrocíclico se elige de la familia de
las ciclodextrinas y, en particular, de las ciclodextrinas que
responden a la fórmula general (II)
en la
que
R_{9} representa un átomo de hidrógeno o un
agrupamiento CH_{2}, OH, OR, OCOR, COR, CH_{2}Pol, OCH_{2}R,
SR, NR, estando Pol y R definidos a continuación,
R_{10} y R_{11}, cada uno
independientemente, representan un átomo de hidrógeno o un
agrupamiento CH_{2}, OH, OR, OCOR, COR, CH_{2}Pol, OCH_{2}R,
estando Pol y R definidos a continuación,
Pol representa un grupo fosfato, sulfato, amina,
amonio o ácido carboxílico,
R representa una cadena hidrocarburo, saturada o
no, ramificada o no, cíclica o no cíclica, sustituida o no por un
agrupamiento halógeno, y que porta funciones polares o no
polares,
n es un número entero comprendido entre 6 y
8,
pudiendo ser los sustituyentes R_{9} a
R_{11} de naturaleza diferente según los motivos. Así, el
compuesto de fórmula (II) se presenta en forma de una sucesión de n
motivos caracterizados por la presencia de un ciclo, y los
sustituyentes de este ciclo pueden ser variables de un motivo a
otro, dentro del límite de sus definiciones anteriores.
Según una variante de realización de la
invención, dicho ligando coadyuvante macrocíclico se elige de la
familia de los ácidos tetraciclocromotrópicos, y particularmente de
los ácidos tetraciclocromotrópicos que responden a la fórmula
general (III)
en la
que
R_{12} y R_{13}, cada uno
independientemente, representan un átomo de hidrógeno o un grupo R o
Pol tales como se definen a continuación,
R_{14} y R_{15}, cada uno
independientemente, representan un átomo de hidrógeno, un
agrupamiento CH_{2} o un grupo R tal como se define a
continuación, o bien
R_{14} y R_{15} representan conjuntamente un
átomo de oxígeno o de azufre,
R_{16} y R_{17}, cada uno
independientemente, representan un átomo de hidrógeno o un grupo
hidroxilo o un grupo OR, OCH_{2}R, OCOR, SR, SCH_{2}R, SCOR,
siendo R tal como se define a continuación,
M representa un átomo de hidrógeno, o un átomo
de elegido entre Na, K, Li, Cs, Rb, Mg y Ca,
Pol representa un grupo fosfato, sulfato, amina,
amonio o ácido carboxílico,
R representa una cadena hidrocarburo, saturada o
no, ramificada o no, cíclica o no cíclica, sustituida o no por un
agrupamiento halógeno, y que porta funciones polares o no
polares,
n es un número entero comprendido entre 3 y
15,
pudiendo ser los sustituyentes R_{12} a
R_{17}, M, Pol y R de naturaleza diferente según los motivos.
Así, el compuesto de fórmula (III) se presenta en forma de una
sucesión de n motivos caracterizados por la presencia de un ciclo,
y los sustituyentes de este ciclo pueden ser variables de un motivo
a otro, dentro del límite de sus definiciones anteriores.
Según otro modo de realización de la invención,
se elige dicho ligando coadyuvante macrocíclico de la familia de
los ciclo[n]veratrilenos, que responden a la fórmula
general (IV)
en la
que
R_{18} representa un átomo de hidrógeno o un
agrupamiento CH_{2}, OH, OR, OCOR, COR, CH_{2}Pol, OCH_{2}R,
SR, NR, estando Pol y R definidos a continuación,
R_{19}, R_{20}, R_{21} y R_{22}, cada
uno independientemente, representan un átomo de hidrógeno o un
agrupamiento CH_{2}, OH, OR, OCOR, COR, CH_{2}Pol, OCH_{2}R,
estando Pol y R definidos a continuación,
Pol representa un grupo fosfato, sulfato, amina,
amonio o ácido carboxílico,
R representa una cadena hidrocarburo, saturada o
no, ramificada o no, cíclica o no cíclica, sustituida o no por un
agrupamiento halógeno, y que porta funciones polares o no
polares,
n es un número entero comprendido entre 1 y
10,
los sustituyentes R_{18} a R_{22}, R, Pol y
R pueden ser de naturaleza diferente según los motivos. Así, el
compuesto de fórmula (IV) se presenta en forma de una sucesión de n
motivos caracterizados por la presencia de un ciclo, y los
sustituyentes de este ciclo pueden ser variables de un motivo a
otro, dentro del límite de sus definiciones anteriores.
Otro objeto de la invención reside en la
utilización de un ligando coadyuvante macrocíclico (LCM) para la
detección del prión PrP^{sc} en una muestra biológica, y
particularmente de un ligando de fórmula (I), (Ia) o (Ib) anterior,
libre o unido a un soporte.
La invención tiene igualmente como objeto un kit
de diagnóstico de enfermedades de las que la PrP^{sc} es
responsable del tipo EEB, tembladera en pequeños rumiantes,
Creutzfeld-Jakob, caracterizado porque comprende la
utilización del ligando coadyuvante macrocíclico y particularmente
de un ligando de fórmula (I), (Ia) o (Ib) anterior, libre o unido a
un soporte.
La invención tiene igualmente como objeto un kit
de dosificación inmunológica de la PrP^{sc}, caracterizado porque
comprende la utilización de un ligando coadyuvante macrocíclico y
particularmente de un ligando de fórmula (I), (Ia) o (Ib) anterior,
libre o unido a un soporte.
Aparecerán otras ventajas y características de
la invención con la lectura de los ejemplos siguientes referidos a
la amplificación de la detección de PrP^{sc} cuando la muestra
biológica se pone en presencia de un ligando coadyuvante
macrocíclico, libre o injertado.
