ES2964810T3 - Ensayo de detección de la alfa-sinucleína y método para diagnosticar alfa-sinucleinopatías - Google Patents

Ensayo de detección de la alfa-sinucleína y método para diagnosticar alfa-sinucleinopatías Download PDF

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Abstract

Se proporciona un método para detectar la presencia de agregación de alfa-sinucleína en una muestra biológica mediante el cual se mezcla una muestra biológica con una muestra de reacción que comprende una población de perlas, un fluoróforo adaptado para unirse a agregados de proteínas y para aumentar la fluorescencia cuando se une a agregados de proteínas. y alfa-sinucleína o un fragmento o variante de la misma para formar una mezcla de reacción, la mezcla de reacción se ilumina y al mismo tiempo se incuba con ciclos de agitación intermitentes, en donde un aumento significativo en la fluorescencia de la mezcla de reacción durante la incubación es indicativo de la Presencia de agregados de alfa-sinucleína en la muestra biológica. Método de diagnóstico de alfa-sinucleinopatías como la enfermedad de Parkinson o la Demencia con Cuerpos de Lewy. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN
Ensayo de detección de la alfa-sinucleína y método para diagnosticar alfa-sinucleinopatías
Campo de la invención
La invención se refiere a un ensayo para la detección de proteínas agregadas en una muestra biológica, más específicamente a un ensayo para la detección de la alfa-sinucleína agregada en una muestra biológica.
Antecedentes de la invención
La alfa-sinucleína (a-sin) es una pequeña proteína ácida bien conservada de 140 aminoácidos y un peso molecular de 19 kDa que es codificada por el gen s NcA ubicado en el cromosoma 4.1 Se encuentra en alta concentración en las terminales nerviosas presinápticas dentro del sistema nervioso central, donde desempeña un papel en la biología de las vesículas sinápticas.2 Las sinucleinopatías son un conjunto de trastornos neurodegenerativos asociados con el depósito de agregados fibrilares de a-sin dentro de poblaciones selectivas de neuronas y glía. Estos depósitos se pueden encontrar dentro del soma neuronal como cuerpos de Lewy (LB) o en neuritas distróficas en enfermedades tales como la enfermedad de Parkinson (PD) o la demencia con cuerpos de Lewy (DLB); o en inclusiones citoplasmáticas gliales en la atrofia multisistémica (MSA).3
Se ha detectado la presencia de a-sin en fluidos biológicos tales como el fluido cefalorraquídeo (CSF)4y el suero.5 La medición de las concentraciones de a-sin en el CSF mediante ELISA se ha propuesto como biomarcador para los trastornos relacionados con la a-sin. Sin embargo, a pesar de que muchos estudios muestran una reducción en los niveles de a-sin en el CSF en la PD y en la DLB46, los resultados generales no son consistentes.7 Incluso en aquellos estudios en los que se ha demostrado una reducción de la a-sin en el CSF, las diferencias son pequeñas8 y existe una superposición considerable dentro de los grupos de pacientes y entre los grupos de pacientes y de control. Además, la estandarización de la medición de la a-sin en el CSF entre laboratorios ha resultado difícil.9 Las propiedades de agregación de la a-sin se han comparado recientemente con las de la proteína priónica, cuya agregación provoca encefalopatías espongiformes transmisibles (TSE).10 De hecho, existe mucha discusión en la literatura actual sobre si las alfa-sinucleinopatías son en realidad enfermedades similares a las priónicas.11 Se ha usado una técnica descrita recientemente llamada conversión inducida por agitación en tiempo real (RT-QuIC), que aprovecha la capacidad de la proteína priónica para inducir la autoagregación, para desarrollar una prueba de diagnóstico en el CSF para determinar la enfermedad de Creutzfeldt-Jakob esporádica (sCJD), la forma humana más común de TSE.12
Sin embargo, dadas las diferencias significativas entre las proteínas priónicas y la a-sin, estas técnicas no han logrado detectar de manera confiable la presencia de a-sin o la agregación de a-sin en una muestra biológica. Por lo tanto, sigue siendo necesario contar con un ensayo confiable para detectar la presencia de a-sin y la agregación de a-sin en una muestra biológica. La solicitud de patente internacional WO 2016/040907 ante la Board of Regents del University of Texas System y otros describe métodos y kits para amplificar y detectar plegamiento anómalo de proteínas a partir de muestras. Ruffman y otros (documento Movement Disorders, vol.31, núm.2, 22 de enero de 2016, páginas 193-202) analiza el posible papel de la a-sin como biomarcador para la enfermedad de Parkinson. Al menos un objetivo de la presente invención es proporcionar un ensayo mejorado para detectar la presencia de asin y/o la agregación de a-sin en una muestra biológica.
