ES2343474T3 - Procedimiento de deteccion de las formas proteicas circulantes de agregacion utilizando un agente de agregacion de las formas proteicas circulantes de agregacion y un agente de captura de los agregados formados. - Google Patents

Abstract

Procedimiento de detección de al menos una forma proteica circulante de agregación (FCPA) vinculada a las enfermedades neurodegenerativas no infecciosas en una muestra biológica de origen humano susceptible de contener dichas FCPA, conteniendo dichas FCPA: a) aminoácidos cuyas cadenas laterales tienen todas una función ácida o una función aceptora de puentes de hidrógeno y que estén presentes globalmente al menos 4 veces en una secuencia peptídica de longitud inferior o igual a 20 aminoácidos y b) un mínimo de tres aminoácidos básicos en una secuencia peptídica de longitud inferior o igual a quince aminoácidos, caracterizado porque emplea un agente 1 no proteico que produce la agregación de las formas circulantes de las proteínas no infecciosas implicadas en procesos de agregación patológica del sistema nervioso central, que se selecciona entre rifampicina, isoniazida, etambutol, trietilentetraamina, bis-3-aminopropilamina, tetraclorhidrato de espermina, sesquisulfato de dihidroestreptomicina y estreptomicina y un agente II no proteico de captura de los agregados naturales de FCPA o inducidos por dichos agentes I, que es un metaciclofano o un glucosaminoglucano, y porque realiza la revelación de la presencia de dichas FCPA.

Description

Procedimiento de detección de las formas proteicas circulantes de agregación utilizando un agente de agregación de las formas proteicas circulantes de agregación y un agente de captura de los agregados formados.

La presente invención se refiere al campo de las enfermedades neurodegenerativas reconocidas como no infecciosas actualmente, y en particular a un procedimiento de detección de las formas proteicas circulantes de agregación vinculadas a estas enfermedades.

El crecimiento de las enfermedades vinculadas al envejecimiento afecta cada vez más a nuestras poblaciones cuya media de edad ha crecido fuertemente durante el último siglo. Algunas de estas enfermedades afectan al cerebro y parecen afectar a todas las funciones cognitivas. Los ataques contra las funciones sensoriomotrices también pueden ser importantes en algunas de estas enfermedades. Estas son las enfermedades llamadas neurodegenerativas reconocidas como no infecciosas actualmente, tales como la enfermedad de Parkinson, enfermedad de Alzheimer, tauopatías, demencias con cuerpos de Lewy, enfermedad de Huntington y demencias vasculares.

De este modo, por ejemplo, más de 25 millones de personas en el mundo padecen enfermedad de Alzheimer. En Francia, casi 800.000 personas están afectadas por la enfermedad de Alzheimer o por enfermedades emparentadas. Además, el envejecimiento demográfico de la población se acentúa y conducirá a un aumento de este número. Ya se cuentan cerca de 165.000 nuevos enfermos al año. La enfermedad de Alzheimer representa la cuarta causa de mortalidad, después de las afecciones cardiovasculares, los cánceres y los accidentes cerebrovasculares (ACV). Esta demencia neurodegenerativa conduce progresiva e irreversiblemente a la pérdida de la memoria (amnesia) y de las funciones cognitivas (afasia, apraxia, agnosia).

Como la enfermedad de Alzheimer, las principales enfermedades neurodegenerativas no infecciosas se caracterizan por depósitos extracelulares y/o intracelulares constituidos por proteínas no infecciosas que pueden estar presentes en forma circulante (formas proteicas circulantes de agregación o FPCA) y están implicadas en procesos de agregación patológica del sistema nervioso central. Estas proteínas pueden experimentar modificaciones conformacionales espontáneas, inducidas por co-factores o enzimas, o también por mutaciones genéticas que favorecen su agregación espontánea en forma de depósitos proteicos; estas modificaciones conllevan una acumulación en diferentes zonas cerebrales según el tipo de proteína y según las circunstancias fisiopatológicas (El-Agnaf O et al., 2003, Lancet Neurol, 2: 461-462).

De este modo, en el caso de la enfermedad de Alzheimer, las proteínas agregadas son principalmente la proteína Tau y fragmentos de la proteína APP (Proteína Precursora de Amiloide, [Amyloid Precursor Protein]), los péptidos beta-amiloides (beta 1-40, beta 1-41, beta 1-42, por ejemplo). La proteína Tau también está asociada a las tauopatías, demencias no de tipo Alzheimer asociadas a depósitos de proteína Tau agregada en el cerebro en ausencia de proteína beta-amiloide. La proteína APP y/o sus fragmentos peptídicos beta-amiloides también están asociados a las demencias vasculares, caracterizadas por depósitos perivasculares de agregados amiloides. En el caso de la enfermedad de Parkinson, caracterizada por una degeneración neuronal a nivel de los núcleos grises centrales, una proteína asociada es la Parkina, particularmente para las formas familiares, así como la alfa-sinucleína. Esta última también está implicada en la demencia de Parkinson que puede sobrevenir en añadidura de los trastornos sensoriomotrices. La alfa-sinucleína también está asociada a las demencias con cuerpos de Lewy. Estas últimas se caracterizan por un depósito de proteína alfa-sinucleína agregada, particularmente en zonas de la corteza frontal, lo que genera una degeneración neuronal con afectación de las funciones cognitivas que desemboca en un síndrome demencial. En el caso de la enfermedad de Huntington, la proteína agregante es la Huntingtina. De este modo, este fenómeno de depósitos cerebrales de agregados proteicos neurotóxicos se encuentra en la mayor parte de las enfermedades neurodegenerativas pero, al contrario que las enfermedades llamadas "con priones", las proteínas asociadas a las enfermedades neurodegenerativas no presentan propiedades infecciosas y no son, por lo tanto, transmisibles. En efecto, las proteínas "Prión" son los agentes vectores de las encefalopatías espongiformes transmisibles y, mediante inyección de estos priones patógenos aislados en individuos enfermos, puede transmitirse la enfermedad; esto también es válido para las enfermedades con priones de origen genético, como la enfermedad de Gertsmann-Straüssler-Scheinker (GSS), cuyo prión patológico es iniciado por las mutaciones genéticas del huésped pero cuya proteína patológica, una vez formada, adquiere las propiedades infecciosas propias de las enfermedades con priones (Lantos PL., 1992, Histopathology, 20(1): 1-11). Las "enfermedades con priones" resultan del crecimiento progresivo de la cantidad de proteína prión patógena en el individuo inoculado o contaminado con estas últimas, o también portador de mutaciones genéticas capaces de iniciar la conversión patológica de la proteína normal, creando de este modo una "infección endógena".

Las proteínas asociadas a las enfermedades neurodegenerativas no infecciosas se diferencian particularmente de estas últimas por su incapacidad para transmitir la enfermedad mediante inyección sistémica a un individuo sano. Del mismo modo, ningún elemento tisular procedente de estas enfermedades neurodegenerativas no infecciosas ha podido transmitir la enfermedad, lo que excluye que estas últimas sean enfermedades infecciosas, al contrario que las enfermedades con priones.

El diagnóstico actual de estas enfermedades neurodegenerativas no infecciosas se basa generalmente en la formación de imágenes, que completa el examen clínico y neuropsicológico. Éste es un procedimiento pesado y costoso que requiere varias etapas de diagnóstico, no realizándose ninguna sobre una muestra biológica. En algunos casos, una mutación de origen genético es el origen de la agregación anormal de una de estas proteínas, es posible un diagnóstico genético a nivel de las secuencias de ADN, pero esto sigue siendo poco frecuente respecto a las formas "no genéticas".

Un diagnóstico de estas enfermedades más fácil y rápido es, por lo tanto, necesario. El diagnóstico en muestras biológicas de ser humano se ha vuelto, por lo tanto, de extrema importancia. Particularmente, su detección inmunológica permitiría un diagnóstico más sencillo, incluso más precoz, con un ahorro evidente sobre las conductas terapéuticas a iniciar antes de la extensión de las lesiones (El-Agnaf O et al., 2003, supra).

Varios equipos se han sumado a los esfuerzos para conseguir dicha detección en muestras biológicas. De este modo, la solicitud de patente EP 713 095 describe el diagnóstico en el líquido cefalorraquídeo (LCR) de un paciente afectado por la enfermedad de Alzheimer mediante medición de la cantidad de un péptido \beta-amiloide, opcionalmente en asociación con la medición de la cantidad de la proteína Tau, y comparación con un valor predeterminado. Este método tiene el inconveniente que solamente se ha demostrado para el LCR y que la detección de péptido \beta-amiloide debe completarse en éste mediante una dosificación de proteína Tau, para mejorar la especificidad del test (Sjogren M et al., 2003, Clin Chim Acta, 332: 1-10).

Actualmente no existe ningún diagnóstico biológico rutinario sanguíneo para estas enfermedades neurodegenerativas no infecciosas. Por ejemplo, la proteína Tau es difícil de detectar en la sangre, ya que solamente se produce en las neuronas y se encuentra muy diluida en la sangre, después del paso por el LCR. Además, en este último, la proteína Tau es más o menos bien detectada por los ensayos existentes. El empleo de la dosificación de la proteína APP y de sus fragmentos circulantes, entre los cuales la proteína precursora, puede producirse en las plaquetas sanguíneas, sigue siendo problemático ya que muchas FPCA están unidas a proteínas plasmáticas que pueden enmascarar epítopos y, de este modo, hacerles indetectables y/o no capturables por anticuerpos dirigidos contra estos mismos epítopos. Por lo tanto, no es posible, ya que los epítopos enmascarados son aquellos que reconocen a los anticuerpos utilizados, utilizar procedimientos inmunoenzimáticos convencionales de tipo "ELISA sándwich". Además, los anticuerpos son proteínas muy grandes que no pueden acceder a sitios moleculares de las FPCA, si éstos están internalizados en una red tridimensional como es el caso en las formas agregadas y en las formas asociadas a ligandos plasmáticos. Solamente pequeñas moléculas pueden interactuar con un mayor número de proteínas en estas FPCA agregadas, mientras que los anticuerpos detectarán más fácilmente las formas libres no agregadas y no asociadas a ligandos plasmáticos, es decir la fracción más fisiológica de estas proteínas asociadas a las enfermedades neurodegenerativas. De este modo, una fracción variable y cuyo nivel significativo sigue siendo inverificable debido a esto, no puede dosificarse mediante los ensayos inmunológicos convencionales (Kuo Y et al., 2000, Biochem Biophys Res Commun, 268: 750-756).

Es por esto que los métodos de la técnica anterior se enfrentan sin cesar a la dificultad de capturar, de concentrar y/o de detectar las formas solubles y/o circulantes de las proteínas asociadas a las patologías neurodegenerativas no infecciosas. A veces se prevén métodos adaptados a cada tipo de proteína pero, además de que son difícilmente transponibles a ensayos rutinarios a gran escala, estos no permiten emplear un método único y común para todas estas proteínas, o para un número suficiente de proteínas que sería aceptable en diagnóstico (Kuo Y et al., 2000, supra).

Un método capaz de recoger estas proteínas, de separarlas de los fluidos biológicos sin pasar por un reconocimiento de anticuerpos, y a continuación opcionalmente de tratarlas para disociar los eventuales ligandos en condiciones compatibles con su inmovilización sobre superficies adaptadas a los ensayos inmunoenzimáticos y, a continuación, de identificarlas finalmente con anticuerpos, permitiría realizar una detección eficaz y comparable de estas diferentes proteínas. Dichas condiciones podrían permitir un aislamiento más eficaz de la totalidad de estas proteínas y de sus diferentes formas circulantes, con una interpretación homogénea de las dosificaciones que correlaciona mejor los parámetros bioclínicos reales, y por lo tanto los diagnósticos respectivos de estas enfermedades.

La patente US 6 365 414 describe un procedimiento in vitro que permite la detección de la formación de péptidos beta-amiloides, y que utiliza cationes de metales pesados tales como el zinc. Sin embargo, debido al reducido número de sitios de fijación del zinc en las proteínas, esta técnica no permite agregar y concentrar los péptidos beta-amiloides formando redes multimoleculares sedimentables mediante centrifugado a baja velocidad.

La solicitud de patente WO 03/073106 describe un procedimiento de unión selectiva de las formas patológicas de las proteínas prión, amiloide y Tau. En particular, la captura de la forma agregada de la proteína Tau por el dextrán sulfato se describe en uno de los ejemplos de esta solicitud. Este documento no menciona la utilización de un agente de agregación y el dextrán sulfato no pertenece ni a la familia de los glucosaminoglucanos ni a la de las moléculas macrocíclicas.

La solicitud de patente WO2004059321 describe un procedimiento de detección de la proteína prión utilizando un aminoglucósido para precipitar la proteína.

Los presenten inventores han demostrado ahora, contra todo pronóstico, que la utilización de un agente I no proteico que produce la agregación de las formas circulantes de las proteínas no infecciosas implicadas en procesos de agregación patológica del sistema nervioso central seleccionado entre rifampicina, isoniazida, etambutol, trietilentetraamina (TET), bis-3-aminopropilamina, tetraclorhidrato de espermina, sesquisulfato de dihidroestreptomicina y estreptomicina y/o de un agente II no proteico de captura de los agregados naturales de FPCA o inducidos por dichos agentes I que es un metaciclofano o un glucosaminoglucano, en un ensayo para el diagnóstico de las formas proteicas circulantes de agregación (FPCA) vinculadas a las enfermedades neurodegenerativas no infecciosas, permitía la detección, de acuerdo con un único método, de estas forma proteicas, a diluciones y en condiciones en las que no son detectables con los métodos utilizados actualmente. La utilización de estos dos agentes en solitario o en combinación puede mejorar claramente, pero en todo caso no impide, la capacidad de unión de las formas proteicas de agregación a un socio de unión específico de estas formas proteicas de agregación, utilizado en el ensayo de diagnóstico.

