TW201814291A - 去除抑制成分之方法 - Google Patents

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Abstract

本發明係關於一種體外方法，其係用於檢測診斷樣本中一或多種疾病相關成分的存在，診斷樣本包含選自由分泌體液、排泄體液和腦脊髓液所組成之群組的生物流體。方法之步驟係包含a) 將樣本和至少一部分與一或多個配體共軛之固相接觸，所述配體對於一或多種存在於樣本中之抑制成分具有親和性且能夠相結合；b) 使一或多種抑制成分與一或多個存在於固相上之配體結合，從而減少樣本中一或多種抑制成分的量；之後c) 檢測診斷樣本中一或多種疾病相關成分的存在。所述一或多種抑制成分的特徵在於能夠結合並干擾步驟c)中的檢測。

Description

去除抑制成分之方法
本發明係關於診斷免疫測定之領域，更特別地，係關於其靈敏度之改良。
免疫測定法為廣泛地用作透過抗原與抗體反應來測量溶液中的濃度或分子之存在的生物化學測試。分析係藉由測量標記活性(如輻射、螢光或酵素活性)來達成。
一個重要的應用係疾病的診斷，其中免疫測定是用來檢測生物流體中小濃度的疾病相關分子。例如，結核病(Tuberculosis，TB)是一種多態樣的疾病，使工業化國家和發展中國家的公共衛生問題都面臨著挑戰，並造成全世界每年300萬人死亡。根據世界衛生組織所稱，全世界有三分之一的人口受到結核菌群之感染，並且結核病佔所有可避免的成年人死因中的26%，使其成為最常見之致死傳染病。因此，要想有效控制結核病需要中斷其傳染鏈，依序需要的是及早和準確的檢測，隨後則是立即性治療。
儘管傳染病如結核病、瘧疾、愛滋病等造成巨大的全球負擔，現今診斷疾病活性的測試仍嫌不足且具有嚴格的限制。因此，需要一種提高診斷測試的靈敏度和準確性的方法。
上述存在之問題現已藉由提供一種新穎的方法，一種固相和包含一或多個能夠去除體液中與固相共軛的抑制物的配體之套組而克服或至少緩解。
作為本發明的第一態樣，提供了一種體外(in vitro)方法，其係用於檢測診斷樣本中一或多種疾病相關成分的存在，診斷樣本包含選自由分泌體液、排泄體液和腦脊髓液所組成之群組的生物流體，所述方法包含以下步驟： a) 將樣本和至少一部分與一或多個配體共軛之固相接觸，所述配體對於一或多種存在於樣本中之抑制成分具有親和性且能夠相結合； b) 使一或多種抑制成分與一或多個存在於固相上之配體結合，從而減少樣本中一或多種抑制成分的量；之後 c) 檢測診斷樣本中一或多種疾病相關成分的存在， 其中所述一或多種抑制成分的特徵在於能夠結合並干擾步驟c)中的檢測。
本發明係基於以下的洞見：一些含有抑制物的體液在免疫測定中可能會阻斷可檢測複合物的形成。發明人從而發現抑制成分的存在會對免疫測定之測試表現產生負面影響。因此，抑制物的存在會導致沒有訊號被看見或記錄，且因此即使樣本含有標的抗原，仍可能被認為呈現陰性。為了克服此問題並反轉回遺失的訊號，本發明人已發現一種能降低這種抑制物濃度的方法，其能導致在隨後的免疫測定中擁有較高的靈敏度。
在本文中，抑制成分可包含蛋白質與碳水化合物的混合物。例如，抑制成分可具有約5-1000 kDa的分子量。在本發明的所有態樣中，抑制成分可包含至少一種蛋白質，如至少一種醣蛋白。
在本公開揭示的所有態樣的涵蓋範疇中，一組較佳的抑制成分為群組 1 ：Ig α-1鏈之C區域、凝血酶原 (Prothrombin)、脂蛋白D、尿調理素 (Uromodulin)、血型糖蛋白-C (Glycophorin- C)、鋅-α-2-醣蛋白、硫酸肝素蛋白多醣 (Heparin sulphate proteoglycan)、磷脂肌醇-3-激酶交互作用蛋白 (Phosphoinositide-3-kinase interacting protein)與介白素 (Interleukin)18結合蛋白抑制成分。
在本公開揭示的所有態樣的涵蓋範疇中，一組更佳的抑制成分為群組 2 ：Ig α-1鏈之C區域、脂蛋白D、尿調理素、血型糖蛋白-C、鋅-α-2-醣蛋白、硫酸肝素蛋白多醣、磷脂肌醇-3-激酶交互作用蛋白與介白素18結合蛋白抑制成分。
在本公開揭示的所有態樣的涵蓋範疇中，一組又更佳的抑制成分為群組 3 ：脂蛋白D、尿調理素和鋅-α-2-醣蛋白。本發明人發現這三種蛋白質是非常有效和充足的抑制物。
本發明第一態樣的實施例中，一或多種抑制成分係選自群組1、群組2或群組3。例如，抑制成分可能係或者包含群組3中所有的抑制成分。
本發明第一態樣的實施例中，步驟b) 進一步地包含以下步驟： b1) 將包含一或多種疾病相關成分的樣本從已與一或多種抑制成分結合之固相分離。 因此，使一或多種抑制成分與一或多種存在於固相上的配體結合之步驟之後可為將樣本與固相彼此分離之步驟。這可有助於任何將來檢測樣本中之疾病相關成分。
步驟a) 包括使診斷樣本與其上共軛有配體的固相接觸。固相可為例如基質或平面，如晶片的表面或試管的表面。表面因此可為塑膠試管內側之表面。因此，在本發明的第一態樣的實施例中，固相係為薄膜或固體表面。故接觸步驟可包括將樣本添加至晶片，將樣本注入到其中安裝晶片的分析流動室中，使樣本通過薄膜或將樣本添加到試管中。
然而，固相可為一或多種顆粒之表面，即接觸步驟可為將顆粒添加至樣本中。因此，在本發明的第一態樣的實施例中，固相是一或多種顆粒的表面，其顆粒的至少一部分共軛有一或多個所述配體。固相因此可以包含相同種類的顆粒，即具有與顆粒共軛之相同類型的配體。然而，固相可以包括具有與其表面共軛的第一類型配體的第一類型的顆粒、具有與其表面共軛的第二類型配體的第二類型的顆粒等等。