Resumen de la invención
La invención reivindicada como se describe en la presente descripción es como se define en el conjunto de reivindicaciones adjunto. De acuerdo con un primer aspecto de la invención, se proporciona un método in vitro para detectar la presencia de la agregación de alfa-sinucleína en una muestra biológica, el método comprende las etapas: (i) proporcionar una muestra de reacción que comprende una población de perlas, un fluoróforo adaptado para unirse a los agregados de proteínas y para aumentar la fluorescencia cuando se une a los agregados de proteínas, y alfa-sinucleína o un fragmento o variante de esta;
(ii) combinar una muestra biológica y la muestra de reacción para formar una mezcla de reacción;
(iii) incubar la mezcla de reacción con ciclos de agitación intermitentes;
(iv) iluminar la muestra con una longitud de onda de luz que excite el fluoróforo de la muestra de reacción; y (v) determinar el nivel de fluorescencia de la mezcla de reacción durante la incubación,
en donde las etapas (iii) a (v) se llevan a cabo al mismo tiempo, y un aumento significativo en la fluorescencia de la mezcla de reacción durante las etapas (iii) a (v) es indicativo de la presencia de agregados de alfa-sinucleína en la mezcla de reacción, y en donde la presencia de agregados de alfa-sinucleína en la mezcla de reacción es indicativa de la presencia de agregados de alfa-sinucleína en la muestra biológica.
El experto en la técnica entenderá que los términos “alfa-sinucleína”, “a-sin”, “a-sinucleína” y a-sin” se refieren a la proteína alfa-sinucleína y se usan indistintamente en todo el documento. Por ejemplo, en modalidades en las que la muestra biológica se obtiene a partir de un sujeto humano, la alfa-sinucleína es alfa-sinucleína humana que tiene la secuencia SEQ ID NO.1:
SEQ ID NO.1:
MDVFMKGLSK AKEGVVAAAE KTKQGVAEAA GKTKEGVLYV GSKTKEGVVH
GVATVAEKTK EQVTNVGGAV VTGVTAVAQK TVEGAGSIAA ATGFVKKDQL
GKNEEGAPQE GILEDMPVDP DNEAYEMPSE EGYQDYEPEA
El término “fragmento” con referencia a la alfa-sinucleína pretende significar un polinucleótido de al menos 10, 20, 30, 50, 100, 120, 130 o 140 nucleótidos contiguos de la secuencia de alfa-sinucleína, o cualquier número entero intermedio; los fragmentos preferidos son aquellos que son capaces de agregarse en las condiciones del método de la invención. Por ejemplo, el fragmento puede comprender la secuencia de aminoácidos 1-60 o 61-140 de la secuencia de la alfa-sinucleína nativa.
Por "variante" con referencia a la alfa-sinucleína se entiende una proteína alfa-sinucleína con al menos una sustitución, inserción y/o deleción de un aminoácido en la secuencia peptídica o polipeptídica o una alteración de un resto unido químicamente a la proteína.
