KR20230115014A - 바이오마커를 이용한 결핵 진단용 조성물, 이를 이용한 결핵 진단방법 및 키트 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 검체 내의 LAM 등과 같은 바이오마커를 마그네틱 비드를 이용한 방식의 타겟 농축 및 TMB 기반 비색 변화 검출 방식을 적용하여 기존 LAM 검출법의 단점인 민감도를 극복하며, 1 시간 이내의 짧은 시간 내에 검출을 하여 결핵을 진단할 수 있는 결핵 진단용 조성물, 이를 이용한 결핵 진단방법 및 이를 이용한 키트에 관한 것으로서, 본 발명의 결핵 진단용 조성물 및 이를 이용한 결핵 진단방법은 측정단계가 간단하며 비색 기반 검출방식이기 때문에 추가적인 신호 리더기가 필요 없다는 장점과 함께, 기존 비색 기반 방식의 낮은 검출 한계(11 pg/mL) 보다 더 낮은 농도의 LAM 검출이 가능하다는 장점을 지니고 있다.
Description
본 발명은 바이오마커를 이용한 결핵 진단용 조성물, 이를 이용한 결핵 진단방법 및 키트에 관한 것으로, 보다 상세하게는 검체 내의 리포아라비노만난(LAM) 등과 같은 바이오마커를 마그네틱 비드를 이용한 방식의 타겟 농축 및 3,3‘,5,5’-테트라메틸벤지딘(TMB) 기반 비색 변화 검출 방식을 적용하여 기존 LAM 검출법의 단점인 민감도를 극복하며, 1 시간 이내의 짧은 시간 내에 검출을 하여 결핵을 진단할 수 있는 결핵 진단용 조성물, 이를 이용한 결핵 진단방법, 이를 이용한 키트 및 이를 이용하여 결핵을 진단할 수 있는 카트리지에 관한 것이다.
WHO에 따르면 결핵(tuberculosis)은 전 세계 10대 사망원인 중 하나로서, 전 세계 인구의 1/3이 감염된 것으로 추산될 정도로 흔한 질환이다. 하지만 결핵균에 감염되었다고 하여 모두 증상이 나타나는 건 아니며, 실제로 감염자의 10%에서만 평생 한번정도 발병하며, 90%는 발병하지 않는 잠복 결핵으로 알려져 있다.
결핵은 면역력과 연관이 깊은 질병으로, 면역력이 떨어지면, 잠복결핵 상태라도 언제든 결핵이 발병할 수 있어, 잠복 결핵 상태라면 꾸준한 약물 치료를 통해 결핵 발병을 막는 것이 중요하다. 실제로 잠복 결핵이 결핵으로 발병하기 전 치료를 진행한다면, 60~90%까지 예방이 가능한 것으로 알려져 있다.
이런 결핵으로 인한 피해를 최소화하기 위해서는 조기 결핵 진단을 통한 선제적인 관리가 매우 중요하다. 이에 WHO와 미국 질병통제예방센터(CDC)는 결핵감염 확인을 위한 검사법으로 체외검사인 ‘Interferon-Gamma Release Assay (IGRA)’(비특허문헌 1)을 우선적으로 권고하고 있다. 하지만 해당 방식은 채혈을 진행하기 때문에, 피검사자의 심적, 물리적 고통을 유발할 수 있으며, 측정 결과를 받기까지 12시간이 소모된다는 단점이 있다.
한편, 결핵 관련 바이오마커로 이용되는 리포아라비노만난(LAM) 검출을 통하여 해당 질병을 진단하는 기술도 체외진단용으로 사용되고 있다. 해당 방식은 결핵 환자로부터 배출된 소변을 이용한 Lateral flow immunoassay(LFA) 방식으로 테스트하는 방법으로서(비특허문헌 2), 피검사자의 고통을 유발하지 아니하고 짧은 시간(25min) 내에 결과를 볼 수 있다는 장점이 있으나, 상대적으로 민감도가 낮다는 단점이 있다.
따라서, 피검사자의 고통을 유발하지 않으면서도 빠르고 정확한 결과를 얻을 수 있는 방식의 결핵 진단방법이 절실히 요구되고 있는 실정이다.
The Korean Journal of Medicine: Vol. 82, No. 3, 2012
PLoS One. 2019 Apr 18;14(4):e0215443
본 발명의 목적은 검체 내의 LAM 등과 같은 바이오마커를 마그네틱 비드를 이용한 방식의 타겟 농축 및 TMB 기반 비색 변화 검출 방식을 적용하여 기존 LAM 검출법의 단점인 민감도를 극복하며, 1 시간 이내의 짧은 시간 내에 검출을 하여 결핵을 진단할 수 있는 결핵 진단용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 결핵 진단용 조성물을 이용함으로써, 검체 내의 LAM 등과 같은 바이오마커를 마그네틱 비드를 이용한 방식의 타겟 농축 및 TMB 기반 비색 변화 검출 방식을 적용하여 기존 LAM 검출법의 단점인 민감도를 극복하며, 1 시간 이내의 짧은 시간 내에 검출을 하여 결핵을 진단할 수 있는 결핵 진단방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 결핵 진단용 조성물을 구비함으로써, 검체 내의 LAM 등과 같은 바이오마커를 마그네틱 비드를 이용한 방식의 타겟 농축 및 TMB 기반 비색 변화 검출 방식을 적용하여 기존 LAM 검출법의 단점인 민감도를 극복하며, 1 시간 이내의 짧은 시간 내에 검출을 하여 결핵을 진단할 수 있는 결핵 진단용 키트를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 결핵 진단용 조성물을 이용함으로써, 검체 내의 LAM 등과 같은 바이오마커를 마그네틱 비드를 이용한 방식의 타겟 농축 및 TMB 기반 비색 변화 검출 방식을 적용하여 기존 LAM 검출법의 단점인 민감도를 극복하며, 1 시간 이내의 짧은 시간 내에 검출을 하여 결핵을 진단할 수 있는 결핵 진단용 카트리지를 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 개질되고, 바이오마커 항체가 코팅된 마그네틱 비드; 및 겨자무과산화수소 태깅 압타머(HRP tagged aptamer)를 포함하는, 바이오마커를 이용한 결핵 진단용 조성물을 제공한다.
