KR102323688B1 - 알파-시뉴클레인 검출 분석 및 알파-시뉴클레인병증의 진단 방법 - Google Patents

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Abstract

생물학적 샘플에서 알파-시뉴클레인 응집물의 존재를 검출하는 방법이 제공되되, 생물학적 샘플은 비드 집단, 단백질 응집물에 결합하기에 그리고 단백질 응집물에 결합되었을 때 형광을 증가시키기에 적합한 형광단, 및 알파 시뉴클레인 또는 이들의 단편 또는 변이체를 포함하는 반응 샘플과 혼합되어 반응 혼합물을 형성하고, 반응 혼합물은 간헐적 교반 주기로 동시에 인큐베이션되며, 인큐베이션 동안 상기 반응 혼합물 형광의 상당한 증가는 상기 생물학적 샘플 중의 알파-시뉴클레인 응집물의 존재를 나타낸다. 알파-시뉴클레인병증, 예컨대 파킨슨병 또는 루이소체 치매를 진단하는 방법.

Description

알파-시뉴클레인 검출 분석 및 알파-시뉴클레인병증의 진단 방법
본 발명은 생물학적 샘플 중의 응집된 단백질의 검출을 위한 분석, 더 구체적으로는 생물학적 샘플 중의 응집된 알파-시뉴클레인의 검출을 위한 분석에 관한 것이다.
알파-시뉴클레인(a-syn)은 염색체 4에 위치된 SNCA 유전자에 의해 암호화된 140개의 아미노산 및 19kDa의 분자량의, 잘 보존된 소형 산성 단백질이다.1 이것이 시냅스 소포 생물학에서 어떤 역할을 하는 중추 신경계 내의 시냅스전 신경 말단에서 고농도로 위치된다.2 시뉴클레인병증은 뉴런 및 교세포의 선택적 집단 내에서 a-syn의 섬유성 응집물의 침착과 관련된 신경퇴행성 장애의 한 세트이다. 이들 침착은 루이소체(Lewy body: LB)로서 뉴런 세포 내에서 또는 파킨슨병(Parkinson's disease: PD) 또는 루이소체 치매(Dementia with Lewy body: DLB)와 같은 질환에서의 이영양성 신경돌기에서; 또는 다계통 위축(multiple system atrophy: MSA)에서의 교세포 세포질 봉입체에서 발견될 수 있다.3
a-syn의 존재는 뇌척수액(cerebrospinal fluid: CSF)4 및 혈청과 같은 생물학적 유체에서 검출되었다.5 ELISA에 의한 CSF 중의 a-syn 농도의 측정은 a-syn 관련 장애에 대한 바이오마커로서 제안되었다. 그러나, PD에서 그리고 DLB에서 CSF a-syn 수준의 감소를 나타내는 다수의 연구에도 불구하고4,6, 전반적인 결과는 일치되지 않는다.7 CSF a-syn의 감소가 입증된 해당 연구에서조차, 차이는 작으며8 환자 그룹 내에서 그리고 환자와 대조군 사이에 상당한 중복이 있다. 추가로, 연구실 간의 CSF a-syn 측정의 표준화는 어려운 것으로 증명되었다.9
a-syn의 응집 특성은 최근에 프리온 단백질과 비교되었는 데, 이의 응집은 전달성 해면상뇌증(transmissible spongiform encephalopathy: TSE)을 야기한다.10 사실, 알파-시뉴클레인병증이 실제로 프리온-유사 질환인지에 관해 현재의 문헌에서 다수의 논의가 있다.11 자기-응집을 유도하는 프리온 단백질의 능력을 이용하는 실시간 떨림 유발 전환(real-time quaking induced conversion: RT-QuIC)으로 불리는 최근에 기재된 기법은 TSE의 가장 통상적인 인간 형태인 산발적 크로이츠펠트-야콥병(sporadic Creutzfeldt-Jakob disease: sCJD)에 대한 진단적 CSF 검사를 개발하는데 사용되었다.12
그러나, 프리온 단백질과 a-syn 사이의 상당한 차이를 고려하여, 이들 기법은 생물학적 샘플 중의 a-syn 또는 a-syn 응집의 존재를 임의의 신뢰 가능한 방법으로 검출하지 못하였다. 따라서, 생물학적 샘플 중의 a-syn 및 a-syn 응집의 존재를 검출하기 위한 신뢰 가능한 분석에 대한 필요가 남아있다.
본 발명의 적어도 하나의 목적은 생물학적 샘플 중의 a-syn 및/또는 a-syn의 응집의 존재를 검출하는 개선된 분석을 제공하는 것이다.
본 발명의 제1 양상에 따르면, 생물학적 샘플 중의 알파-시뉴클레인 응집물의 존재를 검출하는 방법이 제공되며, 상기 방법은:
(i) 생물학적 샘플을 제공하는 단계;
(ii) 비드 집단, 단백질 응집물에 결합하기에 그리고 단백질 응집물에 결합되었을 때 형광을 증가시키기에 적합한 형광단, 및 알파 시뉴클레인 또는 이들의 단편 또는 변이체를 포함하는 반응 샘플을 제공하는 단계;
(iii) 상기 생물학적 샘플을 상기 반응 샘플과 합하여 반응 혼합물을 형성하는 단계;
(iv) 상기 반응 혼합물을 간헐적 교반 주기로 인큐베이션시키는 단계;
(v) 상기 반응 샘플의 형광단을 여기시키는 광의 파장을 이용하여 상기 샘플을 발광시키는 단계; 및
(vi) 인큐베이션 동안 상기 반응 혼합물의 상기 형광 수준을 결정하는 단계를 포함하되,
상기 단계 (iv) 내지 (vi)은 동시에 수행되고, 단계 (iv) 내지 (vi) 동안에 상기 반응 혼합물의 상기 형광의 상당한 증가는 상기 반응 혼합물 중의 알파-시뉴클레인의 응집물의 존재를 나타내며, 상기 반응 혼합물 중의 알파-시뉴클레인의 응집물의 존재는 상기 생물학적 샘플 중의 알파-시뉴클레인의 응집물의 존재를 나타낸다.
당업자는 용어 "알파-시뉴클레인", "a-syn", "α-시뉴클레인", 및 α-syn"은 알파-시뉴클레인 단백질을 지칭하고, 전체적으로 상호 호환적으로 사용된다는 것이 이해될 것이다. 예를 들어, 생물학적 샘플이 인간 대상체로부터 얻어지는 실시형태에서, 알파-시뉴클레인은 서열번호 1의 서열을 갖는 인간 알파-시뉴클레인이다:
Figure 112019011799416-pct00001
알파-시뉴클레인에 관한 용어 "단편"은 알파-시뉴클레인 서열의 적어도 10, 20, 30, 50, 100, 120, 130 또는 140개의 인접한 뉴클레오타이드, 또는 그 사이의 임의의 정수의 폴리뉴클레오타이드 중 하나를 의미하는 것으로 의도되며; 바람직한 단편은 본 발명의 방법의 조건 하에서 응집할 수 있는 것이다. 예를 들어, 단편은 천연 알파-시뉴클레인 서열의 아미노산 서열 1 내지 60 또는 61 내지 140을 포함할 수 있다.
알파-시뉴클레인에 대한 "변이체"는 펩타이드 또는 폴리펩타이드 서열에서 적어도 하나의 아미노산 치환, 삽입 및/또는 결실 또는 단백질에 화학적으로 연결된 모이어티에 대한 변경을 갖는 알파-시뉴클레인 단백질을 의미한다.
보존적 치환: 유사한 생화학적 특성을 갖는 아미노산 잔기로 하나 이상의 아미노산 치환(예를 들어, 1, 2, 5 또는 10개의 잔기). 전형적으로, 보존적 치환은 얻어진 펩타이드 또는 폴리펩타이드의 활성에 대한 영향이 거의 없거나 또는 전혀 없다. 예를 들어, 알파-시뉴클레인에서 보존적 치환은 본 발명의 방법의 반응 조건에서 펩타이드가 응집하는 능력에 실질적으로 영향을 미치지 않는 아미노산 치환일 수 있다. 특정 예에서, 알파-시뉴클레인에서 보존적 치환은 본 발명의 방법의 반응 조건 하에서 단백질이 응집하는 능력을 유의하게 변경하지 않는 아미노산 치환이다. 아미노산 잔기가 아미노산 치환을 용인할 수 있는 알파-시뉴클레인의 변이체의 선별을 동정하기 위해 사용될 수 있다.
일 예에서, 알파-시뉴클레인은 인간 알파-시뉴클레인일 수 있고, 하나의 보존적 치환, 예컨대 서열변호 1에서의 보존적 치환이 펩타이드에 포함될 수 있다. 다른 예에서, 10개 이하(예컨대, 5개 이하)의 보존적 치환이 펩타이드에 포함된다. 따라서 본 발명의 펩타이드 또는 단백질은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개 이상의 보존적 치환을 포함할 수 있다. 폴리펩타이드는, 예를 들어, 표준 절차, 예컨대 부위-지정 돌연변이유발 또는 PCR을 이용하여 해당 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 조작함으로써 하나 이상의 보존적 치환을 함유하도록 생산될 수 있다. 대안적으로, 폴리펩타이드는, 예를 들어 당업계에 공지된 펩타이드 합성 방법을 이용함으로써 하나 이상의 보존적 치환을 함유하도록 생산될 수 있다.