Sustitución conservadora: Una o más sustituciones de aminoácidos (por ejemplo, de 1, 2, 5 o 10 residuos) para residuos de aminoácidos que tienen propiedades bioquímicas similares. Típicamente, las sustituciones conservadoras tienen poco o ningún impacto sobre la actividad de un péptido o polipéptido resultante. Por ejemplo, una sustitución conservadora en la alfa-sinucleína puede ser una sustitución de aminoácidos que no afecta sustancialmente la capacidad del péptido para agregarse en las condiciones de reacción del método de la invención. En un ejemplo particular, una sustitución conservadora en la alfa-sinucleína, es una sustitución de aminoácidos que no altera significativamente la capacidad de la proteína para agregarse en las condiciones de reacción del método de la invención. Puede usarse el cribado de variantes de alfa-sinucleína para identificar qué residuos de aminoácidos pueden tolerar una sustitución de aminoácidos.
En un ejemplo, la alfa-sinucleína puede ser alfa-sinucleína humana y se puede incluir una sustitución conservadora en el péptido, tal como una sustitución conservadora en la SEQ ID NO:1. En otro ejemplo, se incluyen en el péptido 10 o menos sustituciones conservadoras, tal como cinco o menos. Por lo tanto, un péptido o proteína de la invención puede incluir 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más sustituciones conservadoras. Puede producirse un polipéptido para que contenga una o más sustituciones conservadoras mediante la manipulación de la secuencia de nucleótidos que codifica ese polipéptido mediante el uso, por ejemplo, de procedimientos estándar tales como mutagénesis dirigida al sitio o<p>C<r>. Alternativamente, puede producirse un polipéptido para que contenga una o más sustituciones conservadoras mediante el uso de métodos de síntesis de péptidos, por ejemplo, como se conoce en la técnica.
Las variantes de sustitución son aquellas en las que se ha eliminado al menos un residuo en la secuencia de aminoácidos y se ha insertado un residuo diferente en su lugar. Ejemplos de aminoácidos que pueden sustituirse por un aminoácido original en una proteína y que se consideran sustituciones conservadoras, incluyen: Ser por Ala; Lys por Arg; Gln o His por Asn; Glu por Asp; Asn por Gln; Asp por Glu; Pro por Gly; Asn o Gln por His; Leu o Val por Ile; Ile o Val por Leu; Arg o Gln por Lys; Leu o Ile por Met; Met, Leu o Tyr por Phe; Thr por Ser; Ser por Thr; Tyr por Trp; Trp o Phe por Tyr; e Ile o Leu por Val.
En una modalidad, las sustituciones son entre Ala, Val, Leu e Ile; entre Ser y Thr; entre Asp y Glu; entre Asn y Gln; entre Lys y Arg; y/o entre Phe y Tyr.
Se puede encontrar más información sobre sustituciones conservadoras, entre otras ubicaciones, en los documentos de Ben-Bassat y otros, (J. Bacteriol. 169:751-7, 1987), O'Regan y otros, (Gene 77:237-51, 1989), Sahin-Toth y otros, (Protein Sci. 3:240-7, 1994), Hochuli y otros, (Bio/Technology 6:1321-5, 1988), el documento WO 00/67796 (Curd y otros) y en libros de texto estándar de genética y biología molecular.
Normalmente, la alfa-sinucleína forma un tetrámero plegado de forma estable que resiste la agregación. Sin embargo, se ha sugerido que las mutaciones en la alfa-sinucleína promueven la agregación, y que estos agregados de alfa-sinucleína son un bloque de construcción primario de las fibrillas que se cree que están involucradas en las alfa-sinucleinopatías tales como la demencia con cuerpos de Lewy y la enfermedad de Parkinson.
Por lo tanto, la detección o determinación de si una muestra biológica comprende agregados de alfa-sinucleína puede permitir la detección de dichas patologías sin requerir técnicas invasivas o costosas, y puede permitir la detección de dichas patologías antes de lo que sería posible mediante el uso de los métodos estándar.