본 발명의 일 구현예로 상기 바이오마커 항체는 리포아라비노만난(LAM) 항체일 수 있다.
본 발명의 일 구현예로 상기 마그네틱 비드는 카르복실기로 개질된 것일 수 있다.
본 발명의 일 구현예로 상기 마그네틱 비드는 아민기를 포함하는 화합물이 처리된 것일 수 있다.
본 발명의 일 구현예로 상기 아민기를 포함하는 화합물은 1-에틸-3-(3-디에틸아미노프로필)카르보디이미드일 수 있다,
본 발명의 일 구현예로 상기 마그네틱 비드는 표면의 비특이적 결합을 방지하기 위하여 소 혈청 알부민(BSA)이 처리된 것일 수 있다.
본 발명의 일 구현예로 상기 겨자무과산화수소(HRP) 태깅 압타머는 상기 바이오마커와 샌드위치 결합될 수 있다.
본 발명의 일 구현예로 상기 샌드위치 결합된 겨자무과산화수소(HRP) 태깅 압타머 및 상기 바이오마커는 3,3‘,5,5’-테트라메틸벤지딘(TMB) 용액의 처리에 의해 색 변화가 발생할 수 있다.
본 발명의 일 구현예로 상기 색 변화는 무색에서 파란색으로 변하는 것일 수 있다.
본 발명의 일 구현예로 상기 색 변화 여부에 의해 결핵을 진단할 수 있다.
본 발명의 일 구현예로 상기 색 변화가 파란색으로 변하는 경우에 결핵으로 진단할 수 있다.
본 발명의 일 구현예로 상기 겨자무과산화수소(HRP) 태깅 압타머는 상기 압타머와 상기 겨자무과산화수소(HRP)가 1 : 0.5~1.5의 중량비로 태깅된 것일 수 있다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 (a) 상기 결핵 진단용 조성물을 검체와 접촉시키는 단계; 및 (b) 상기 검체와 접촉시킨 결핵 진단용 조성물에 3,3‘,5,5’-테트라메틸벤지딘(TMB) 용액을 처리하여 색 변화를 관찰하는 단계를 포함하는, 바이오마커를 이용한 결핵 진단방법을 제공한다.
본 발명의 일 구현예로 상기 검체는 전혈, 혈청, 혈장, 가래, 소변, 흉수, 복수액, 뇌척수액 또는 기관지 폐포 세척액(brocho alveolar lavage)일 수 있다.
본 발명의 일 구현예로 상기 (a) 단계 후에 계면활성제로 세정하여, 결합이 되지 않은 겨자무과산화수소(HRP) 태깅 압타머를 제거하는 단계를 더 포함할 수 있다.
본 발명의 일 구현예로 상기 계면활성제는 트윈 20일 수 있다.
본 발명의 일 구현예로 상기 색 변화는 무색에서 파란색으로 변하는 것일 수 있다.
본 발명의 일 구현예로 상기 색 변화가 파란색으로 변하는 경우에 결핵으로 진단할 수 있다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 상기 결핵 진단용 조성물을 포함하는 바이오마커를 이용한 결핵 진단용 키트를 제공한다.
본 발명의 일 구현예로 상기 키트의 검출한계는 7.5~8.5 x 10-2 pg/mL일 수 있다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 (a) 카르복실기로 개질된 마그네틱 비드에 1-에틸-3-(3-디에틸아미노프로필)카르보디이미드를 처리하는 단계, (b) 상기 1-에틸-3-(3-디에틸아미노프로필)카르보디이미드가 처리된 개질 마그네틱 비드에 리포아라비노만난(LAM) 항체를 코팅하는 단계, (c) 상기 리포아라비노만난(LAM) 항체가 코팅된 개질 마그네틱 비드에 검체를 접촉시키는 단계, (d) 상기 검체와 접촉시킨 리포아라비노만난(LAM) 항체가 코팅된 개질 마그네틱 비드에 겨자무과산화수소(HRP) 태깅 압타머를 처리하여 샌드위치 결합을 유도하는 단계, 및 (e) 상기 (d) 단계의 결과물에 3,3‘,5,5’-테트라메틸벤지딘(TMB) 용액을 처리하여, 무색에서 파란색으로의 색 변화를 관찰하는 단계를 포함하는 바이오마커를 이용한 결핵 진단방법을 제공한다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 상기 결핵 진단용 조성물, 검체, 워싱 버퍼 및 3,3‘,5,5’-테트라메틸벤지딘(TMB) 용액을 주입하기 위한 챔버를 구비하는 샘플 모듈; 상기 샘플 모듈의 각 챔버와 연결되고, 하기 검출 모듈로 유체가 진행되는 컬럼, 말단에 위치하고 상기 조성물에 포함된 마이크로 비드를 농축하기 위한 자석, 및 가장자리에 위치하는 홀을 구비하는 반응 모듈; 베벨 기어 및 태엽 스프링을 구비하여, 상기 반응 모듈을 시간에 따라 회전 가능하게 하는 구동 모듈; 및 웨이스트 챔버 및 검출 챔버를 구비하는 검출 모듈을 포함하는 바이오마커를 이용한 결핵 진단용 카트리지를 제공한다.