故步驟a)可包含向所述樣本中添加一或多種具有與其表面至少一部分共軛的一或多個配體的顆粒，所述配體對樣本中的抑制成分具有親和性並能夠與其結合。
進一步地，若使用了顆粒，則步驟b)進一步地包含以下步驟： b1) 從生物樣本中去除一或多種顆粒。 這會在使一或多種抑制成分與一或多個存在於顆粒表面上的配體結合之後進行，且因此可以減少樣本中抑制成分的量。
顆粒可以是具有已經被活化的表面並且已經固定有配體的顆粒。 因此，顆粒可以是經化學活化的顆粒。
例如，顆粒可以是奈米顆粒或微粒。此外，或作為替代，顆粒可為磁粒子或乳膠顆粒。
顆粒可例如藉由使用磁鐵來從生物流體中去除。作為另一例子，顆粒可例如藉由使用離心來從生物流體中去除。作為更進一步的例子，顆粒可例如藉由使用過濾來從生物流體中去除。
此外，步驟c)可以包含：使樣本與抗病相關成分抗體(檢測抗體)接觸，然後檢測診斷樣本中抗病相關成分的存在。檢測之抗體可以任何合適的方式標記，並且可以例如藉由電磁波譜法及/或光密度(OD)測量來檢測。可藉由添加化學試劑來進行檢測。
檢測之抗體可共軛至一表面。因此，步驟c)可以例如包含添加至少一部分表面被抗病相關成分塗布之顆粒，之後檢測診斷樣本中抗病相關成分的存在。若步驟a)包括使樣本與其至少一部分共軛有一或多個配體的顆粒接觸，則步驟c)可包含向診斷樣本添加顆粒，所述顆粒在其表面的至少一部分上塗布有抗病相關成分抗體，之後檢測診斷樣本中抗病相關成分的存在。
因此，如果步驟a)包含向樣本中添加一或多種其表面至少一部分共軛有一或多個配體的顆粒，則步驟c)可以包含向診斷樣本添加第二顆粒，所述顆粒在其表面的至少一部分上塗布有抗病相關成分抗體，然後檢測診斷樣本中抗病相關成分之存在。
在本公開揭示的涵蓋範疇中，生物流體可以選自由尿液、痰、唾液及腦脊髓液所組成的群組。這些生物流體係非常適合於使用光密度測量作為檢測方法的未來測定。此外，生物流體可以選自由尿液、痰及唾液所組成的群組。這些係易於採樣的生物流體，可以大量獲得，且與血液相比，它們是相對無菌和不可傳輸的。因此，這種流體適合用於從患者獲得樣本的可能性受限的環境中。舉例而言，生物流體可以為尿液。
疾病相關成分可以包含抗原，即能夠在生物體中引發免疫反應的分子或其代謝物。例如，疾病相關成分可以包含外源性抗原，即藉由例如注射或吸入方式從外部進入身體的抗原。然而，抗原可以為內源性抗原或腫瘤抗原。
在本發明第一態樣的實施例中，所述一或多種疾病相關成分包含至少一種多醣。
一或多種疾病相關成分可能源自人類或病原體。一或多種疾病相關成分可包含完整的細菌、細胞、病毒或可為其片段，例如細胞壁成分。此外，一或多種疾病相關成分可包含蛋白質、碳水化合物或者是來自蛋白質或碳水化合物的降解產物。
在第一態樣的實施例中，所述一或多種疾病相關成分包含至少一種病原體衍生成分。病原體衍生成分可為多醣。病原體是一種感染性物質，例如病毒、細菌、原生動物、普恩蛋白、真菌或其他可能侵入宿主生物的微生物。病原體衍生成分因此是起源於這種病原體的分子。病原體衍生成分可以在所有類型的生物樣本(包括血液)中進一步檢測。因此，在本發明的另一態樣，提供了一種體外方法，其係用於檢測包含生物流體的診斷樣本中一或多種病原體衍生成分的存在，所述方法包含以下步驟： a) 將樣本和至少一部分與一或多個配體共軛之固相接觸，所述配體對於一或多種存在於樣本中之抑制成分具有親和性且能夠相結合； b) 使一或多種抑制成分與一或多個存在於固相上之配體結合，從而減少樣本中一或多種抑制成分的量；之後 c) 檢測診斷樣本中一或多種疾病相關成分的存在， 其中所述一或多種抑制成分的特徵在於能夠結合並干擾步驟c)中的檢測。 生物流體可以選自由血液、尿液、痰、唾液和腦脊髓液所組成之群組。
舉例而言，疾病相關成分可為結核分枝桿菌(Mycobacterium Tuberculosis )抗原，例如LAM或其代謝物。LAM係為主要的結核分枝桿菌表面抗原，脂阿拉伯甘露聚醣(lipoarabinomannan)。LAM的代謝物可為LAM降解片段，如脫脂LAM。
疾病相關成分的進一步例子包括磷酸肌醇甘露糖苷(Phosphoinositol mannoside)、脂甘露聚醣、C-多醣肺炎鏈球菌(C-polysaccharideS. pneumoniae )、和磷酸膽鹼(Phosphocholine，PC)，其為人體內源性抗原，是合成磷脂醯膽鹼的中間產物。
如上所述，在本發明的所有態樣中，所使用的配體可對蛋白質(例如醣蛋白)具有親和性。蛋白質可為上述群組1、群組2或群組3所列的抑制成分中的任一種。
配體因此可以對群組1、群組2或群組3中至少一種抑制成分具有親和性。與固相共軛的配體因此可以對群組1、群組2或群組3中任何數量的抑制成分具有親和性且能夠結合。舉例而言，與固相共軛的配體可以對群組1、群組2或群組3中所有的抑制成分具有親和性且能夠與之結合。
在本發明的第一態樣的實施例中，與固相共軛的配體對群組1或群組2中至少2種的抑制成分具有親和性，如群組1或群組2中至少3種，如至少5種的抑制成分。
在本發明的第一態樣的實施例中，與固相共軛的配體對群組3中至少一種，如至少2種，如所有的抑制成分具有親和性。