Se hará referencia en estos ejemplos a los
dibujos adjuntos en los que:
Con referencia al ejemplo 1:
- la figura 1 es un ejemplo comparativo de la
detección mediante inmunotransferencia de PrP^{sc} por un lado en
una muestra puesta en presencia de un ligando coadyuvante
macrocíclico específico (LCM1) cuya preparación se describe a
continuación y, por otro lado, en una muestra no puesta en presencia
de LCM1;
- la figura 2 representa las curvas de densidad
óptica de detección de PrP^{sc} por una lado en una muestra
puesta en presencia de LCM1 y, por otro lado, en una muestra no
puesta en presencia de LCM1;
- la figura 3 muestra imágenes de microscopía
por barrido de sonda (SPM) en modo sin contacto para películas
secadas de la proteína priónica recombinante (recPrP) sola (A), de
recPrP en presencia de LCM1 (B) y de LCM1 solo (C);
- la figura 4 muestra imágenes de microscopía
por barrido de sonda (SPM) en modo sin contacto para películas
secadas de recPrP en presencia de LCM a diferentes proporciones:
1/1.000 LCM1/recPrP, 1/100 LCM1/recPrP, 1/10 LCM1/recPrP,
- la figura 5 es una representación gráfica que
da los valores de densidad óptica (DO) obtenidos en función de la
concentración de calixareno C6S injertado sobre una placa activada
con amina (NHS) después de la incubación de una solución de PrP
recombinante bovina y el revelado mediante el anticuerpo
anti-PrP AC23 marcado con peroxidasa,
- la figura 6 es una representación gráfica que
da los valores de densidad óptica (OD) obtenidos en función de la
concentración de calixareno CS6 injertado sobre una bola activada
con amina (NHS) después de la incubación de una solución de PrP
recombinante humana dosificada a 0,25 \mug/ml mediante revelado
directo con el anticuerpo anti-PrP 8D11G12 marcado
con peroxidasa,
- la figura 7 es una representación gráfica que
da los valores de densidad óptica (DO) obtenidos después de la
incubación con un intervalo de diluciones de suero humano en PBST al
0,05% puesto en contacto con calixareno C6S injertado sobre una
bola activada con amina (NHS) mediante revelado directo con el
anticuerpo anti-PrP 8D11G12 marcado con
peroxidasa,
- la figura 8 es una representación gráfica que
da los valores de densidad óptica (DO) obtenidos después de la
puesta en contacto de calixareno C6S injertado sobre una placa
activada con amina (NHS) con muestras de líquido cefalorraquídeo
humano positivas (LCR+) y negativas (LCR-) de ECJ en función del
calentamiento mediante revelado con el anticuerpo
anti-PrP AC23 marcado con fosfatasa alcalina,
- la figura 9 es una representación gráfica que
da los valores de densidad óptica (DO) obtenidos después de la
puesta en contacto de calixareno C6S injertado sobre una placa
activada con amina (NHS) con PrP^{sc} extraída de cerebros de
pacientes aquejados o no de la enfermedad de
Creutzfeld-Jakob (ECJ+/ECJ-) mediante revelado con
el anticuerpo anti-PrP AC23 marcado con fosfatasa
alcalina,
- la figura 10 es una representación gráfica que
da los valores de densidad óptica (DO) obtenidos en función de la
concentración de calixareno C6S injertado sobre una placa activada
con amina (NHS) después de la puesta en contacto con una muestra de
LCR de paciente no aquejado de ECJ, diluida a 1/2 o 1/6 y en
ausencia de digestión por proteinasa K,
- la figura 11 es una representación gráfica que
da los valores de densidad óptica (DO) obtenidos en función de la
concentración de calixareno C6S injertado sobre una placa activada
con amina (NHS) después de la puesta en contacto con una muestra de
LCR de pacientes no aquejados de ECJ (LCR-) o aquejados de esta
enfermedad (LCR+), eventualmente diluida a 1/2 (LCR+1/2 o
LCR-1/2) en ausencia de digestión por proteinasa K,
y
- la figura 12 es una representación gráfica que
da los valores de densidad óptica (DO) obtenidos en función de la
concentración de proteinasa K después de la puesta en contacto de
calixareno C6S injertado sobre una placa activada con amina (NHS)
con una muestra de LCR de pacientes no aquejados de ECJ (LCR-) o
aquejados de esta enfermedad (LCR+).
Ejemplo
1
Este ligando coadyuvante macrocíclico LCM1 posee
la fórmula general (V):
Este ligando se sintetiza como sigue: se agita a
reflujo una suspensión de calix[6]areno en
acetonitrilo en presencia de un equivalente de base
(K_{2}CO_{3}). Después de 30 minutos, se añaden 0,5 equivalentes
de agente alquilante (bromoacetato de etilo) a la mezcla de
reacción, que se mantiene a reflujo y con agitación durante 24
horas. Después de enfriar la suspensión, se evapora el disolvente a
presión reducida, se disuelve el sólido resultante en 200 ml de
CH_{2}Cl_{2} y se lava dos veces con una solución de ácido
clorhídrico (1 M) y una vez con agua desmineralizada. Después de
haber secado sobre sulfato de magnesio (MgSO_{4}), se evapora el
disolvente orgánico a presión reducida y se permite la obtención de
un polvo blanco. Se purifica éste sobre una columna de
cromatografía de sílice (eluyente: CH_{2}Cl_{2}:hexano 4:1). Se
analiza el producto purificado por RMN-^{1}H o
^{13}C y por espectrometría de masas con electropulverización. Se
realiza la saponificación del éster carboxílico mediante hidróxido
de potasio en solución en una mezcla de agua:etanol (30:70) con
agitación a temperatura ambiente durante 24 horas. Se filtra el
precipitado formado, después se lava con 50 ml de ácido clorhídrico
(1 M) y 50 ml de agua, después se purifica sobre columna de
cromatografía de sílice (eluyente: cloroformo:metanol:ácido acético
95:5:0,1%) y se permite obtener, después de la evaporación del
disolvente, un sólido blanco y cristalino. Se analiza este producto
por RMN-^{1}H o ^{13}C y por espectrometría de
masas con electropulverización. Se realiza la sulfonación mediante
un tratamiento con ácido sulfúrico a 50ºC durante 24 horas. Se
precipita el producto con éter y se permite obtener el LCM1 en forma
de un polvo blanco cristalino.
Este ligando coadyuvante macrocíclico posee la
fórmula general (VI):
Se prepara este ligando según el método descrito
por Eric Da Silva y Anthony W. Coleman en "Synthesis and
complexation properties towards amino acids of
mono-substituted
p-sulphonato-calix[n]arene",
Tetrahedron 59 (2003), 7357-7364.