La presente invención tiene por objeto un procedimiento de detección de al menos una FPCA vinculada a las enfermedades neurodegenerativas no infecciosas en una muestra biológica de origen humano susceptible de contener dichas FPCA, conteniendo dichas FPCA:

a)

aminoácidos cuyas cadenas laterales tienen una función ácida o una función aceptora de puentes de hidrógeno y que están presentes globalmente al menos 4 veces en una secuencia peptídica de longitud inferior o igual a 20 aminoácidos y

b)

un mínimo de 3 aminoácidos básicos en una secuencia peptídica de longitud inferior o igual a quince aminoácidos

caracterizado porque emplea un agente I no proteico que produce la agregación de las formas circulantes de las proteínas no infecciosas implicadas en procesos de agregación patológica del sistema nervioso central que se selecciona entre rifampicina, isoniazida, etambutol, trietilentetraamina (TET), bis-3-aminopropilamina, tetraclorhidrato de espermina, sesquisulfato de dihidroestreptomicina y estreptomicina y un agente II no proteico de captura de los agregados naturales de FPCA o inducidos por dichos agentes I, que es un metaciclofano o un glucosaminoglucano, y que realiza la revelación de la presencia de dichas FPCA.

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La presente invención también tiene por objeto un procedimiento de detección de al menos una FPCA vinculada a las enfermedades neurodegenerativas no infecciosas, conteniendo dichas FPCA aminoácidos cuyas cadenas laterales tienen una función ácida o una función aceptora de puentes de hidrógeno y que están presentes globalmente al menos 4 veces en una secuencia peptídica de longitud inferior o igual a 20 aminoácidos,

caracterizado porque comprende la etapa de puesta en contacto de una muestra biológica, procedente u obtenida de un organismo humano, con un agente I no proteico tal como se ha definido anteriormente y porque realiza la revelación de la presencia de dichas FPCA.

La invención también se refiere a la utilización de un kit de diagnóstico que comprende un agente I no proteico que produce la agregación de las formas circulantes de las proteínas no infecciosas implicadas en procesos de agregación patológica del sistema nervioso central y eventualmente un agente II no proteico de captura de los agregados naturales de FPCA o inducidos por dichos agentes I para la detección de al menos una FPCA vinculada a las enfermedades neurodegenerativas no infecciosas, siendo dichos agentes I y II tales como se han descrito anteriormente.

El procedimiento de la invención es, por lo tanto, un procedimiento simple, universal en términos de aplicación, y particularmente útil para realizar un diagnóstico en muestras biológicas, tales como la sangre, de las enfermedades neurodegenerativas no infecciosas, sea cual sea la naturaleza de las FPCA y sea cual sea su concentración.

De acuerdo con una primera realización, éste emplea dos agentes, a saber:

-

un agente I no proteico que produce la agregación de las formas circulantes de las proteínas no infecciosas implicadas en procesos de agregación patológica del sistema nervioso central y

-

un agente II no proteico de captura de los agregados naturales de FPCA o inducidos por dichos agentes I, siendo dichos agentes I y II tales como se han descrito anteriormente.

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Por agente no proteico que produce la agregación de las formas circulantes de las proteínas no infecciosas implicadas en procesos de agregación patológica del sistema nervioso central, se entiende cualquier molécula de naturaleza no proteica capaz de conllevar en su presencia la agregación de las FPCA, es decir capaz de producir agrupaciones proteicas de tamaño superior a las FPCA iniciales y/o de permitir su sedimentación rápida mediante simple centrifugado. La agregación se define, en efecto, como la formación de redes multi-moleculares sedimentables mediante centrifugado a baja velocidad (10000 g).

Por agente no proteico de captura de los agregados naturales de FPCA o inducidos por dichos agentes I, se entiende cualquier molécula de naturaleza no proteica capaz de unirse a los agregados de FPCA, ya estén formados de forma natural, es decir en el organismo, o artificial, es decir después de la reacción con los agentes I.

Por enfermedad neurodegenerativa reconocida como no infecciosa actualmente, se entiende una enfermedad caracterizada por depósitos extracelulares y/o intracelulares de FPCA, como se ha descrito anteriormente, no siendo estas FPCA proteínas infecciosas, es decir proteínas transmisibles. De este modo, las enfermedades con prión, tales como la enfermedad de Creutzfeldt-Jakob o la encefalopatía espongiforme bovina, están excluidas claramente de esta definición.

Como ejemplos de enfermedades incluidas en la definición de la invención, pueden mencionarse la enfermedad de Parkinson, enfermedad de Alzheimer, tauopatías, demencias con cuerpos de Lewy, enfermedad de Huntington y demencias vasculares.

Las muestras biológicas en las que se emplea el procedimiento de detección de la invención, son cualquier muestra de origen humano susceptible de contener al menos una FPCA.

Como ejemplo de dichas muestras, pueden mencionarse el cerebro, los tejidos del sistema nervioso central, los órganos tales como el bazo y el intestino, así como los fluidos biológicos tales como el líquido cefalorraquídeo, la orina y la sangre, prefiriéndose estos últimos y constituyendo la sangre una muestra biológica de elección.

Debido a la característica particular de los agentes I de permitir la agregación de las FPCA y de capturarlas de forma amplificada en la muestra a ensayar con respecto a los agentes proteicos tales como los anticuerpos (captura de más formas), es posible utilizar únicamente el agente I para detectar las FPCA.

De este modo, la invención también se refiere a un procedimiento de detección de las FPCA vinculadas a las enfermedades neurodegenerativas no infecciosas tal como se define en la reivindicación 8.

Los agentes II no proteicos de captura de los agregados naturales de FPCA o inducidos por dichos agentes I son cualesquiera moléculas no proteicas que tienen esta función de captura, seleccionadas entre los metaciclofanos que son moléculas macrocíclicas y los glucosaminoglucanos.

Los glucosaminoglucanos son ampliamente conocidos por el experto en la materia y se describen, por ejemplo, en el documento Polysaccharides, M. Yalpani, Elsevier, Ámsterdam, 1988.

Como glucosaminoglucanos apropiados para los fines de la invención, pueden mencionarse por ejemplo la heparina, el sulfato de condroitina, el sulfato de dermatán, el ácido hialurónico y el sulfato de queratán.

Por molécula macrocíclica, se entiende un compuesto constituido por una sucesión de anillos que forman un macrociclo.

Las moléculas macrocíclicas tienen la ventaja particular de que permiten atrapar a la proteína a ensayar, en forma libre o en forma de agregado, mediante un efecto jaula.

Las moléculas macrocíclicas pueden prepararse de acuerdo con las técnicas conocidas por el experto en la materia, por ejemplo descritas en el documento Comprehensive Supramolecular Chemistry, Pergamon, Oxford, 1996.

Las moléculas macrocíclicas del procedimiento de la invención se seleccionan entre los metaciclofanos, prefiriéndose particularmente los calixarenos. Dichos compuestos calixarenos pueden obtenerse según la metodología descrita en los documentos Arduini, A. et al., 1996, Macrocycle Synthesis, Eds. Harwood, L.M. & Moddy, C. J. Oxford University Press, Oxford y Da Silva et al., 2001, J. Supramol. Chem., 1: 135-138.

De acuerdo con una realización preferida, el metaciclofano es p-sulfonato-3,7-(2-aminoetiloxi)-calix-[6]-areno.

De acuerdo con una realización, la molécula macrocíclica responde a la siguiente fórmula general (I):

1

en la que

R_{1} representa un átomo de hidrógeno, un grupo hidroxilo, un grupo OR o un grupo OCOR, siendo R tal como se define a continuación,

R_{2} representa un átomo de hidrógeno, un grupo R, COR, PoI, CH_{2}PoI, en los que PoI representa un grupo fosfato, sulfato, amina, amonio, ácido carboxílico y R es tal como se define a continuación,

R_{3} representa un átomo de hidrógeno, un grupo hidroxilo, un grupo OR o un grupo OCOR en los que R es tal como se define a continuación,

R_{4} representa un átomo de hidrógeno, un grupo hidroxilo, un grupo OR, un grupo OCH_{2}R o un grupo OCOR, en los que R es tal como se define a continuación,

Y es un átomo de carbono, de nitrógeno o un átomo de azufre,

R_{5} y R_{6}, cada uno independientemente, están ausentes o representan un átomo de hidrógeno, un grupo CH_{2} o R tal como se define a continuación, o bien

R_{5} y R_{6} representan conjuntamente un átomo de oxígeno o de azufre,

X representa un grupo CH_{2}, o un átomo de oxígeno o de azufre,

m representa un número entero igual a 0 ó 1,

R representa un átomo de hidrógeno o una cadena hidrocarbonada, saturada o no, ramificada o no, cíclica o no cíclica, sustituida o no por un grupo halógeno, y que porta funciones polares o no polares,

n es un número entero comprendido entre 3 y 15,

los sustituyentes R_{1} a R_{5}, R, X, Y y el número entero m pueden ser de diferente naturaleza según los motivos.

De este modo, el compuesto de fórmula (I) se presenta en forma de una sucesión de n motivos caracterizados por la presencia de un anillo bencénico, y los sustituyentes de este anillo pueden ser variables de un motivo a otro, en el límite de sus definiciones anteriores.

Por supuesto, la presencia de los asteriscos en las fórmulas permite representar la conexión necesaria que permite la formación de un anillo.

Las cadenas hidrocarbonadas, saturadas o no, ramificadas o no, cíclicas o no cíclicas, sustituidas o no por un grupo halógeno, y que portan funciones polares o no polares, son ampliamente conocidas por el experto en la materia. Como ejemplos, pueden mencionarse los alquilos, alquenos, arilos y anillos saturados tales como ciclohexano. Un ejemplo de grupo no polar es CF_{3} y ejemplos de grupos polares son los sustituyentes PoI tal como se han definido anteriormente.

Los compuestos de fórmula (I) particularmente preferidos responden a la siguiente fórmula (Ia):

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2

en la que

n es un número entero comprendido entre 4 y 8,

cada grupo R_{2}, tomado de forma independiente, es un grupo sulfato o un grupo fosfato

R_{7} representa un grupo (CH_{2})_{t}-(CO)_{s}-(NH_{2}) o un grupo (CH_{2})_{t}-COOH donde t es un número entero comprendido entre 0 y 6 y s es un número entero comprendido entre 0 y 6.

Los compuestos de fórmula (Ia) particularmente preferidos son aquellos para los que los dos grupos R_{2} son cada uno un grupo sulfato, n es 4, 6 u 8, y R_{7} es un átomo de hidrógeno, un grupo -CH_{2}COOH, un grupo -CH_{2}CONH_{2} o un grupo -CH_{2}CH_{2}NH_{2}.

De acuerdo con una realización preferida, el ligando macrocíclico responde a la fórmula general (Ia) en la que n=6, R_{2}=sulfato y R_{7} es -CH_{2}CH_{2}NH_{2}.

Debido a la característica particular de los agentes II de permitir la captura de los agregados de FPCA y esto de forma amplificada en la muestra a ensayar, con respecto a los agentes proteicos tales como los anticuerpos (captura de más formas), es posible utilizar únicamente el agente II para detectar las FPCA.

De este modo, la descripción también se refiere a un procedimiento de detección de las FPCA vinculadas a las enfermedades neurodegenerativas no infecciosas, caracterizado porque comprende o consiste en la etapa de puesta en contacto de una muestra biológica, procedente u obtenida de un organismo humano, con un agente II no proteico de captura de los agregados naturales de FPCA, preferentemente una molécula macrocíclica o un glucosaminoglucano.

Por supuesto, los agentes II son tal como se han definido anteriormente.

La cantidad de agentes I y II puede ser determinada fácilmente por el experto en la materia en función de las especificidades de la muestra. De este modo, por ejemplo, la cantidad del agente I, tal como estreptomicina, puede estar comprendida entre 50 y 500 mg/ml, preferentemente entre 100 y 300 mg/ml.

Contra todo pronóstico, los Solicitantes demostraron que las FPCA a detectar en el procedimiento de la invención, para unirse a los agentes I y en particular a los agentes que tienen al menos dos funciones guanidinio y/o piridinio y/o amonio, contienen aminoácidos cuyas cadenas laterales tienen una función ácida, preferentemente ácido carboxílico, como ácido aspártico (D) o ácido glutámico (E), o una función aceptora de puentes de hidrógeno, como serina (S) o asparagina (N), estando estos aminoácidos (D, E, S o N) presentes globalmente al menos 4 veces en una secuencia peptídica de longitud inferior o igual a 20 aminoácidos. Preferentemente, una densidad de estos aminoácidos (D, E, S o N) superior o igual a cuatro en una secuencia peptídica inferior o igual a 20 aminoácidos se encuentra al menos dos veces en la secuencia completa de la proteína que constituye las FPCA. Preferentemente, estos aminoácidos (D, E, S o N) están presentes globalmente al menos 5 veces en una secuencia peptídica de longitud inferior o igual a 20 aminoácidos o al menos 4 veces en una secuencia peptídica de longitud inferior o igual a 16 aminoácidos. Preferentemente, una densidad tal como se ha definido anteriormente está asociada a una zona de mayor densidad para estos aminoácidos (D, E, S o N), que corresponde a al menos 5 veces en una secuencia peptídica de longitud inferior o igual a 12 aminoácidos. Una densidad de funciones equivalentes en una distancia espacial equivalente también puede constituir una estructura mimética de la que se ha definido anteriormente en una estructura primaria de proteína.

Del mismo modo, los Solicitantes han demostrado que, para unirse a los agentes II y en particular a las moléculas macrocíclicas tales como los calixarenos, las FPCA contienen un mínimo de tres aminoácidos básicos, preferentemente arginina (R), lisina (K), histidina (H) o glutamina (Q), en una secuencia peptídica de longitud inferior o igual a doce, incluso quince, aminoácidos. Una densidad de tres cargas positivas equivalentes, en una distancia espacial equivalente, también puede constituir una estructura mimética de la que se ha definido anteriormente en una estructura primaria de proteína. Esta puede ser, por ejemplo, una conformación que proyecta estos cationes o sus equivalentes funcionales en un espacio tridimensional equivalente a una secuencia de doce, incluso quince, aminoácidos en una porción de este espacio que representa una hélice alfa constituida por aminoácidos.

La adición de los dos agentes I y/o II a la muestra biológica en este procedimiento puede realizarse en cualquier orden, ya que, contra todo pronóstico, esto no obstaculiza en absoluto la detección de las FPCA, por ejemplo con ayuda de un anticuerpo de detección anti-FPCA. Sin embargo, se prefiere que dicho agente I se añada a dicha muestra biológica para la agregación de las FPCA antes de dicho agente II, lo que constituye una realización de la invención.