在本發明的第一態樣的實施例中，與固相共軛的配體對群組3中至少一種，如至少2種，如所有的抑制成分具有親和性，且對至少一種，如至少2種，如至少3種，如至少4種，如至少5種選自由Ig α-1鏈之C區域、凝血酶原、血型糖蛋白-C、硫酸肝素蛋白多醣、磷脂肌醇-3-激酶交互作用蛋白與介白素18結合蛋白抑制成分所組成之群組的抑制成分具有親和性。
在本發明的第一態樣的實施例中，與固相共軛的配體對群組3中所有的抑制成分具有親和性，且對至少一種，如至少2種，如至少3種，如至少4種，如至少5種選自由Ig α-1鏈之C區域、凝血酶原、血型糖蛋白-C、硫酸肝素蛋白多醣、磷脂肌醇-3-激酶交互作用蛋白與介白素18結合蛋白抑制成分所組成之群組的抑制成分具有親和性。
在本發明的第一態樣的實施例中，與固相共軛的配體對群組3中至少一種，如至少2種，如所有的抑制成分具有親和性，且對至少一種，如至少2種，如至少3種，如至少4種，如至少5種選自由Ig α-1鏈之C區域、血型糖蛋白-C、硫酸肝素蛋白多醣、磷脂肌醇-3-激酶交互作用蛋白與介白素18結合蛋白抑制成分所組成之群組的抑制成分具有親和性。
在本發明的第一態樣的實施例中，與固相共軛的配體對群組3中所有的抑制成分具有親和性，且對至少一種，如至少2種，如至少3種，如至少4種，如至少5種選自由Ig α-1鏈之C區域、血型糖蛋白-C、硫酸肝素蛋白多醣、磷脂肌醇-3-激酶交互作用蛋白與介白素18結合蛋白抑制成分所組成之群組的抑制成分具有親和性。
固相因此可能包含對不同抑制成分具有親和性的不同配體，如上述群組1、群組2或群組3所列之抑制成分。舉例而言，至少2種，如至少3種，如至少5種不同類型的配體可能與固相共軛，其中每個類型對不同的抑制成分具有親和性。
配體可為生物分子，如合成肽。舉例而言，配體可能為對一或多種上述群組1、群組2或群組3所列之抑制成分具有親和性之生物分子。
此外，生物分子可為包含選自以下的氨基序列的肽：群組 4 ： CPRLSLH RPALEDLL (序列 ID NO: 1) CSIPVCGQDQ VTV (序列 ID NO: 2) CLAGLFGAAEG QAF (序列 ID NO: 3) CWFMPSAPYWI LA (序列 ID NO: 4) CLTCVDLDECA IPG (序列 ID NO: 5) CYYVYNLTAPP ECH (序列 ID NO: 6) CALFQTPSYTQ PYQ (序列 ID NO: 7) CLRYMYRHKGT YH (序列 ID NO: 8) CEPVYVQRAKA YLE (序列 ID NO: 9) C RNPDEDPRGP W (序列 ID NO: 10) C AKQCPALEVTWP (序列 ID NO: 11) C VLVDPEQVVQRH (序列 ID NO: 12)
包含選自群組4的氨基序列的肽可對群組1或群組2中至少一種，如所有的抑制成分具有親和性。
上述肽中的一或幾種，如至少2種，如至少3種，如至少5種的上述肽，可以與固相共軛。舉例而言，各種不同類型的肽可以與固相共軛，如與表面或單個顆粒共軛。舉例而言，固相可以包含具有多於一種或所有肽的顆粒，所述肽隨機地共軛到顆粒上以在顆粒中產生差不多相等的肽分佈。作為替代方案，固相可包含僅具有一或幾種肽與表面共軛的第一類型的顆粒以及具有其它類型的肽與表面共軛的第二類型的顆粒等等。舉例而言，固相可包含許多不同類型的顆粒，每種類型的顆粒與其它類型相比具有與其表面共軛的不同類型的配體。
此外，配體可為化學分子。舉例而言，配體可以選自由4-巰基苯基硼酸、胺重氮苯(amine benzenediazonium)化合物和多粘菌素所組成之群組。上述群組中的幾種化學分子可以同時被用作配體。
作為本發明第一態樣的組態，提供了一種體外方法，其係用於從包含生物流體的診斷樣本中去除一或多種抑制成分，所述方法包括以下步驟： a) 對樣本添加一或多種其至少一部分表面與一或多種配體共軛之顆粒，所述配體對於存在於樣本中之抑制成分具有親和性且能夠相結合； b) 使一或多種抑制成分與顆粒結合；且 c) 去除樣本中之顆粒，其中抑制成分的特徵在於當使用於隨後的免疫測定時成分能干擾診斷樣本。 生物流體可以選自由如上所述的分泌體液、排泄體液和腦脊髓液所組成之群組。
本發明第一態樣的另一組態提供了一種體外方法，其係用於製備及/或清潔包含用於隨後免疫測定的生物流體的診斷樣本，所述方法包括以下步驟： a) 對樣本添加一或多種其至少一部分表面與一或多種配體共軛之顆粒，所述配體對於存在於樣本中之抑制成分具有親和性且能夠相結合； b) 使樣本中存在的一或多種抑制成分與存在於顆粒上的一或多種配體結合；且之後 c) 獲得為免疫測定製備的經清潔及/或經製備的診斷樣本，其中抑制成分的特徵在於能夠結合測定成分並且還干擾診斷免疫測定。 生物流體可以選自由如上所述的分泌體液、排泄體液和腦脊髓液所組成之群組。
本發明的第二態樣提供了一種體外方法，其係用於檢測診斷樣本中一或多種疾病相關成分的存在，診斷樣本包含選自由分泌體液、排泄體液和腦脊髓液所組成之群組的生物流體，所述方法包含以下步驟： a) 減少生物流體中一或多種抑制成分的量，以提供經清潔的診斷樣本，其中一或多種抑制成分包含至少一種蛋白質；且 b) 檢測在步驟a)的經清潔的診斷樣本中一或多種疾病相關成分的存在。
關於第二態樣使用的術語和定義如上述第一態樣所討論。
抑制成分可包含至少一種蛋白質，例如至少一種醣蛋白。在本發明的第二態樣的實施例中，一或多種抑制成分係選自群組1、群組2或群組3之上述所公開揭示之抑制成分。