본 발명의 상기 결핵 진단용 조성물 및 이를 이용한 결핵 진단방법은 측정단계가 간단하며 비색 기반 검출방식이기 때문에 추가적인 신호 리더기가 필요 없다는 장점과 함께, 기존 비색 기반 방식의 낮은 검출 한계(11 pg/mL) 보다 더 낮은 농도의 LAM 검출이 가능하다는 장점을 가지고 있어, 감염 의심자의 증상 발현전 초기 모니터링을 통해 결핵 감염의 유/무 확인 및 조기 치료를 가능하게 하여 현재의 판데믹 상황 종식에 기여할 수 있다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 LAM의 농축 및 비색 기반 신호 검출 어세이 단계별 모식도를 나타낸 것이다.
도 2a는 본 발명의 일 실시예에 따른 항체와 마그네틱 비드의 결합(conjugation) 모식도를 나타낸 것이다.
도 2b는 본 발명의 일 실시예에 따른 농도에 따른 결합 효율(conjugation efficiency)의 변화값을 나타낸 것이다.
도 3a는 본 발명의 일 실시예에 따른 HRP 태깅 압타머의 제작 개요를 나타낸 것이다.
도 3b는 본 발명의 일 실시예에 따른 압타머와 HRP 비에 따른 흡광도(absorbance)값 분석결과를 나타낸 것이다.
도 4a는 본 발명의 일 실시예에 따른 LAM-항체-마그네틱 비드에 결합한 압타머(Aptamer-LAM-Ab-MB)의 모식도를 나타낸 것이다.
도 4b는 본 발명의 일 실시예에 따른 HRP-압타머의 농도에 따른 흡광도의 변화를 나타낸 것이다.
도 5a는 본 발명의 일 실시예에 따른 소 혈청 알부민(BSA) 처리 시간에 따른 TMB 반응시의 색변화 정도를 나타낸 것이다.
도 5b는 본 발명의 일 실시예에 따른 TMB 반응시 색변화에 따른 흡광도의 차이를 나타낸 것이다.
도 6a는 본 발명의 일 실시예에 따른 사용한 워싱 버퍼(washing buffer)에 따른 TMB 반응시의 색변화 정도를 나타낸 것이다.
도 6b는 본 발명의 일 실시예에 따른 TMB 반응시 색변화에 따른 흡광도의 차이를 나타낸 것이다.
도 7a는 본 발명의 일 실시예에 따른 워싱 버퍼 변경 후 BSA 처리 시간에 따른 색 변화를 나타낸 것이다.
도 7b는 본 발명의 일 실시예에 따른 BSA 처리 시간에 따른 흡광도 변화 정도를 나타낸 것이다.
도 8은 본 발명의 일 실시예에 따른 TMB 반응 시간에 따른 색 변화 및 흡광도를 나타낸 것이다.
도 9a 및 도 9b는 본 발명의 일 실시예에 따른 검출 한계 조사 결과를 나타낸 것이다.
도 10은 본 발명의 일 실시예에 따른 리커버리 테스트 결과를 나타낸 것이다.
도 11은 본 발명의 일 실시예에 따른 결핵 진단용 카트리지의 이미지를 나타낸 것이다.
도 12는 본 발명의 일 실시예에 따른 결핵 진단용 카트리지의 구성도를 나타낸 것이다.
도 13은 본 발명의 일 실시예에 따른 결핵 진단용 카트리지를 이용하여 결핵을 진단하는 순서도를 나타낸 것이다.
도 2a는 본 발명의 일 실시예에 따른 항체와 마그네틱 비드의 결합(conjugation) 모식도를 나타낸 것이다.
도 2b는 본 발명의 일 실시예에 따른 농도에 따른 결합 효율(conjugation efficiency)의 변화값을 나타낸 것이다.
도 3a는 본 발명의 일 실시예에 따른 HRP 태깅 압타머의 제작 개요를 나타낸 것이다.
도 3b는 본 발명의 일 실시예에 따른 압타머와 HRP 비에 따른 흡광도(absorbance)값 분석결과를 나타낸 것이다.
도 4a는 본 발명의 일 실시예에 따른 LAM-항체-마그네틱 비드에 결합한 압타머(Aptamer-LAM-Ab-MB)의 모식도를 나타낸 것이다.
도 4b는 본 발명의 일 실시예에 따른 HRP-압타머의 농도에 따른 흡광도의 변화를 나타낸 것이다.
도 5a는 본 발명의 일 실시예에 따른 소 혈청 알부민(BSA) 처리 시간에 따른 TMB 반응시의 색변화 정도를 나타낸 것이다.
도 5b는 본 발명의 일 실시예에 따른 TMB 반응시 색변화에 따른 흡광도의 차이를 나타낸 것이다.
도 6a는 본 발명의 일 실시예에 따른 사용한 워싱 버퍼(washing buffer)에 따른 TMB 반응시의 색변화 정도를 나타낸 것이다.
도 6b는 본 발명의 일 실시예에 따른 TMB 반응시 색변화에 따른 흡광도의 차이를 나타낸 것이다.
도 7a는 본 발명의 일 실시예에 따른 워싱 버퍼 변경 후 BSA 처리 시간에 따른 색 변화를 나타낸 것이다.
도 7b는 본 발명의 일 실시예에 따른 BSA 처리 시간에 따른 흡광도 변화 정도를 나타낸 것이다.
도 8은 본 발명의 일 실시예에 따른 TMB 반응 시간에 따른 색 변화 및 흡광도를 나타낸 것이다.
도 9a 및 도 9b는 본 발명의 일 실시예에 따른 검출 한계 조사 결과를 나타낸 것이다.
도 10은 본 발명의 일 실시예에 따른 리커버리 테스트 결과를 나타낸 것이다.
도 11은 본 발명의 일 실시예에 따른 결핵 진단용 카트리지의 이미지를 나타낸 것이다.
도 12는 본 발명의 일 실시예에 따른 결핵 진단용 카트리지의 구성도를 나타낸 것이다.