De acuerdo con una realización de la invención, el procedimiento comprende o consiste en las etapas que consisten en:

a)

añadir a dicha muestra dicho agente I para agregar las FPCA y precipitarlas,

b)

poner a la mezcla obtenida de este modo en contacto con dicho agente II para capturar dichos agregados de FPCA y

c)

revelar la presencia de las FPCA.

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Preferentemente, para favorecer la precipitación de las FPCA, después de la adición del agente I, se procede a un calentamiento moderado del medio de reacción a una temperatura comprendida entre 25 y 45ºC, prefiriéndose una temperatura de 37ºC.

Los agregados de FPCA, formados en presencia del agente I, pueden separarse del medio de reacción antes de su reacción con el agente II. El procedimiento de separación puede realizarse mediante cualquier procedimiento de separación de un precipitado conocido por el experto en la materia. Como ejemplos, los agregados de FPCA se separan del medio de reacción mediante centrifugado o separación sobre membrana, y a continuación mediante eliminación del sobrenadante. Esta etapa de separación permite eliminar todos los productos no necesarios para la reacción de detección posterior de las FPCA, tales como el agente I libre en solución.

Para favorecer, después de la formación de los agregados por un agente I, la separación entre los ligandos plasmáticos y las proteínas de las FPCA a las que dichos ligandos plasmáticos están unidos (desnaturalización), puede añadirse un agente químico de desnaturalización tal como Guanidina-HCl, a la concentración de 1 a 6 moles/l y/o se realiza una desnaturalización térmica a 100ºC, lo que permite liberar los epítopos enmascarados de las proteínas de las FPCA separándolas de los ligandos que no están unidos por el agente I. Esto permite mejorar más la sensibilidad del procedimiento de detección de la invención. La desnaturalización de dichos agregados presentes en la muestra biológica a ensayar antes de la reacción de los agregados de FPCA con el agente II también puede realizarse mediante cualquier procedimiento de desnaturalización de agregados proteicos conocido por el experto en la materia.

De este modo, el procedimiento de detección de las FPCA de acuerdo con la invención comprende preferentemente al menos una de las siguientes etapas suplementarias i) y ii) que consisten en:

i)

separar los agregados de FPCA de la mezcla de reacción y

ii)

desnaturalizar los agregados de FPCA,

estando estas etapas incluidas, llegado el caso, entre la etapa a) y la etapa b).

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La revelación de la presencia de las FPCA en una muestra biológica de acuerdo con el procedimiento de la invención puede realizarse de acuerdo con los procedimientos convencionales de detección de analitos en una muestra.

Ésta puede realizarse, por ejemplo, mediante una detección inmunológica o no.

Por detección inmunológica, se entiende la demostración de una reacción inmunológica con las FPCA, consistiendo esta reacción inmunológica en la unión entre las FPCA a detectar y al menos un socio de unión específico de FPCA o bien en una reacción competitiva entre las FPCA susceptibles de estar contenidas en la muestra a ensayar y FPCA marcadas.

Como detección no inmunológica, pueden mencionarse por ejemplo las técnicas de tinción en gel de electroforesis bien conocidas por el experto en la materia.

La detección de las FPCA mediante reacción inmunológica puede realizarse por ejemplo después de la adición de al menos un socio de unión específico de FPCA.

Por socio de unión específico de las FPCA, se entiende cualquier socio capaz de unirse a las FPCA en cuestión. La visualización de la reacción inmunológica consistirá entonces en la visualización del complejo socio de unión específico de las FPCA/FPCA.

De acuerdo con una realización preferida, el procedimiento de la invención es tal que se añade al menos un socio de unión específico de FPCA para la reacción inmunológica entre el socio de unión específico de las FPCA y las FPCA, llegado el caso, en la etapa c). Por supuesto, también pueden añadirse dichos socios cuando se decide utilizar solamente el agente I o el agente II en el procedimiento de la invención.

El número de socios de unión diferentes a añadir en el procedimiento de la invención depende del número de FPCA diferentes a ensayar. De este modo, en el caso de la detección de la enfermedad de Alzheimer, si solamente se desea ensayar la proteína Tau, se añadirá un socio de unión específico de Tau. Por el contrario, si se desea detectar a la vez la proteína Tau y péptidos beta-amiloides, se añadirán también socios de unión específicos de péptidos beta-amiloides.

Como socio de unión específico de las FPCA, pueden mencionarse, por ejemplo, los anticuerpos, fragmentos de anticuerpo, polipéptidos, proteínas, ácidos nucleicos, haptenos y aptámeros.

El término "anticuerpo" incluye anticuerpos policlonales o monoclonales, anticuerpos obtenidos mediante recombinaciones genéticas y fragmentos de anticuerpo.

Los anticuerpos policlonales pueden obtenerse mediante inmunización de un animal con al menos un antígeno diana de interés, en el presente caso una FPCA, seguido de la recuperación de los anticuerpos investigados en forma purificada, mediante extracción del suero de dicho animal, y separación de dichos anticuerpos de los demás constituyentes del suero, particularmente mediante cromatografía de afinidad en una columna a la que está fijada un antígeno reconocido específicamente por los anticuerpos, particularmente la FPCA en cuestión.

Los anticuerpos monoclonales pueden obtenerse mediante la técnica de los hibridomas cuyo principio general se recuerda a continuación.

En un primer momento, se inmuniza a un animal, generalmente un ratón, (o células en cultivo en el marco de inmunizaciones in vitro) con un antígeno diana de interés, en el presente caso una FPCA, cuyos linfocitos B son capaces entonces de producir anticuerpos contra dicho antígeno. Estos linfocitos productores de anticuerpos se fusionan a continuación con células mielomatosas "inmortales" (murinas en el ejemplo) para dar lugar a hibridomas. A partir de la mezcla heterogénea de las células obtenida de este modo, se realiza entonces una selección de las células capaces de producir un anticuerpo particular y de multiplicarse indefinidamente. Cada hibridoma se multiplica en forma de clon, conduciendo cada uno a la producción de un anticuerpo monoclonal cuyas propiedades de reconocimiento respecto al antígeno de interés podrán ensayarse por ejemplo en ELISA, mediante inmunotransferencia en una o dos dimensiones, en inmunofluorescencia, o con ayuda de un biosensor. Los anticuerpos monoclonales seleccionados de este modo, se purifican a continuación particularmente de acuerdo con la técnica de cromatografía de afinidad descrita anteriormente.

Como anticuerpos apropiados para la invención, pueden mencionarse por ejemplo los anticuerpos monoclonales dirigidos contra las proteínas Tau total (anticuerpos Tau-1 (Chemicon), T46 (Zymed)), contra la proteína Tau fosforilada (anticuerpo PHF-6 (Zymed)), contra la proteína APP (anticuerpo 22Cl 1 (Chemicon)), contra los péptidos beta-amiloides (anticuerpos 6E10 y 4G8 (Sigma)).

Los fragmentos de anticuerpo son tales que conservan la función de unión a las FPCA.

Por "polipéptido", se entiende una sucesión de al menos dos aminoácidos. Por aminoácidos, se entiende los aminoácidos primarios que codifican las proteínas, los aminoácidos derivados después de la acción enzimática como la trans-4-hidroxiprorina y los aminoácidos naturales, pero no presentes en las proteínas como norvalina, N-metil-L-leucina, estalina (Hunt S. en Chemistry and Biochemistry of the amino acids, Barett GC, ed., Chapman and Hall, London, 1985), los aminoácidos protegidos por funciones químicas utilizables en síntesis sobre soporte sólido o en fase líquida y los aminoácidos no naturales.

El término "proteína" incluye las holoproteínas y las heteroproteínas como las nucleoproteínas, lipoproteínas, fosfoproteínas, metaloproteínas y glucoproteínas tanto fibrosas como globulares.

Por ácido nucleico, se entiende los oligonucleótidos, ácidos desoxirribonucleicos y ácidos ribonucleicos, así como sus derivados.

El término "oligonucleótido" designa una sucesión de al menos 2 nucleótidos (desoxirribonucleótidos o ribonucleótidos, o ambos), naturales o modificados. Por nucleótido modificado, se entiende por ejemplo un nucleótido que comprende una base modificada y/o que comprende una modificación a nivel del enlace internucleotídico y/o a nivel del esqueleto. Como ejemplo de base modificada, puede mencionarse la inosina, metil-5-desoxicitidina, dimetilamino-5-desoxiuridina, diamino-2,6-purina y bromo-5-desoxiuridina. Para ilustrar un enlace internucleotídico modificado, pueden mencionarse los enlaces fosforotioato, N-alquilfosforamidato, alquilfosfonato y alquilfosfodiéster. Los alfa-oligonucleótidos tales como los descritos en el documento FR-A-2 607 507, los LNA tales como fosforotioato-LNA y 2'-tio-LNA descritos en el documento Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters, Volumen 8, Nº 16, 18 de agosto de 1998, páginas 2219-2222, y los PNA que son objeto del artículo de M. Egholm et al., J. Am. Chem. Soc. (1992), 114, 1895-1897, son ejemplos de oligonucleótidos constituidos por nucleótidos cuyo esqueleto está
modificado.

El término "hapteno" designa compuestos no inmunógenos, es decir incapaces por sí mismos de promover una reacción inmunitaria mediante producción de anticuerpos, pero capaces de ser reconocidos por anticuerpos obtenidos mediante inmunización de animales en condiciones conocidas, en particular mediante inmunización con un conjugado de hapteno-proteína. Estos compuestos tienen generalmente una masa molecular inferior a 3000 Da, y generalmente inferior a 2000 Da, y pueden ser, por ejemplo, péptidos glucosilados, metabolitos, vitaminas, hormonas, prostaglandinas, toxinas o diversos medicamentos, nucleósidos y nucleótidos.

Los aptámeros son socios de captura de naturaleza proteica y nucleica que tienen como función actuar como anticuerpos y unirse a ligandos proteicos (Toulmé, JJ. y Giege, R., 1998, Medecine Science, 14(2), 155-166).

Estos polipéptidos, proteínas, haptenos y aptámeros tienen todos la capacidad de unirse a las FPCA o al agregado de FPCA.

La visualización de la reacción inmunológica entre el o los socios de unión específicos de las FPCA y las FPCA empleadas, particularmente en la etapa c), puede realizarse mediante cualquier medio de detección conocido por el experto en la materia, tales como medios directos o indirectos.

En el caso de la detección directa, es decir sin mediación de un marcado, se observa la reacción inmunológica por ejemplo por resonancia del plasmón o mediante voltametría cíclica en un electrodo que lleva un polímero conductor.

En el caso de la detección indirecta, es decir por medio de un marcado, el marcado puede realizarse por medio de dicho socio de unión específico de las FPCA que se marcará entonces por adelantado.

La visualización de la presencia de las FPCA en una muestra biológica de acuerdo con el procedimiento de la invención también puede realizarse de acuerdo con un método llamado competitivo. Se añade entonces, particularmente en la etapa c), en lugar del socio específico de unión de FPCA, la FPCA marcada previamente. En este caso, la señal de detección es máxima en ausencia de FPCA, y después disminuye progresivamente a medida que la concentración de FPCA investigada, no marcada, aumenta mediante la reacción competitiva.

Por marcado, se entiende la fijación de un marcador capaz de generar directa o indirectamente una señal detectable. Una lista no limitante de estos marcadores consiste en:

\bullet

las enzimas que producen una señal detectable por ejemplo por colorimetría, fluorescencia, luminescencia, como la peroxidasa de rábano rusticano, la fosfatasa alcalina, \alpha-galactosidasa, glucosa-6-fosfato deshidrogenasa,

\bullet

los cromóforos como los compuestos luminiscentes, colorantes,

\bullet

las moléculas radiactivas como ^{32}P, ^{35}S o ^{125}I,

\bullet

las moléculas fluorescentes tales como la fluoresceína, rodamina, alexa o las ficocianinas, y

\bullet

las partículas tales como las partículas de oro, de látex magnético, los liposomas.

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También pueden utilizarse sistemas indirectos, como por ejemplo por medio de otro par ligando/antiligando. Los pares ligando/antiligando son bien conocidos por el experto en la materia, y pueden mencionarse por ejemplo los siguientes pares: biotina/estreptavidina, hapteno/anticuerpo, antígeno/anticuerpo, péptido/anticuerpo, azúcar/lectina, polinucleótido /complementario del polinucleótido. En este caso, es el ligando el que porta el agente de unión. El antiligando puede ser detectable directamente por los marcadores descritos en el párrafo anterior o ser, a su vez, detectable por un ligando/anti-ligando.

Estos sistemas de detección indirectos pueden conducir, en algunas condiciones, a una amplificación de la señal. Esta técnica de amplificación de la señal es bien conocida por el experto en la materia, y podremos remitirnos al artículo J. Histochem. Cytochem. 45: 481-491, 1997.

El marcado de proteínas es ampliamente conocido por el experto en la materia y es descrito por ejemplo por Greg T. Hermanson en el documento Bioconjugate Techniques, 1996, Academic Press Inc, 525B Street, San Diego, CA92101 USA.

De acuerdo con el tipo de marcado utilizado, como por ejemplo utilizando una enzima, el experto en la materia añadirá reactivos que permitan la visualización del marcado.

Dichos reactivos son ampliamente conocidos por el experto en la materia y se describen particularmente en el documento Principles and Practice of Immunoessay, 2ª Edición, Editado por C. Price, DJ. Newman Stockton Press, 1997, 345 Park Avenue South, New York.

La detección de FPCA puede ser una detección en fase sólida, es decir utilizando una fase sólida sobre la que se inmoviliza un socio de captura para la captura de la proteína a detectar. En el caso de un procedimiento de la presente invención, es el agente II el que puede servir de socio de captura previamente inmovilizado sobre un soporte sólido. Un ejemplo de detección en fase sólida bien conocido por el experto en la materia es la detección de tipo sándwich, tal como la detección de tipo ELISA.

De este modo, de acuerdo con una realización preferida de la invención, dicho agente II está unido a un soporte sólido.

Como soporte sólido, pueden mencionarse por ejemplo las perlas, tales como perlas magnéticas, y las placas de microvaloración.

El agente II puede estar unido al soporte sólido de forma conocida por el experto en la materia, tal como mediante adsorción o enlace covalente, prefiriéndose el enlace covalente.