因此，步驟a)可能包括減少群組1、群組2或群組3中任何數量的抑制成分的量，例如減少群組1、群組2或群組3中所有抑制成分。
在本發明的第二態樣的實施例中，步驟a)包含減少群組1、群組2或群組3中至少2種的抑制成分的量，如減少群組1或群組2中至少3種，如至少5種的抑制成分的量。
在本發明的第二態樣的實施例中，步驟a)包含減少群組3中至少一種、如至少2種、如所有的抑制成分的量，且減少至少一種，如至少2種，如至少3種，如至少4種，如至少5種選自由Ig α-1鏈之C區域、凝血酶原、血型糖蛋白-C、硫酸肝素蛋白多醣、磷脂肌醇-3-激酶交互作用蛋白與介白素18結合蛋白抑制成分所組成之群組的抑制成分的量。
在本發明的第二態樣的實施例中，步驟a)包含減少群組3中至少一種、如至少2種、如所有的抑制成分的量，且減少至少一種，如至少2種，如至少3種，如至少4種，如至少5種選自由Ig α-1鏈之C區域、血型糖蛋白-C、硫酸肝素蛋白多醣、磷脂肌醇-3-激酶交互作用蛋白與介白素18結合蛋白抑制成分所組成之群組的抑制成分的量。
本發明的第三態樣提供了一種固相，其係用於在隨後免疫測定中使用診斷樣本之前從診斷樣本中去除抑制成分，此固相具有一或多個與其至少一部分共軛的配體，所述配體對抑制成分具有親和性並且能夠結合，其中抑制成分的特徵在於能夠干擾診斷免疫測定。
關於第三態樣使用的術語和定義如上述第一態樣所討論。
舉例而言，上述固相可具有至少2個與其至少一部分共軛的配體。因此，第三態樣可提供一種固相，其係用於在隨後免疫測定中使用診斷樣本之前，從診斷樣本中去除抑制成分，此固相具有至少2個與其至少一部分共軛的配體，所述配體對不同的抑制成分具有親和性並且能夠與之結合，其中抑制成分的特徵在於能夠干擾診斷免疫測定。
例如，所述配體可如上述第一態樣的任何實施例中所定義。
在本發明第三態樣的實施例中，此固相具有與其至少一部分共軛的不同配體，使得所述配體對至少2種選自上述群組1、群組2或群組3的抑制成分具有親和性。
舉例而言，此固相可為至少一種顆粒。此外，所述顆粒可為奈米顆粒或微粒。另舉例而言，所述顆粒可為磁粒子或乳膠顆粒。
顆粒的表面也可以被活化以便將配體結合到表面。因此，所述顆粒可以是表面活化的磁粒子。
本發明的第四態樣提供了根據本發明第三態樣的用於製備及/或清潔用於隨後免疫測定的診斷樣本的固相的用途。關於第四態樣使用的術語和定義如上述其他態樣所討論。所述用途可包括在進行診斷免疫測定之前從診斷樣本中去除或減少一或多種抑制成分的量。抑制成分可以選自上述的群組1、群組2或群組3。因此，所述用途可包括減少群組1、群組2或群組3中任何數量的抑制成分的量，如降低群組1、群組2或群組3中的所有抑制成分。
此外，所述用途可包含減少群組1、群組2或群組3中至少2種抑制成分的量，如減少群組1、群組2或群組3中至少3種，如至少5種的抑制成分的量。
在本發明的第四態樣的實施例中，所述用途包含減少群組3中至少一種、如至少2種、如所有的抑制成分的量，且減少至少一種，如至少2種，如至少3種，如至少4種，如至少5種選自由Ig α-1鏈之C區域、凝血酶原、血型糖蛋白-C、硫酸肝素蛋白多醣、磷脂肌醇-3-激酶交互作用蛋白與介白素18結合蛋白抑制成分所組成之群組的抑制成分的量。
在本發明的第四態樣的實施例中，所述用途包含減少群組3中至少一種、如至少2種、如所有的抑制成分的量，且減少至少一種，如至少2種，如至少3種，如至少4種，如至少5種選自由Ig α-1鏈之C區域、血型糖蛋白-C、硫酸肝素蛋白多醣、磷脂肌醇-3-激酶交互作用蛋白與介白素18結合蛋白抑制成分所組成之群組的抑制成分的量。
本發明的第五態樣提供了一種零件套組，其包含： a) 用於在免疫測定中捕獲和檢測一種或多種疾病相關成分的工具，及 b) 用於減少生物流體中一或多種抑制成分的量的工具，其中一或多種抑制成分包含至少一種蛋白質。
在本發明的第五態樣的實施例中，用於減少生物流體中一或多種抑制成分的量的工具包含根據上述第三態樣的一或多種固相。因此，套組可包含與本文所公開揭示的針對抑制成分的配體共軛的顆粒。然而，用於減少生物流體中一或多種抑制成分的量的工具可包含固相，例如薄膜、基質、晶片表面或試管的內表面，其上固定了針對一或多種抑制成分的配體。
所述至少一或多種抑制成分包含至少一種蛋白質，如至少一種醣蛋白。抑制成分可以選自上述群組1、群組2或群組3所列的抑制成分。
此外，用於減少一或多種抑制成分的量的工具可包含減少至少2種不同抑制成分的工具，例如至少2種選自上述群組1、群組2或群組3中的抑制成分。
用於在免疫測定中捕獲和檢測一或多種疾病相關成分的工具可包含抗病相關成分抗體(檢測抗體)，如與已和針對抑制成分的配體共軛的顆粒以外的顆粒共軛的抗病相關成分抗體。
此外，在本發明的第五態樣的實施例中，一或多種疾病相關成分係結核分枝桿菌抗原，如LAM。
本發明的發明人已經找到了減少生物樣本中抑制化合物的量的方法，使得隨後的免疫測定中的靈敏度增加。
例如，如果從健康個體或結核病(TB)患者的尿液中加入主要的結核分枝桿菌表面抗原脂阿拉伯甘露聚醣(LAM)，與PBS或合成尿液中的相同量的LAM相比，LAM訊號通常會減少甚至完全淬滅。這種抑制效果因人而異，且因從相同個體的不同時間點採集的樣本而異。
過去的蛋白質體學研究已經鑑別出來自健康個體的2800多種尿蛋白，但是它們對免疫測定的影響仍尚未被探討。使用各種層析法與質譜分析結合，發明人例如現在已經能夠從健康尿中分離、純化和表徵幾種大量的蛋白質，其對LAM免疫測定具有潛在的抑制作用。