치환적 변이체는 아미노산 서열에서 적어도 하나의 잔기가 제거된 것 및 상이한 잔기가 그의 위치에 삽입된 것이다. 단백질에서 본래의 아미노산을 치환할 수 있고 보존적 치환으로 간주되는 아미노산의 예는 Ser을 Ala으로; Lys을 Arg으로; Gln 또는 His을 Asn으로; Glu을 Asp으로; Asn을 Gln으로; Asp를 Glu으로; Pro을 Gly으로; Asn 또는 Gln을 His으로; Leu 또는 Val을 Ile으로; Ile 또는 Val을 Leu으로; Arg 또는 Gln을 Lys으로; Leu 또는 Ile을 Met으로; Met, Leu 또는 Tyr을 Phe으로; Thr을 Ser으로; Ser을 Thr으로; Tyr을 Trp으로; Trp 또는 Phe을 Tyr으로; 그리고 Ile 또는 Leu을 Val으로를 포함한다.
일 실시형태에서, 치환은 Ala, Val, Leu 및 Ile 중; Ser 및 Thr 중; Asp 및 Glu 중; Asn 및 Gln 중; Lys 및 Arg 중; 그리고/또는 Phe 및 Tyr 중에 있다.
위치 중에서도 보존적 치환에 관한 추가적인 정보는, 문헌[Ben-Bassat et al., (J. Bacteriol. 169:751-7, 1987), O'Regan et al., (Gene 77:237-51, 1989), Sahin-Toth et al., (Protein Sci. 3:240-7, 1994), Hochuli et al., (Bio/Technology 6:1321-5, 1988]), WO 00/67796(Curd et al.)에 그리고 유전학 및 분자 생물학의 표준 교재에서 찾을 수 있다.
정상적으로 알파-시뉴클레인은 응집에 저항하는 안정하게 폴딩된 4량체를 형성한다. 그러나, 알파-시뉴클레인에서 돌연변이는 응집을 촉진시키며, 알파-시뉴클레인의 이런 응집은 알파-시뉴클레인병증, 예컨대 루이소체 치매 및 파킨슨병에 연루되는 것으로 여겨지는 피브릴의 주요 빌딩 블록이라는 것이 시사되었다.
따라서, 생물학적 샘플이 알파-시뉴클레인의 응집물을 포함하는지 여부의 검출 또는 결정은 침습적 또는 값비싼 기법을 필요로 하는 일 없이 이러한 병리의 검출을 허용할 수 있고, 그들이 표준 방법을 이용하여 가능하게 되기 전에 이러한 병리의 검출을 허용할 수 있다.
실시간 떨림 유발 전환(RT-QuIC)과 같은 분석은 지금까지 알파-시뉴클레인의 응집물의 존재를 검출할 수 없었다. 본 발명자들은 놀랍게도 본 발명의 변형된 RT-QuIC 방법이 매우 높은 민감성 및 특이성으로 알파-시뉴클레인의 검출을 허용하고, 알파-시뉴클레인 응집 관련 병리가 다른 단백질 응집 관련 병리와 구별되게 허용한다는 것을 발견하였다.
"형광의 상당한 증가"는 적합한 시점에, 전형적으로 90 내지 120시간 내에 적어도 평균 상대적 형광에서의 형광 증가 + 음성 대조군의 평균 상대적 형광 또는 기준 형광의 표준 편차의 2배를 지칭한다.
전형적으로, 생물학적 샘플은 체액 샘플이다. 그러나, 생물학적 샘플은 세포 기반 조직 샘플일 수 있다. 생물학적 샘플은 본 발명의 방법을 이용하는 분석을 위해 대상체로부터 취하여 건강 관리자가 대상체가 알파-시뉴클레인의 응집물의 존재와 관련된 질환을 가질 수 있는지의 여부를 결정하도록 허용할 수 있다.
체액은 뇌척수액, 혈액, 또는 혈액 분획, 비강액 또는 조직, 소변, 분변 및 림프를 포함하는 군으로부터 선택될 수 있다. 바람직하게는, 체액은 뇌척수액, 혈액 혈장 또는 다른 분획, 및 비강 조직 또는 유체를 포함하는 군으로부터 선택된다. 예를 들어, 체액은 뇌척수액일 수 있다. 다른 예에서, 체액은, 예를 들어, 비강 면봉을 이용하여 추출된 비강 조직 또는 유체일 수 있다. 추가 예에서, 체액은 혈액 샘플 또는 혈액 분획일 수 있다.
따라서, 본 발명의 방법은 대상체로부터 취한 생물학적 샘플로부터 알파-시뉴클레인의 응집과 관련된 질환의 검출을 허용하여, 비침습적 진단 또는 예후 방법을 허용할 수 있다.
생물학적 샘플은 전형적으로 포유류 대상체로부터, 바람직하게는 인간 대상체로부터 취한다. 그러나, 생물학적 샘플은 어류, 조류, 파충류 또는 양서류 대상체로부터 취할 수 있다.
반응 샘플은 전형적으로 용매를 포함한다. 반응 샘플이 수용액이 되도록 용매는 수성 용매일 수 있다.
반응 샘플은 반응 샘플의 pH를 실질적으로 유지하기 위한 완충 반응 샘플일 수 있다. 예를 들어, 반응 샘플은, 예를 들어 생물학적으로 허용 가능한 완충제, 예컨대 트리스(하이드록시메틸)아미노메탄(TRIS), 인산염 완충 식염수(PBS), 4-(2-하이드록시에틸)-1-피페라진에탄설폰산(HEPES), 피페라진-N,N'-비스(2-에탄설폰산)(PIPES), 또는 소렌센 인산염 완충제를 포함할 수 있다.
전형적으로, 반응 샘플은 반응 샘플의 pH를 약 pH 6 내지 약 pH 8.5로 유지하도록 완충된다. 바람직하게는, 반응 샘플은 반응 샘플의 pH를 약 7.0 내지 약 8.5로 유지하도록 완충된다. 예를 들어, 반응 샘플은 샘플의 pH를 pH 7.0, 7.2, 7.4, 7.6, 7.8, 8.0, 8.2 또는 8.4로 유지하도록 완충될 수 있다.
바람직하게는, 반응 샘플은 pH를 9.0 미만의 pH로 유지하도록 완충된다.
바람직하게는, 반응 샘플은 반응 샘플의 pH를 pH 8.0, 8.2 또는 8.4에서 유지하도록 완충된다.
단백질의 응집물에 결합될 때, 반응 샘플의 형광단은 전형적으로 형광을 변화시킨다. 예를 들어, 형광단은 용액 중에서 유리될 때 약하게 형광성일 수 있고, 단백질 응집물에 결합될 때 강하게 형광성일 수 있다. 대안적으로, 형광단이 용액 중에서 유리될 때 형광단은 형광성이 아닐 수도 있고, 형광단이 단백질 응집물에 결합될 때 형광성일 수도 있다.
단백질 응집물은 상당한 베타-시트 함량을 포함할 수 있고, 비-응집 단백질은 상당한 베타-시트 함량을 결여할 수 있으며, 형광단은 단백질의 베타-시트에 결합하도록 구성될 수 있다.
형광단이 응집된 단백질에 결합될 때 형광단의 방출 스펙트럼은 이동될 수 있다. 예를 들어, 형광단이 단백질 응집물에 결합할 때, 형광단의 방출 스펙트럼은 적색-이동될 수 있다. 대안적으로, 형광단이 단백질 응집물에 결합할 때, 형광단의 방출 스펙트럼은 청색-이동될 수 있다.
전형적으로, 형광단은 티오플라빈이다. 바람직하게는, 형광단은 티오플라빈 T(ThT)이다.
대안적으로, 형광단은 사이아닌 T-284, 또는 단백질 응집물, 예컨대 알파-시뉴클레인 응집물에 결합될 때, 형광을 증가시키는 다른 형광단일 수 있다.
표준 RT-QuIC에서, 응집될 소량의 단백질은 단백질 응집을 위한 기질로서 작용하도록 반응 샘플 중에 포함된다. 따라서, 반응 샘플은 응집 기질로서 작용하도록 1㎎/㎖ 미만의 알파-시뉴클레인을 포함할 수 있다. 반응 샘플은 0.5㎎/㎖ 미만의 알파-시뉴클레인을 포함할 수 있다. 반응 샘플은 0.1㎎/㎖ 미만의 알파 시뉴클레인을 포함할 수 있다.
반응 샘플은 응집 기질로서 작용하도록 대략 0.01㎎/㎖의 알파-시뉴클레인 내지 약 10㎎/㎖의 알파-시뉴클레인을 포함할 수 있다. 반응 샘플은 응집 기질로서 작용하도록 대략 0.1 ㎎/㎖ 내지 약 1㎎/㎖의 알파-시뉴클레인을 포함할 수 있다.