De este modo, el soporte sólido puede estar funcionalizado por una función susceptible de formar un enlace con una función portada por dicho agente II. De acuerdo con una realización preferida, el soporte sólido está funcionalizado por un enlace NHS (N-hidroxisuccinimida) o por una función NH_{2}. Esta función puede reaccionar con una función portada en el agente II. En esta realización, se prefieren particularmente los agentes II portan una función susceptible de reaccionar para formar un enlace con el enlace funcional del soporte sólido, particularmente que porta un enlace NH_{2} o COOH.

Para la realización del procedimiento de detección de al menos una FPCA de la invención, pueden utilizarse kits de diagnóstico que comprenden un agente I y un agente II, siendo dichos agentes tales como se han definido anteriormente.

De este modo, la invención también se refiere a la utilización de un kit de diagnóstico que comprende un agente I no proteico que produce la agregación de las formas circulantes de las proteínas no infecciosas implicadas en procesos de agregación patológica del sistema nervioso central y eventualmente un agente II no proteico de captura de los agregados naturales de FPCA para la detección de al menos una FPCA vinculada a las enfermedades neurodegenerativas no infecciosas.

De acuerdo con una realización preferida, dicho agente II presente en el kit está unido a un soporte sólido para la realización de la detección de al menos una FPCA de acuerdo con un procedimiento de detección en fase sólida.

La invención se entenderá mejor con ayuda de los siguientes ejemplos que se dan a título ilustrativo y no limitante, así como con ayuda de las figuras 1 a 24, en las que:

- la figura 1 muestra una comparación de las secuencias de las FPCA alfa-sinucleína, APP (proteína precursora de péptidos amiloides), Parkina y proteína Tau;

- la figura 2 es una representación esquemática (figura 2A) de la radiografía de un gel de electroforesis (figura 2B) después de una transferencia de Western, obtenida después de la migración de la proteína Tau tratada con un agente I que es la estreptomicina (pistas 3 y 4), o la TET (pistas 5 y 6), la pista 1 correspondiendo a la pista de los marcadores de peso molecular y la pista 2 correspondiendo a la muestra de control sin tratamiento con el agente I,

- la figura 3 es una representación esquemática (figura 3A) de la radiografía de un gel de electroforesis (figura 3B) después de una transferencia de Western, obtenida después de la migración de la proteína Tau tratada con un agente I que es la rifampicina (pistas 3, 4 y 5), o la isoniazida (pistas 8, 9 y 10), las pistas 1 y 6 correspondiendo a las pistas de los marcadores de peso molecular y las pistas 2 y 7 correspondiendo a la muestra de control sin tratamiento con el agente I,

- la figura 4 es una representación esquemática (figura 4A) de la radiografía de un gel de electroforesis (figura 4B) después de una transferencia de Western, obtenida después de la migración de la proteína Tau tratada con el calixareno p-sulfonato-3,7-(2-aminoetiloxi)-calix-[6]-areno (C6S) como agente II, siendo la fracción recuperada el sedimento (pistas 2 a 9) o el sobrenadante (pistas 12 a 20), las pistas 1 y 21 correspondiendo a la muestra de control sin tratamiento con el calixareno y la pista 11 correspondiendo a la pista de los marcadores de peso molecular,

- la figura 5 es una representación esquemática (figura 5A) de la radiografía de un gel de electroforesis (figura 5B) después de una transferencia de Western, obtenida después de la migración del péptido beta-amiloide 1-40 tratado con el C6S (pista 2), con la estreptomicina (pista 3) o con la TET (pista 4), la pista 1 correspondiendo a la muestra de control sin tratamiento con el agente I o II y la pista 5 correspondiendo a la pista de los marcadores de peso molecular,

- la figura 6 es una representación esquemática (figura 6A) de la radiografía de un gel de electroforesis (figura 6B) después de una transferencia de Western, obtenida después de la migración del péptido beta-amiloide 1-40 tratado con un agente I que es la rifampicina (pistas 3, 4 y 5), o la isoniazida (pistas 8, 9 y 10), las pistas 1 y 6 correspondiendo a las pistas de los marcadores de peso molecular y las pistas 2 y 7 correspondiendo a la muestra de control sin tratamiento con el agente I,

- la figura 7 es una representación esquemática (figura 7A) de la radiografía de un gel de electroforesis (figura 7B) después de una transferencia de Western, obtenida después de la migración del péptido bata-A 1-42 tratado con el C6S (pista 2), con la estreptomicina (pista 3) o con la TET (pista 4), la pista 1 correspondiendo a la muestra de control sin tratamiento con el agente I o II y la pista 5 correspondiendo a la pista de los marcadores de peso molecular,

- la figura 8 es una representación esquemática (figura 8A) de la radiografía de un gel de electroforesis (figura 8B) después de una transferencia de Western, obtenida después de la migración del péptido beta-amiloide 1-42 tratado con un agente I que es la rifampicina (pistas 3, 4 y 5), o la isoniazida (pistas 8, 9 y 10), las pistas 1 y 6 correspondiendo a las pistas de los marcadores de peso molecular y las pistas 2 y 7 correspondiendo a la muestra de control sin tratamiento con el agente I,

- la figura 9 es una representación gráfica que da la elipticidad molar en función de la longitud de onda obtenida por dicroísmo circular del péptido beta-amiloide 1-42 después del tratamiento con el agente II para-sulfonato-calix[4]areno de acuerdo con diferentes concentraciones, siendo Ab42 el control sin tratamiento con el agente II,

- la figura 10 es una representación gráfica que da la intensidad de los picos de complejación cps (recuentos por segundo) obtenida mediante espectrometría de masas en modo electropulverización del péptido beta-amiloide 1-40 después del tratamiento con los agentes II: para-sulfonato-calix[4]areno (SC4), para-sulfonato-calix[6]areno (SC6), para-sulfonato-calix[8]areno (SC8), siendo Ab40 el control sin tratamiento con el agente II,

- la figura 11 es una representación gráfica que da la elipticidad molar en función de la longitud de onda obtenida por dicroísmo circular del péptido beta-amiloide 1-42 después de la reacción con el agente II condroitin-6-sulfato de acuerdo con diferentes concentraciones, siendo Ab42 el control sin tratamiento con el agente II,

- la figura 12 es una representación gráfica de una dosificación de ELISA realizada a partir de extractos de cerebros de pacientes afectados por la enfermedad de Alzheimer (AD+) o no (AD-), no tratados (NT) o tratados con el agente I, que es la trietilentetraamina (TET). La detección de la proteína Tau fosforilada (en pg/ml, dosificada en equivalentes (eq) de proteína Tau recombinante) se realiza en las fracciones de sedimentos o sobrenadantes,

- la figura 13 es una representación gráfica de un ensayo ELISA realizado a partir de extractos de cerebros de pacientes afectados por la enfermedad de Alzheimer, no tratados (NT) o tratados con diferentes concentraciones (mg/ml) de agente I, que es la estreptomicina. La detección de la proteína Tau fosforilada (eq Tau en pg/ml) se realiza en las fracciones de sedimentos o sobrenadantes,

- la figura 14 es una representación gráfica que muestra el efecto de diferentes tampones de recogida sobre la detección de la proteína Tau fosforilada, después del tratamiento o no con SDS al 1% y precipitación con la estreptomicina (500 mg/ml). Los resultados se obtuvieron a partir de extractos de cerebros de pacientes afectados por la enfermedad de Alzheimer (PAD+) o no (PAD-), o de plasma sin sobrecargar (P). Gnd: guanidina; SN: sobrenadante; stp: estreptomicina,

- la figura 15 es una representación esquemática (panel superior) de un gel de electroforesis (panel inferior) después de tinción con azul de Coomassie (figura 15A) y de la radiografía del mismo gel después de una transferencia de Western (figura 15B), obtenida después de la migración de la proteína SYN en el plasma después del tratamiento con la TET (pistas 2-5: sedimentos; pistas 8-11: sobrenadantes). Las pistas 1 y 7 corresponden a los sedimentos y sobrenadantes de la muestra de control sin adición de agente I, la pista 6 contiene marcadores de peso molecular (188, 62, 49, 38, 28, 18, 14, 6 y 3 kDa) y la pista 12 corresponde a la proteína recombinante en solitario,

- la figura 16 es una representación esquemática (panel superior) de un gel de electroforesis (panel inferior) después de tinción con azul de Coomassie (figura 16A) y de la radiografía del mismo gel después de una transferencia de Western (figura 16B), obtenida después de la migración de la proteína SYN en el plasma después del tratamiento con la estreptomicina (pistas 2-5: sedimentos; pistas 8-11: sobrenadantes). Las pistas 1 y 7 corresponden a los sedimentos y sobrenadantes de la muestra de control sin adición de agente I, la pista 6 contiene marcadores de peso molecular (188, 62, 49, 38, 28, 18, 14, 6 y 3 kDa) y la pista 12 corresponde a la proteína recombinante en solitario,

- la figura 17 es una representación esquemática (panel superior) de un gel de electroforesis (panel inferior) después de tinción con azul de Coomassie obtenida después de la migración de la proteína SYN en el plasma después del tratamiento con los calixarenos (agente II). La figura 17A corresponde a la fracción de sedimentos mientras que la figura 17B corresponde a la fracción de sobrenadantes. Las pistas 1 a 7 corresponden a la proteína SYN tratada con diferentes concentraciones de calixarenos, la pista 8 contiene marcadores de peso molecular (188, 62, 49, 38, 28 y 14 kDa) y la pista 9 corresponde a la proteína recombinante no tratada,

- la figura 18 es una representación esquemática (panel superior) de la autorradiografía (panel inferior) de un gel de electroforesis después de una transferencia de Western, obtenida después de la migración de la proteína SYN en el plasma después del tratamiento con los calixarenos (agente II). La figura 18A corresponde a la fracción de sedimentos, mientras que la figura 18B corresponde a la fracción de sobrenadantes. Las pistas 1 a 7 corresponden a la proteína Syn tratada con diferentes concentraciones de calixarenos, la pista 8 contiene marcadores de peso molecular (188, 62, 49, 38, 28, 18, 14 y 6 kDa) y la pista 9 corresponde a la proteína recombinante no tratada,

- la figura 19 es una representación esquemática (panel superior) de la autorradiografía (panel inferior) de un gel de electroforesis después de una transferencia de Western, obtenida después de la migración de la proteína SYN en el plasma después del tratamiento con los calixarenos (agente II). La figura 19A corresponde a la fracción de sedimentos mientras que la figura 19B corresponde a la fracción de sobrenadantes. Las pistas 1 a 8 corresponden a diferentes concentraciones de la proteína Syn tratada con los calixarenos, las pistas 10 a 12 corresponden a la proteína Syn no tratada y la pista 9 contiene marcadores de peso molecular (188, 62, 49, 38, 28, 18, 14 y 3 kDa),

- la figura 20 es una representación gráfica de una dosificación de ELISA realizada a partir de una gama de concentraciones (ng/ml) de proteína Syn presente en el plasma, y tratada con los calixarenos (agente II). La densidad óptica se lee en las fracciones de sedimentos o de sobrenadantes,

- la figura 21 es una representación gráfica de una dosificación de ELISA de tipo sándwich en la que los calixarenos (agente II) se utilizan en la fase de captura. Se ensayan diferentes cantidades (ng) de proteínas procedentes de extractos de cerebros de pacientes afectados por la enfermedad de Alzheimer (AD+) o no afectados (AD-). Los resultados obtenidos se expresan en forma de unidad relativa de luz (RLU),

- la figura 22 es una representación gráfica de una dosificación de ELISA de tipo sándwich que utiliza un anticuerpo específico en fase de captura. La dosificación se realiza a partir de extractos de cerebros de pacientes afectados por la enfermedad de Alzheimer (PAD+) o a partir de la proteína alfa-sinucleína recombinante (P\alpha-syn), sobrecargadas en una mezcla (pool) de plasmas humanos, y precipitadas con un agente I, que es la estreptomicina. Después de la precipitación, los sedimentos (C) se recogen en un tampón guanidina calentado o no. Los resultados se expresan en forma de densidad óptica. NT significa no tratado, C sedimento y S sobrenadante,

- la figura 23 es una representación gráfica de una dosificación de ELISA de tipo sándwich después de precipitación con el agente I (estreptomicina) y detección mediante ELISA con captura con el agente II (calixareno). La dosificación se realiza a partir de extractos de cerebros de pacientes afectados por la enfermedad de Alzheimer (P AD+) o a partir de la proteína alfa-sinucleína recombinante (P\alpha-syn), sobrecargados en una mezcla (pool) de plasmas humanos. Después de la precipitación con el agente I, los sedimentos se recogen en un tampón guanidina calentado o no. Los resultados se expresan en forma de densidad óptica,

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- la figura 24 es una representación gráfica de una dosificación de ELISA de la proteína Tau fosforilada, realizada a partir de un extracto de cerebro de paciente afectado por la enfermedad de Alzheimer (AD pos) sobrecargado en una mezcla (pool) de plasmas de pacientes sanos, no tratado o tratado con el agente I, que es la estreptomicina. La fase de captura está constituida por calixarenos (agente II). Los resultados obtenidos en las fracciones de sedimentos o sobrenadantes se expresan en forma de unidades relativas de luz (RLU).

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Ejemplo 1 Análisis comparado de las secuencias peptídicas de las proteínas asociadas a los depósitos de agregados neurotóxicos en las enfermedades neurodegenerativas no infecciosas

Hemos utilizado el programa "Mac Vector" para realizar un alineamiento de las secuencias peptídicas primarias de proteínas representativas de las proteínas asociadas a depósitos de agregados neurotóxicos en las enfermedades neurodegenerativas, es decir las proteínas alfa-sinucleína (SEC ID Nº 1), precursor de la proteína amiloide o APP (SEC ID Nº 2), Parkina (SEC ID Nº 3) y proteína Tau (SEC ID Nº 4). Los aminoácidos en éstas están numerados por encima del alineamiento, en base a su coincidencia con la secuencia consenso más larga, y los guiones en la secuencia de una proteína representan un desfase entre su secuencia peptídica lineal y el alineamiento de motivos comunes al conjunto de las proteínas en la secuencia consenso.

Se realizó un alineamiento de tipo "Clustal W" con una opción de alineamiento múltiple y se presenta en la figura 1. Las zonas de homologías (aminoácidos idénticos o de funcionalidad química equivalente) están enmarcadas y definen dominios comunes a estas diferentes proteínas de las que una propiedad común es la formación de agregados neurotóxicos en el sistema nervioso central de las enfermedades neurodegenerativas.