當LAM加入磷酸鹽緩衝鹽水或合成尿液模擬重建時，這些蛋白質單獨或組合地藉由遮蔽LAM抗原或藉由與檢測器抗體的交互作用在測試上產生抑制作用。減少患者尿液的抑制作用明顯地可提高基於LAM的尿液測試的診斷靈敏度和準確性。
本文呈現了這些蛋白質對免疫測定的抑制作用，對作用機制的理解，並且還找到從體液中去除它們並因此恢復測定的靈敏度的方法。這為免疫測定的靈敏度提供了巨大的好處。使用LAM測定被用來作為可以從診斷樣本的預清潔中受益的免疫測定的實例，但該方法也適用於其他免疫測定。
本文中，尿液係用於診斷各種疾病的良好基質，因為其是無菌的，與血液或任何其它液體相比可獲得更大的體積，且最重要的是不需採血使用的針頭，因此避免例如肝炎或愛滋病毒進一步的內部感染。
為此，使用了兩種構建樣本清潔劑(SpeClean)來從體液中去除抑制物的方法： A) 藉由噬菌體展示技術鑑別對尿液抑制物具有結合親和性的肽。如下所列作為鎖定抑制蛋白之配體的十二個肽被鑑別出來，並與磁粒子(MP)共軛，以便藉由磁鐵簡單地從體液中去除抑制物。 B) 我們對標的醣脂抗原(LAM)與抑制蛋白(主要由N-乙醯葡萄糖胺組成)的碳水化合物部分(moiety)之間的結構差異的理解有助於鑑別幾種具有抑制物結合能力的配體。然後將這些配體用於構建許多配體-磁粒子(MP)共軛物，其係用於從體液中簡單地去除抑制物。
因此，本文首次提供一種方法，其係用於在將生物樣本(如體液)用於隨後的診斷測定(如免疫測定)之前從生物樣本中去除抑制物，所述樣本包含尿液或其他體液，如血漿、痰、唾液等。為了去除抑制物可以使用顆粒，如奈米顆粒或微粒。所述顆粒可以例如乳膠顆粒或磁粒子。一般方法如圖1所示。A) 顯示其上固定有配體之磁粒子如何能在培養後(即與抑制成分結合後)從樣本中利用磁性被去除，B) 顯示固定在磁粒子(MNP)上的配體(SpeClean配體)和與其結合的抑制物，C) 顯示配體與固體表面結合，以及D)顯示配體與過濾基質結合。
有許多製造商提供各種不同之顆粒，包括可在目前情況下使用的各種表面、尺寸和功能的磁粒子。
樣本清潔劑(例如包含與本文定義的表面的至少一部分共軛的配體(化學或生物)的顆粒)是可用於從任何生物流體中去除抑制物的技術。該方法可以與各種診斷方法結合使用，因此不限於LAM測定。 配體與顆粒的共軛可以通過常規方法進行。 抑制蛋白與配體之實例
以下是分離的蛋白質(抑制蛋白干擾診斷測定)的列表，其形成用於鑑別與其結合之生物分子的基礎，所述結合作用係用以作為隨後用於免疫測定之清潔及/或製備診斷樣本中的配體。另提供了在本文公開揭示的方法中用作配體的實例的化學配體列表。
在免疫測定中具有抑制作用的蛋白質的實例 ( 群組 1) Ig α-1鏈之C區域 凝血酶原 脂蛋白D 尿調理素 血型糖蛋白-C 鋅-α-2-醣蛋白 硫酸肝素蛋白多醣 磷脂肌醇-3-激酶交互作用蛋白 介白素18結合蛋白抑制成分
肽配體 ( 群組 4) CPRLSLH RPALEDLL (序列 ID NO: 1) CSIPVCGQDQ VTV (序列 ID NO: 2) CLAGLFGAAEG QAF (序列 ID NO: 3) CWFMPSAPYWI LA (序列 ID NO: 4) CLTCVDLDECA IPG (序列 ID NO: 5) CYYVYNLTAPP ECH (序列 ID NO: 6) CALFQTPSYTQ PYQ (序列 ID NO: 7) CLRYMYRHKGT YH (序列 ID NO: 8) CEPVYVQRAKA YLE (序列 ID NO: 9) C RNPDEDPRGP W (序列 ID NO: 10) C AKQCPALEVTWP (序列 ID NO: 11) C VLVDPEQVVQRH (序列 ID NO: 12)
化學配體 ( 實例 ) 4-巰基苯基硼酸 胺重氮苯化合物 多粘菌素實驗部分
實驗部分說明了使用清潔步驟從診斷樣本的抗原上去除任何抑制物的正面效果，例如(LAM)檢測。樣本清潔劑 (SpeClean) 的製備
肽 ( 抗抑制物 ) 與各種基質的共軛 磁性微粒、硝化纖維膜、乳膠珠和玻璃料全部與胺基官能化後被用於肽配體的固定/共軛。將等量的群組4中的所有肽與固相共軛。首先通過與溴乙酸N-羥基琥珀醯亞胺酯(Bromoacetic acid N-hydroxysuccinimide ester)的溴烷基化反應將胺基轉化成溴。接著，保持pH的同時將半胱胺醯化(cysteinylated)之肽逐滴加入活化的基質中。為了讓共軛產率最大化，將10mM的三丁基膦加入到反應混合物中以保持巰基團免受氧化，並因此使其與基體表面上的溴反應。
所得樣本清潔劑被標示為SpeClean 1 。可以將其加入至樣本中，並在培養後去除以減少抑制化合物的量。例如，磁粒子可藉由磁鐵去除。
化學配體與基質表面的共軛 如上所述進行4-巰基苯基硼酸與基質表面的共軛。為了固定胺重氮苯化合物與多粘菌素，係使用羧基(COOH)官能化基質。簡言之，該基質首先在pH6.0下用2-(N-嗎啉基)乙磺酸平衡，然後用N-羥基琥珀醯亞胺(NHS)與1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)-碳二亞胺(EDC)在室溫下活化1小時。洗滌後，加入含胺配體，使共軛在室溫下進行2小時。
所得樣本清潔劑被標示為SpeClean 2 。一般測定描述（ LAM 測定，檢測 LAM 抗原）