Hasta la fecha, ensayos tales como la conversión inducida por agitación en tiempo real (RT-QuIC) no han podido detectar la presencia de agregados de alfa-sinucleína. Los inventores han descubierto sorprendentemente que el método RT-QuIC modificado de la invención permite la detección de la alfa-sinucleína con una sensibilidad y especificidad muy altas, y permite diferenciar las patologías relacionadas con agregados de alfa-sinucleína de otras patologías relacionadas con agregados de proteínas.
Por “aumento significativo en la fluorescencia” nos referimos a un aumento en la fluorescencia de al menos la fluorescencia relativa media más dos veces la desviación estándar de la fluorescencia relativa media de los controles negativos o la fluorescencia inicial en un punto temporal adecuado, típicamente dentro de 90-120 horas. Típicamente, la muestra biológica es una muestra de fluido corporal. Sin embargo, la muestra biológica puede ser una muestra de tejido basado en células. La muestra biológica se puede tomar de un sujeto para su análisis mediante el uso del método de la invención, para permitir que un profesional de la salud determine si el sujeto puede tener una enfermedad asociada con la presencia de agregados de alfa-sinucleína.
El fluido corporal puede seleccionarse del grupo que incluye fluido cefalorraquídeo, sangre o fracciones de la sangre, fluido o tejido nasal, orina, heces y linfa. Preferentemente, el fluido corporal se selecciona del grupo que incluye fluido cefalorraquídeo, plasma sanguíneo u otra fracción, y tejido o fluido nasal. Por ejemplo, el fluido corporal puede ser fluido cefalorraquídeo. En otro ejemplo, el fluido corporal puede ser, por ejemplo, tejido o fluido nasal que se ha extraído mediante el uso de un hisopo nasal. En un ejemplo adicional, el fluido corporal puede ser una muestra de sangre o una fracción de sangre.
En consecuencia, el método de la invención puede permitir la detección de una enfermedad asociada con la agregación de alfa-sinucleína a partir de una muestra biológica tomada de un sujeto, lo que permite un método no invasivo de diagnóstico o pronóstico.
La muestra biológica se toma típicamente de un sujeto mamífero, preferentemente, de un sujeto humano. Sin embargo, la muestra biológica puede tomarse de peces, aves, reptiles o anfibios.
La muestra de reacción comprende típicamente un solvente. El solvente puede ser un solvente acuoso, de manera que la muestra de reacción es una solución acuosa.
La muestra de reacción puede ser una muestra de reacción tamponada para mantener sustancialmente el pH de la muestra de reacción. Por ejemplo, la muestra de reacción puede comprender un tampón biológicamente aceptable tal como, por ejemplo, tris(hidroximetil)aminometano (TRIS), solución salina tamponada con fosfato (PBS), ácido 4-(2-hidroxietil)-1-piperazinetanosulfónico (HEPES), ácido piperazin-N,N'-bis(2-etanosulfónico) (PIPES) o tampón fosfato de Sorensen.
Típicamente, la muestra de reacción se tampona para mantener el pH de la muestra de reacción de aproximadamente pH 6 a aproximadamente pH 8,5. Preferentemente, la muestra de reacción se tampona para mantener el pH de la muestra de reacción de aproximadamente 7,0 a aproximadamente 8,5. Por ejemplo, la muestra de reacción puede tamponarse para mantener el pH de la muestra a pH 7,0, 7,2, 7,4, 7,6, 7,8, 8,0, 8,2 u 8,4.
Preferentemente, la muestra de reacción se tampona para mantener un pH inferior a un pH de 9,0.
Preferentemente, la muestra de reacción se tampona para mantener el pH de la muestra de reacción a pH 8,0, 8,2 u 8,4.