Los aminoácidos enmarcados individualmente son representativos de repetición más frecuente de algunos aminoácidos de interés en la secuencia primaria de una proteína en particular. Estas repeticiones pueden estar repartidas de forma diferente según las proteínas, pero constituyen una base funcional más densa que el consenso, o bien su proyección en el espacio puede constituir un dominio de unión.

En base a nuestros conocimientos originales sobre las funciones implicadas en las uniones con los agentes I tales como los compuestos orgánicos que comprenden al menos dos funciones guanidinio y/o piridinio y/o amonio, o los agentes II tales como los calixarenos de tipo Calix-6-areno-sulfonato, hemos podido identificar los aminoácidos que portan las funciones descritas anteriormente con una densidad particular a nivel de estas regiones homólogas.

De este modo puede verse en la figura 1 que, para unirse a los agentes I tales como compuestos orgánicos que comprenden al menos dos funciones guanidinio y/o piridinio y/o amonio, las regiones tales como se definen a continuación contienen un mínimo de 4 aminoácidos seleccionados entre D, E, S o N, en una secuencia peptídica de longitud inferior o igual a 20 aminoácidos:

i) para la alfa sinucleína, por ejemplo, las regiones

-

124-143 tienen 4 restos D, E, S o N en 20 aminoácidos,

-

231-261 tienen 10 restos D, E, S o N en 19 aminoácidos (los guiones indican un desfase de la numeración basado en el consenso con respecto a la secuencia primaria, lo que hace que los 20 aminoácidos estén numerados en un número superior a su número real en el intervalo de secuencia de la proteína) y

-

232-249 tienen incluso 6 restos D, E, S o N en 12 aminoácidos;

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ii) para el APP, por ejemplo, las regiones

-

80-98 tienen 5 restos D, E, S o N en 20 aminoácidos,

-

193-216 tienen 14 restos D, E, S o N en 17 aminoácidos,

-

225-236 tienen 6 restos D, E, S o N en 12 aminoácidos,

-

247-256 tienen 9 restos D, E, S o N en 10 aminoácidos,

-

692-702 tienen 5 restos D, E, S o N en 11 aminoácidos,

-

713-718 tienen 4 restos D, E, S o N en 6 aminoácidos;

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iii) para la Parkina, por ejemplo, las regiones

-

25-46 tienen 8 restos D, E, S o N en 20 aminoácidos (debido a los desfases de numeración con el consenso),

-

153-172 tienen 8 restos D, E, S o N en 20 aminoácidos,

-

224-240 tienen 5 restos D, E, S o N en 12 aminoácidos;

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iv) para la proteína Tau las regiones

-

31-53 tienen 6 restos D, E, S o N en 20 aminoácidos,

-

225-248 tiene 12 restos D, E, S o N en 20 aminoácidos,

-

236-247 tienen 9 restos D, E, S o N en 12 aminoácidos,

-

289-308 tienen 8 restos D, E, S o N en 20 aminoácidos,

-

361-380 tienen 8 restos D, E, S o N en 20 aminoácidos,

-

523-542 tienen 9 restos D, E, S o N en 20 aminoácidos, y

-

753-764 tienen 5 restos D, E, S o N en 12 aminoácidos.

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También puede observarse que una densidad de estos aminoácidos (D, E, S o N) superior o igual a 4 en una secuencia peptídica inferior o igual a 20 aminoácidos también puede encontrarse al menos dos veces en la secuencia completa de la proteína que constituye las FPCA. Además, se constata que estos aminoácidos (D, E, S o N) pueden estar presentes globalmente al menos 5 veces en una secuencia peptídica de longitud inferior o igual a 20 aminoácidos y/o al menos 4 veces en una secuencia peptídica de longitud inferior o igual a 16 aminoácidos. Finalmente, una densidad tal como se ha definido anteriormente también puede estar asociada con una zona de mayor densidad para estos aminoácidos (D, E, S o N), correspondiendo a al menos 5 en una secuencia peptídica de longitud inferior o igual a 12 aminoácidos. Una densidad de funciones equivalentes en una distancia espacial equivalente también puede constituir una estructura mimética de la que se ha definido anteriormente en una estructura primaria de proteína.

También es interesante observar que la frecuencia de estos aminoácidos puede alcanzar 32 en 49 aminoácidos contiguos en la secuencia peptídica del APP, sin excluir, sin embargo, otras regiones de fijación a distancia de esta sucesión de 49 restos (región 225-275).

Por otro lado, también puede observarse en la figura 1 que, para unirse a los agentes II tales como molécula macrocíclica de tipo calixarenos, las regiones tales como se definen a continuación contienen un mínimo de 3 aminoácidos básicos, preferentemente arginina (R), lisina (K), histidina (H) o glutamina (Q), en una secuencia peptídica de longitud inferior o igual a doce, incluso quince, aminoácidos:

i) para alfa sinucleína las regiones

-

106-120 tienen 5 restos K, H, Q o R en 15 aminoácidos,

-

128-142 tienen 4 restos K, H, Q o R en 15 aminoácidos,

-

159-163 tienen 3 restos K, H, Q o R en 15 aminoácidos;

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ii) para APP las regiones

-

90-104 tienen 7 restos K, H, Q o R en 15 aminoácidos,

-

105-116 tienen 4 restos K, H, Q o R en 12 aminoácidos,

-

132-143 tienen 5 restos K, H, Q o R en 12 aminoácidos,

-

153-163 tienen 3 restos K, H, Q o R en 12 aminoácidos,

-

697-707 tienen 5 restos K, H, Q o R en 11 aminoácidos;

\newpage

iii) para la Parkina las regiones

-

83-100 tienen 7 restos K, H, Q o R en 15 aminoácidos,

-

182-195 tienen 6 restos K, H, Q o R en 12 aminoácidos;

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iv) para la proteína Tau las regiones

-

101-108 tienen 4 restos K, H, Q o R en 8 aminoácidos,

-

135-147 tienen 4 restos K, H, Q o R en 13 aminoácidos,

-

178-183 tienen 3 restos K, H, Q o R en 6 aminoácidos,

-

197-208 tienen 5 restos K, H, Q o R en 1 aminoácido.

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También puede observarse que una densidad de tres cargas positivas equivalentes, en una distancia espacial equivalente, también puede constituir una estructura mimética de la que se ha definido anteriormente en una estructura primaria de proteína. Ésta puede ser, por ejemplo, una conformación que proyecta estos cationes o sus equivalentes funcionales en un espacio tridimensional equivalente a una secuencia de doce, incluso quince, aminoácidos en una porción de este espacio que representa una hélice alfa constituida por aminoácidos.

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Ejemplo 2 Detección de la proteína Tau mediante un procedimiento que utiliza un agente I 2.1 Técnica de análisis

El análisis se realiza de acuerdo con la técnica de Transferencia de Western (Laemmli, UK 1970, Nature, 227: 680-685). Las muestras a analizar se desnaturalizan en tampón SDS (Tris HCl 125 mM pH 6,8, glicerol al 20%, SDS al 4%, azul de bromofenol al 0,02%) (50/50 v/v) a 100ºC durante 5 minutos. Éstas se depositan a continuación sobre un gel de electroforesis unidimensional de poliacrilamida al 12% en presencia de dodecil sulfato sódico (SDS-PAGE).

Después de la migración, las proteínas se transfieren a una membrana de nitrocelulosa y se someten a inmunotransferencia a 4ºC durante una noche con un anticuerpo monoclonal específico de la proteína Tau (anticuerpo Tau-1 (Chemicon)).

El anticuerpo secundario de detección es un anticuerpo de cabra que reconoce las cadenas pesadas y ligeras de las inmunoglobulinas G de ratón conjugado a la peroxidasa de rábano rusticano.

La membrana se lava entre cada etapa en solución salina tamponada con fosfato (PBS) con y después sin Tween20 (al 0,05% p/v).

Las señales se detectan mediante quimioluminiscencia con el kit super signal (Pierce) y se visualizan en una película radiográfica (Pierce).

2.2 Detección en presencia del agente I

Los ensayos se realizan con 1 \mug de proteína Tau recombinante fusionada a una cola de 6 histidinas (Calbiochem) y con, como agente I, estreptomicina, en forma de sulfato, o trietilentetraamina o TET, o rifampicina o isoniazida, con una proporción de cantidad de agente I (\mug) por cantidad de proteínas totales (\mug) igual a 9/1 ó 35/1.

Una vez puestos en contacto la proteína recombinante y el agente I, la mezcla se incuba durante 30 minutos a 37ºC.

Las muestras se centrifugan a continuación durante 10 minutos a 13000 rpm. Los sedimentos se recuperan y, después de la desnaturalización, se analizan mediante la técnica de la transferencia de Western.

Los resultados se representan en las figuras 2 y 3, tales como se definen a continuación:

- la figura 2 es una representación esquemática (figura 2A) de la radiografía de un gel de electroforesis (figura 2B) de la transferencia de Western, obtenida después de la migración de la proteína Tau tratada con estreptomicina (pistas 3 y 4), o con TET (pistas 5 y 6), la pista 1 correspondiendo a la pista de los marcadores de peso molecular y la pista 2 correspondiendo a la muestra de control sin tratamiento con el agente I, y

\newpage

- la figura 3 es una representación esquemática (figura 3A) de la radiografía de un gel de electroforesis (figura 3B) de la transferencia de Western, obtenida después de la migración de la proteína Tau tratada con un agente I que es rifampicina (pistas 3, 4 y 5), o isoniazida (pistas 8, 9 y 10), las pistas 1 y 6 correspondiendo a las pistas de los mar-
cadores de peso molecular y las pistas 2 y 7 correspondiendo a la muestra de control sin tratamiento con el agente I.

Las concentraciones de agente I con respecto a las pistas de electroforesis son tales como se indican en las tablas 1 y 2 a continuación.

TABLA 1

3

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TABLA 2

4

Los resultados muestran que la proteína Tau y sus formas digeridas se encuentran en el sedimento después del tratamiento con el agente I, ya sea estreptomicina, TET, rifampicina o isoniazida. Su presencia en el sedimento atestigua su concentración a partir del volumen de muestra ensayado, lo que no se produce en ausencia de agente I. Estas moléculas inducen, por lo tanto, una precipitación de la proteína Tau después de una incubación de 30 minutos a 37ºC y un centrifugado simple.

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Ejemplo 3 Detección de la proteína Tau mediante un procedimiento que utiliza un agente II (procedimiento que no pertenece a la invención) 3.1 Técnica de análisis

Es idéntica a la descrita en el punto 2.1 anteriormente.

3.2 Detección realizada en presencia del calixareno p-sulfonato-3,7-(2-amino-etiloxi)-calix-[6]-areno (denominado C6S) como agente II

Los ensayos se realizan como se ha indicado en el punto 2.2 anteriormente, excepto en que se utilizó C6S preparado como se indica en la solicitud de patente WO2004/059322, con un intervalo de concentración de 0,5 mM a 60 mM.

Los resultados se representan en la figura 4 que es una representación esquemática (figura 4A) de la radiografía de un gel de electroforesis (figura 4B) de la transferencia de Western, obtenida después de la migración de la proteína Tau tratada con el calixareno p-sulfonato-3,7-(2-aminoetiloxi)-calix-[6]-areno como agente II, siendo la fracción recuperada el sedimento (pistas 2 a 9) o el sobrenadante (pistas 12 a 20), las pistas 1 y 21 correspondiendo a la muestra de control sin tratamiento con el calixareno y la pista 11 correspondiendo a la pista de los marcadores de peso molecular.

Las concentraciones de agente II con respecto a las pistas de electroforesis son tales como se indican en la tabla 3 a continuación.

TABLA 3

5

6

Estos resultados muestran que la proteína Tau y sus formas digeridas se encuentran en el sedimento después del tratamiento con C6S y, que en ausencia de agente II, no se observa ninguna concentración ni separación de la proteína Tau. Estas moléculas inducen, por lo tanto, una captura de la proteína Tau después de una incubación de 30 minutos a 37ºC y la sedimentan mediante un centrifugado simple. Además, se constata un óptimo de precipitación de 0,5 mM a 40 mM.

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Ejemplo 4 Detección de los péptidos beta-amiloides mediante un procedimiento que utiliza un agente I o un agente II (procedimiento que no pertenece a la invención)

Se ha recuperado el modo operatorio indicado en los ejemplos 2 y 3 anteriormente, excepto que se utilizaron:

-

10 \mug de péptido beta-amiloide sintético de 40 aminoácidos de longitud (péptido beta-A 1-40; SEC ID Nº 5) o 10 \mug de péptido beta-amiloide sintético de 42 aminoácidos de longitud (péptido beta-A 1-42; SEC ID Nº 6),

-

un anticuerpo monoclonal específico de los péptidos amiloides (anticuerpo 6E10 (Sigma)),

-

como agente I estreptomicina y TET, con una proporción de cantidad de agente I (\mug) por cantidad de proteínas totales (\mug) igual a 35/1, o bien rifampicina e isoniazida, con una proporción de cantidad de agente I (\mug) por cantidad de proteínas totales (\mug) igual a 2/1, 9/1 ó 35/1, y

-

como agente II C6S a la concentración de 1 mM final.

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Se realizó la transferencia de Western con los sedimentos de centrifugado que se analizaron como se ha descrito en el ejemplo 2.