-將塗布有捕獲抗LAM抗體的磁粒子加入至尿液/其他體液中並培養。 -洗滌後，加入生物素化檢測抗體並培養。 -洗滌後，加入抗生物素蛋白-HRP酵素共軛物並培養。 -洗滌四甲基聯苯胺後，加入TMB基質以及顯色強度(光密度記錄在450nm)。
由於體液可能含有阻斷任何顏色形成的抑制物，所以會看到或記錄到較低或沒有訊號，因此即使含有標的抗原，樣本也將被認為呈現陰性。為了克服這個問題並反轉回遺失的訊號，抑制物需要從流體中清除。為此，將添加捕獲顆粒之前使用SpeClean 1或SpeClean 2對抑制物進行清潔來應用於本公開揭示的樣本清潔步驟。因此，一清潔步驟在進行上述測定/方法之前被引入。 結果
實例 1 在下文中，實例1是LAM(抗原)測定，實例2至4包括在進行抗原(LAM)測定之前進行的另外的標本清潔步驟。數據顯示在抗原檢測測試之前(在本文中為LAM)進行清潔步驟提高了測定的靈敏度，因為在與抗原(LAM)結合之捕獲顆粒加入生物樣本之前，存在於樣本中且與抗原結合的任何抑制分子已被去除 。
在添加LAM的合成尿液中，LAM的訊號由於其中不存在抑制分子而更高。然而，LAM的信號在添加LAM的尿液中係為低或幾乎不存在。
實例 2 SpeClean對添加+/- 100pg/ml LAM的一個健康捐贈者的尿液的影響
這說明在進行測定之前，SpeClean步驟(即去除樣本中的抑制物)增加了抗原(LAM)檢測測試的靈敏度。如果不進行清潔步驟，則會獲得抗原(LAM)的低/沒有信號。
實例 3 SpeClean對5種具有不同程度抑制作用的健康捐獻者的尿液的影響。在此實驗中，尿液樣本係添加100 pg/ml LAM。
該實驗清楚地說明了個別尿液中各種量的抑制物的存在，其範圍從低(D2、D4)、中等(D3)到高(D1、D5)不等，並在樣本清潔劑處理後反轉回正常信號(添加LAM之合成尿液)。
實例 4 兩種不同的SpeClean組成物，SpeClean 1和SpeClean 2(見上述)，對添加LAM之健康尿液的影響。
此實驗顯示基於生物配體(SpeClean 1)的樣本清潔劑表現跟基於化學的樣本清潔劑(SpeClean 2)一樣良好。
實例 5 進行實驗以觀察SpeClean改善在各種體液中的LAM-TB測定的影響。在上述實例1-4中所述的測定中測試於尿液、痰、唾液及腦脊髓液中添加以及不添加SpeClean 1。其結果顯示在圖2中，其清楚地顯示出添加SpeClean 1組成物明顯地提高了所有生物樣本測定中的OD。
實例 6 進行實驗以觀察SpeClean改善在添加各種抗原的尿液樣本中進行測定時的影響，抗原包括：磷酸肌醇甘露糖苷、脂甘露聚醣與C-多醣肺炎鏈球菌。其結果顯示在圖3中，且顯而易見地，與未處理的樣本相比，用SpeClean 1處理的所有樣本明顯地改善了620nm時的OD，即測試的所有抗原的測定靈敏度皆增加。
實例 7 在從確診肺結核的21位不同結核病患者收集的尿液樣本中測試了SpeClean提高測定靈敏度的影響。
圖4示例了用SpeClean 1組成物預處理尿液樣本時免疫測定(尿液中LAM的檢測)的臨床靈敏度差異。SpeClean 1的預處理導致多數樣本的陽性訊號增加，並且整體提高了該檢測的臨床靈敏度，從正確識別31.8%的感染個體提升至80.9%的感染患者。
實例 8 根據上文所公開揭示的共軛方案，將針對脂蛋白D、尿調理素以及鋅-α-2-醣蛋白的肽配體共軛到磁性微粒上，得到標示為SpeClean 3的樣本清潔劑。
於根據上述一般測定描述進行抗原(LAM)測定之前，將SpeClean 3加入到尿液樣本中，並在培養後去除。
實例 9 根據上文所公開揭示的共軛方案，將針對脂蛋白D、尿調理素以及鋅-α-2-醣蛋白的肽配體共軛到固體表面上，得到標示為SpeClean 4的樣本清潔劑。
將尿液樣本與SpeClean 4表面接觸，並保持培養。然後於根據上述一般試驗說明進行抗原(LAM)測定之前，將樣本與表面分離。
實例 10 根據上文所公開揭示的共軛方案，將針對脂蛋白D、尿調理素以及鋅-α-2-醣蛋白的肽配體共軛到試管的內表面上，得到標示為SpeClean 5的樣本清潔劑。
將尿液樣本加入至試管中，並在從試管中取出之前培養。然後根據上述一般試驗說明進行樣本的抗原(LAM)測定。 實施例之逐項列表
1. 一種體外方法，其係用於檢測診斷樣本中一或多種疾病相關成分的存在，所述診斷樣本包含選自由分泌體液、排泄體液和腦脊髓液所組成之群組的生物流體，所述方法包含以下步驟： a) 將樣本和至少一部分與一或多個配體共軛之固相接觸，所述配體對於一或多種存在於樣本中之抑制成分具有親和性且能夠相結合； b) 使一或多種抑制成分與一或多個存在於固相上之配體結合，從而減少樣本中一或多種抑制成分的量；之後 c) 檢測診斷樣本中一或多種疾病相關成分的存在， 其中所述一或多種抑制成分的特徵在於能夠結合並干擾步驟c)中的檢測。
2.如第1項所述之體外方法，其中一或多種抑制成分包含蛋白質與碳水化合物的混合物。
3. 如第2項所述之體外方法，其中一或多種抑制成分具有約5-1000 kDa的分子量。
4.如第1至3項中任一項所述之體外方法，其中一或多種抑制成分包含至少一種醣蛋白。
5.如任何上述項中所述之體外方法，其中一或多種抑制成分係選自由Ig α-1鏈之C區域、凝血酶原、脂蛋白D、尿調理素、血型糖蛋白-C、鋅-α-2-醣蛋白、硫酸肝素蛋白多醣、磷脂肌醇-3-激酶交互作用蛋白與介白素18結合蛋白抑制成分所組成的群組。