도 13은 본 발명의 일 실시예에 따른 결핵 진단용 카트리지를 이용하여 결핵을 진단하는 순서도를 나타낸 것이다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명의 제1 구현예는 개질되고, 바이오마커 항체가 코팅된 마그네틱 비드; 및 겨자무과산화수소 태깅 압타머(HRP tagged aptamer)를 포함하는, 바이오마커를 이용한 결핵 진단용 조성물에 관한 것이다.
상기 바이오마커 항체는 리포아라비노만난(LAM) 항체일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 마그네틱 비드는 카르복실기로 개질될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 또한, 상기 마그네틱 비드는 아민기를 포함하는 화합물이 처리된 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에서, 상기 “아민기를 포함하는 화합물의 처리”는 항체를 마그네틱 비드 표면에 붙이기 위하여 링커 역할을 하는 아민기를 포함하는 화합물, 예컨대 1-에틸-3-(3-디에틸아미노프로필)카르보디이미드(EDC)를 항체와 마그네틱 비드가 포함된 반응용액에 첨가하는 것을 의미할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 아민기를 포함하는 화합물은 1-에틸-3-(3-디에틸아미노프로필)카르보디이미드일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 마그네틱 비드는 표면의 비특이적 결합을 방지하기 위하여, 소 혈청 알부민(BSA)이 추가적으로 처리될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에서, 상기 “소 형청 알부민(BSA)의 처리”는 마그네틱 비드 표면의 항체가 부착되지 않은 부위를 블로킹하기 위하여, 항체가 부착된 마그네틱 비드를 BSA 용액에 분산시켜 블로킹하는 것을 의미할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 겨자무과산화수소(HRP) 태깅 압타머는 상기 바이오마커와 샌드위치 결합될 수 있고, 상기 샌드위치 결합된 HRP 태깅 압타머 및 상기 바이오마커는 3,3‘,5,5’-테트라메틸벤지딘(TMB) 용액의 처리에 의해 색 변화가 발생할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 색 변화는 무색에서 파란색으로 변할 수 있고, 경우에 결핵으로 진단할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
HRP 태깅 압타머는 상기 압타머와 상기 HRP가 1 : 0.5~1.5의 중량비, 바람직하게는 1:1로 태깅될 수 있고, 이 경우에 HRP가 압타머에 가장 많이 붙을 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 제2 구현예는 (a) 상기 결핵 진단용 조성물을 검체와 접촉시키는 단계; 및 (b) 상기 검체와 접촉시킨 결핵 진단용 조성물에 3,3‘,5,5’-테트라메틸벤지딘(TMB) 용액을 처리하여 색 변화를 관찰하는 단계를 포함하는 바이오마커를 이용한 결핵 진단방법에 관한 것이다.
상기 검체는 전혈, 혈청, 혈장, 가래, 소변, 흉수, 복수액, 뇌척수액 또는 기관지 폐포 세척액(brocho alveolar lavage), 바람직하게는 소변일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 (a) 단계 후에 계면활성제로 세정하는 단계를 더 포함할 수 있는데, 상기 단계를 거침으로써 결합이 되지 않은 HRP 태깅 압타머를 제거할 수 있나, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 계면활성제는 Tween 20, Triton-X100 등을 포함할 수 있으나, 바람직하게는 Tween 20, 보다 바람직하게는 0.1 M PBS에 용해된 0.1% Tween 20(0.1% Tween 20 in 0.1 M PBS)을 사용할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 색 변화는 무색에서 파란색으로 변할 수 있고, 상기 색 변화가 파란색으로 변하는 경우에 결핵으로 진단할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 제3 구현예는 상기 결핵 진단용 조성물을 포함하는 바이오마커를 이용한 결핵 진단용 키트에 관한 것이다.
본 발명에 의한 상기 키트의 검출한계는 7.5~8.5 x 10-2 pg/mL, 바람직하게는 7.9~8.3 x 10-2 pg/mL, 보다 바람직하게는 8.1 x 10-2 pg/mL일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 제4 구현예는 (a) 카르복실기로 개질된 마그네틱 비드에 1-에틸-3-(3-디에틸아미노프로필)카르보디이미드를 처리하는 단계, (b) 상기 1-에틸-3-(3-디에틸아미노프로필)카르보디이미드가 처리된 개질 마그네틱 비드에 리포아라비노만난(LAM) 항체를 코팅하는 단계, (c) 상기 리포아라비노만난(LAM) 항체가 코팅된 개질 마그네틱 비드에 검체를 접촉시키는 단계, (d) 상기 검체와 접촉시킨 리포아라비노만난(LAM) 항체가 코팅된 개질 마그네틱 비드에 겨자무과산화수소(HRP) 태깅 압타머를 처리하여 샌드위치 결합을 유도하는 단계, 및 (e) 상기 (d) 단계의 결과물에 3,3‘,5,5’-테트라메틸벤지딘(TMB) 용액을 처리하여, 무색에서 파란색으로의 색 변화를 관찰하는 단계를 포함하는 바이오마커를 이용한 결핵 진단방법에 관한 것이다.
상기 마그네틱 비드는 표면의 비특이적 결합을 방지하기 위하여 소 혈청 알부민(BSA)을 처리하는 것이 바람직하고, 상기 HRP 태깅 압타머는 상기 압타머와 상기 HRP가 1 : 1의 중량비로 태깅되는 것이 바람직하지만, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 검체는 전혈, 혈청, 혈장, 가래, 소변, 흉수, 복수액, 뇌척수액 또는 기관지 폐포 세척액(brocho alveolar lavage), 바람직하게는 소변일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 TMB 용액을 처리하기 전에 트윈 20으로 세정하여, 결합이 되지 않은 HRP 태깅 압타머를 제거하는 것이 바람직하지만, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 제5 구현예는 상기 제1 구현예에 따른 결핵 진단용 조성물, 검체, 워싱 버퍼 및 3,3‘,5,5’-테트라메틸벤지딘(TMB) 용액을 주입하기 위한 챔버를 구비하는 샘플 모듈; 상기 샘플 모듈의 각 챔버와 연결되고, 하기 검출 모듈로 유체가 진행되는 컬럼, 말단에 위치하고 상기 조성물에 포함된 마이크로 비드를 농축하기 위한 자석, 및 가장자리에 위치하는 홀을 구비하는 반응 모듈; 베벨 기어 및 태엽 스프링을 구비하여, 상기 반응 모듈을 시간에 따라 회전 가능하게 하는 구동 모듈; 및 웨이스트 챔버 및 검출 챔버를 구비하는 검출 모듈을 포함하는 바이오마커를 이용한 결핵 진단용 카트리지에 관한 것이다.