El fluoróforo de la muestra de reacción cambia típicamente de fluorescencia cuando se une a agregados de proteínas. Por ejemplo, el fluoróforo puede emitir una fluorescencia débil cuando está libre en solución, y puede emitir una fluorescencia intensa cuando está unido a agregados de proteínas. Alternativamente, el fluoróforo puede no emitir fluorescencia cuando el fluoróforo está libre en solución, y puede emitir fluorescencia cuando el fluoróforo está unido a agregados de proteínas.
Los agregados de proteínas pueden comprender un contenido significativo de láminas beta, y la proteína no agregada puede carecer de un contenido significativo de láminas beta, y el fluoróforo puede configurarse para unirse a láminas beta de proteína.
Los espectros de emisión del fluoróforo pueden cambiar cuando el fluoróforo está unido a la proteína agregada. Por ejemplo, los espectros de emisión del fluoróforo pueden desplazarse al rojo cuando el fluoróforo se une a los agregados de proteínas. Alternativamente, los espectros de emisión del fluoróforo pueden desplazarse hacia el azul cuando el fluoróforo se une a los agregados de proteínas.
Típicamente, el fluoróforo es una tioflavina. Preferentemente, el fluoróforo es tioflavina T (ThT).
Alternativamente, en ejemplos que no entran dentro del alcance de la invención reivindicada, el fluoróforo puede ser cianina T-284, u otro fluoróforo que aumente la fluorescencia cuando se une a agregados de proteínas tales como agregados de alfa-sinucleína.
En la RT-QuIC estándar, se incluye una pequeña cantidad de la proteína que se va a agregar en la muestra de reacción, para que actúe como sustrato para la agregación de proteínas. En consecuencia, la muestra de reacción puede comprender menos de 1 mg/ml de alfa-sinucleína para que actúe como sustrato para la agregación. La muestra de reacción puede comprender menos de 0,5 mg/ml de alfa-sinucleína. La muestra de reacción puede comprender menos de 0,1 mg/ml de alfa sinucleína.
La muestra de reacción puede comprender de aproximadamente 0,01 mg/ml de alfa-sinucleína a aproximadamente 10 mg/ml de alfa-sinucleína para que actúe como sustrato para la agregación. La muestra de reacción puede comprender de aproximadamente 0,1 mg/ml a aproximadamente 1 mg/ml de alfa-sinucleína para que actúe como sustrato para la agregación.
La alfa-sinucleína de la muestra de reacción puede ser alfa-sinucleína recombinante, de seres humanos o de otras especies. La alfa-sinucleína de la muestra de reacción puede ser un fragmento de la alfa-sinucleína de longitud completa. Por ejemplo, el fragmento puede comprender los aminoácidos 1-60 o 61 a 140 de la alfa-sinucleína de longitud completa.
Las perlas de la población de perlas de la muestra de reacción comprenden zirconia, sílice o vidrio.
Típicamente, la población de perlas tiene un diámetro medio de las perlas de aproximadamente 1 mm a aproximadamente 0,001 mm.
El diámetro medio de la población de perlas es de aproximadamente 1 mm a aproximadamente 0,1 mm. Por ejemplo, el diámetro medio de las perlas puede ser 1 mm, 0,5 mm o 0,1 mm.
La población de perlas tiene una distribución estándar de diámetros de aproximadamente más o menos un 10 % del diámetro medio. En consecuencia, el diámetro de las perlas puede ser sustancialmente homogéneo.
La muestra de reacción puede comprender de aproximadamente 1 mg a aproximadamente 150 mg de perlas por 100 |jl de la mezcla de reacción. La muestra de reacción puede comprender de aproximadamente 10 mg a aproximadamente 100 mg de perlas por 100 j l de la mezcla de reacción. La mezcla de reacción puede comprender aproximadamente 10, 20, 30, 40 o 50 mg de perlas por 100 j l de la mezcla de reacción, o una cantidad intermedia. Por ejemplo, la mezcla de reacción puede comprender de aproximadamente 10 a 50 mg de perlas por 100 j l de la mezcla de reacción, de 20 a 50 mg de perlas por 100 j l de la mezcla de reacción, o de 30 a 50 mg de perlas por 100 j l de la mezcla de reacción.