6. 如第4項所述之體外方法，其中一或多種抑制成分係選自由脂蛋白D、尿調理素以及鋅-α-2-醣蛋白所組成的群組。
7. 如上述中任一項所述之體外方法，其中步驟b)進一步地包含以下步驟： b1) 將包含一或多種疾病相關成分的樣本從一或多種抑制成分所結合之固相分離。
8. 如上述中任一項所述之體外方法，其中固相係一或多種顆粒的表面，其顆粒的至少一部分共軛有一或多個配體。
9. 如第7及8 項所述之體外方法，其中步驟b)進一步地包含b1)步驟，從生物樣本中去除一或多種顆粒。
10. 如第6或7項所述之體外方法，其中顆粒係奈米顆粒或微粒。
11. 如第8至10項中任一項所述之體外方法，其中顆粒係磁粒子或乳膠顆粒。
12. 如第9至11項中任一項所述之體外方法，其中顆粒藉由使用磁鐵來從生物流體中去除。
13. 如第9至11項中任一項所述之體外方法，其中顆粒藉由使用離心來從生物流體中去除。
14. 如第9至11項中任一項所述之體外方法，其中顆粒藉由使用過濾來從生物流體中去除。
15. 如第1至7項中任一項所述之體外方法，其中固相係為薄膜或固體表面。
16. 如上述中任一項所述之體外方法，其中步驟c)包含：使樣本與抗病相關成分抗體(檢測抗體)接觸，然後檢測診斷樣本中抗病相關成分的存在。
17. 如第16項所述之體外方法，其中步驟c)包含：添加顆粒至診斷樣本，所述顆粒至少一部分表面被抗病相關成分塗布，之後檢測診斷樣本中抗病相關成分的存在。
18. 如第16或17項所述之體外方法，其中藉由添加化學試劑來進行檢測。
19. 如上述中任一項所述之體外方法，其中生物流體係選自由尿液、痰、唾液以及腦脊髓液所組成之群組。
20. 如第19項所述之體外方法，其中生物流體係選自由尿液、痰以及唾液所組成之群組。
21. 如第20項所述之體外方法，其中生物流體係尿液。
22. 如上述中任一項所述之體外方法，其中一或多種疾病相關成分包含抗原。
23. 如上述中任一項所述之體外方法，其中一或多種疾病相關成分包含全部細菌、細胞、病毒或其片段。
24. 如上述中任一項所述之體外方法，其中一或多種疾病相關成分包含至少一種多醣。
25. 如上述中任一項所述之體外方法，其中一或多種疾病相關成分包含至少一種病原體衍生成分。
26. 如第25項所述之體外方法，其中至少一種病原體衍生成分係多醣。
27. 如第26項所述之體外方法，其中疾病相關成分係結核分枝桿菌抗原，如LAM。
28.如第25項所述之體外方法，其中疾病相關成分係選自由磷酸肌醇甘露糖苷、脂甘露聚醣、C-多醣肺炎鏈球菌以及磷酸膽鹼，其為人體內源性抗原，所組成之群組。
29. 如上述中任一項所述之體外方法，其中一或多個配體對蛋白質具有親和性。
30. 如上述中任一項所述之體外方法，其中配體係生物分子，如合成肽。
31. 如第30項所述之體外方法，其中配體係生物分子，並對下列一或多種組成物具有親和性：Ig α-1鏈之C區域、凝血酶原、脂蛋白D、尿調理素、血型糖蛋白-C、鋅-α-2-醣蛋白、硫酸肝素蛋白多醣、磷脂肌醇-3-激酶交互作用蛋白以及介白素18結合蛋白抑制成分。
32. 如第31項所述之體外方法，其中配體係生物分子，並對下列一或多種組成物具有親和性：脂蛋白D、尿調理素以及鋅-α-2-醣蛋白。
33. 如第1至29項所述之體外方法，其中配體係化學分子。
34. 如第33項所述之體外方法，其中配體係選自由4-巰基苯基硼酸、胺重氮苯化合物以及多粘菌素所組成之群組。
35. 如上述中任一項所述之體外方法，其中固相包含具有對不同抑制成分之親和性的不同配體。
36. 如第35項所述之體外方法，其中固相包含具有對不同抑制成分之親和性的不同配體，所述抑制成分係選自由Ig α-1鏈之C區域、凝血酶原、脂蛋白D、尿調理素、血型糖蛋白-C、鋅-α-2-醣蛋白、硫酸肝素蛋白多醣、磷脂肌醇-3-激酶交互作用蛋白以及介白素18結合蛋白抑制成分所組成之群組。
37. 一種體外方法，其係用於檢測診斷樣本中一或多種疾病相關成分的存在，所述診斷樣本包含選自由分泌體液、排泄體液和腦脊髓液所組成之群組的生物流體，所述方法包含以下步驟： a) 減少生物流體中一或多種抑制成分的量以提供經清潔的診斷樣本，其中一或多種抑制成分包含至少一種蛋白質；且 b) 檢測在步驟a)的經清潔的診斷樣本中一或多種疾病相關成分的存在。
38. 如第37項所述之體外方法，其中一或多個抑制成分係選自由Ig α-1鏈之C區域、凝血酶原、脂蛋白D、尿調理素、血型糖蛋白-C、鋅-α-2-醣蛋白、硫酸肝素蛋白多醣、磷脂肌醇-3-激酶交互作用蛋白以及介白素18結合蛋白抑制成分所組成之群組。
39. 如第37或38項所述之體外方法，其中一或多種抑制成分係為至少2種抑制成分選自由脂蛋白D、尿調理素以及鋅-α-2-醣蛋白所組成之群組。
40. 一種體外方法，其係用於從診斷樣本中去除一或多種抑制成分，診斷樣本包含選自由分泌體液、排泄體液和腦脊髓液所組成之群組的生物流體，所述方法包含以下步驟： a) 對樣本添加一或多種其至少一部分表面與一或多種配體共軛之顆粒，所述配體對於存在於樣本中之抑制成分具有親和性且能夠相結合； b) 使一或多種抑制成分與顆粒結合；且 c) 去除樣本中之顆粒， 其中抑制成分的特徵在於當使用於隨後的免疫測定時成分能干擾診斷樣本。
41. 一種固相，其係用於在隨後免疫測定中使用診斷樣本之前從診斷樣本中去除抑制成分，固相具有至少2個與其至少一部分共軛的配體，所述配體對不同的抑制成分具有親和性並且能夠結合，其中抑制成分的特徵在於能夠干擾診斷免疫測定。