Se acopla este ligando con un soporte sólido
(bola o placa) que porta una superficie activada.
Las placas, placas activadas con NHS, de 96
pocillos provienen de la compañía Covalab (Lyon, Francia). Se
disuelven 100 \mul de una solución de ligando a diferentes
concentraciones en tampón fosfato 50 mM, pH 8,2. Se lavan los
pocillos 3 veces (3 x 200 \mul) con agua MilliQ después de 2 horas
de incubación a 37ºC. Se secan las placas a temperatura ambiente
antes de su utilización.
\vskip1.000000\baselineskip
Se han preparado varias placas a diferentes
concentraciones de ligando C6S. Estas placas se definen como
"placas C6S" en todo el texto.
Se realizan alícuotas de 4 ml de una solución de
bolas activadas con NHS (2 x 10^{9} bolas/ml; Dynabeads®
M270Amine, Société Dynals, Noruega) en tubos de 1 ml. Se centrifugan
las bolas y se precipitan por imantación. Se retira el sobrenadante
y se lavan las bolas 3 veces con 1 ml de agua. Se retoma el
sedimento de bolas con diferentes volúmenes de solución de
calixareno en un tampón fosfato 50 mM a pH 8,2. Se añaden 600
\mul, 120 \mul, 60 \mul y 12 \mul de una solución de
ligando a 50 mg/ml (tampón fosfato 50 mM, pH 8,2). Se agitan las
bolas durante 24 horas a temperatura ambiente. Se lavan las bolas
tres veces con agua MilliQ 18\Omega con el fin de eliminar el
ligando que no ha reaccionado. Se conservan las bolas en 1 ml de
agua con el fin de reconstituir la concentración inicial de 2 x
10^{9} bolas/ml. La solución de bolas está lista para el empleo.
Estas bolas se definen como "bolas C6S" en todo el
texto.
texto.
Se pone en solución 1 ml de
3-aminopropiltrimetoxi-silano
(Société ABCR) en una solución de 50 ml (95% de etanol y 5% de
H_{2}O) durante 5 min. Se sumerge la placa de silicio en esta
solución durante 4 min con agitación. Se aclara la placa de silicio
con etanol y después se pone a secar la placa a 130ºC durante 15
min. Se acoplan 10 \mul de LCM1 en solución 0,1 M en DMSO sobre
una placa de silicio modificado utilizando un agente de
acoplamiento (DCC/HOBT). Se seca la muestra durante 12 horas a
23ºC.
Ejemplo
2
Las muestras que han servido para la realización
de los ejemplos de las figuras 1 y 2 se han preparado como
sigue:
Muestra sin LCM: se trituran 0,5 g de tejido de
cerebro en 4,5 ml de solución de glucosa al 5% para obtener una
suspensión al 10% en peso/volumen. Se añade por 100 \mul de
homogeneizado de cerebro al 10% en glucosa al 5% (equivalente a 10
mg de cerebro), 1 \mug de proteinasa K (Boehringer) en 10 \mul.
Se pone la solución en vórtex y se incuba a 37ºC durante otra hora.
Después de añadir 100 \mul de tampón Laemmli desnaturalizante, se
calienta durante 5 minutos a 100ºC, se centrifuga a 12.000 g durante
5 min y se recuperan los sobrenadantes para hacerlos migrar en
PAGE-SDS.
Muestra con LCM: se trituran 0,5 g de tejido de
cerebro en 4,5 ml de solución de glucosa al 5% para obtener una
suspensión al 10% en peso/volumen. Se añade por 100 \mul de
homogeneizado de cerebro al 10% en glucosa al 5% (equivalente a 10
mg de cerebro), 1 \mul de LCM 0,1 M. Después de 1 hora a 37ºC, se
añaden 1,5 \mug de proteinasa K (Boehringer) en 10 \mul. Se
pone en vórtex la solución y se incuba a 37ºC durante otra hora.
Después de añadir 100 \mul de tampón Laemmli desnaturalizante, se
calienta 5 minutos a 100ºC, se centrifuga a 12.000 g durante 5 min
y se recuperan los sobrenadantes para hacerlos migrar en
PAGE-SDS.
Después de la migración sobre un gel de
electroforesis unidimensional de 15% de poliacrilamida en presencia
de dodecilsulfato de sodio (PAGE-SDS) como se
describe por Laemmli, Nature 227 (1970),
680-685, se transfieren las proteínas mediante
electroforesis a membranas de nitrocelulosa y se inmunotransfieren a
temperatura ambiente durante 60 minutos con un anticuerpo
monoclonal que reconoce un epítopo específico constituido por los
aminoácidos 126-160. El anticuerpo secundario
(1/5000) es un anticuerpo de cabra dirigido contra las cadenas
pesadas y ligeras de inmunoglobulinas de ratón conjugadas con
peroxidasa de rábano picante (IgG H + L).
Se lavan a continuación las transferencias y se
detectan las señales mediante quimioluminiscencia o bien con un kit
ECL (Amersham) en películas (Blomex light, Kodak) o con Super Signal
Ultra (Pierce) y visualización con Fluor S. Multimager
(BioRad).
La figura 1 es un ejemplo comparativo que
muestra que la detección del prión se amplifica al menos cuatro
veces cuando se pone en práctica el procedimiento de la invención,
con relación a la detección de la misma proteína en ausencia de
LCM1. En ausencia de LCM1, para diluciones superiores a 1/8, no es
detectable ninguna PrP^{sc}. En presencia de LCM1, la detección
de la PrP^{sc} en la misma muestra es posible hasta una dilución
de 1/32. Los resultados de la figura 2 muestran la detección.
Las muestras que han servido para los
experimentos en microscopía de barrido por sonda reseñados en las
figuras 3 y 4 se han preparado como sigue:
Muestras que contienen ligando coadyuvante
macrocíclico únicamente: se preparan muestras que contienen ligando
coadyuvante macrocíclico (50 mM) mediante deposición sobre mica
recién exfoliada de 10 \mul de solución de LCM y 10 \mul de
agua respectivamente, y se secan durante 24 horas a 37ºC.