반응 샘플의 알파-시뉴클레인은 인간 또는 다른 종으로부터의 재조합 알파-시뉴클레인일 수 있다. 반응 샘플의 알파-시뉴클레인은 전장 알파-시뉴클레인의 단편일 수 있다. 예를 들어, 단편은 전장 알파-시뉴클레인의 아미노산 1 내지 60 또는 61 내지 140을 포함할 수 있다.
반응 샘플의 비드 집단의 비드는 지르코니아, 실리카, 유리, 석영, 또는 중합체, 중합체 폴리스타이렌, 폴리테트라플루오로에틸렌(PTFE), 폴리메틸메타크릴레이트(PMMA), 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다.
전형적으로, 비드 집단은 비드의 평균 직경이 대략 1㎜ 내지 대략 0.001㎜이다.
비드 집단의 평균 직경은 대략 1㎜ 내지 대략 0.1㎜일 수 있다. 예를 들어, 비드의 평균 직경은 1㎜, 0.5㎜ 또는 0.1㎜일 수 있다.
비드 집단은 평균 직경으로부터 대략 + 또는 - 10% 직경의 표준 분포를 가질 수 있다. 따라서, 비드의 직경은 실질적으로 균질할 수 있다.
반응 샘플은 100㎕의 반응 혼합물 당 대략 1㎎ 내지 대략 150㎎의 비드를 포함할 수 있다. 반응 샘플은 100㎕의 반응 혼합물 당 대략 10㎎ 내지 대략 100㎎의 비드를 포함할 수 있다. 반응 혼합물은 100㎕의 반응 혼합물당 대략 10, 20, 30, 40 또는 50㎎의 비드, 또는 그 사이의 양을 포함할 수 있다. 예를 들어, 반응 혼합물은 100㎕의 반응 혼합물당 약 10 내지 50㎎의 비드, 100㎕의 반응 혼합물당 20 내지 50㎎의 비드, 또는 100㎕의 반응 혼합물당 30 내지 50㎎의 비드를 포함할 수 있다.
생물학적 샘플 중의 알파-시뉴클레인 응집물의 존재는 알파-시뉴클레인의 비정상적 응집과 관련된 질환을 나타낸다. 예를 들어, 질환은 루이소체 치매 또는 파킨슨병 질환, 또는 다른 알파-시뉴클레인병증일 수 있다.
반응 혼합물은 40시간 초과, 60시간 초과, 80시간 초과, 또는 120시간 초과 동안 인큐베이션될 수 있다. 반응 혼합물은 일정 기간 동안 교반될 수 있고, 일정 기간 동안 방치될 수 있다. 전형적으로, 반응 혼합물이 교반되는 기간은 반응 혼합물이 교반 없이 방치되는 기간보다 상당히 더 짧다. 반응 혼합물은 적어도 1분, 적어도 2분 또는, 또는 적어도 5분의 기간 동안 교반될 수 있다. 반응 혼합물은 적어도 10분, 적어도 15분 또는 적어도 20분의 기간 동안 방치될 수 있다. 예를 들어, 반응 혼합물은 1분의 기간 동안 교반될 수 있고, 14분의 기간 동안 교반 없이 방치될 수 있다.
간헐적 교반 주기는 간헐적 진탕 주기를 포함할 수 있다. 진탕 주기는 원형 또는 궤도 운동에서 반응 혼합물을 이동시킬 수 있고, 따라서, 진탕 속도는, 예를 들어, 분당 회전에 관해 정해질 수 있다. 대안적으로, 진탕 주기는 반응 혼합물을 단일 축을 따라서 앞뒤로 움직일 수 있고, 따라서, 진탕 속도는 분당 반복에 관해 정해질 수 있다.
반응 혼합물은 고정 속도로 교반이 실시될 수 있다. 다음에서, 교반 속도는 분당 회전으로 표현되지만, 진탕이 선형 움직임을 따르는 실시형태에 대해 분당 반복에 대해 동일하게 적용될 수 있다. 반응 혼합물은 분당 적어도 100회의 회전으로 교반이 실시될 수 있다. 반응 혼합물은 분당 적어도 150회의 회전으로 교반이 실시될 수 있다. 반응 혼합물은 분당 적어도 200회의 회전으로 교반이 실시될 수 있다. 반응 혼합물은 분당 적어도 100회의 회전 내지 적어도 300회의 회전으로 교반이 실시될 수 있다. 반응 혼합물은 분당 적어도 150회의 회전 내지 적어도 250회의 회전으로 교반이 실시될 수 있다. 예를 들어, 반응 혼합물은 분당 150, 200 또는 250회의 회전으로 교반이 실시될 수 있다. 바람직하게는, 반응 혼합물은 분당 200회의 회전으로 교반이 실시될 수 있다.
반응 혼합물의 필요한 교반 속도는 진탕기의 진탕 궤도에 따라 다를 수 있다. 반응 혼합물의 필요한 교반 속도는 상기 방법에서 사용되는 생물학적 샘플에 따라 다를 수 있다. 예를 들어, 생물학적 샘플이 혈액 분획, 예컨대 혈장 중의 혈소판인 실시형태에서, 예를 들어, 반응 혼합물은 분당 400, 600, 800, 900 또는 1000회의 회전 속도로 교반될 수 있다.
간헐적 교반 주기는 반응 혼합물의 간헐적 초음파처리를 포함할 수 있다. 반응 혼합물의 초음파 처리는 교반을 촉진시키기 위해 반응 혼합물을 교반시킬 수 있다. 반응 혼합물을 교반시키는 대안의 방법이 또한 사용될 수 있다.
본 발명의 방법은 25℃ 내지 45℃의 온도에서 수행될 수 있다. 본 발명의 방법은 30℃ 내지 40℃의 온도에서 수행될 수 있다. 예를 들어, 상기 방법은 30℃, 32℃, 34℃, 36℃, 38℃ 또는 40℃의 온도, 및 그 사이의 값에서 수행될 수 있다.
일 실시형태에서, 본 발명의 방법은 약 30℃의 온도에서 수행될 수 있다. 대안의 실시형태에서, 본 발명의 방법은 약 35℃, 또는 약 37℃의 온도에서 수행될 수 있다.
생물학적 샘플은 생물학적 샘플 중의 알파-시뉴클레인을 농축시키기 위한 본 발명의 방법 전에 처리될 수 있다. 생물학적 샘플은 복잡한 생물학적 샘플로부터 알파-시뉴클레인을 추출하기 위한 본 발명의 방법 전에 처리될 수 있다.
생물학적 샘플은 비드 집단으로 처리될 수 있다. 비드는 자기 물질을 포함할 수 있다. 예를 들어, 비드는 상자성 물질을 포함할 수 있고, 비드는 복합 혼합물로부터 비드를 추출하기 위해 외부에 적용된 자기장을 이용하여 비드 표면에 특이적으로 결합하는 물질을 분리시킬 수 있다. 자기 비드는 본 발명의 방법 전에 생물학적 샘플 중의 알파-시뉴클레인의 추출 또는 농축을 허용할 수 있다.
예를 들어, 비드는 초상자성 산화철, 또는 다른 상자성 물질을 포함할 수 있고, 알파-시뉴클레인은 비드에 결합될 수 있으며, 자기장의 적용은 비드, 및 그에 따른 알파-시뉴클레인이 생물학적 샘플에서 분리되거나 또는 농축되도록 허용할 수 있다.
본 발명의 제2 양상에서, 알파-시뉴클레인병증을 진단하는 방법이 제공되며, 상기 방법은:
(i) 대상체로부터 생물학적 샘플을 제공하는 단계;
(ii) 비드 집단, 단백질 응집물에 결합하기에 그리고 단백질 응집물에 결합되었을 때 형광을 증가시키기에 적합한 형광단, 및 알파 시뉴클레인 또는 이들의 단편 또는 변이체를 포함하는 반응 샘플을 제공하는 단계;
(iii) 상기 생물학적 샘플을 상기 반응 샘플과 합하여 반응 혼합물을 형성하는 단계;
(iv) 상기 반응 혼합물을 간헐적 교반 주기로 인큐베이션시키는 단계;
(v) 상기 반응 샘플의 형광단을 여기시키는 광의 파장을 이용하여 상기 샘플을 발광시키는 단계; 및
(vi) 인큐베이션 동안 상기 반응 혼합물의 상기 형광 수준을 결정하는 단계를 포함하되,
상기 단계 (iv) 내지 (vi)은 동시에 수행되고, 단계 (iv) 내지 (vi) 동안에 상기 반응 혼합물의 상기 형광의 상당한 증가는 알파-시뉴클레인병증을 갖는 대상체를 나타낸다.
알파-시뉴클레인병증은 전형적으로, 파킨슨병 또는 루이소체 치매이다.
본 발명은 수성 완충 용액을 포함하는 부품 키트(kit of parts)의 제공에 관한 제3 양상에서 확장되며, 수성 완충 용액은 비드 집단, 형광단 및 알파-시뉴클레인 또는 이의 단편 또는 변이체를 포함한다.