도 11은 본 발명의 일 실시예에 따른 결핵 진단용 카트리지의 이미지, 도 12는 본 발명의 일 실시예에 따른 결핵 진단용 카트리지의 구성도를 나타낸 것이다.
도 12를 참조하여 상기 결핵 진단용 카트리지(100)를 상세히 설명하면 다음과 같다.
상기 샘플 모듈(110)은 상기 제1 구현예에 따른 결핵 진단용 조성물, 검체(소변), 워싱 버퍼 및 TMB 용액을 주입하기 위한 챔버를 구비할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 챔버는 상기 조성물, 검체, 워싱 버퍼 및 TMB 용액의 볼륨을 고려하여 설계되는 것이 바람직하다.
본 발명의 일 실시예에 따른 상기 샘플 모듈(110)의 전체 사이즈는 바람직하게는 40 X 20 mm (D X H), 상기 샘플 모듈(110)에 구비되는 각 챔버의 사이즈는 바람직하게는 40 X 20 mm (D X H))일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 반응 모듈(120)은 상기 샘플 모듈(110)의 각 챔버와 연결되고, 하기 검출 모듈(140)로 유체가 진행되는 컬럼, 말단에 위치하고 상기 조성물에 포함된 마이크로 비드를 농축하기 위한 자석(121), 및 가장자리에 위치하는 홀(122)을 구비할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 일 실시예에 따른 상기 반응 모듈(120)의 전체 사이즈는 바람직하게는 40 X 40 mm (D X H), 홀 사이즈는 바람직하게는 10 mm (R))일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 구동 모듈(130)은 베벨 기어 및 태엽 스프링으로 구성되어 상기 반응 모듈(120)을 시간에 따라 회전 가능할 수 있도록 설계될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 검출 모듈(140)은 웨이스트 챔버 및 검출 챔버로 구성될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 챔버는 검출 용액의 부피(예를 들면, 100㎕)를 고려하여 설계되는 것이 바람직하다.
본 발명의 일 실시예에 따른 상기 검출 모듈의 전체 사이즈는 바람직하게는 40 X 20 mm (D X H), 챔버의 사이즈는 40 X 20 mm (D X H)일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 결핵 진단용 카트리지(100)는 아래와 같은 순서로 구동될 수 있다.
먼저, 상기 제1 구현예에 따른 결핵 진단용 조성물과 샘플(검체)을 카트리지(100) 내에 주입한 후, 반응 모듈(120)을 90° 회전하여 워싱 버퍼를 이동시킴으로써, 상기 자석(121)에 농축된 마이크로 비드를 워싱하여 불순물을 제거할 수 있다.
그런 다음, 다시 반응 모듈(120)을 90° 회전하여 TMB 용액을 이동시킴으로써, 비색 변화가 시작될 수 있고, 다시 반응 모듈(120)을 90° 회전시켜 색상이 변화된 TMB 용액을 상기 검출 챔버(140)로 이동시켜 색상 변화를 분석함으로써, 결핵 진단을 할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
도 13은 본 발명의 일 실시예에 따른 결핵 진단용 카트리지를 이용하여 결핵을 진단하는 순서도를 나타낸 것이다.
이하, 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세히 설명한다. 그러나, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이에 제한되는 것은 아니다.
<실시예 1> LAM 검출을 위한 LAM 항원, 항체, 압타머 조사 및 실험 설계
우선 LAM 검출 기법 개발을 위해 필요한 재료 및 구매 가능한 회사에 대하여 조사를 진행하였으며, 해당 내역은 하기 표 1과 같다.
| 재료 | 구입처 |
| LAM 항원 | BEI resource |
| LAM 항체 | BEI resource |
| LAM 압타머 | Bioneer |
| 스텝타타비딘-HRP 콘쥬게이트 | Thermofisher Scientific |
| 인공 소변 | Biochemazone TM |
| TMB 용액 | Signa Aldrich |
상기 LAM 압타머의 경우 현재까지 보고된 LAM 용 서열 중, 사람을 감염시키는 MTB H37Rv에서 나온 LAM을 타겟으로 제작된 ZXL1(5’- GGCGCCATAGCGACGGGG CCATTCCAAGAA-3’)을 사용하였다.
또한 촉매반응을 일으킬수 있는 HRP를 압타머에 직접적으로 태그가 불가능하여, 이에 대한 대안으로 압타머 3‘ 말단에 비오틴(biotin)을 부착하여 이후 스텝타타비딘-비오틴(streptavidin-biotin) 결합을 통하여 HRP 태깅을 진행하였다.
해당 재료들을 사용하여 비색 기반 신호를 볼 수 있는 모식도를 제작하였으며, 상기 모식도는 도 1과 같다. 도 1을 참조하여 비색 기반 신호를 볼 수 있는 모식도를 설명하면 다음과 같다.
먼저 표면에 카르복실기가 처리된 마그네틱 비드(MB)에 1-에틸-3-(3-디에틸아미노프로필)카르보디이미드(EDC) 처리를 통하여 단백질 표면에 발현된 아민기가 펩타이드 결합을 통하여 붙을 수 있게 한 후, 해당 원리를 이용하여 LAM 항체를 처리하였다.