Los resultados se representan en las figuras 5 a 8 tales como se definen a continuación:

- la figura 5 es una representación esquemática (figura 5A) de la radiografía de un gel de electroforesis (figura 5B) de la transferencia de Western, obtenida después de la migración del péptido beta-amiloide 1-40 tratado con C6S (pista 2), con estreptomicina (pista 3) o con TET (pista 4), la pista 1 correspondiendo a la muestra de control sin tratamiento con el agente I o II y la pista 5 correspondiendo a la pista de los marcadores de peso molecular,

- la figura 6 es una representación esquemática (figura 6A) de la radiografía de un gel de electroforesis (figura 6B) de la transferencia de Western, obtenida después de la migración del péptido beta-amiloide 1-40 tratado con un agente I que es rifampicina (pistas 3, 4 y 5), o isoniazida (pistas 8, 9 y 10), las pistas 1 y 6 correspondiendo a las pistas de los marcadores de peso molecular y las pistas 2 y 7 correspondiendo a la muestra de control sin tratamiento con el agente I,

- la figura 7 es una representación esquemática (figura 7A) de la radiografía de un gel de electroforesis (figura 7B) de la transferencia de Western, obtenida después de la migración del péptido beta-amiloide 1-42 tratado con C6S (pista 2), con estreptomicina (pista 3) o con TET (pista 4), la pista 1 correspondiendo a la muestra de control sin tratamiento con el agente I o II y la pista 5 correspondiendo a la pista de los marcadores de peso molecular,

- la figura 8 es una representación esquemática (figura 8A) de la radiografía de un gel de electroforesis (figura 8B) de la transferencia de Western, obtenida después de la migración del péptido beta-amiloide 1-42 tratado con un agente I que es rifampicina (pistas 3, 4 y 5), o isoniazida (pistas 8, 9 y 10), las pistas 1 y 6 correspondiendo a las pistas de los marcadores de peso molecular y las pistas 2 y 7 correspondiendo a la muestra de control sin tratamiento con el agente I.

Las concentraciones de agente I o II con respecto a las pistas de electroforesis son tales como se indican en las tablas 4 y 5 a continuación, que corresponden a las figuras 5 y 7 (tabla 4) y a las figuras 6 y 8 (tabla 5).

TABLA 4

7

TABLA 5

8

Como anteriormente, los resultados muestran que los péptidos beta-amiloides y sus oligómeros se encuentran en el sedimento después del tratamiento con el agente I o el agente IL Estas moléculas inducen, por lo tanto, una precipitación de los péptidos después de una incubación de 30 minutos a 37ºC y un centrifugado simple.

Además, como muestra la figura 7, pista 1, los oligómeros de alto peso molecular (multímeros), no capturados habitualmente por los agentes proteicos tales como anticuerpos utilizados convencionalmente, son capturados y precipitados con el agente II, lo que prueba su eficacia sobre estas formas multimerizadas. El agente II permite de este modo recuperar tanto las formas monoméricas como oligoméricas sin reticularlas (diferentes bandas observadas en migración electroforética).

Del mismo modo, como muestra la figura 8, pista 5, los oligómeros de alto peso molecular (multímeros), no reticulados habitualmente por los agentes proteicos tales como anticuerpos utilizados convencionalmente, son reticulados y precipitados con el agente I, lo que prueba su eficacia sobre estas formas multimerizadas. Por otro lado, el agente I permite también reticular todas las formas monoméricas y oligoméricas, lo que se demuestra mediante la migración electroforética del conjunto de las fracciones antigénicas beta-amiloides en una zona relativamente homogénea (banda gruesa y extendida o "smear") de alto peso molecular.

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Ejemplo 5 Interacción del péptido beta-amiloide 1-42 con el para-sulfonato-calix[4]areno 5.1. Técnica de análisis

El análisis se realiza mediante dicroísmo circular.

El péptido beta-amiloide a analizar tal como se ha definido anteriormente, también llamado A\beta_{42}, se disuelve extemporáneamente en concentración madre 2,2 x 10^{4} M en una solución de TriFluoroEtanol (TFE) al 20% en agua para estructurar los péptidos \beta-Amiloides. Los para-sulfonato-calix[n]arenos, preparados como se describe en el documento Da Silva, E. et al., 2003, Tetrahedron, 59(37): 7357-7364, se disuelven a 100 \muM en tampón fosfato 50 mM. Las muestras se preparan para obtener una concentración final de 10 \muM de péptido beta-amiloide en tampón fosfato, o para un volumen final de 500 \mul. Las proporciones de concentración de péptido/calixareno son variables de 1/0 a 1/5.

Se realiza un control \beta-amiloide sin para-sulfonato-calix[n]areno: 22,5 \mul de solución madre de A\beta_{42} 2,2 x 10^{4} M (5 nmoles) en TFE al 20%, 477,5 \mul de tampón fosfato 50 mM.

Las muestras se analizan mediante dicroísmo circular entre 180 y 260 nm.

5.2. Interacción del péptido A\beta_{42} con el para-sulfonato-calix[4]areno

Los ensayos se realizan para proporciones de concentración de péptido A\beta_{42}/calixareno 1/1, 1/2, y 1/5, como se indica en la tabla 6 a continuación. El control es una muestra de péptido A\beta_{42} sin calixareno (1/0). Las soluciones se preparan para un volumen final de 500 \mul. El péptido A\beta_{42} tiene una masa molar de 4514 g/mol, el para-sulfonato-calix[4]areno tiene una masa molar de 744 g/mol.

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TABLA 6

9

Los resultados se presentan en la figura 9 que es un gráfico que da la elipticidad molar en función de la longitud de onda obtenida para el control sin calixareno (Ab42) y para las proporciones de concentración 1/1, 1/2, 1/5. Las curvas en la figura 9 demuestran que el péptido inicialmente en hélice \alpha, adopta en presencia del para-sulfonato-calix[4]areno las tres estructuras, hélice \alpha (210 nm), lámina \beta (220 nm) y aperiódica (200 nm), sea cual sea la concentración de calix[4]areno utilizada, a concentración reducida (1/1) o a gran concentración (1/5). La estructura en hélice \alpha representa más del 37% de las estructuras visibles, las láminas \beta más del 26% y finalmente la estructura aperiódica está presente al 38%.

Constatamos que a la proporción de concentración 1/1, la elipticidad molar de las estructuras aumenta con respecto a 1/2. Por el contrario, el espectro de concentración en la proporción 1/5 del péptido A\beta_{42} se aproxima a la de 1/1 hacia las longitudes de onda próximas a 210 nm y se aproxima a la 1/2 más allá.

Estas variaciones demuestran la interacción molecular entre el agente II y el péptido beta-amiloide mediante las modificaciones estructurales significativas observadas en el espectro.

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Ejemplo 6 Estudio de complejación del péptido \beta-amiloide 1-40 con los para-sulfonato-calix[n]arenos por espectrometría de masas en modo electropulverización 6.1. Técnica de análisis

El péptido \beta-amiloide (también llamado A\beta_{40}) y los diferentes para-sulfonato-calix[n]arenos (n = 4, 6, 8), preparados como se describe en el documento Da Silva, E. et al., 2003, supra, se disuelven a una concentración de 100 \muM en tampón acetato de amonio 10 mM. La solución de péptido \beta-amiloide a ensayar se mezcla extemporáneamente con la solución de para-sulfonato-calix[n]arenos. Las muestras se inyectan directamente en espectrometría de masas en modo electropulverización.

6.2. Estudio de complejación del péptido A\beta_{40} con los diferentes para-sulfonato-calix[n|arenos

Se prepara una solución madre de péptido A\beta_{40} 10 \muM (Peso molecular = 4430 g/mol) en un tampón acetato de amonio 10 mM. Los diferentes para-sulfonato-calix[n]arenos (n = 4: SC4 Peso molecular = 744 g/mol; n = 6: SC6 Peso molecular = 1116 g/mol; n = 8: SC8 Peso molecular = 1488 g/mol) se disuelven a 100 \muM en un tampón acetato de amonio 10 mM.

100 \mul de la solución de péptido A\beta_{40} 100 \muM se mezclan con 100 \mul de una solución de para-sulfonato-calix[n]areno 100 \muM. Las muestras se inyectan extemporáneamente en espectrometría de masas en modo electropulverización.

Los resultados obtenidos se presentan en la figura 10 que es una representación gráfica que da la intensidad de los picos de complejación cps (recuentos por segundo) obtenida mediante espectrometría de masas en modo electropulverización del péptido beta-amiloide 1-40 después de la reacción con los agentes II: para-sulfonato-calix[4]areno (SC4), para-sulfonato-calix[6]areno (SC6), para-sulfonato-calix[8]areno (SC8), siendo Ab40 el control sin tratamiento con el agente II.

Estos resultados muestran picos característicos de la complejación de los para-sulfonato-calix[n]arenos con el péptido A\beta_{40}. Puede observarse que el control está presente en un muy gran exceso, lo que explica el pico.

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Ejemplo 7 Interacción del péptido beta-amiloide 1-42 con condroitin-6-sulfato

Se ha recuperado el modo operatorio descrito en el ejemplo 5 anteriormente, excepto que se utilizó como agente II el condroitin-6-sulfato (Sigma).

Los resultados se dan en la figura 11 que es una representación gráfica que da la elipticidad molar en función de la longitud de onda para el control sin calixareno (Ab42) y para las proporciones de concentración 1/1 y 1/5.

Los resultados obtenidos en la figura 11 muestran que el espectro de A\beta_{42} presenta dos mínimos negativos, el primero se sitúa a 201 nm y el segundo a 226 nm. Este péptido \beta-amiloide sintético adopta una estructura en hélice \alpha con una parte en estructura aperiódica.

En presencia de Condroitin-6-sulfato, a concentración igual a la de A\beta_{42}, la estructura del péptido cambia. Tres estructuras están presentes a porcentajes similares. En efecto, la hélice \alpha (a 210 nm) está presente a más del 37%, la estructura aperiódica (a 200 nm) es superior al 26%. Finalmente, la lámina \beta aparece a 220 nm.

Al aumentar la concentración de condroitin-6-sulfato en cinco veces superior a la del péptido A\beta_{42}, la conformación secundaria de este último cambia para adoptar una estructura esencialmente aperiódica.

En conclusión, en presencia de Condroitin-6-sulfato a concentración igual a la del péptido amiloide, aparecen láminas \beta mientras que a gran concentración de condroitin-6-sulfato esta conformación es sustituida por una estructura aperiódica.

Estas variaciones demuestran la interacción molecular entre el agente II y el péptido beta-amiloide mediante las modificaciones estructurales significativas observadas en el espectro.

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Ejemplo 8 Detección de la proteína Tau fosforilada mediante un procedimiento que utiliza un agente precipitante I 8.1 Técnica de análisis

El análisis se realiza de acuerdo con la técnica inmunoenzimática convencional de tipo "ELISA sándwich" como se describe por Kohnken y col (Neuroscience Letters 287 (2000) 187-190).

El ensayo Elisa PhosphoTau se basa en la utilización de microplacas Dynex sobre las que se fijan 3 \mug/ml de anticuerpo de cabra anti-Fc de ratón (Pierce) en un tampón KHPO4 25 mM, (pH 7,2), NaCl 140 mM, EDTA 1 mM, NaN3 2 mM durante tres horas a 24ºC. Los pocillos se pasivizan a continuación con un tampón TBS (Tris-HCl 25 mM, pH 7,5, NaCl 140 mM) Caseína (1%) durante 1 h a 24ºC y después se incuban 2 h a 24ºC con 3 \mug/ml de anticuerpo Tau1 (Chemicon) y CP27 (AppliedNeuroSolutions) diluidos en tampón TBS caseína.

Patrones y extractos de cerebros se diluyen en una mezcla (pool) de plasmas sanos para estos ensayos y se depositan a razón de 80 \mul por pocillo por duplicado. El anticuerpo de detección CP9 (AppliedNeuroSolutions, US) se diluye en un tampón que contiene 200 \mug/ml de albúmina humana, 22 \mug/ml de IgG humana y 0,15 \mu g/ml de IgM humanas en un tampón bicarbonato Krebs-Ringer. 20 \mul de esta mezcla se añaden a cada pocillo y se incuban 66 horas a 24ºC. Para reconocer al anticuerpo CP9 fijado, un anticuerpo de cabra (F(ab')_{2}) biotinilado anti-IgM de ratón (Accurate) a 0,2 \mug/ml en tampón TBS caseína que contiene el 1% de suero humano normal (Biocell) se añade durante 2 h a 24ºC. La detección del anticuerpo biotinilado se asegura con 0,4 \mug/ml de un conjugado de estreptavidina-peroxidasa (Pierce) diluido en tampón TBS caseína e incubado durante 45 minutos a 24ºC. Un reactivo Lumiglo (Kirkegaard and Perry laboratories, US) se añade a cada pocillo y la quimioluminiscencia se lee en un luminómetro (Berthold, Centro LB 960). Los datos obtenidos están en forma de unidad relativa de luz (RLU), las concentraciones en pg/ml, dosificadas en equivalentes de tau recombinante, que están generadas remitiendo las RLU de las muestras a la curva de los patrones (RLU en función de la concentración en pg/ml). Entre cada etapa descrita anteriormente los pocillos se lavan con tampón TBS que contiene el 0,1% de Tween20.

8.2 Detección en presencia del agente I, la TET

Los ensayos se realizan con 25 ng de extractos de cerebros y con, como agente I, trietilentetraamina o TET a 100 mg/ml.

Una vez que se han puesto en contacto la muestra y el agente I, la mezcla se incuba durante 60 minutos a 37ºC.

Las muestras se centrifugan a continuación durante 10 minutos a 13000 rpm. Los sedimentos se recuperan y los sedimentos se separan de los sobrenadantes. Todas las fracciones se conservan. Los sedimentos se recogen con 250 \mul de tampón tris-maleato (a no ser que se indique lo contrario). Las muestras están entonces listas para depositarlas sobre placas.

La figura 12 resume los resultados obtenidos en extractos de cerebros de pacientes de Alzheimer (AD+) o no (AD-)
sobrecargados ("spiking") en plasma. Los resultados se generaron en ausencia (NT) o después del tratamiento con TET a 100 mg/ml y análisis de las dos fracciones de sedimento y sobrenadante.

Los resultados muestran que la proteína Tau fosforilada se encuentra en el sedimento después del tratamiento con el agente I, la TET. Su presencia en el sedimento atestigua su concentración por agregación a partir del volumen de muestra ensayado, lo que no se produce en ausencia de agente I. Estas moléculas inducen, por lo tanto, una precipitación de la proteína recombinante Tau después de una incubación de 60 minutos a 37ºC y un centrifugado simple; la proteína está entonces disponible para una detección mediante una técnica Elisa utilizable de forma rutinaria en un laboratorio clínico.

8.3 Detección en presencia del agente I, estreptomicina

Los ensayos se realizan con 25 ng de extractos de cerebros y con, como agente I, estreptomicina, en forma de sulfato, a diferentes concentraciones.

Una vez puestos en contacto la muestra y el agente I, la mezcla se incuba durante 60 minutos a 37ºC.