부품 키트는 제1 및 제2 양상의 방법을 위한 반응 샘플로서 사용될 수 있다.
본 발명의 제1 양상을 위한 바람직한 그리고 최적의 특징 및 제2 및 제3 양상을 위한 최적의 특징이 바람직하다.
본 발명의 실시형태는 이제 수반하는 도면을 참고로 하여 비제한적 예로서 기재할 것이다.
도 1: 표준 RT-QuIC 공정을 나타내는 개략적 다이어그램을 도시한 도면;
도 2: 루이소체 치매(DLB), 알츠하이머병(AD) 및 크로이츠펠트-야콥병(sCJD)을 갖는 환자와 대조군으로서 급사한(died suddenly: SD) 신경병리학적 질환의 증거가 없는 환자로부터의 뇌 파쇄액(brain homogenate: BH)에 대한 RT-QuIC 추적을 도시한 도면;
도 3: 혼합된 병변을 갖는 환자로부터의 BH 샘플에 대한 RT-QuIC 추적을 도시한 도면;
도 4: 확인된 DLB 및 sCJD 환자로부터의 뇌척수액(CSF) 샘플에 대한 RT-QuIC 추적을 도시한 도면;
도 5: DLB를 갖는 환자로부터의 대조군 CSF 샘플 및 하나의 BH 샘플에 대한 RT-QuIC 추적을 도시한 도면;
도 6: AD를 갖는 환자로부터의 CSF 샘플 및 DLB를 갖는 환자로부터의 하나의 BH 샘플에 대한 RT-QuIC 추적을 도시한 도면;
도 7: DLB를 갖는 환자로부터의 CSF 샘플 및 DLB를 갖는 환자로부터의 하나의 BH 샘플에 대한 RT-QuIC 추적을 도시한 도면;
도 8: DLB 및 AD를 갖는 환자로부터의 CSF 샘플 및 DLB를 갖는 환자로부터의 하나의 BH 샘플에 대한 RT-QuIC 추적을 도시한 도면;
도 9: 파킨슨병(PD)을 갖는 환자로부터의 CSF 샘플 및 대조군 대상체로부터의 CSF 샘플에 대한 RT-QuIC 추적을 도시한 도면;
도 10: A) 비드가 있는 그리고 B) 비드가 없는 SD BH 샘플에 대한 RT-QuIC 추적을 도시한 도면;
도 11: A) 비드가 있는 그리고 B) 비드가 없는 DLB BH 샘플에 대한 RT-QuIC 추적을 도시한 도면;
도 12: A) 비드가 있는 그리고 B) 비드가 없는 파킨슨병 뇌척수액(CSF) 샘플에 대한 RT-QuIC 추적을 도시한 도면;
도 13: A) 비드가 있는 그리고 B) 비드가 없는 루이소체 치매 CSF 샘플에 대한 RT-QuIC 추적을 도시한 도면;
도 14: A) 비드 없음 B) 18.7㎎의 비드/웰 및 c) 37.5㎎의 비드/웰의 루이소체 치매 BH 샘플에 대한 RT-QuIC 추적을 도시한 도면;
도 15: (A) 0.1㎜ 지르코늄/실리카 비드, (B) 0.5㎜ 지르코늄/실리카 비드 및 (c) 2.3㎜ 지르코늄/실리카 비드에 대해 대조군 대상체(SDBH), 루이소체병 환자(LBDBH), 알츠하이머병(ADBH) 또는 크로이츠펠트-야콥병(sCJDBH)으로부터의 BH 또는 비파종으로부터의 BH에 대한 RT-QuIC 추적을 도시한 도면;
도 16: 37㎎의 (A) 0.1㎜ 지르코늄/실리카 비드, (B) 0.5㎜ 지르코늄/실리카 비드 및 (c) 2.3㎜ 지르코늄/실리카 비드의 첨가에 의해 루이소체병(LB)을 갖는 환자로부터의 또는 대조군 대상체로부터의 CSF 샘플에 대한 RT-QuIC 추적을 도시한 도면;
도 17: (A) 0.5㎜ 강철 비드 또는 (B) 0.5㎜ 유리 비드를 이용하여, 대조군 대상체(SDBH), 루이소체병 환자(LBDBH) 및 알츠하이머병(ADBH)으로부터의 BH 샘플에 대한 그리고 비파종으로 남긴 해당 반응물과의 비교한 RT-QuIC 추적을 도시한 도면;
도 18: (A) 0.5㎜ 강철 비드 또는 (B) 0.5㎜ 유리 비드를 이용하여, 대조군 대상체, 및 루이소체병 환자(LBDBH)로부터의 CSF 샘플에 대한, 그리고 비파종으로 남긴 해당 반응물과 비교한 RT-QuIC 추적을 도시한 도면; 및
도 19: PD 및 대조군 대상체로부터의 EDTA 항-응고 혈액 샘플로부터 단리시킨 혈소판 샘플에 대한 RT-QuIC 추적을 도시한 도면.
본 발명의 다양한 실시형태를 생성하고 이용하는 것을 이하에 상세하게 논의하지만, 본 발명은 매우 다양한 특정 내용으로 구현될 수 있는 다수의 적용 가능한 개념을 제공한다는 것이 인식되어야 한다. 본 명세서에 논의되는 특정 실시형태는 단지 본 발명의 제조하고 사용하기 위한 구체적 방법을 예시하며, 본 발명의 범주를 정하는 것은 아니다.
본 발명의 이해를 용이하게 하기 위해, 다수의 용어를 이하에 정의한다. 본 명세서에 정의되는 용어는 본 발명에 적절한 영역에서 당업자에 의해 통상적으로 이해되는 것과 같은 의미를 가진다. 단수의 용어는 단수 독립체만을 지칭하는 것으로 의도되지는 않지만, 구체적 실시예가 예시를 위해 사용될 수 있는 일반적 부류를 포함한다. 본 명세서의 용어는 본 발명의 특정 실시형태를 기재하기 위해 사용되지만, 그들의 사용은 청구범위에 약술된 것을 제외하고, 본 발명의 범위를 제한하지는 않는다.
일반적 물질 및 방법
알파- 시뉴클레인에 대한 실시간 떨림 유발 응집
RT-QuIC 반응 완충제(RB)는 100mM 인산염 완충제(pH 8.2), 10μM 티오플라빈 T(ThT) 및 0.1㎎/㎖ 인간 재조합 전장(1-140aa) 알파-시뉴클레인(영국 캠브릿지에 소재한 스타테크(Stratech))로 구성되었다. 깨끗한 바닥을 갖는 검정색 96-웰 플레이트(영국에 소재한 날겐 눈크 인터내셔널(Nalgene Nunc International), 피셔 사이언티픽 엘티디(Fisher Scientific Ltd))의 각각의 웰은 98㎕, 90㎕ 또는 85㎕ RB(첨가한 종자의 용적에 따름) 및 37 ± 3㎎의 0.5㎜ 지르코늄/실리카 비드(영국 글래스고에 소재한 티스틀 사이언티픽 엘티디(Thistle Scientific Ltd))를 함유하였다. 반응물에 2㎕의 작업 강도 뇌 파쇄액(BH), 5㎕, 10㎕ 또는 15㎕의 비희석 CSF을 이용하여 100㎕의 최종 반응 용적까지 파종하였다. 플레이트 밀봉기 필름(영국에 소재한 피셔 사이언티픽 엘티디(Fisher Scientific Ltd))을 이용하여 플레이트를 밀봉시키고 나서, 30℃에서 120시간 동안 간헐적 진탕 주기(1분 진탕(200rpm), 14분 휴식을 이용하는 2회 궤도)를 이용하여 BMG 옵티마 플루오스타(OPTIMA FluoSTAR) 플레이트 판독기에서 인큐베이션시켰다. ThT 형광 측정(450㎚ 여기 및 480㎚ 방출)을 15분마다 취하였다. 각각의 샘플을 2회 중복하여 실행하여, 2개의 음성 대조군 샘플(SD 및 AD BH로 파종한 반응물), 1개의 양성 대조군(DLB BH로 파종한 반응물), 비파종 반응물 및 하나의 플레이트 상에서 시험될 44개의 CSF 샘플을 허용하였다.
환자 그룹
순수한 DLB(n=12), PD(n=2), 진행성 핵상마비(진행성 핵상 마비: PSP)(n=2), 피질기저 퇴행(n=3), AD 병리를 갖는 DLB(n=17), 부수적 LB를 갖는 AB(n=13), 순수한 AD(n=30) 및 대조군(n=20)의 임상적으로 그리고 신경병리학적으로 확인된 진단을 갖는 옵티마(OPTIMA) 코호트(기억과 노화를 연구하기 위한 옥스포드 프로젝트)로부터 얻은 99개의 CSF 샘플에 대해 CSF RT-QuIC 발생의 초기 상을 수행하였다. 1988에 개시된 옵티마는 임상 후속조치 동안 다중 시점에 CSF 수집을 포함하는 치매 및 노화의 전향적, 종단 임상-병리학적 연구이다. 모든 임상 및 병리학적 프로토콜은 상세하게 기재되어 있으며13 지역 윤리 위원회에 의해 승인되었고, 참가자는 등록전에 사전 동의서를 제공하였다.