이후 LAM을 처리하여 포획을 진행한 후, LAM 분자에 HRP가 달린 압타머를 처리하여 샌드위치 결합을 유도하였다.
마지막으로 TMB 용액을 처리하여 타겟이 존재할 경우, HRP 촉매반응으로 인하여 TMB가 oxTMB로 바뀌게 되고, 이로 인하여 파란색으로 변하는 색상을 통하여 LAM의 검출 여부 및 농도 정량이 가능하게 된다.
<실시예 2> 항체의 마그네틱 비드 표면 부착 조건 선정
1차로 항체를 마그네틱 비드(MB) 표면상에 부착시키는 조건에 대한 실험을 진행하였다.
마그네틱 비드 표면에 항체 개수가 많을수록 LAM을 검출할 수 있는 효율이 높아지기 때문에, 적정 처리 농도에 대한 실험을 진행하였다.
우선 0.1~0.8 mg/mL의 항체를 농도별로 마그네틱 비드와 반응시킨 후, Nanodrop2000을 이용하여 항체 결합 반응 후에 상층액을 추출하여 결합하지 않은 항체의 흡광도 값을 측정하였다.
그 다음 결합 효율(conjugation efficiency) (%) 값을 아래와 같은 식으로 계산하였다.
도 2a는 항체와 마그네틱 비드의 결합(conjugation) 모식도를 나타낸 것이고, 도 2b는 농도에 따른 결합 효율(conjugation efficiency)의 변화값을 나타낸 것이다.
도 2b에서 보는 바와 같이, 시험 결과 초기 농도의 흡광도 값과 비교하여 결합 효율 값을 산출하였을 때, 0.4mg/mL 농도의 항체 처리 이후의 효율 값이 마그네틱 비드와의 결합 효율이 가장 높았으며(85%), 추후 항체-마그네틱 비드(Ab-MB) 결합을 상기의 농도 처리를 통해 진행하였다.
<실시예 3> HRP-압타머 제작 조건 확립 및 최적 HRP-압타머 농도 선택
비오틴이 결합된 LAM 압타머에 HRP 스트렙트타비딘(streptavidin)을 반응시켜 HRP가 부착된 형태의 압타머를 제작하는 작업을 진행하였다.
실험 조건을 0.1 ng/mL LAM, 10 μg/mL LAM 압타머, 5, 10, 20 μg/mL HRP-스트렙타비딘으로 설정한 다음, 압타머와 HRP-스트렙타비딘의 비율별로 반응시킨 후, Nanodrop2000을이용하여 280 nm 파장대의 단백질(HRP)의 흡광도 측정을 통하여, LAM-Ab-MB에 처리하여 나오는 흡광도 값을 비교한 결과를 도 3a 및 도 3b에 나타내었다.
도 3a는 HRP 태깅 압타머의 제작 개요를 나타낸 것이고, 도 3b는 압타머와 HRP 비에 따른 흡광도(absorbance)값 분석결과를 나타낸 것이다.
실험 결과, 도 3b에서 보는 바와 같이, 1:1 비율로 반응 시 가장 높은 흡광도 값, 즉 HRP가 가장 많이 붙는 것을 확인하였으며, 추후 1:1로 반응시킨 HRP 결합 압타머를 이용하여 실험을 진행하였다.
다음으로는 HRP-압타머의 농도에 따른 LAM-Ab-MB로의 결합효율 분석을 진행하였다.
처리되는 HRP-압타머 농도를 2, 20, 200, 2000 ng/mL로 설정한 후, 반응 직후의 absorbance (280nm) 측정을 통하여 마그네틱 비드 표면에 결합한 단백질 (HRP)을 정량한 결과를 도 4a 및 도 4b에 나타내었다.
도 4a는 LAM-항체-마그네틱 비드에 결합한 압타머(Aptamer-LAM-Ab-MB)의 모식도를 나타낸 것이고, 도 4b는 HRP-압타머의 농도에 따른 흡광도의 변화를 나타낸 것이다.
실험 결과, 도 4b에서 보는 바와 같이, 200 ng/mL 농도까지는 흡광도 값이 증가함을 확인했으나, 그 이상의 농도 구간인 2000 ng/mL에서는 감소함을 알 수 있다. 이는 고농도에서 HRP-압타머 간의 입체 장애(steric hindrance)가 강하게 작용하여 LAM-Ab-MB로의 결합을 방해한 것으로 판단된다.
해당 결과를 바탕으로 HRP-압타머 사용량을 200 ng/mL로 고정하여 추후 실험을 진행하였다.
<실시예 4> 노이즈 최소화 방법 및 최적 TMB 반응 시간 선정
블랭크 샘플을 이용하여 TMB 반응을 진행할 때, 마그네틱 비드에 비특이적으로 흡착하거나, 제대로 세정(washing)이 되지않아 남아 있는 HRP-압티머로 인하여, 블랭크 샘플 내에서도 색변화가 일어나는 것을 방지하기 위한 실험을 진행하였다.
1차로 BSA(1%) 처리 시간에 따른 노이즈(noise) 변화 정도를 조사하였다. 15, 30, 45, 60 분 동안 BSA를 처리한 후 TMB 반응을 진행하여 색변화 및 650 nm 파장대에서 흡광도 값을 측정한 결과를 도 5a 및 도 5b에 나타내었다.
도 5b에서 보는 바와 같이, 실험결과 시간이 지남에 따라 색깔이 옅어지며, 흡광도 값이 감소함을 확인하였으나, 색변화가 나타나는 것은 해결이 되지 않았다. 이에 워싱 버퍼(washing buffer)에 대한 추가적인 조사를 한 후, 이에 대한 효용성 실험을 진행하였다.