Muestras que contienen proteína PrP recombinante
(recPrP) únicamente: se preparan muestras que contienen recPrP (50
mM) mediante deposición sobre mica recién exfoliada 10 \mul de
solución 1/10 (v/v) de LCM1/recPrP, 1/100 (v/v) de LCM1/recPrP y
1/1000 (v/v) de LCM1/recPrP respectivamente y 10 \mul de agua, y
se secan durante 24 horas a 37ºC.
Muestras que comprenden a la vez ligando
coadyuvante macrocíclico y recPrP: 1) se preparan muestras que
contienen a la vez ligando coadyuvante macrocíclico y recPrP
mediante deposición sobre mica recién exfoliada de 1 \mul de
solución de LCM y 1.000 \mul de recPrP respectivamente, y se secan
durante 24 horas a 37ºC; 2) se preparan muestras que contienen a la
vez ligando coadyuvante macrocíclico (LCM1) y recPrP mediante
deposición sobre mica recién cortada de 1 \mul de solución de LCM
y 100 \mul de recPrP respectivamente, y se secan durante 24 horas
a 37ºC; 3) se preparan muestras que contienen a la vez ligando
coadyuvante macrocíclico y recPrP mediante deposición sobre mica
recién cortada de 1 \mul de solución de LCM y 10 \mul de recPrP
respectivamente, y se secan durante 24 horas a 37ºC.
Se efectúa un análisis mediante formación de
imágenes mediante un AFM Thermomicroscope Explorer equipado con un
escáner en trípode de 100 \mum en modo sin contacto, utilizando
frecuencias de resonancia elevadas (F_{0}= 320 kHz) de palanca
piramidal con sondas de silicona a una frecuencia de barrido de 1
Hz. Se realiza el tratamiento de las imágenes con el software
SPMlab 5.1 y se presentan no filtradas.
Se deduce de las figuras 3 y 4 que las películas
de recPrP solas muestran una estructura en agregados circulares
característica. En presencia de LCM, se modifican secuencialmente
las estructuras observadas para la recPrP, son función creciente de
la cantidad de LCM y muestran motivos redondeados y eventualmente
cristalinos ortogonales. Las imágenes de ligando coadyuvante
macrocíclico solo (LCM1) muestran estructuras similares, pero más
pequeñas, a los motivos de las películas de
recPrP-LCM.
Se han realizado otros experimentos mediante
microscopía de fuerza atómica.
Se da un análisis posterior mediante análisis de
superficie de la rugosidad en la tabla I. La utilización de estas
medidas de rugosidad puede extenderse a técnicas de análisis
perfilométricas.
Los valores de rugosidad calculados se obtienen
mediante el software Thermomicroscope SPML 5.01. La rugosidad media
Ra se define como la media aritmética de las desviaciones de altura
(fórmula A), la raíz cuadrática media de la rugosidad (root mean
square roughness RMS) se define como la raíz cuadrada del valor
medio de los cuadrados de las distancias de los puntos al valor
medio de la imagen (fórmula B) y la altura media de la muestra
(fórmula C).
Ejemplo
3
Se copia el protocolo empleado en esta
experiencia del realizado en un ELISA clásico.
Según el ejemplo 1, se realiza el injerto de
placas activadas con amina (NHS) durante 6 horas con un intervalo
de calix-6-arenos sulfonados (C6S)
diluidos en una solución de PBS 50 mM (solución salina tamponada con
fosfato). Se aclaran a continuación las placas con agua destilada
antes de saturar con una solución de PBST (PBS Tween) (0,05% de
leche al 5% durante 1 hora a temperatura ambiente). Después del
aclarado, se deposita una solución de proteína priónica (PrP)
recombinante diluida a una concentración de 0,25 \mug/ml en PBST
al 0,05%. Se incuba durante 1 hora a temperatura ambiente. Se
aclara de nuevo la placa tres veces. Después, se incuba con una
solución de anticuerpo anti-PrP marcado con
peroxidasa diluida a 0,5 \mug/ml en PBST al 0,05% durante una
hora a temperatura ambiente. El anticuerpo utilizado reconoce la
región definida por los aminoácidos 145-154 de la
PrP humana y las regiones homólogas de las PrP animales (AC23).
Finalmente, después de un nuevo ciclo de aclarado, se añade el
revelador, una solución de OPD (ortofenilendiamina), que se incuba
durante 10 minutos a temperatura ambiente protegida de la luz. Se
detiene la reacción con la ayuda de una solución de H_{2}SO_{4}.
La lectura de la señal obtenida se efectúa con la ayuda de un
espectrofotómetro a 495 nm.
Los resultados se indican en la figura 5, que
muestra que la densidad óptica (DO) medida en ordenadas refleja la
cantidad de PrP capturada por los C6S y que queda captada después de
los lavados. La señal obtenida por los diferentes injertos muestra
que la PrP recombinante bovina se captura bien por los C6S. La PrP
recombinante bovina se fija sobre los C6S injertados sobre placas
NHS.
Según el ejemplo 1, se ponen en contacto en
primer lugar las bolas NHS con una solución de C6S diluida en agua
destilada para injerto de C6S sobre las bolas. Después de este
periodo, se lavan las bolas con agua destilada y después con PBST
al 0,05%. Se prepara paralelamente una solución de PrP recombinante
humana dosificada a 0,25 \mug/ml en PBST al 0,05%. Después, se
preparan un intervalo de bolas C6S añadiendo respectivamente 0,
0,1, 1, 5 y 10 \mul de solución de bolas por 100 \mul de
solución de PrP. La incubación dura 1 hora a 37ºC, después se
separan las bolas del sobrenadante mediante imantación. La PrP
fijada sobre las bolas se dosifica directamente con la ayuda de un
anticuerpo marcado según un método sándwich parecido al método
ELISA.
Se incuba el anticuerpo de revelado marcado con
peroxidasa durante 1 hora a 37ºC, después del aclarado de las bolas
mediante una solución de PBST al 0,05%. Se separan las bolas del
sobrenadante mediante imantación antes de lavarse de nuevo y
después se revelan mediante una solución de OPD incubada durante 10
minutos. Se detiene la reacción con la ayuda de una solución de
H_{2}SO_{4}. El anticuerpo de revelado empleado es 8D11G12
(bioMérieux, Francia).
La lectura de la señal obtenida se efectúa con
la ayuda de un espectrofométro a 495 nm.