RT-QuIC의 검증기를 옥스포드 디스커버리(Oxford Discovery) 코호트로부터 얻은 지금까지 가장 크게 임상적으로 잘 특성규명된 종단 PD 코호트인 CSF 샘플(20 PD, 15개의 대조군 및 3개의 위험 상태) 상에서 수행하였다. 이 코호트의 완전한 임상적 상세한 설명은 이전에 기재되었다.14 간략하게, 영국 PD 협회 뇌 은행 진단 기준15에 따라 3.5년 내에 진단된 특발성 PD를 갖는 환자를 2백 9십만명의 집단으로부터 2010년 9월과 2014년 9월 사이에 채용하였다(윤리 연구 10/H0505/71). 20명의 PD 환자 중의 평균 질환 지속기간은 1.6 ± 1.1년(범위 0.1 내지 3.2년) 및 혼과 야의 단계(Hoehn and Yahr stage) 1.9 ± 0.4(범위 1 내지 3, 가능한 최대값 스코어 5)였다. 대조군 집단을 연구에 참여하는 환자의 배우자 및 친구뿐만 아니라 일반 대중으로부터 채용하였다. REM 수면 행동을 갖는 환자를 포함하는 위험 상태 그룹을 밤새 수면다원 검사로 확인하였고,16 이 중 80%는 시간에 따라 루이소체 장애가 발생하는 것으로 나타났다.17 인구통계학 정보를 표 1에 제공한다.
연구한 옵티마 및 디스커버리 환자에 대한 환자 인구통계학적 정보
옵티마 환자(n) 사망 시 연령
평균 ± SD(범위)		 F/M
순수한 LBD (12) 80.8 ± 6.5 (71-92) 4/8
파킨슨병(2) 77.5 ± 7.8 (72-83) 0/2
혼합 LBD/AD (17) 80.1 ± 6.4 (69-90) 10/7
부수적 LB를 갖는 AD(13) 79.8 ± 7.8 (67-91) 9/4
순수한 AD(30) 77.7 ± 8.6 (61-93) 17/13
진행성 핵상 마비(PSP) (2) 69.5 ± 3.5 (67-72) 2/0
피질기저 퇴행 (CBD) (3) 64.0 ± 10.6 (52-72) 1/2
대조군(20) 82.9 ± 6.9 (68-93) 10/10
발견 환자(n)
파킨슨병(20) 65.1 ± 9.1 (42-80) 6/14
위험 상태 RBD 환자 (3) 67.6 ± 7.7 (59-74) 0/3
대조군(15) 65.8 ± 7.4 (55-83) 8/7
뇌 파쇄액
뇌 조직은 NCJDRSU에서의 MRC 뇌 은행(윤리적 라이센스 11/ES/0022)을 제공하였다. 모든 조직을 샘플링 2시간 내에 -80℃에서 냉동시키고 나서, 분석 전에 -80℃에서 저장시켰다. 뇌 조직을 사용 전에 2 내지 18년 저장하였다.
알츠하이머병(AD); 크로이츠펠트-야콥병(sCJD); 및 미만성 루이소체 치매(DLB)를 갖는 환자로부터 전두엽 조직을 취하였다. 추가로, MRC 급사 뇌 및 조직 은행(급사(SD) 대조군)으로부터의 신경퇴행성 질환이 없는 개체로부터 전두엽을 얻었다. 전두엽과 흑질 조직을 둘 다 혼합형 AD/DLB; 혼합형 sCJD/DLB 및 혼합형 AD/PD를 갖는 환자로부터 얻었다. 사용한 모든 사례를 조직학적으로 시험하였고, 국제적으로 허용되는 기준을 이용하여 진단에 도달하였다.18 1mM EDTA, 150mM NaCl, 0.5% 트리톤 X 및 로슈사(Roche)로부터의 완전 프로테아제 저해제 칵테일을 함유하는 인산염 완충 식염수(PBS)를 이용하여 초기 10% w/v 뇌 파쇄액(brain homogenate: BH)을 준비하였다. PBS를 이용하여 1:20,000 초과로 희석시킴으로써 후속 작업 강도 BH를 준비하였다.
뇌척수액 샘플
분석 전에 CSF 샘플을 -80℃에서 폴리프로필렌관 내 0.5㎖ 분취액 중에 저장하였다. 옵티마(OPTIMA) 코호트로부터의 99개의 CSF 샘플 및 옥스포드 파킨슨병 질병 센터(OPDC) 디스커버리 연구로부터의 38개의 CSF 샘플을 옥스포드 유니버시티의 임상신경과학의 너필드 부서(Nuffield Department of Clinical Neurosciences)로부터 받았다. 모든 CSF 샘플을 드라이 아이스 상에서 옥스포드로부터 에든버러로 수송하였고, 도착 시 -80℃에서 저장하였다. 추가로, NCJDRSU CSF 뱅크로부터 신경병리학적으로 확인된 sCJD 또는 DLB를 갖는 환자로부터의 CSF 샘플을 분석하였다. NCJDRSU CSF 뱅크로부터의 CSF 샘플 사용을 위한 윤리적 승인을 스코틀랜드 05/MRE00/67에 대한 멀티-센터 연구 윤리 위원회에 의해 보장받았다. 모든 CSF를 교반시키고 나서, 분석 전에 -80℃에서 저장하였다.
결과
DLB, 알츠하이머병(AD) 및 sCJD의 임상 병리학적 진단을 받은 환자로부터의 전두엽 BH를 이용하여 RT-QuIC의 연구에 착수하였다. 급사한 그리고 MRC 급사 뇌 은행의 부분인 신경학적 질환의 신경병리적 증거가 없는 환자를 대조군으로서 사용하였다(SD)(도 2). DLB로부터의 BH를 파종한 RT-QuIC 반응물은 50시간의 정체기를 가지며, 이후에 티오플라빈 T 형광 신호의 증가는 70시간에 최대가 되는 것으로 보였다. 다른 단백질 미스폴딩 장애(AD 또는 sCJD) 또는 SD 대조군을 갖는 환자로부터의 BH로 파종한 반응물 중 어떤 것도 120시간 후 조차 양성 반응을 제공하지는 않았다.
다수의 질환 병리, 특히, AD-관련 및 a-syn 병리는 통상적으로 공동 존재한다19. 대안의 단백질-미스폴딩 장애의 존재가 DLB 또는 PD 중 하나에 의해 유도되는 a-syn 응집을 방해하는지의 여부를 연구하기 위해, 혼합형 병리를 갖는 환자의 전두엽으로부터의 BH를 시험하였다(도 3). 제2 단백질 미스폴딩 장애, 예컨대 AD 또는 sCJD의 존재는 DLB 또는 PD BH에 의해 유도되는 RT-QuIC 반응을 저해하지 않는다(도 2 및 도 3). 개발한 RT-QuIC 방법이 CSF에서 a-syn을 검출하기에 충분히 민감한지의 여부를 연구하기 위해, 신경병리학적으로 확인된 DLB를 갖는 환자로부터의 2개의 CSF 샘플 및 sCJD의 신경병리학적으로 확인된 사례로부터의 1개의 CSF을 분석하였다(도 4). DLB 환자로부터의 CSF 샘플은 둘 다 60 내지 100시간 사이에 정체기를 갖는 양성 반응을 제공한다.
후속적인 신경병리학적으로 확인된 질환을 갖는 환자로부터의 옵티마 연구의 부분으로서 얻은 99개의 생체내 CSF 샘플의 탐색적 세트를 3가지의 상이한 용적(즉, 5, 10 및 15㎖)으로 분석하여 RT-QuIC의 민감도 및 특이성을 연구하고, 분석을 위한 최적의 CSF 용적을 계산하였다(표 2). 15㎕의 용적을 이용하여 DLB로부터의 CSF 샘플에 대해 92%의 민감도를 얻었고(도 7 및 도 8) 혼합형 DLB/AD 병리를 갖는 환자로부터의 CSF 샘플에 대해 65%의 민감도를 얻었다. 대조군 대상체(도 5) 또는 순수한 AD를 갖는 환자(도 6)로부터의 CSF 샘플 중 어떤 것도, CBD 또는 PSP 양성이 아니었다. CSF 샘플의 이러한 탐색적 세트를 이용하여, 양성 반응을 CSF 2개 중 적어도 하나의 120시간에 음성 대조군 평균의 2SD를 초과하는 상대적 형광 단위(rfu) 값으로서 정의하였다.