60분 동안 BSA 처리를 한 다음, 3 종류의 워싱 버퍼(0.1 M PBS, 0.05 % Triton-X100 in 0.1M PBS, 0.1 % Tween 20 in 0.1M PBS) (Biotechnol Appl Biochem. 66(4), 586-590 (2019), Anal. Chem.88, 8596-8603 (2016)) 를 이용하여 세정을 진행한 후 20분간 TMB 반응을 진행하였다.
이후 반응물을 Nanodrop 2000을 이용하여 650 nm 파장대의 흡광도 값을 측정한 결과를 도 6a 및 도 6b에 나타내었다.
실험 결과, 도 6b에서 보는 바와 같이, 세정 단계에서 계면활성제(detergent)를 사용한 버퍼가 노이즈 값을 매우 낮춰줌을 확인하였고, 그 중에서 0.1 M PBS에 용해된 0.1% 트윈 20(0.1% Tween 20 in 0.1 M PBS)가 가장 효율이 좋음을 확인하고, 해당 용액을 세정용으로 고정한 후 뒤의 실험을 진행하였다.
마지막으로 워싱 버퍼를 0.1% Tween 20으로 변경한 후에 적정 BSA 처리 시간 분석을 진행하였다.
앞에서 진행한 BSA 처리 조건인 15, 30, 45, 60 min 동안 BSA를 처리한 다음, 변경된 워싱 버퍼를 이용하여 20분 동안 TMB 반응을 진행하였고, 이후 반응 용액의 흡광도 측정을 진행하여 비교한 결과를 도 7a 및 도 7b에 나타내었다.
실험 결과, 도 7a에서 보는 바와 같이 색 변화적인 부분은 거의 차이가 나지 않는 것을 확인하였으며, 도 7b에서 보는 바와 같이 흡광도 값의 경우 30분 이후부터 오차 범위 안의 값들이 측정됨을 확인하였다. 이에 BSA 블로킹 시간을 30분으로 고정시켰다.
다음으로는 TMB 비색 변화 반응시 시간별 변화 정도를 분석하여 최적 반응시간 선정 실험을 진행하였다. 5, 10, 15, 20분으로 TMB 반응 시간을 선정하여 실험을 진행하였으며, 블랭크 값, 1 pg/mL, 1 ng/mL 의 LAM으로 총 3개 농도 구간으로 각 구간별 차이를 분석한 결과를 도 8에 나타내었다.
실험 결과, 도 8에서 보는 바와 같이, 5분에서 가장 큰 색상 및 흡광도 차이가 나타나는 것을 확인하였으며, 반응시간이 길어질수록 그 차이가 줄어듦을 확인하였다.
<실시예 5> 검출 한계 조사
본 발명의 일 실시예에 따른 카르복실기로 개질되고, LAM 항체가 코팅된 마그네틱 비드, 및 HRP 태깅 압타머를 포함하는 결핵 진단용 조성물을 이용하여 1.0 × 10-1 ~ 1.0 × 10-4 pg/mL의 동적 영역(dynamic range)에서 검출 한계를 조사한 결과를 도 9a 및 도 9b에 나타내었다.
도 9a 및 도 9b에서 보는 바와 같이, 본 발명의 일 실시예에 따른 결핵 진단용 조성물은 8.1 × 10-2 pg/mL의 검출 한계를 갖음을 확인할 수 있다.
<실시예 6> 리커버리 테스트
본 발명의 일 실시예에 따른 카르복실기로 개질되고, LAM 항체가 코팅된 마그네틱 비드, 및 HRP 태깅 압타머를 포함하는 결핵 진단용 조성물의 실제 적용 가능성을 알아보기 위하여, 결핵 환자의 소변 내에서 검출되는 LAM을 인공 소변에 스파이킹하여 검출을 진행한 결과를 도 10에 나타내었다.
검출 결과, 도 10에서 보는 바와 같이, 약 80~120%의 리커버리 값을 갖는 것을 확인할 수 있다. 상기의 결과로부터 소변과 같은 여러 성분이 들어 있는 용매 내에서도 정확하게 작동함을 확인할 수 있다.
이상으로 본 발명의 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시예일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다.
따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다. 본 발명의 단순한 변형 내지 변경은 이 분야의 통상의 지식을 가진 자에 의하여 용이하게 이용될 수 있으며, 이러한 변형이나 변경은 모두 본 발명의 영역에 포함되는 것으로 볼 수 있다.
100 : 결핵 진단용 카트리지
110 : 샘플 모듈
120 : 반응 모듈
121 : 자석
122 : 홀
130 : 구동 모듈
140 : 검출 모듈
110 : 샘플 모듈
120 : 반응 모듈
121 : 자석
122 : 홀
130 : 구동 모듈
140 : 검출 모듈
Claims (22)
- 개질되고, 바이오마커 항체가 코팅된 마그네틱 비드; 및
겨자무과산화수소(HRP) 태깅 압타머를 포함하는, 바이오마커를 이용한 결핵 진단용 조성물.
- 제1항에 있어서, 상기 바이오마커 항체는 리포아라비노만난(LAM) 항체인 것을 특징으로 하는 바이오마커를 이용한 결핵 진단용 조성물.
- 제1항에 있어서, 상기 마그네틱 비드는 카르복실기로 개질된 것을 특징으로 하는 바이오마커를 이용한 결핵 진단용 조성물.
- 제1항에 있어서, 상기 마그네틱 비드는 아민기를 포함하는 화합물이 처리된 것을 특징으로 하는 바이오마커를 이용한 결핵 진단용 조성물.
- 제1항에 있어서, 상기 아민기를 포함하는 화합물은 1-에틸-3-(3-디에틸아미노프로필)카르보디이미드인 것을 특징으로 하는 바이오마커를 이용한 결핵 진단용 조성물.
- 제1항에 있어서, 상기 마그네틱 비드는 표면의 비특이적 결합을 방지하기 위하여 소 혈청 알부민(BSA)이 처리된 것을 특징으로 하는 바이오마커를 이용한 결핵 진단용 조성물.