Los resultados de los revelados sobre bolas se
indican en la figura 6, y muestran que los C6S se injertan
correctamente sin pérdida de función sobre los soportes NHS, pero
sobre todo mantienen su propiedad de captura de PrP recombinante de
diferentes especies y amplifican incluso la señal obtenida con los
anticuerpos específicos de esta proteína de forma reproducible.
Ejemplo
4
Según el ejemplo 1, se ponen en contacto en
primer lugar las bolas NHS con una solución de C6S diluido en agua
destilada para injerto. Después de este periodo, se lavan las bolas
con agua destilada y después con PBST al 0,05%.
Se prepara un intervalo de sueros mediante
dilución con PBS. Se prepara paralelamente una solución de PrP
recombinante humana dosificada a 0,25 \mug/ml en PBS, así como una
solución de PBST al 0,05% en leche al 5%, que servirán
respectivamente de testigo positivo y negativo.
Se añaden las bolas a razón de 5 \mul de una
solución de 2 x 10^{9} bolas/ml para 250 \mul de muestra. La
incubación dura 1 hora a 37ºC con agitación. Se separan a
continuación las bolas del sobrenadante mediante imantación. La PrP
fijada sobre las bolas se dosifica directamente con la ayuda de un
anticuerpo marcado.
El revelado sobre bolas utiliza un protocolo
similar al de ELISA. Se incuba el anticuerpo de revelado marcado
con peroxidasa durante 1 hora a 37ºC con agitación suave después del
aclarado de las bolas con una solución de PBST al 0,05%. Se separan
las bolas del sobrenadante mediante imantación antes de lavar de
nuevo, después se revelan mediante una solución de OPD incubada
durante 10 minutos. Se detiene la reacción con la ayuda de una
solución de H_{2}SO_{4}. El anticuerpo de revelado empleado es
8D11G12.
La lectura de la señal obtenida se efectúa con
la ayuda de un espectrofotómetro a 495 mm.
Se indican los resultados en la figura 7, que
pone en evidencia que:
- -
- el testigo negativo en leche permite evaluar el ruido de fondo, mientras que el testigo positivo en una solución de PrP 0,25 \mug/ml permite verificar que el experimento ha funcionado y es interpretable,
- -
- los C6S injertados sobre bolas NHS capturan la PrP fisiológica presente en el suero humano. Además, la captura es mejor cuando la dilución del suero aumenta, con una meseta de saturación alcanzada para las soluciones a 1/5 y 1/10.
Sorprendentemente, los C6S injertados sobre
bolas NHS capturan la PrP fisiológica presente en el suero humano.
Las diluciones de suero permiten aumentar la señal obtenida sobre
las bolas.
Se reparten las muestras de LCR en primer lugar
en tubos de volúmenes equivalentes. Se realizan dos puntos de
dilución: puro y 1/2 para cada muestra. Después, se someten éstos a
tres tipos de tratamiento térmico: 30 minutos a 56ºC, 15 minutos a
75ºC o 5 minutos a 95ºC. Se realiza un testigo sin calentamiento en
paralelo para las muestras puras.
Según el ejemplo 1, se ponen en contacto
paralelamente las placas NHS durante 6 horas con una solución de
C6S diluido en una solución de PBS 50 mM para el injerto.
Se lavan a continuación las placas con agua
destilada y después con PBST al 0,05%.
Se depositan después las muestras y se incuban
durante una noche a 2-8ºC. Se aclara a continuación
la placa seis veces. Después, se incuba con una solución de
anticuerpo anti-PrP marcado con biotina diluida a
0,5 \mug/ml en PBST al 0,05% durante una hora a temperatura
ambiente. El anticuerpo utilizado es AC23.
Después de un nuevo ciclo de aclarado, se añade
una solución de estreptavidina-PAL (fosfatasa
alcalina) que se incuba durante 20 minutos a temperatura ambiente.
La placa se lava por última vez, se deposita la solución de
revelado de PNPP y se incuba durante 30 minutos a 37ºC. Se detiene
la reacción con la ayuda de una solución de NaOH 0,4 N.
Se efectúa la lectura de la señal obtenida con
la ayuda de un espectrofotómetro a 405 nm contra un filtro a 490
nm.
Los resultados se indican en la figura 8, que
pone en evidencia que la PrP fisiológica puede dosificarse al
LCR.
Ejemplo
5
La primera etapa consiste en obtener PrP^{sc}
purificada mediante extracción a partir de cerebros de pacientes
aquejados o no de la enfermedad de Creutzfeld-Jakob
(ECJ). Se extrae una muestra de 260 mg de cada cerebro, después se
tritura con el fin de obtener una homogeneizado al 10% en glucosa al
5%. Se filtra a continuación el triturado con la ayuda de una
aguja. Después, viene una etapa de digestión por proteinasa K. Se
utiliza a la concentración de 20 \mug por 100 mg de tejido a 37ºC
durante 1 hora. A continuación, se añaden 650 \mul de una
solución de Sarkosyl al 30%. En paralelo, se deposita un lecho de
sacarosa de 400 \mul en el fondo de un tubo para
ultracentrifugación. A continuación, se deposita la muestra sobre
este lecho. Se completan los tubos antes de soldarse y después se
ultracentrifugan durante 2 horas a 20ºC a 100.000 rpm. Se eliminan
los sobrenadantes y se secan toscamente las paredes de los tubos con
papel absorbente. Se retoman a continuación los sedimentos en
Tris-maleato. Se calientan entonces las muestras
durante 5 minutos a 95ºC y después se centrifugan durante 15
minutos a 12.000 rpm a 20ºC. Se conservan las muestras a -80ºC hasta
su próxima utilización. Se ha confirmado el éxito de esta primera
etapa mediante transferencia Western.
Según el ejemplo 1, se realiza el injerto de
placas NHS durante 6 horas con un intervalo de C6S diluidos en una
solución de PBS 50 mM. Se saturan en primer lugar mediante una
solución de PBST al 0,05% en leche al 5% durante 6 horas a
temperatura ambiente. Después, se lavan tres veces con una solución
de PBST al 0,05%. Se deposita la muestra diluida previamente en
Tris-maleato sobre la placa y se incuba durante una
noche a 2-8ºC. A continuación se lava la placa 6
veces con PBST al 0,05%. Se incuba la solución de anticuerpo de
revelado durante 1 hora a temperatura ambiente. Después de una
nueva serie de lavados, se incuba la
estreptavidina-PAL durante 20 minutos. Se lava la
placa una última vez antes de depositar el PNPP (fosfato de
para-nitrofenilo), que se incuba durante 30 minutos
a 37ºC. Después, se detiene la reacción de revelado mediante la
adición de sosa.