탐색적 환자 그룹(n) 5㎕를 이용하는 양성 RT-QuIC의 수(%) 10㎕를 이용하는 양성 RT-QuIC의 수(%) 15㎕를 이용하는 양성 RT-QuIC의 수(%)
부수적 LB를 갖는 AD(13) 2 (15%) 4 (31%) 2 (15%)
건강한 대조군(20) 0 (0%) 0 (0%) 0 (0%)
혼합형 DLB/AD (17) 9 (53%) 11 (65%) 11 (65%)
파킨슨병(2) 2 (100%) 2 (100%) 2 (100%)
진행성 핵상 마비(2) 0 (0%) 0 (0%) 0 (0%)
피질기저 퇴비(3) 0 (0%) 0 (0%) 0 (0%)
순수한 AD (30) 2 (7%) 1 (3%) 0 (0%)
순수한 DLB (12) 10 (83%) 11 (92%) 11 (92%)
민감도(DLB) 83% 92% 92%
특이성(대 대조군) 100% 100% 100%
특이성(대 AD) 93% 97% 100%
특이성(대 대조군 + AD) 96% 98% 100%
확증적 환자 그룹(n) 15㎕를 이용하는 양성 RT- QuiC(%)의 수
파킨슨병(20) / / 19 (95%)
위험 상태 PD 환자 (3) / / 3 (100%)
파킨슨병 대조군(15) / / 0 (0%)
민감도(PD) / / 95%
특이성 / / 100%
부수적 LB, AD, PD 및 건강한 대조군(탐색적 그룹)을 갖는 신경병리학적으로 확인된 DLB, 혼합된 DLB/AD, AD를 갖는 환자, 및 임상적으로 진단된 PD, 위험상태-PD, 신경병리학적으로 확인된 피질기저 퇴행 및 핵상마비를 갖는 환자 및 PD 대조군(확인 그룹)로부터의 CSF 샘플을 파종한 양성 RT-QuIC 반응. 양성 RT-QuIC 반응을 CSF 2개 중 적어도 하나의 120시간에 음성 대조군 평균의 2SD를 초과하는 상대적 형광 단위(rfu) 값으로서 분류하였다.
연구의 제2상은 거대 전향적, OPDC 디스커버리 코호트로부터 얻은20 임상적으로 진단된 PD를 갖는 20명의 환자, 15명의 대조군 환자 및 장래의 알파-시뉴클레인병증이 진행될 높은 위험에 있는 것으로 인식되는 REM 수면 행동 장애를 갖는 3명의 환자(RBD)20로부터의 확증 생체내 CSF 샘플의 세트에 이들 분석 조건 및 컷오프 기준을 적용하였다. 이들 CSF 샘플을 암호화하고, 최종 진단의 지식 없이 분석하고, 보고하였다. 샘플을 해독한 후에, 결과는 20명의 PD 환자 중 19명이 양성 RT-QuIC 반응을 가지고(도 9) 15명의 대조군 중 누구도 양성인 것으로 발견되지 않았다는 것을 나타낸다. 이는 각각 95% 및 100%의 PD에 대한 RT-QuIC 민감도 및 특이성을 초래하였다(표 2). 흥미롭게도, 진행 중인 PD의 위험 상태인 모두 3명의 환자는 양성 RT-QuIC 반응을 가졌다. 이들 환자는 RBD를 가졌고, 이 중 80%는 루이소체 장애가 발생하도록 진행되는 것으로 나타났다.20
논의
DLB와 PD 둘 다의 초기 진단은 민감성 및 신뢰 가능한 임상 진단 검사의 결여에 의해 방해된다. 조건은 둘 다 CSF 내로 방출된 a-syn의 응집 형태의 신경병리학적 침착에 의해 뒷받침된다. 본 발명자들은 100% 특이성과 함께 각각 92% 및 95%의 민감도를 갖는 DLB 및 PD에서 비응집 a-syn의 추가적인 응집을 유도하는 응집된 a-syn의 능력을 연구하였다. 독특하게, 본 발명자들은 루이소체 장애가 발생할 높은 장래의 위험에 있는 3명의 RBD 환자가 양성 RT-QuIC 반응을 제공한다는 것을 발견하였는데, 이는 시험은 전구증상 PD에 대한 초기 진단 검사로서 사용될 수 있다는 것을 시사한다. RBD 환자의 더 큰 코호트에서의 시험 검증에 중점을 둔 장래의 작업 다음에 진행 중인 종단적 평가는 신경보호 요법이 시험될 수 있는 초기 PD 전환의 가장 큰 위험에 있는 전구 증상 개체의 위험 계층화에서의 분석 효용을 검사할 것이다. 본 발명자들은 또한 CBD 및 PSP 환자로부터의 CSF 샘플이 양성 RT-QuIC 반응을 제공하지 않는다는 것을 발견하였다. 이들은 초기에 PD에 대해 잘못될 수 있는 a-syn보다는 타우 단백질의 이상과 관련된 행동 장애이다. 따라서, RT-QuIC는 비정상적 a-syn의 검출에 대한 새로운 접근 및 MSA과 같은 다른 알파-시뉴클레인병증에 추가로 PD 및 DLB의 초기 임상 진단을 개선할 가능성이 있는 것을 제공한다.
알파- 시뉴클레인의 검출을 위한 변형된 RT- QuiC 분석에서 비드의 역할
도 10 내지 도 13에 대해, 상기 분석에서 사용한 비드에 의해 행해지는 역할을 나타내기 위해, A) 비드가 있는 그리고 B) 비드가 없는 급사(SD) 뇌 파쇄액(BH) 샘플, A) 비드가 있는 그리고 B) 비드가 없는 루이소체 치매 BH 샘플, A) 비드가 있는 그리고 B) 비드가 없는 파킨슨병 뇌척수액(CSF) 샘플, 및 A) 비드가 있는 그리고 B) 비드가 없는 루이소체 치매 CSF 샘플에 대해 병행 분석을 수행하였다. 이들 분석을 상기 기재한 것과 동일한 일반적 방법을 이용하여 수행하였다. 도 10으로부터 알 수 있는 바와 같이, SD 샘플에 대한 판독은 볼 수 없었다. 추가로, 비드가 없는 루이소체병 및 파킨슨병을 갖는 해당 샘플(도 11B, 도 12B 또는 도 13B)은 판독 없음을 나타내었다. 그러나, 비드가 있는 루이소체병 또는 파킨슨병 중 하나를 이용하는 해당 샘플에 대해 판독은 분명하게 보인다. 따라서, 비드의 존재는 RT-QuiC을 이용하여 a-syn 응집물의 존재를 검출하는 능력에 필수적이다.
도 14에 관해, 루이소체 치매 뇌 파쇄액 샘플을 이용하여 비드 농도의 효과를 연구하였다. 반응 혼합물 중에 존재하는 비드가 없는 샘플은 일정한 형광 신호를 나타내었는데, 이는 음성 RT-QuiC 결과를 나타내었다. 대조적으로, 웰 당 18.7㎎ 비드 및 웰 당 37.5㎎ 비드를 갖는 샘플은 형광의 분명한 증가 및 더 고농도의 비드를 제공하여 더 선명한 그리고 더 조기의 신호를 제공하였다.
따라서, 반응 혼합물 내 비드의 존재는 얻어질 알파-시뉴클레인 응집물의 검출을 위한 신호가 결정적이라는 것이 분명하다.
1. 0.1㎜, 0.5㎜ 및 2.3㎜ 지르코늄/실리카 비드(대략 37 ± 3㎎)를 이용하고 BH를 파종한 a-syn RT-QuIC 반응
37㎎의 0.1㎜, 0.5㎜ 또는 2.3 ㎜ 비드의 첨가가 있는 RT-QuIC 반응물에 대조군 대상체(SDBH), 루이소체병 환자(LBDBH), 알츠하이머병(ADBH) 또는 크로이츠펠트-야콥병(sCJDBH)으로부터의 동일한 BH의 5㎕의 1:200,000 희석물로 파종하거나 또는 비파종하였다. 0.1㎜ 지르코늄/실리카 비드에 의해 얻은 a-syn RT-QuIC 반응을 도 15A에 나타내고, 0.5㎜ 지르코늄/실리카 비드가 있는 것을 도 15B에 나타내며, 2.3㎜ 지르코늄/실리카 비드가 있는 것을 도 15c에 나타낸다.
도 15A, 도 15B, 도 15c로부터 지르코늄/실리카 비드 크기의 증가는 LBDBH 파종 반응에 의해 양성 a-syn RT-QuIC 반응을 유발하는 데 걸리는 시간의 증가를 초래한다는 것을 알 수 있다. 그러나 0.1㎜ 지르코늄/실리카 비드를 이용하여 더 빠른 반응 시간을 가짐에도 불구하고, a-syn RT-QuIC는 ADBH 파종 반응에 의해 양성 반응을 제공하였다.
2. 0.1㎜, 0.5㎜ 및 2.3㎜ 지르코늄/실리카 비드(대략 37 ± 3㎎)를 이용하는 그리고 CSF 샘플을 파종한 a-syn RT-QuIC 반응
37㎎의 0.1㎜, 0.5㎜ 또는 2.3㎜ 비드의 첨가에 의한 RT-QuIC 반응물에 루이소체병(LB)을 갖는 환자로부터의 또는 대조군 대상체로부터의 15㎕ CSF 샘플을 파종하였다. 0.1㎜ 지르코늄/실리카 비드를 이용하여 얻은 a-syn RT-QuIC 반응물을 도 16A에 나타내며, 0.5㎜ 지르코늄/실리카 비드를 이용하여 얻은 것은 도 16B에 나타내고, 2.3㎜ 지르코늄/실리카 비드를 이용하여 얻은 것은 도 16c에 나타낸다.