- 제1항에 있어서, 상기 겨자무과산화수소(HRP) 태깅 압타머는 상기 바이오마커와 샌드위치 결합되는 것을 특징으로 하는 바이오마커를 이용한 결핵 진단용 조성물.
- 제7항에 있어서, 상기 샌드위치 결합된 겨자무과산화수소(HRP) 태깅 압타머 및 상기 바이오마커는 3,3‘,5,5’-테트라메틸벤지딘(TMB) 용액의 처리에 의해 색 변화가 발생하는 것을 특징으로 하는 바이오마커를 이용한 결핵 진단용 조성물.
- 제8항에 있어서, 상기 색 변화는 무색에서 파란색으로 변하는 것을 특징으로 하는 바이오마커를 이용한 결핵 진단용 조성물.
- 제8항에 있어서, 상기 색 변화 여부에 의해 결핵을 진단하는 것을 특징으로 하는 바이오마커를 이용한 결핵 진단용 조성물.
- 제8항에 있어서, 상기 색 변화가 파란색으로 변하는 경우에 결핵으로 진단하는 것을 특징으로 하는 바이오마커를 이용한 결핵 진단용 조성물.
- 제1항에 있어서, 상기 겨자무과산화수소(HRP) 태깅 압타머는 상기 압타머와 상기 겨자무과산화수소(HRP)가 1 : 0.5~1.5의 중량비로 태깅된 것을 특징으로 하는 바이오마커를 이용한 결핵 진단용 조성물.
- (a) 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항의 결핵 진단용 조성물을 검체와 접촉시키는 단계; 및
(b) 상기 검체와 접촉시킨 결핵 진단용 조성물에 3,3‘,5,5’-테트라메틸벤지딘(TMB) 용액을 처리하여 색 변화를 관찰하는 단계를 포함하는, 바이오마커를 이용한 결핵 진단방법.
- 제13항에 있어서, 상기 검체는 전혈, 혈청, 혈장, 가래, 소변, 흉수, 복수액, 뇌척수액 또는 기관지 폐포 세척액(brocho alveolar lavage)인 것을 특징으로 하는 바이오마커를 이용한 결핵 진단방법.
- 제13항에 있어서, 상기 (a) 단계 후에 계면활성제로 세정하여, 결합이 되지 않은 겨자무과산화수소(HRP) 태깅 압타머를 제거하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 바이오마커를 이용한 결핵 진단방법.
- 제15항에 있어서, 상기 계면활성제는 트윈 20인 것을특징으로 하는 바이오마커를 이용한 결핵 진단방법.
- 제13항에 있어서, 상기 색 변화는 무색에서 파란색으로 변하는 것을 특징으로 하는 바이오마커를 이용한 결핵 진단방법.
- 제13항에 있어서, 상기 색 변화가 파란색으로 변하는 경우에 결핵으로 진단하는 것을 특징으로 하는 바이오마커를 이용한 결핵 진단방법.
- 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항의 결핵 진단용 조성물을 포함하는, 바이오마커를 이용한 결핵 진단용 키트.
- 제19항에 있어서, 상기 키트의 검출한계는 7.5~8.5 x 10-2 pg/mL인 것을 특징으로 하는 바이오마커를 이용한 결핵 진단용 키트.
- (a) 카르복실기로 개질된 마그네틱 비드에 1-에틸-3-(3-디에틸아미노프로필)카르보디이미드를 처리하는 단계;
(b) 상기 1-에틸-3-(3-디에틸아미노프로필)카르보디이미드가 처리된 개질 마그네틱 비드에 리포아라비노만난(LAM) 항체를 코팅하는 단계;
(c) 상기 리포아라비노만난(LAM) 항체가 코팅된 개질 마그네틱 비드에 검체를 접촉시키는 단계;
(d) 상기 검체와 접촉시킨 리포아라비노만난(LAM) 항체가 코팅된 개질 마그네틱 비드에 겨자무과산화수소(HRP) 태깅 압타머를 처리하여 샌드위치 결합을 유도하는 단계; 및
(e) 상기 (d) 단계의 결과물에 3,3‘,5,5’-테트라메틸벤지딘(TMB) 용액을 처리하여, 무색에서 파란색으로의 색 변화를 관찰하는 단계를 포함하는, 바이오마커를 이용한 결핵 진단방법.
- 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항의 결핵 진단용 조성물, 검체, 워싱 버퍼 및 3,3‘,5,5’-테트라메틸벤지딘(TMB) 용액을 주입하기 위한 챔버를 구비하는 샘플 모듈;
상기 샘플 모듈의 각 챔버와 연결되고, 하기 검출 모듈로 유체가 진행되는 컬럼, 말단에 위치하고 상기 조성물에 포함된 마이크로 비드를 농축하기 위한 자석, 및 가장자리에 위치하는 홀을 구비하는 반응 모듈;
베벨 기어 및 태엽 스프링을 구비하여, 상기 반응 모듈을 시간에 따라 회전 가능하게 하는 구동 모듈; 및
웨이스트 챔버 및 검출 챔버를 구비하는 검출 모듈을 포함하는, 바이오마커를 이용한 결핵 진단용 카트리지.
Priority Applications (2)
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| KR1020220011475A KR20230115014A (ko) | 2022-01-26 | 2022-01-26 | 바이오마커를 이용한 결핵 진단용 조성물, 이를 이용한 결핵 진단방법 및 키트 |
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|---|---|---|---|
| KR1020220011475A KR20230115014A (ko) | 2022-01-26 | 2022-01-26 | 바이오마커를 이용한 결핵 진단용 조성물, 이를 이용한 결핵 진단방법 및 키트 |
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2023
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Non-Patent Citations (2)
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| PLoS One. 2019 Apr 18;14(4):e0215443 |
| The Korean Journal of Medicine: Vol. 82, No. 3, 2012 |
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