Se efectúa la lectura de la DO a 405 nm contra
un filtro a 490 nm con la ayuda de un espectrofotómetro.
Se indican los resultados en la figura 9 que
muestra que, sorprendentemente, la PrP^{sc} de las muestras
obtenidas de pacientes aquejados de la enfermedad de
Creutzfeld-Jakob es detectable mediante el
procedimiento de la invención utilizando una captura por C6S
injertados sobre placas NHS y una detección mediante un anticuerpo
dirigido específicamente contra la proteína PrP, estando validado
éste por los testigos positivos de PrP recombinante humana y
negativos de PBST al 0,05%.
Ejemplo
6
Las muestras están constituidas por extracciones
de líquido cefalorraquídeo (LCR) preferiblemente no hemolizado y
sin desechos celulares. Estas extracciones son anónimas y se
conservan congeladas a -80ºC en tubos de paredes débilmente
adsorbentes de proteínas (tubo de microcentrífuga prelubricado de
1,7 ml, Marsh Biochemical Products, ref. T605G).
Se reparten en dos categorías:
Por una parte, las muestras positivas de
ECJ.
Son LCR post-mortem,
recuperados en la autopsia mediante punción de cisternas, y cuya
búsqueda de PrP^{sc} en el tejido cerebral mediante transferencia
Western ha permitido confirmar el diagnóstico de ECJ (casos
ciertos). En la autopsia, se reparte el LCR extraído inmediatamente
en los tubos descritos anteriormente, sin centrifugación previa
(con la excepción de las muestras que presentan desechos celulares
en cantidad importante) y se congelan las alícuotas a -80ºC.
Por otra parte, las muestras negativas de ECJ.
Son de dos tipos:
LCR post-mortem
recuperados en la autopsia y cuya búsqueda de PrP^{sc} en el
tejido cerebral por transferencia Western ha permitido eliminar el
diagnóstico de ECJ (testigos negativos de ECJ).
LCR de pacientes no aquejados de ECJ y
procedentes de derivaciones ventriculares externas (DVE). Las
condiciones de almacenamiento de estas extracciones son idénticas a
las descritas anteriormente.
Se incuban simplemente las muestras a
temperatura elevada durante un tiempo dado, después de enfriar, se
diluyen a 1/2 o 1/5 en un tampón compatible con un análisis
inmunométrico (ELISA) (tampón Tris-maleato, pH 8).
Cuando interviene la digestión por proteinasa K antes de la
deposición sobre placa C6S, se digieren las muestras por proteinasa
K durante 15 minutos, después se depositan así sobre placa C6S sin
inhibición previa.
El término ELISA se emplea aunque la captura no
sea inmunológica, ya que se trata de una reacción de tipo
ligando/ligando de afinidad con revelado inmunológico.
Las técnicas ELISA son técnicas
inmunoenzimológicas cuantitativas que permiten dosificar el antígeno
buscado mediante la transformación de un sustrato en un producto
mensurable y proporcional a la cantidad de antígeno presente en la
muestra. La técnica utilizada aquí comprende las mismas etapas que
un ELISA sándwich no competitivo clásico, con la excepción de la
sensibilización de las cavidades. Efectivamente, el anticuerpo
antipriónico de captura se reemplaza por
calix-6-arenos sulfonados injertados
sobre los agrupamientos NHS de las microplacas por su función
amina.
Después de la inmovilización de los C6S en el
fondo de las cavidades de una microplaca y la saturación de los
sitios no específicos de fijación del antígeno, se deposita la
muestra y se incuba la placa para permitir el enlace del antígeno
con el C6S. Después de varios lavados, se añade el anticuerpo de
revelado, específico de la proteína priónica y marcado. Se
visualizan los complejos formados mediante un método colorimétrico,
después de añadir el sustrato de la enzima, que se transforma en un
producto coloreado cuya absorbancia se determina con la ayuda de un
lector de microplaca (espectrofotómetro automatizado).
Se incuba un volumen de LCR al baño maría seco a
75ºC durante 15 minutos. Después de enfriar, se diluye la muestra 5
veces en tampón Tris-maleato 0,2 M, pH 8 (adición de
4 volúmenes de tampón) y, o bien se deposita directamente sobre una
microplaca sensibilizada previamente por los C6S, o bien se digiere
por la proteinasa K durante 15 minutos a 37ºC y después se deposita
sobre microplaca.
Se enumeran las etapas sucesivas de análisis
inmunométrico a continuación en orden cronológico:
1. Se realiza el injerto de
calix-6-arenos sulfonados C6S sobre
placas activadas con amina (NHS) siguiendo el método mencionado
anteriormente durante 6 horas a temperatura ambiente según un
intervalo de concentraciones o según una concentración fija,
diluidos en una solución de PBS 50 mM.
2. Se lavan a continuación las placas 3 veces en
PBST al 0,05%, después se saturan con PBST al 0,05%- leche al 5%
durante 1 hora a 37ºC.
3. Después del lavado, se depositan 100 \mul
de LCR preparado según el principio analítico descrito anteriormente
por pocillo, se incuban las placas durante 1 hora y 30 minutos a
37ºC.
4. Después del lavado, se depositan 100 \mul
de anticuerpo de revelado por pocillo (AC23-HRP, HRP
es peroxidasa de rábano picante, a 0,5 \mug/ml o
AC23-biotina a 0,5 \mug/ml). Se incuban las placas
durante 1 hora a temperatura ambiente.
5. Después del lavado, se revelan los complejos
formados:
- 5.1.