0.1㎜ 및 0.5㎜ 지르코늄/실리카 비드의 사용은 LB CSF 샘플을 파종하였지만, 대조군 CSF 샘플은 파종하지 않은 양성 a-syn RT-QuIC 반응물을 초래하였다. 대조적으로, 2.3㎜ 지르코늄/실리카 비드의 사용은 LB 환자로부터의 CSF 샘플을 파종한 a-syn RT-QuIC 반응을 뒷받침하지 않았다. 도 16A, 도 16B 및 도 16c에 도시한 실험에서 동일한 CSF 샘플을 사용하였다.
도 15 및 도 16에서 도시한 실험으로부터의 결과는 2.3㎜ 지르코늄/실리카의 사용이 LB 환자로부터의 BH 또는 CSF 중 하나에 의해 a-syn RT-QuIC 반응을 가속화시키지 않는다는 것을 입증한다. 0.1㎜ 지르코늄/실리카 비드를 이용하는 a-syn RT-QuIC 반응이 양성 반응을 유도하는 ADBH를 초래함에도 불구하고, 0.1㎜ 또는 0.5㎜ 지르코늄/실리카 비드 중 하나를 이용하는 a-syn RT-QuIC 반응의 결과는 유사하였다. 매우 작은 크기는 그들이 더 큰 0.5㎜ 지르코늄/실리카보다 더 고정 상태로 되기 쉽다는 것을 의미하기 때문에 0.1㎜ 지르코늄/실리카 비드를 조절하는 것은 어려웠다. 따라서, 비드의 조성에 대한 모든 추가적인 연구는 직경이 0.5㎜인 비드를 취하였다.
3. BH를 파종한 0.5㎜ 강철 및 0.5㎜ 유리 비드를 이용하는 a- syn RT- QuIC 반응
37㎎의 0.5㎜ 강철 또는 유리 비드를 첨가한 RT-QuIC 반응물에 대조군 대상체(SDBH), 루이소체병 환자(LBDBH) 및 알츠하이머병(ADBH)으로부터의 동일한 BH의 5㎕의 1:200,000 희석물로 파종하였고, 비파종으로 남겨둔 해당 반응물과 비교하였다. 0.5m 강철 비드를 이용하는 a-syn RT-QuIC 반응을 도 17A에 나타내고, 유리 비드에 대한 것을 도 17B에 나타낸다.
0.5㎜ 강철 비드의 사용은 LBDBH를 파종한 a-syn RT-QuIC 반응을 뒷받침하지 않는다. 대조적으로, 0.5㎜ 유리 비드의 사용은 LBDBH를 파종한 양성 a-syn RT-QuIC 반응물을 초래하지만, 그러나 비파종 및 ADBH 파종된 반응물은 정적 기준의 결여를 초래하는 형광의 점진적 증가를 나타낸다.
4. CSF 샘플을 파종한 0.5㎜ 강철 및 0.5㎜ 유리 비드를 이용하는 a-syn RT-QuIC 반응
37㎎의 0.5㎜ 강철 또는 유리 비드의 첨가에 의한 RT-QuIC 반응물을 루이소체병(LB)을 갖는 환자로부터의 또는 대조군 대상체로부터의 15㎕ CSF 샘플로 파종하였다. 0.5m 강철 비드를 이용하여 CSF로 파종한 a-syn RT-QuIC 반응물을 도 18A에 나타내고, 유리 비드에 대한 반응물을 도 18B에 나타낸다. 강철 비드의 사용은 a-syn RT-QuIC를 파종하기 위한 LB 환자로부터의 CSF 샘플의 능력을 저해하는 반면, 유리 비드의 사용은 형광의 비특이적 증가를 초래하고, 또한 a-syn RT-QuIC 반응을 뒷받침하지 않는다.
상기 실험으로부터의 전체 결과는 0.5㎜ 지르코늄/실리카 비드의 37㎎/웰의 첨가가 LBD를 갖는 환자로부터의 BH 또는 CSF 샘플 중 하나로 파종한 a-syn RT-QuIC 반응의 가장 우수한 프로모터라는 것이다.
알파- 시뉴클레인 (α- syn ) 실시간 떨림 유발 전환(RT- QuIC )을 파종시키기 위한 파킨슨병으로부터의 혈액 성분 능력의 연구
두 명의 PD 환자 및 대조군 대상체로부터의 EDTA 항-응고 혈액 샘플로부터 혈소판을 단리시켰다. 진탕 속도를 200rpm으로부터 600rpm로 증가시키고, 반응 온도를 42℃로 증가시킴으로써, PD를 갖는 이들 2명의 환자로부터의 15㎕의 혈소판을 이용하여 α-syn RT-QuIC 반응물을 파종시키는 것이 가능하였다(도 19). 대조적으로, 대조군 대상체로부터의 혈소판은 반응물을 파종하지 못하였다. 따라서, 이는 본 발명의 방법이 혈액 샘플이 a-syn의 응집물을 포함하는지의 여부를 결정하는 데, 그리고 그에 따라 샘플이 유래된 대상체가 파킨슨병 또는 루이소체 치매와 같은 알파-시뉴클레인병증을 갖는지의 여부를 잠재적으로 진단하는 데 효과적이라는 것을 입증하였다.
참고문헌
Figure 112019011799416-pct00002
Figure 112019011799416-pct00003
SEQUENCE LISTING <110> The University Court of the University of Edinburgh <120> ALPHA-SYNUCLEIN DETECTION ASSAY AND METHOD FOR DIAGNOSING ALPHA-SYNUCLEINOPATHIES <130> WO/2018/007817 <140> PCT/GB2017/051988 <141> 2017-07-06 <150> GB1611840.8 <151> 2016-07-07 <160> 1 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 140 <212> PRT <213> human <400> 1 Met Asp Val Phe Met Lys Gly Leu Ser Lys Ala Lys Glu Gly Val Val 1 5 10 15 Ala Ala Ala Glu Lys Thr Lys Gln Gly Val Ala Glu Ala Ala Gly Lys 20 25 30 Thr Lys Glu Gly Val Leu Tyr Val Gly Ser Lys Thr Lys Glu Gly Val 35 40 45 Val His Gly Val Ala Thr Val Ala Glu Lys Thr Lys Glu Gln Val Thr 50 55 60 Asn Val Gly Gly Ala Val Val Thr Gly Val Thr Ala Val Ala Gln Lys 65 70 75 80 Thr Val Glu Gly Ala Gly Ser Ile Ala Ala Ala Thr Gly Phe Val Lys 85 90 95 Lys Asp Gln Leu Gly Lys Asn Glu Glu Gly Ala Pro Gln Glu Gly Ile 100 105 110 Leu Glu Asp Met Pro Val Asp Pro Asp Asn Glu Ala Tyr Glu Met Pro 115 120 125 Ser Glu Glu Gly Tyr Gln Asp Tyr Glu Pro Glu Ala 130 135 140

Claims (37)

  1. 생물학적 샘플 중의 알파-시뉴클레인 응집물의 존재를 검출하는 방법으로서,
    (i) 생물학적 샘플을 제공하는 단계;
    (ii) 하기를 포함하는 반응 샘플을 제공하는 단계:
    (a) 비드의 평균 직경이 1mm ± 10% 내지 0.001mm ± 10%인 비드 집단,
    (b) 단백질 응집물에 결합하며, 단백질 응집물에 결합되었을 때 형광을 증가시키는 형광단, 및
    (c) 알파-시뉴클레인 또는 이들의 단편 또는 변이체;
    (iii) 상기 생물학적 샘플을 상기 반응 샘플과 합하여 반응 혼합물을 형성하는 단계;
    (iv) 상기 반응 혼합물을 간헐적 교반 주기로 인큐베이션시키는 단계;
    (v) 상기 반응 샘플의 형광단을 여기시키는 광의 파장을 이용하여 상기 샘플을 발광시키는 단계; 및
    (vi) 인큐베이션 동안 상기 반응 혼합물의 상기 형광 수준을 결정하는 단계를 포함하되,
    상기 단계 (iv) 내지 (vi)은 동시에 수행되고, 단계 (iv) 내지 (vi) 동안에 상기 반응 혼합물의 상기 형광의 상당한 증가는 상기 반응 혼합물 중의 알파-시뉴클레인의 응집물의 존재를 나타내며, 상기 반응 혼합물 중의 알파-시뉴클레인의 응집물의 존재는 상기 생물학적 샘플 중의 알파-시뉴클레인의 응집물의 존재를 나타내며, 상기 비드의 집단은 자기(magnetic) 비드를 포함하지 않고,
    상기 방법은 반응 혼합물을 배양하기 전에 생물학적 샘플을 농축하는 단계를 포함하지 않는, 생물학적 샘플 중의 알파-시뉴클레인 응집물의 존재를 검출하는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 생물학적 샘플은 체액 샘플인, 생물학적 샘플 중의 알파-시뉴클레인 응집물의 존재를 검출하는 방법.