42. 如第41項所述之固相，其中配體如第29至35 項中任一項所定義。
43. 如第41或2項所述之固相，其中固相具有與其至少一部分共軛的不同配體，所述配體對至少2種抑制成分具有親和性，所述抑制成分係選自由Ig α-1鏈之C區域、凝血酶原、脂蛋白D、尿調理素、血型糖蛋白-C、鋅-α-2-醣蛋白、硫酸肝素蛋白多醣、磷脂肌醇-3-激酶交互作用蛋白以及介白素18結合蛋白抑制成分所組成之群組。
44. 如第41至43項中任一項所述之固相， 其中固相係至少一種顆粒。
45. 如第44項所述之固相， 其中顆粒係奈米顆粒或微粒。
46. 如第44或45項所述之固相， 其中顆粒係磁粒子或乳膠顆粒。
47. 如第44至46項中任一項所述之固相， 其中顆粒係表面活化的磁粒子。
48. 一種如第41至47項中任一項所述之固相之用途，其係用於製備及/或清潔用於隨後免疫測定的診斷樣本。
49. 如第48項所述之用途， 其中用途包括在進行診斷免疫測定之前從診斷樣本中去除或減少一或多種抑制成分的量。
50. 一種零件套組，其包含： a) 用於在免疫測定中捕獲和檢測一種或多種疾病相關成分的工具，及 b) 用於減少生物流體中一或多種抑制成分的量的工具，其中一或多種抑制成分包含至少一種蛋白質。
51. 如第50項所述之零件套組， 其中用於減少生物流體中一或多種抑制成分的量的工具係包含一或多種如第39至45項中任一項所述之固相。
52. 如第50或51項所述之零件套組， 其中至少一種蛋白質係選自由Ig α-1鏈之C區域、凝血酶原、脂蛋白D、尿調理素、血型糖蛋白-C、鋅-α-2-醣蛋白、硫酸肝素蛋白多醣、磷脂肌醇-3-激酶交互作用蛋白以及介白素18結合蛋白抑制成分所組成之群組。
53. 如第50至52項中任一項所述之零件套組， 其中一或多種疾病相關成分係結核分枝桿菌抗原，如LAM。
A‧‧‧在免疫測定之前清潔樣本之方法
B‧‧‧配體使用於顆粒上
C‧‧‧配體使用於固體表面上
D‧‧‧配體使用於過濾基質上
圖1顯示了本公開揭示的一般方法，其係用於在免疫測定之前清潔樣本。(A)其係藉由將配體使用在：顆粒(B)、固體表面(C)、過濾基質(D)上。 圖2顯示了各種體液(100pg / ml)中的LAM-Tb測定的SpeClean(樣本清潔劑)的改進。 圖3顯示了SpeClean對加入各種抗原(100 pg / ml)的尿液樣本中檢測靈敏度改進的影響。 圖4示例了用SpeClean預處理尿液樣本時免疫測定(尿液中LAM的檢測)的臨床靈敏度差異。未經處理的靈敏度= 47.6％，SpeClean處理= 80.9％，n = 21，LOD 0.4 OD 620nm。

Claims (10)

  1. 一種體外方法，其係用於檢測一診斷樣本中一或多種疾病相關成分的存在，該診斷樣本包含選自由一分泌體液、一排泄體液和腦脊髓液所組成之群組的一生物流體，該方法包含以下步驟： a) 將該樣本和一至少一部分與一或多個配體共軛之固相接觸，該配體對於一或多種存在於該樣本中之抑制成分具有親和性且能夠相結合； b) 使該一或多種抑制成分與一或多個存在於該固相上之配體結合，從而減少該樣本中該一或多種抑制成分的量；之後 c) 檢測該診斷樣本中一或多種疾病相關成分的存在， 其中該一或多種抑制成分的特徵在於能夠結合並干擾步驟c)中的檢測。
  2. 如申請專利範圍第1項所述之體外方法，其中該一或多種抑制成分係選自由Ig α-1鏈之C區域、凝血酶原、脂蛋白D、尿調理素、血型糖蛋白-C、鋅-α-2-醣蛋白、硫酸肝素蛋白多醣、磷脂肌醇-3-激酶交互作用蛋白與介白素18結合蛋白抑制成分所組成的群組。
  3. 如申請專利範圍第1項或第2項所述之體外方法，其中該固相係一或多種顆粒的表面，該固相的至少一部分共軛有該一或多個配體。
  4. 如申請專利範圍第3項所述之體外方法，其中該步驟b)進一步地包含一步驟b1)，其包括從該生物樣本中去除該一或多種顆粒。
  5. 如申請專利範圍第1項至第4項任一項所述之體外方法，其中該步驟c)包含：使該樣本與抗病相關成分抗體(檢測抗體)接觸，然後檢測診斷樣本中抗病相關成分的存在。
  6. 如申請專利範圍第1項至第5項任一項所述之體外方法，其中該生物流體係選自由尿液、痰、唾液以及腦脊髓液所組成之群組。
  7. 如申請專利範圍第1項至第6項任一項所述之體外方法，其中該一或多種疾病相關成分包含至少一種病原體衍生成分。
  8. 如申請專利範圍第12項所述之體外方法，其中該疾病相關成分係一結核分枝桿菌抗原，如LAM。
  9. 一種固相，其係用於在隨後一免疫測定中使用一診斷樣本之前，從該診斷樣本中去除抑制成分，該固相具有至少2個與該固相至少一部分共軛的配體，該配體對不同的抑制成分具有親和性並且能夠相結合，其中該抑制成分的特徵在於能夠干擾該診斷免疫測定。
  10. 一種零件套組，包含： a) 用於在一免疫測定中捕獲和檢測一種或多種疾病相關成分的工具，及 b) 用於減少一生物流體中一或多種抑制成分的量的工具，其中該一或多種抑制成分包含至少一種選自由Ig α-1鏈之C區域、凝血酶原、脂蛋白D、尿調理素、血型糖蛋白-C、鋅-α-2-醣蛋白、硫酸肝素蛋白多醣、磷脂肌醇-3-激酶交互作用蛋白以及介白素18結合蛋白抑制成分所組成之群組之蛋白質。
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