- Si el anticuerpo de revelado está acoplado a biotina, se depositan 100 \mul de una solución de SA-PAL diluida 1/20.000 en tampón PBST al 0,05% por pocillo. Se incuban las placas durante 20 minutos a temperatura ambiente. Después del lavado, se depositan 100 \mul de PNPP por pocillo. Se incuban las placas durante 10 a 30 minutos a 37ºC. Al término de la incubación, se detiene la reacción colorimétrica mediante la adición en cada pocillo de 50 \mul de NaOH 0,4 N. Se mide a continuación la densidad óptica en el espectrofotómetro a 405 nm contra un filtro a 450 nm.
- 5.2.
- Si el anticuerpo de revelado está acoplado a peroxidasa, se depositan 100 \mul de OPD por pocillo. Se incuban las placas durante 10 minutos en la oscuridad y a temperatura ambiente.
Al término de la incubación, se detiene la
reacción colorimétrica mediante la adición en cada pocillo de 50
\mul de H_{2}SO_{4} 1,8 N. Se mide a continuación la densidad
óptica en el espectrofotómetro a 495 nm.
Se calienta un líquido cefalorraquídeo de
paciente no aquejado de la enfermedad de
Creutzfeld-Jakob durante 15 minutos a 75ºC, y a
continuación se diluye a 1/2 o 1/6 en un tampón compatible con un
revelado inmunológico en ELISA. Las muestras no se digieren por
proteinasa K, y se depositan así sobre una placa injertada con C6S
según un intervalo de concentraciones comprendido entre 1,8 y 18
\mug/ml. Después de la incubación, el revelado inmunológico del
antígeno capturado sobre C6S se asegura por el anticuerpo AC23
acoplado a peroxidasa, utilizado a 0,5 \mug/ml. Los resultados se
presentan en la figura 10.
Estos resultados muestran que los C6S se asocian
bien con una forma de proteína priónica en el LCR, ya que se
observa una señal desde la primera concentración de C6S
inmovilizados en el fondo de las cavidades.
Un LCR de paciente no aquejado de ECJ (LCR-) y
un LCR de paciente fallecido por ECJ (ECJ+) no diluidos o diluidos
a 1/2 experimentan diferentes tipos de tratamiento térmico. A
continuación, se depositan sobre placa injertada con C6S 7,2
\mug/ml. Después del lavado, se asegura el revelado inmunológico
por el anticuerpo antipriónico AC23 acoplado a biotina.
Se representan gráficamente los resultados en la
figura 11.
\newpage
Estos resultados muestran una adsorción de la
proteína priónica sobre los C6S injertados sobre la placa en
ausencia de tratamiento por proteinasa K más eficaz para la muestra
positiva que para la muestra negativa. Los diferentes tratamientos
térmicos influyen ligeramente en la eficacia de la adsorción de la
proteína priónica sobre los C6S en ausencia de dilución, y más
cuando la muestra está diluida. Así, las condiciones experimentales
que favorecen la adsorción de la proteína priónica sobre los C6S MN
en fase heterogénea parecen ser una dilución de muestras y un
tratamiento durante 5 minutos a 95ºC.
Se ha utilizado una etapa de digestión por
proteinasa K durante 15 minutos a 37ºC en tratamiento preanalítico,
antes de la captura sobre placa C6S de la mezcla de digestión
durante 1 hora a 37ºC. La eliminación de la proteinasa K residual
se asegura mediante lavados sucesivos en tampón
PBS-Tween al 0,05%.
Los resultados se indican en la figura 12.
Estos resultados muestran una diferencia de
densidad óptica a favor de la muestra positiva de ECJ después de
digestión por proteinasa K. Este diferencial es visible desde la
primera concentración de proteinasa K ensayada (0,5 \mug/ml).
La detección de la proteína priónica en el LCR
se hace posible según el procedimiento de la invención.
Efectivamente, en ausencia de digestión por proteinasa K, se
amplifica la detección de la PrP total (celular y patológica) en
presencia de calix-6-arenos
sulfonados e, inesperadamente, se detecta preferiblemente la
PrP^{sc}. La utilización de estos C6S en captura, después de la
digestión de las muestras por proteinasa K, permite detectar la
PrP^{sc} del LCR, proporcionando una señal significativamente
diferente entre los LCR procedentes de pacientes no aquejados de
ECJ y los LCR procedentes de pacientes aquejados de ECJ.
Claims (18)
1. Procedimiento de detección de PrP, y
particularmente de PrP^{sc}, caracterizado porque se añade
en una muestra biológica susceptible de contener PrP^{sc} un
ligando coadyuvante macrocíclico (LCM) libre o unido a un soporte,
después se hace reaccionar la suspensión resultante con un
anticuerpo anti-PrP^{sc}, y se detecta la
presencia de PrP.
2. Procedimiento de detección de PrP, y
particularmente de PrP^{sc}, según la reivindicación 1,
caracterizado porque comprende la etapa suplementaria de
tratamiento de la muestra con proteinasa K antes o después del
contacto con el LCM.
3. Procedimiento de detección de PrP, y
particularmente de PrP^{sc}, según una de las reivindicaciones 1
ó 2, caracterizado porque dicha muestra biológica proviene de
un animal incluyendo el hombre.
4. Procedimiento de detección de PrP, y
particularmente de PrP^{sc}, según la reivindicación 3,
caracterizado porque dicha muestra es un tejido o un fluido
biológico, especialmente líquido cefalorraquídeo o suero.
5. Procedimiento de detección de PrP, y
particularmente de PrP^{sc}, según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 4, caracterizado porque dicho soporte
sólido se funcionaliza preferiblemente con un grupo NHS o un grupo
NH_{2} y, preferiblemente es una bola magnética o una
microplaca.
6. Procedimiento de detección de PrP, y
particularmente de PrP^{sc}, según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 5, caracterizado porque dicho ligando
coadyuvante macrocíclico se une a sitios contiguos o próximos en el
espacio a sitios de unión de PrP^{sc} con un anticuerpo.
7. Procedimiento de detección de PrP, y
particularmente de PrP^{sc}, según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 6, caracterizado porque el ligando
coadyuvante macrocíclico se elige de la familia de metaciclofanos y,
particularmente, entre los calixarenos.
8. Procedimiento de detección de PrP, y
particularmente de PrP^{sc}, según la reivindicación 7,
caracterizado porque los calixarenos preferidos son
para-sulfonatocalixarenos funcionalizados sobre la
cara fenólica, preferiblemente
p-sulfonatocalix[4]areno,
p-sulfonatocalix[6]areno,
p-sulfonatocalix[8]areno o uno de sus
derivados.