  3. 제2항에 있어서, 상기 체액은 뇌척수액, 혈액, 혈액 분획, 비강액, 비강 조직, 소변, 분변 및 림프를 포함하는 군으로부터 선택되는, 생물학적 샘플 중의 알파-시뉴클레인 응집물의 존재를 검출하는 방법.
  4. 제1항에 있어서, 상기 반응 샘플은 완충된 반응 샘플인, 생물학적 샘플 중의 알파-시뉴클레인 응집물의 존재를 검출하는 방법.
  5. 제4항에 있어서, 상기 반응 샘플은 상기 반응 샘플의 pH를 pH 6 내지 pH 8.5로 유지하도록 완충되는, 생물학적 샘플 중의 알파-시뉴클레인 응집물의 존재를 검출하는 방법.
  6. 제1항에 있어서, 상기 단백질 응집물은 베타-시트 함량을 포함하는, 생물학적 샘플 중의 알파-시뉴클레인 응집물의 존재를 검출하는 방법.
  7. 제1항에 있어서, 상기 형광단은 티오플라빈 또는 시아닌 T-284인, 생물학적 샘플 중의 알파-시뉴클레인 응집물의 존재를 검출하는 방법.
  8. 제1항에 있어서, 상기 반응 샘플은 응집 기질로서 작용하는 0.01㎎/㎖의 알파-시뉴클레인 내지 10㎎/㎖의 알파-시뉴클레인을 포함하는, 생물학적 샘플 중의 알파-시뉴클레인 응집물의 존재를 검출하는 방법.
  9. 제1항에 있어서, 상기 반응 샘플의 상기 알파-시뉴클레인은 전장 알파-시뉴클레인의 단편인, 생물학적 샘플 중의 알파-시뉴클레인 응집물의 존재를 검출하는 방법.
  10. 제1항에 있어서, 상기 반응 샘플의 비드 집단의 비드는 지르코니아/실리카, 유리, 석영, 또는 중합체, 예컨대 폴리스타이렌, 폴리테트라플루오로에틸렌(PTFE), 폴리메틸메타크릴레이트(PMMA) 또는 이들의 조합을 포함하는, 생물학적 샘플 중의 알파-시뉴클레인 응집물의 존재를 검출하는 방법.
  11. 제10항에 있어서, 상기 반응 샘플의 비드 집단의 비드는 지르코니아/실리카 또는 유리를 포함하는, 생물학적 샘플 중의 알파-시뉴클레인 응집물의 존재를 검출하는 방법.
  12. 삭제
  13. 제1항에 있어서, 상기 비드 집단의 평균 직경은 1㎜ ± 10% 내지 0.1㎜ ± 10%인, 생물학적 샘플 중의 알파-시뉴클레인 응집물의 존재를 검출하는 방법.
  14. 제1항에 있어서, 상기 반응 샘플은 100㎕의 반응 혼합물 당 1㎎ 내지 150㎎의 비드를 포함하는, 생물학적 샘플 중의 알파-시뉴클레인 응집물의 존재를 검출하는 방법.
  15. 삭제
  16. 제1항에 있어서, 상기 생물학적 샘플 중의 알파-시뉴클레인의 응집물의 존재는 알파-시뉴클레인의 비정상적 응집과 관련된 질환, 예컨대 루이소체 치매 또는 파킨슨병, 또는 다른 알파-시뉴클레인병증을 나타내는, 생물학적 샘플 중의 알파-시뉴클레인 응집물의 존재를 검출하는 방법.
  17. 제1항에 있어서, 상기 반응 혼합물은 40시간 초과, 60시간 초과, 80시간 초과 또는 120시간 초과 동안 인큐베이션되는, 생물학적 샘플 중의 알파-시뉴클레인 응집물의 존재를 검출하는 방법.
  18. 제1항에 있어서, 상기 방법은 25℃ 내지 45℃의 온도에서 수행되는, 생물학적 샘플 중의 알파-시뉴클레인 응집물의 존재를 검출하는 방법.
  19. 삭제
  20. 삭제
  21. 삭제
  22. 생물학적 샘플 중의 알파-시뉴클레인 응집의 존재를 검출하는 방법으로서,
    (i) 생물학적 샘플을 제공하는 단계;
    (ii) 하기를 포함하는 반응 샘플을 제공하는 단계:
    (a) 화학적으로 불활성이고, 비드의 평균 직경이 1mm ± 10% 내지 0.1mm ± 10%인 비드 집단,
    (b) 단백질 응집물에 결합하며, 단백질 응집물에 결합되었을 때 형광을 증가시키는 형광단, 및
    (c) 알파-시뉴클레인 또는 이들의 단편 또는 변이체;
    (iii) 상기 생물학적 샘플을 상기 반응 샘플과 합하여 반응 혼합물을 형성하는 단계;
    (iv) 상기 반응 혼합물을 간헐적 교반 주기로 인큐베이션시키는 단계;
    (v) 상기 반응 샘플의 형광단을 여기시키는 광의 파장을 이용하여 상기 샘플을 발광시키는 단계; 및
    (vi) 인큐베이션 동안 상기 반응 혼합물의 상기 형광 수준을 결정하는 단계를 포함하되,
    상기 단계 (iv) 내지 (vi)은 동시에 수행되고, 단계 (iv) 내지 (vi) 동안에 상기 반응 혼합물의 상기 형광의 상당한 증가는 상기 반응 혼합물에서 알파-시뉴클레인 응집물의 존재를 나타내고, 상기 반응 혼합물에서 알파-시뉴클레인 응집물의 존재는 상기 생물학적 샘플에서 알파-시뉴클레인 응집물의 존재를 나타내는, 방법.
  23. 삭제
  24. 삭제
  25. 삭제
  26. 제22항에 있어서, 상기 생물학적 샘플이 뇌척수액 및 혈액으로 구성된 군에서 선택되는 방법.
  27. 제22항에 있어서, 상기 반응 샘플은 완충된 반응 샘플이고, 상기 반응 샘플은 반응 샘플의 pH를 pH 6 내지 pH 8.5로 유지하도록 완충되는, 방법.
  28. 제22항에 있어서, 상기 형광단이 티오플라빈 또는 시아닌 T-284인 방법.
  29. 제22항에 있어서, 상기 반응 샘플이 응집 기질로서 작용하는 0.01 mg/mL 알파-시뉴클레인 내지 10 mg/mL 알파-시뉴클레인을 포함하는, 방법.
  30. 제22항에 있어서, 상기 반응 샘플의 알파-시뉴클레인이 전장 알파-시뉴클레인의 단편인, 방법.
  31. 제22항에 있어서, 상기 반응 샘플의 비드 집단의 비드는 지르코니아/실리카, 유리, 석영, 또는 중합체, 예컨대, 폴리스티렌, 폴리테트라플루오로에틸렌(PTFE), 폴리메틸메타크릴레이트(PMMA) 또는 이들의 조합을 포함하는, 방법.
  32. 제22항에 있어서, 상기 반응 샘플이 100μL의 반응 혼합물 당 1 mg 내지 150 mg의 비드를 포함하는, 방법.
  33. 생물학적 샘플에서 알파-시뉴클레인 응집의 존재를 검출하는 방법으로서,
    (i) 생물학적 샘플을 제공하는 단계;
    (ii) 하기를 포함하는 반응 샘플을 제공하는 단계:
    (a) 0.5mm ± 10% 지르코니아/실리카 비드,
    (b) 10 uM 티오플라빈 T(ThT), 및
    (c) 0.1 mg/mL 인간 재조합 전장(1-140aa) 알파-시뉴클레인;
    (iii) 상기 생물학적 샘플과 상기 반응 샘플을 합하여 반응 혼합물을 형성하는 단계;
    (iv) 간헐적인 교반 사이클로 상기 반응 혼합물을 인큐베이션하는 단계;
    (v) 상기 ThT를 여기시키는 빛의 파장으로 상기 샘플을 발광시키는 단계; 및
    (vi) 인큐베이션 동안 상기 반응 혼합물의 형광 수준을 측정하는 단계를 포함하되,
    단계 (iv) 내지 (vi)는 동시에 수행되고, 단계 (iv) 내지 (vi) 동안 상기 반응 혼합물의 형광의 상당한 증가는 상기 반응 혼합물에서 알파-시뉴클레인 응집물의 존재를 나타내고, 상기 반응 혼합물에서 알파-시뉴클레인 응집물의 존재는 상기 생물학적 샘플에서 알파-시뉴클레인 응집물의 존재를 나타내는, 방법.
  34. 제33항에 있어서, 상기 반응 샘플이 37 ± 3 mg의 0.5 mm ± 10 % 지르코니아/실리카 비드를 포함하는, 방법.
  35. 제33항에 있어서, 상기 ThT가 10 μM의 농도로 존재하는, 방법.
  36. 제33항에 있어서, 상기 반응 샘플이 완충된 반응 샘플이고, 상기 반응 샘플은 반응 샘플의 pH를 pH 8.2로 유지하기 위해 완충되는, 방법.
  37. 제33항에 있어서, 상기 반응 샘플이 100 mM 포스페이트 완충액을 추가로 포함하는, 방법.
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