Las muestras se centrifugan a continuación durante 10 minutos a 13000 rpm. Los sedimentos se recuperan y los sedimentos se separan de los sobrenadantes. Todas las fracciones se conservan. Los sedimentos se recogen con 250 \mul de tampón tris-maleato (a no ser que se indique lo contrario). Las muestras están entonces listas para depositarlas sobre placas.

La figura 13 resume los resultados obtenidos en extractos de cerebros de pacientes de Alzheimer (AD+) sobrecargados en plasma. Los resultados se generaron en ausencia (NT) o después del tratamiento con estreptomicina a diferentes concentraciones y análisis de las dos fracciones, sedimento y sobrenadante.

Los resultados muestran que la proteína Tau fosforilada se encuentra en el sedimento después del tratamiento con el agente I, la estreptomicina a concentración reducida. Su presencia en el sedimento atestigua su concentración por agregación a partir del volumen de muestra ensayado, lo que se traduce en un aumento de la detección en comparación con el análisis de la misma muestra en ausencia de tratamiento con el agente I. Estas moléculas inducen, por lo tanto, una precipitación de la proteína recombinante Tau después de una incubación de 60 minutos a 37ºC y un centrifugado simple; la proteína está entonces disponible para una detección mediante una técnica Elisa utilizable de forma rutinaria en un laboratorio clínico. Sin embargo, se observa que la precipitación no es total ya que subsiste proteína en el sobrenadante. El aumento de la cantidad de agente I permite suprimir la presencia de la proteína en el sobrenadante para una concentración de 500 mg/ml. En este caso la proteína precipitada ya no es detectable en el sedimento mediante una técnica Elisa. Análisis mediante transferencia de Western (datos no comunicados) permitieron verificar que la proteína está muy presente en forma agregada. Para detectar dicha forma agregada con un anticuerpo, un tampón de recogida adaptado es necesario para volver a exponer a los epítopos de cada proteína (véase el punto 8.4).

8.4 Detección en presencia del agente I, estreptomicina: elección de un tampón de recogida

Los ensayos se realizan con 25 ng de extractos de cerebros y con, como agente I, estreptomicina, en forma de sulfato, a 500 mg/ml. Las muestras se tratan o no previamente con SDS (1% final).

Una vez puestos en contacto la muestra y el agente I, en presencia o ausencia de SDS, la mezcla se incuba durante 60 minutos a 37ºC.

Las muestras se centrifugan a continuación durante 10 minutos a 13000 rpm. Los sedimentos se recuperan y se separan de los sobrenadantes. Todas las fracciones se conservan. Los sedimentos se recogen con 250 \mul de diferentes soluciones:

-

SDS al 1%

-

Guanidina HCl 0,1 M (Gnd)

-

Urea 1 M

-

SDS al 1% + Guanidina HCl 0,1 M (Gnd)

-

SDS al 1% + Urea 1 M

-

Guanidina HCl 0,1 M (Gnd) + Urea 1 M

-

SDS al 1% + Guanidina HCl 0,1 M (Gnd) + Urea 1 M.

Las muestras están entonces listas para depositarlas sobre placas.

Los resultados (figura 14) muestran que, en ausencia de SDS durante la etapa de precipitación, la detección de la proteína no es óptima.

Cuando la precipitación se realiza en presencia de SDS, los resultados difieren según el tipo de tampón de resuspensión utilizado. Una vez más, la presencia de SDS en este tampón de recogida es indispensable. Las dos mejores combinaciones son SDS-Guanidina y, mejor aún, SDS-Guanidina-Urea que permite una mayor intensidad de detección. La muestra Alzheimer positiva (PAD+) está entonces perfectamente disociada de la muestra Alzheimer negativa (PAD-) o del plasma no sobrecargado (P). Su presencia en el sedimento atestigua de este modo su concentración por agregación a partir del volumen de muestra ensayado, lo que no se produce en ausencia de agente I. Estas moléculas inducen, por lo tanto, una precipitación de la proteína recombinante Tau después de una incubación de 60 minutos a 37ºC y un centrifugado simple; la proteína está entonces disponible para una detección mediante una técnica Elisa utilizable de forma rutinaria en un laboratorio clínico.

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Ejemplo 9 Detección de la proteína alfa-sinucleína mediante un procedimiento que utiliza un agente precipitante I 9.1 Técnica de análisis: Gel de proteína y transferencia de Western

Las muestras a analizar se desnaturalizan en tampón SDS (Tris HCl 125 mM pH 6,8, glicerol al 20%, SDS al 4%, azul de bromofenol al 0,02%) (50/50 v/v) a 100ºC durante 5 minutos. Éstas se depositan a continuación sobre un gel de electroforesis unidimensional de poliacrilamida al 12% en presencia de dodecil sulfato sódico (SDS-PAGE). Después de la migración se utilizan dos opciones:

\bullet

el gel de proteína se tiñe en Azul de Coomassie mediante adición del reactivo gelcode blue stain reagent (Pierce) durante una noche a temperatura ambiente con agitación. Después de lavados en agua destilada, el gel se incuba en solución de secado (Pierce) 15 minutos a temperatura ambiente con agitación y después se deja secar entre dos láminas de celofán al menos una noche a temperatura ambiente.

\bullet

El análisis se realiza de acuerdo con la técnica de Transferencia de Western (Laemmli UK, 1970, Nature, 227: 680-685). Las proteínas se transfieren a una membrana de nitrocelulosa y se someten a inmunotransferencia a temperatura ambiente durante una hora con un anticuerpo específico de la proteína Syn 211 (Zymed). El anticuerpo secundario de detección es un anticuerpo de cabra (Jackson) que reconoce las cadenas pesadas y ligeras de las inmunoglobulinas G de ratón conjugado a la peroxidasa de rábano rusticano. La membrana se lava entre cada etapa en solución salina tamponada con fosfato (PBS) con, y después sin, Tween20 (0,05% p/v). Las señales se detectan mediante quimioluminiscencia con el kit super signal (Pierce) y se visualizan en una película radiográfica (Pierce).

9.2 Detección en presencia del agente I

Los ensayos se realizan con 1 \mug de proteína Alfa sinucleína (SYN) recombinante (rPeptide) sobrecargada en una mezcla (pool) de plasmas humanos y con, como agente I, estreptomicina, en forma de sulfato, o trietilentetraamina o TET, a diferentes concentraciones.

Una vez puestos en contacto la proteína recombinante y el agente I, la mezcla se incuba durante 60 minutos a 37ºC. Las muestras se centrifugan a continuación durante 10 minutos a 13000 rpm. Los sedimentos se recuperan y se separan de los sobrenadantes. Todas las fracciones se conservan. Los sedimentos se recogen con 250 \mul de tampón SDS. Después de la desnaturalización, todas las fracciones se analizan mediante la técnica de la transferencia de Western.

La figura 15 da los resultados obtenidos (representación esquemática, panel superior, y foto, panel inferior) en un gel de proteína después de la tinción (figura 15A) y después de la transferencia de Western (figura 15B), obtenida después de la migración de la proteína SYN en el plasma después del tratamiento con la TET (pistas 2-5: sedimentos, 8-11: sobrenadantes), las pistas 1 y 7 corresponden a los sedimentos y sobrenadantes de la muestra de control sin adición de agente I, la pista 6 contiene marcadores de peso molecular y la pista 12 correspondiendo a la proteína recombinante en solitario.

La figura 16 da los resultados obtenidos (representación esquemática, panel superior, y foto, panel inferior) en un gel de proteína después de la tinción (figura 16A) y después de la transferencia de Western (figura 16B), obtenida después de la migración de la proteína SYN en el plasma después del tratamiento con la estreptomicina (pistas 2-5: sedimentos, 8-11: sobrenadantes), las pistas 1 y 7 corresponden a los sedimentos y sobrenadantes de la muestra de control sin adición de agente I, la pista 6 contiene marcadores de peso molecular y la pista 12 correspondiendo a la proteína recombinante en solitario.

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Las concentraciones de agente I con respecto a las pistas de electroforesis son tales como se indican en las tablas 7 y 8 a continuación.

TABLA 7 (figura 15)

10

TABLA 8 (figura 16)

12

Los resultados muestran que la proteína SYN se encuentra en el sedimento después del tratamiento con el agente I, ya sea la estreptomicina o la TET. Su presencia en el sedimento atestigua su concentración por agregación a partir del volumen de muestra ensayado. Estas moléculas inducen, por lo tanto, una precipitación de la proteína recombinante Syn después de una incubación de 60 minutos a 37ºC y un centrifugado simple. Sin embargo, esta precipitación no es total, ya que se encuentra proteína en la fracción de sobrenadante. Sin embargo, esta concentración es suficiente para permitir su detección en un ensayo Elisa utilizable de forma rutinaria en un laboratorio clínico.

También se observará que esta precipitación es relativamente específica ya que las proteínas plasmáticas se encuentran mayoritariamente en el sobrenadante (figura 15A y 16A, pistas 7-12).

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Ejemplo 10 Detección de la proteína Alfa-sinucleína mediante un procedimiento que utiliza un agente precipitante II (procedimiento que no pertenece a la invención) 10.1 Técnica de análisis: Gel de proteína y transferencia de Western

La técnica es la misma que la descrita en el ejemplo 9

10.2 Técnica de análisis: ELISA

El análisis se realiza de acuerdo con la técnica inmunoenzimática convencional de tipo "ELISA sándwich": human alpha-synuclein ELISAkit (BioSource KHB0061) siguiendo las recomendaciones del proveedor.

10.3 Detección en presencia del agente II

Los ensayos se realizan con 1 \mug de proteína Alfa sinucleína (SYN) recombinante (rPeptide) sobrecargada en una mezcla (pool) de plasmas humanos y con, como agente II, el calixareno p-sulfonato-3,7-(2-amino-etiloxi)-calix-[6]-areno (denominado C6S). Los ensayos se realizan como se ha indicado en el ejemplo anterior, excepto que se utilizó C6S preparado como se indica en la solicitud de patente WO2004/059322, con una gama de concentraciones de 0 a 200 mg/ml.

La figura 17 da los resultados obtenidos (representación esquemática, panel superior, y foto, panel inferior) en un gel de proteína, obtenida después de la migración de la proteína SYN en el plasma después del tratamiento con los calixarenos. La figura 17A corresponde a la fracción de sedimentos mientras que la figura 17B corresponde a los sobrenadantes. Las pistas 1 a 7 corresponden a la proteína SYN tratada con diferentes concentraciones de calixarenos, la pista 8 contiene marcadores de peso molecular y la pista 9 correspondiendo a la proteína recombinante no tratada.

Las concentraciones de agente II con respecto a las pistas de electroforesis son tales como se indican en las tablas 9 y 10 a continuación.

TABLA 9 (figura 17A)

13

TABLA 10 (figura 17B)

14

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Los resultados muestran que, a partir de una concentración de 10 mg/ml, las proteínas del plasma se encuentran exclusivamente en los sedimentos (en el límite de sensibilidad del gel de proteínas).

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(Tabla pasa a página siguiente)

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La figura 18 da los resultados obtenidos (representación esquemática, panel superior, y foto, panel inferior) a partir de la autorradiografía de un gel de electroforesis seguida de una transferencia de Western, obtenida después de la migración de la proteína SYN en el plasma después del tratamiento con los calixarenos. La figura 18A corresponde a la fracción de sedimentos mientras que la figura 18B corresponde a los sobrenadantes. Las pistas 1 a 7 corresponden a la proteína Syn tratada con diferentes concentraciones de calixarenos, la pista 8 contiene marcadores de peso molecular y la pista 9 correspondiendo a la proteína recombinante no tratada. Las concentraciones de agente II con respecto a las pistas de electroforesis son tales como se indican en las tablas 11 y 12 a continuación.

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TABLA 11 (figura 18A)

16

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(Tabla pasa a página siguiente)

TABLA 12 (figura 18B)

18

Los resultados muestran que la proteína SYN se encuentra en el sedimento después del tratamiento con el agente II. Su presencia en el sedimento atestigua su captura a partir del volumen de muestra ensayado. Estas moléculas inducen, por lo tanto, una captura de la proteína recombinante Syn después de una incubación de 60 minutos a 37ºC pero en este caso, de forma inesperada para un agente de tipo II, esta captura hace a la proteína precipitable mediante un centrifugado simple. Sin embargo, esta captura no es total, ya que se encuentra la proteína en la fracción de sobrenadante. El máximo de proteína encontrado en el sedimento es para una concentración de calixareno comprendida entre 10 y 50 mg/ml.

Sin embargo, esta concentración es suficiente para permitir su detección en un ensayo Elisa utilizable de forma rutinaria en un laboratorio clínico.

10.4 Sensibilidad de detección en presencia del agente II

Los ensayos se realizan con una gama de proteína Alfa sinucleína (SYN) recombinante (rPeptide) sobrecargada en una mezcla (pool) de plasmas humanos y con, como agente II, el calixareno p-sulfonato-3,7-(2-amino-etiloxi)-calix-[6]-areno (denominado C6S). Los ensayos se realizan como se ha indicado en el ejemplo anterior, excepto que se utilizó C6S preparado como se indica en la solicitud de patente WO2004/059322, con una concentración de
50 mg/ml.

La figura 19 da los resultados obtenidos (representación esquemática, panel superior, y foto, panel inferior) a partir de la autorradiografía de un gel de electroforesis seguida de una transferencia de Western, obtenida después de la migración de la proteína SYN en el plasma después del tratamiento con los calixarenos. La figura 19A corresponde a la fracción de sedimentos mientras que la figura 19B corresponde a los sobrenadantes. Las pistas 1 a 8 corresponden a diferentes concentraciones de la proteína Syn tratada con los calixarenos, las pistas 10 a 12 corresponden a la proteína Syn no tratada y la pista 9 contiene marcadores de peso molecular.

Las concentraciones de proteína con respecto a las pistas de electroforesis son tales como se indican en las tablas 13 y 14 a continuación.

TABLA 13 (figura 19A)

19

TABLA 14 (figura 19B)

20

Los resultados muestran que la proteína Syn se encuentra en el sedimento después del tratamiento con el agente II, con una sensibilidad de 25 ng/ml. Su presencia en el sedimento atestigua su captura, que en este caso creó las condiciones favorables para su precipitación a partir del volumen de muestra ensayado. Estas moléculas inducen, por lo tanto, una captura de la proteína recombinante Syn después de una incubación de 60 minutos a 37ºC y favorecen su concentración mediante un centrifugado simple. Esta captura es total ya que no se encuentra la proteína en la fracción de sobrenadante hasta una concentración de 100 ng/ml.