9. Procedimiento de detección de PrP, y
particularmente de PrP^{sc}, según una cualquiera de las
reivindicaciones 7 u 8, caracterizado porque el ligando
coadyuvante macrocíclico responde a la fórmula general (I)
siguiente:
en la
que
R_{1} representa un átomo de hidrógeno, un
grupo hidroxilo, un grupo OR o un grupo OCOR, siendo R tal como se
define a continuación,
R_{2} representa un átomo de hidrógeno, un
grupo R, COR, Pol, CH_{2}Pol, en los que Pol representa un grupo
fosfato, sulfato, amina, amonio, ácido carboxílico y R es tal como
se define a continuación,
R_{3} representa un átomo de hidrógeno, un
grupo hidroxilo, un grupo OH o un grupo OCOR, en los que R es tal
como se define a continuación,
R_{4} representa un átomo de hidrógeno, un
grupo hidroxilo, un grupo OR, un grupo OCH_{2}R o un grupo OCOR,
en los que R es tal como se define a continuación,
Y es un átomo de carbono, nitrógeno o un átomo
de azufre,
R_{5} y R_{6}, cada uno independientemente,
están ausentes o representan un átomo de hidrógeno, un agrupamiento
CH_{2} o R tal como se define a continuación, o bien
R_{5} y R_{6} representan conjuntamente un
átomo de oxígeno o de azufre,
X representa un agrupamiento CH_{2} o un átomo
de oxígeno o de azufre,
m representa un número entero igual a 0 ó 1,
R representa un átomo de hidrógeno o una cadena
hidrocarburo, saturada o no, ramificada o no, cíclica o no cíclica,
sustituida o no por un agrupamiento halógeno, y que porta funciones
polares o no polares,
n es un número entero comprendido entre 3 y
15,
pudiendo ser los sustituyentes R_{1} a
R_{5}, R, X, Y y el número entero m de naturaleza diferente según
los motivos.
10. Procedimiento de detección de PrP, y
particularmente de PrP^{sc}, según la reivindicación 9,
caracterizado porque dicho ligando coadyuvante macrocíclico
responde a la fórmula general (Ia) siguiente
en la
que
cada agrupamiento R_{2}, tomado
independientemente, es un agrupamiento sulfato o un agrupamiento
fosfato,
R_{7} es un agrupamiento
(CH_{2})_{r}-Z en el que Z es un
agrupamiento COOEt, COOH, CN o NH_{2},
r es un número entero comprendido entre 1 y
20,
p es un número entero comprendido entre 1 y
10,
n es un número entero comprendido entre 2 y
10.
11. Procedimiento según la reivindicación 9,
caracterizado porque dicho ligando responde a la fórmula (Ib)
siguiente:
en la
que
n es un número entero comprendido entre 4 y
8,
cada agrupamiento R_{2}, tomado
independientemente, es un agrupamiento sulfato o un agrupamiento
fosfato,
R_{8} representa un agrupamiento
(CH_{2})_{t}-(CO)_{s}-(NH_{2}) o un
agrupamiento (CH_{2})_{t}-COOH en los
que t es un número entero comprendido entre 0 y 6 y s es un número
entero comprendido entre 0 y 6.
12. Procedimiento según la reivindicación 11,
caracterizado porque dicho ligando es un calixareno de
fórmula (Ib) en la que los dos agrupamientos R_{2} son cada uno
un agrupamiento sulfato, n es 4 6 u 8, y R_{8} es un átomo de
hidrógeno, un agrupamiento CH_{2}COOH, un agrupamiento
CH_{2}CONH_{2} o un agrupamiento CH_{2}CH_{2}NH_{2}.
13. Procedimiento según la reivindicación 11,
caracterizado porque dicho ligando es tal que los dos
agrupamientos R_{2} son cada uno un agrupamiento sulfato, n es un
número entero igual a 6 y R_{8} es un agrupamiento
(CH_{2})_{2}-NH_{2}.
14. Procedimiento de detección de PrP, y
particularmente de PrP^{sc}, según una cualquiera de las
reivindicaciones 7 a 12, caracterizado porque dicho
calixareno está unido a un soporte funcionalizado especialmente
mediante una función NHS o NH_{2}.
15. Ligando coadyuvante macrocíclico injertado
sobre un soporte funcionalizado, en el que el ligando responde a la
fórmula (Ib)
en la
que
n es un número entero comprendido entre 4 y
8,
cada agrupamiento R_{2}, tomado
independientemente, es un agrupamiento sulfato o un agrupamiento
fosfato,
R_{8} representa un agrupamiento
(CH_{2})_{t}-(CO)_{s}-(NH_{2}) o un
agrupamiento (CH_{2})_{t}-COOH en los
que t es un número entero comprendido entre 0 y 6 y s es un número
entero comprendido entre 0 y 6,
y el soporte es de tipo soporte sólido,
preferiblemente funcionalizado por un grupo NHS o un grupo NH_{2},
y es preferiblemente una bola magnética o una microplaca.
16. Utilización de un ligando coadyuvante
macrocíclico para la detección de PrP, de PrP recombinante,
fisiológica o patológica, bovina o humana o de otras especies o
PrP^{sc} en una muestra biológica, especialmente un fluido
biológico, y particularmente un ligando de fórmula (I), (Ia) o (Ib)
tal como se define en las reivindicaciones 9, 10 y 15, libre o
unido a un soporte.
17. Utilización de un kit que comprende un
ligando coadyuvante macrocíclico y, particularmente, un ligando de
fórmula (I), (Ia) o (Ib) tal como se define en las reivindicaciones
9, 10 y 15, libre o unido a un soporte, para el diagnóstico de
enfermedades de las que la PrP^{sc} es responsable, del tipo EEB,
tembladera en pequeños rumiantes,
Creutzfeld-Jakob.
18. Utilización de un kit que comprende un
ligando coadyuvante macrocíclico y, particularmente, un ligando de
fórmula (I), (Ia) o (Ib) tal como se definen en las reivindicaciones
9, 10 y 15, libre o unido a un soporte, para la dosificación
inmunológica de PrP^{sc}.
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