Estos resultados se confirman en ensayo Elisa (véase el ejemplo 10) (figura 20) en el que una concentración de 25 ng/ml se detecta de manera significativa en el sedimento con respecto al sobrenadante.

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Ejemplo 11 Detección de la proteína Tau total en presencia de un agente II (procedimiento que no pertenece a la invención) Técnica de análisis

El análisis se realiza de acuerdo con la técnica inmunoenzimática convencional de tipo "ELISA sándwich" como se describe por Kohnken y col (Neuroscience Letters 287 (2000) 187-190) donde los calixarenos sustituyen al anticuerpo utilizado habitualmente en captura.

El ensayo Elisa se basa en la utilización de microplacas activadas por NHS en las que se injertan calixarenos a una concentración de 0,6 mg/ml durante 2 h a temperatura ambiente. Después de realizar 3 lavados en agua destilada las placas se secan al vacío 15 minutos a 37ºC. A continuación las placas se pasivizan con 200 \mul/pocillo de PBS que contiene el 0,5% de leche durante 1 h a 37ºC. Después de 3 lavados en PBS que contiene el 0,05% de Tween20, las placas están listas para su empleo. Extractos de cerebros de pacientes afectados (AD+) o no de la enfermedad de Alzheimer (AD-) se diluyen en un tampón que contiene 200 \mug/ml de albúmina humana, 22 \mug/ml de IgG humana y 0,15 \mug/ml de IgM humanas en un tampón bicarbonato Krebs-Ringer. Se ensayan concentraciones de 1 a 10000 ng; 100 \mul de estas diluciones se incuban durante 1 h 30 minutos a 37ºC. 100 \mul de un anticuerpo monoclonal de ratón específico de la proteína Tau T14 (Zymed) a la concentración de 3 \mug/ml diluida en tampón PBS que contiene el 0,05% de Tween20 se incuban a continuación durante 1 h a 37ºC. Para reconocer al anticuerpo anti T14 fijado, un anticuerpo de cabra anti IgG de ratón marcado con peroxidasa (Jackson) se utiliza a 0,5 \mug/ml en tampón PBS que contiene el 0,05% de Tween20 durante 45 minutos a 37ºC. Un reactivo Lumiglo (Kirkegaard and Perry laboratories, US) se añade a cada pocillo y la quimioluminiscencia se lee en un luminómetro (Berthold, Centro LB 960). Los datos obtenidos están en forma de unidad relativa de luz (RLU). Entre cada etapa descrita anteriormente, los pocillos se lavan con tampón PBS que contiene el 0,05% de Tween20.

Los resultados de la figura 21 muestran que la proteína Tau es capturada perfectamente por los calixarenos hasta una concentración de 1 ng/ml. Esta captura permite la detección por un anticuerpo específico en un formato de ensayo Elisa. El experto en la materia habrá observado un "efecto de gancho" para las grandes concentraciones de proteína, fenómeno fácilmente solucionado durante una optimización realizada por un experto. El diferencial obtenido entre los pacientes afectados por la enfermedad de Alzheimer (AD+) y los pacientes no afectados (AD-) permite la utilización de este ensayo de forma rutinaria en un laboratorio.

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Ejemplo 12 Detección de la proteína syn en presencia de los agentes I y II Técnica de análisis

El primer análisis se realiza según la técnica inmunoenzimática convencional de tipo "ELISA sándwich": human alpha-synuclein ELISA kit (BioSource KHB0061) siguiendo las recomendaciones del proveedor.

El segundo análisis se realiza según la técnica inmunoenzimática convencional de tipo "ELISA sándwich" como se describe por Kohnken y col (Neuroscience Letters 287 (2000) 187-190) donde los calixarenos sustituyen al anticuerpo utilizado habitualmente en captura.

El ensayo Elisa se basa en la utilización de microplacas activadas por NHS en las que se injertan calixarenos (agente II) a una concentración de 0,6 mg/ml durante dos horas a temperatura ambiente. Después de realizar 3 lavados en agua destilada las placas se secan al vacío 15 minutos a 37ºC. A continuación las placas se pasivizan con 200 \mul/pocillo de PBS que contiene el 0,5% de leche durante 1 h a 37ºC. Después de 3 lavados en PBS que contiene el 0,05% de Tween20, las placas están listas para su empleo.

Los ensayos se realizan con extractos de cerebros de pacientes afectados por la enfermedad de Alzheimer (20 \mug/ml) y una proteína Alfa sinucleína (SYN) recombinante (rPeptide) (25 ng/ml) se sobrecargan en una mezcla (pool) de plasmas humanos. Las muestras se precipitan en presencia de agente I (estreptomicina a 500 mg/ml). Una vez puestos en contacto la muestra y el agente I, la mezcla se incuba durante 60 minutos a 37ºC.

Las muestras se centrifugan a continuación durante 10 minutos a 13000 rpm. Los sedimentos se recuperan y los sedimentos se separan de los sobrenadantes. Todas las fracciones se conservan. Los sedimentos se recogen con 25 \mul de Guanidina-HCl 6 M, se calientan o no durante 1 minuto a 90ºC y después se diluyen en 225 \mul de tampón tris-maleato. Las muestras están entonces listas para depositarlas sobre placas.

La figura 22 muestra los resultados obtenidos después de la precipitación con el agente I y la detección con una técnica Elisa convencional con captura por anticuerpos (primer análisis; sin utilización de agente II). Los resultados muestran que la proteína recombinante es detectada en el plasma después de precipitación con el agente I; sin embargo, su precipitación en forma agregada no permite una detección óptima. La precipitación tampoco es total, ya que la proteína es detectada en el sobrenadante y que esta forma monomérica es perfectamente capturada por los anticuerpos. Por el contrario, en el extracto de cerebros, en el que la proteína está mayoritariamente en forma agregada, se observa enseguida que la detección en la muestra no tratada es reducida y que, después del tratamiento con un agente I, la proteína no se detecta ni en el sedimento ni en el sobrenadante en las condiciones operatorias de este ejemplo.

La figura 23 muestra los resultados obtenidos después de precipitación en forma agregada con el agente I y detección con una técnica ELISA convencional con captura por el agente II. Los resultados muestran que la proteína recombinante y el extracto de cerebro se detectan poco o nada si no son tratados. Por el contrario, después de la acción del agente I, puede verse muy fácilmente el interés de utilizar el agente II como herramienta de captura. En efecto, tanto en el caso de la proteína recombinante como en el del extracto de cerebro, la proteína Syn en su forma agregada se detecta perfectamente en el sedimento de precipitación. Además, la etapa de calentamiento permite mejorar la señal obtenida.

Por lo tanto, se puede concluir que la asociación de agente I/agente II permite mejorar la detección de la proteína alfa-sinucleína en una muestra tal como el plasma.

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Ejemplo 13 Detección de la proteína Tau fosforilada en presencia de los agentes I y II

La técnica de análisis es la misma que la descrita en el ejemplo 8, excepto que los anticuerpos de captura son sustituidos por calixarenos (agente II) como se ha descrito en el ejemplo 12. El anticuerpo de detección utilizado es un anticuerpo monoclonal desarrollado por bioMérieux y se utiliza conjugado a la peroxidasa a una concentración de 1 \mug/ml. Este anticuerpo monoclonal se obtuvo después de la inmunización con un péptido fosforilado, obtenido de la proteína Tau fosforilada en posición 231.

La muestra utilizada es un extracto de cerebro de paciente que tiene la enfermedad de Alzheimer (AD pos) y sobrecargado en una mezcla (pool) de plasma de pacientes sanos. Los ensayos se realizan con 25 ng de extracto de cerebros y con, como agente I, estreptomicina, en forma de sulfato, a diferentes concentraciones. Una vez puestos en contacto la muestra y el agente I, la mezcla se incuba durante 60 minutos a 37ºC. Las muestras se centrifugan a continuación durante 10 minutos a 13000 rpm. Los sedimentos se recuperan y los sedimentos se separan de los sobrenadantes. Todas las fracciones se conservan. Los sedimentos se recogen con 250 \mul de tampón tris-maleato (a no ser que se indique lo contrario). Las muestras están entonces listas para depositarlas sobre placas.

Los resultados de la figura 24 muestran que la proteína Tau fosforilada se detecta difícilmente en una muestra de plasma no tratada. Por el contrario, parece claramente que, después de la agregación por el agente I, su detección en un ensayo Elisa, en el que la captura se realiza mediante un agente II, se hace posible en el sedimento. Por lo tanto, se puede concluir que la asociación agente I/agente II permite mejorar la detección de la proteína Tau fosforilada en una muestra tal como el plasma.

<110> bioMérieux

\hskip1cm

Centre National de la Recherche Scientifique

\hskip1cm

Université Claude Bernard Lyon 1

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<120> Procedimiento de detección de las formas proteicas circulantes de agregación utilizando un agente de agregación de las formas proteicas circulantes de agregación y un agente de captura de los agregados formados

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<130> Neuroninf

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<160> 6

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<170> Patentin versión 3.3

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<210> 1

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<211> 140

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<212> PRT

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<213> humano

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<400> 1

\hskip1cm

22

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 2

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<211> 770

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<212> PRT

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<213> humano

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 2

\hskip1cm

23

\hskip1cm

24

\hskip1cm

25

\hskip1cm

26

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<210> 3

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<211> 465

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<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> humano

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 3

\hskip1cm

27

\hskip1cm

28

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<210> 4

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<211> 758

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<212> PRT

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<213> humano

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<400> 4

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29

\hskip1cm

30

\hskip1cm

31

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<210> 5

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<211> 40

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<212> PRT

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<213> humano

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 5

\hskip1cm

32

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 6

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<211> 42

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<212> PRT

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<213> humano

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 6

\hskip1cm

33

Claims (11)

1. Procedimiento de detección de al menos una forma proteica circulante de agregación (FCPA) vinculada a las enfermedades neurodegenerativas no infecciosas en una muestra biológica de origen humano susceptible de contener dichas FCPA, conteniendo dichas FCPA:

a)

aminoácidos cuyas cadenas laterales tienen todas una función ácida o una función aceptora de puentes de hidrógeno y que estén presentes globalmente al menos 4 veces en una secuencia peptídica de longitud inferior o igual a 20 aminoácidos y

b)

un mínimo de tres aminoácidos básicos en una secuencia peptídica de longitud inferior o igual a quince aminoácidos,

caracterizado porque emplea un agente 1 no proteico que produce la agregación de las formas circulantes de las proteínas no infecciosas implicadas en procesos de agregación patológica del sistema nervioso central, que se selecciona entre rifampicina, isoniazida, etambutol, trietilentetraamina, bis-3-aminopropilamina, tetraclorhidrato de espermina, sesquisulfato de dihidroestreptomicina y estreptomicina y un agente II no proteico de captura de los agregados naturales de FCPA o inducidos por dichos agentes I, que es un metaciclofano o un glucosaminoglucano, y porque realiza la revelación de la presencia de dichas FCPA.

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2. Procedimiento de detección de al menos una FCPA de acuerdo con la reivindicación 1, caracterizado porque dicho agente I se añade a dicha muestra biológica para la agregación de las FCPA antes que dicho agente II.

3. Procedimiento de detección de al menos una FCPA de acuerdo con la reivindicación 2, caracterizado porque comprende las etapas que consisten en:

a)

añadir a dicha muestra dicho agente I para agregar las FCPA,

b)

poner a la mezcla obtenida de este modo en contacto con dicho agente II para capturar dichos agregados de FCPA y

c)

revelar la presencia de las FCPA.

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4. Procedimiento de detección de al menos una FCPA de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado porque comprende al menos una de las siguientes etapas suplementarias i) y ii) que consisten
en:

i)

separar los agregados de FCPA de la mezcla de reacción y

ii)

desnaturalizar los agregados de FCPA,

estando estas etapas incluidas, llegado el caso, entre la etapa a) y la etapa b).

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5. Procedimiento de detección de al menos una FCPA de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizado porque se añade al menos un socio de unión específico de las FCPA para una reacción inmunológica entre el socio de unión específico de las FCPA y las FCPA, llegado el caso en la etapa c).

6. Procedimiento de detección de al menos una FCPA de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizado porque dicho agente II está unido a un soporte sólido.

7. Procedimiento de detección de al menos una FCPA de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, caracterizado porque el metaciclofano es p-sulfonato-3,7-(2-aminoetiloxi)-calix-[6]-areno.

8. Procedimiento de detección de al menos una FCPA vinculada a enfermedades neurodegenerativas no infecciosas, conteniendo dichas FCPA aminoácidos cuyas cadenas laterales tienen una función ácida o una función aceptora de puentes de hidrógeno y que están presentes globalmente al menos 4 veces en una secuencia peptídica de longitud inferior o igual a 20 aminoácidos, caracterizado porque comprende la etapa de puesta en contacto de una muestra biológica, procedente u obtenida de un organismo humano, con un agente I no proteico que produce la agregación de las formas circulantes de las proteínas no infecciosas implicadas en procesos de agregación patológica del sistema nervioso central, que se selecciona entre rifampicina, isoniazida, etambutol, trietilentetraamina, bis-3-aminopropilamina, tetraclorhidrato de espermina, sesquisulfato de dihidroestreptomicina y estreptomicina y porque realiza la revelación de la presencia de dichas FCPA.

\newpage

9. Procedimiento de detección de al menos una FCPA de acuerdo con la reivindicación 8, caracterizado porque se añade al menos un socio de unión específico de las FCPA para una reacción inmunológica entre el socio de unión específico de las FCPA y las FCPA.

10. Utilización de un kit de diagnóstico que comprende un agente I no proteico que produce la agregación de las formas circulantes de las proteínas no infecciosas implicadas en procesos de agregación patológica del sistema nervioso central, que se selecciona entre rifampicina, isoniazida, etambutol, trietilentetraamina, bis-3-aminopropilamina, tetraclorhidrato de espermina, sesquisulfato de dihidroestreptomicina y estreptomicina para la detección de al menos una FCPA vinculada a enfermedades neurodegenerativas no infecciosas.

11. Utilización de un kit de acuerdo con la reivindicación 10, caracterizado porque también comprende un metaciclofano o un glucosaminoglucano.