La presencia de agregados de alfa-sinucleína en la muestra biológica es indicativa de una enfermedad asociada con la agregación anómala de alfa-sinucleína. Por ejemplo, la enfermedad puede ser demencia con cuerpos de Lewy o enfermedad de Parkinson, u otras alfa-sinucleinopatías.
La mezcla de reacción puede incubarse durante más de 40 horas, más de 60 horas, más de 80 horas o más de 120 horas. La mezcla de reacción puede agitarse por un período y dejarse reposar por un período. Típicamente, el período dentro del cual se agita la mezcla de reacción es significativamente más corto que el período dentro del cual se deja reposar la mezcla de reacción sin agitación. La mezcla de reacción puede agitarse por un período de al menos 1 minuto, al menos 2 minutos o al menos 5 minutos. La mezcla de reacción puede dejarse reposar por un período de al menos 10 minutos, al menos 15 minutos o al menos 20 minutos. Por ejemplo, la mezcla de reacción puede agitarse por un período de un minuto y dejarse reposar sin agitación por un período de catorce minutos. Los ciclos de agitación intermitentes pueden comprender ciclos de sacudidas intermitentes. Los ciclos de sacudidas pueden mover la mezcla de reacción en un movimiento circular u orbital y, por lo tanto, la velocidad de sacudida puede definirse en términos de rotaciones por minuto, por ejemplo. Alternativamente, los ciclos de sacudidas pueden mover la mezcla de reacción hacia adelante y hacia atrás a lo largo de un único eje y, por lo tanto, la velocidad de sacudida puede definirse en términos de repeticiones por minuto.
La mezcla de reacción puede someterse a agitación a una velocidad fija. En lo adelante, la velocidad de agitación se expresa en rotaciones por minuto, pero puede aplicarse igualmente a repeticiones por minuto para modalidades en las que la sacudida sigue un movimiento lineal. La mezcla de reacción puede someterse a agitación a al menos 100 rotaciones por minuto. La mezcla de reacción puede someterse a agitación a al menos 150 rotaciones por minuto. La mezcla de reacción puede someterse a agitación a al menos 200 rotaciones por minuto. La mezcla de reacción puede someterse a agitación desde al menos 100 rotaciones por minuto hasta al menos 300 rotaciones por minuto. La mezcla de reacción puede someterse a agitación desde al menos 150 rotaciones por minuto hasta al menos 250 rotaciones por minuto. Por ejemplo, la mezcla de reacción puede someterse a agitación a 150, 200 o 250 rotaciones por minuto. Preferentemente, la mezcla de reacción se somete a agitación a 200 rotaciones por minuto.
La velocidad de agitación requerida de la mezcla de reacción puede variar en dependencia del orbital de sacudida del agitador. La velocidad de agitación requerida de la mezcla de reacción puede variar en dependencia de la muestra biológica usada en el método. Por ejemplo, en modalidades en las que la muestra biológica es una fracción de sangre tal como plaquetas en plasma, por ejemplo, la mezcla de reacción puede agitarse a una velocidad de 400, 600, 800, 900 o 1000 rotaciones por minuto.
Los ciclos de agitación intermitentes pueden comprender la sonicación intermitente de la mezcla de reacción. La sonicación de la mezcla de reacción puede agitar la mezcla de reacción para promover la agregación. También pueden usarse métodos alternativos para agitar la mezcla de reacción.
El método de la invención puede llevarse a cabo a una temperatura de 25 °C a 45 °C. El método de la invención puede llevarse a cabo a una temperatura de 30 °C a 40 °C. Por ejemplo, el método puede llevarse a cabo a una temperatura de 30 °C, 32 °C, 34 °C, 36 °C, 38 °C o 40 °C, y valores intermedios.
En una modalidad, el método de la invención puede llevarse a cabo a una temperatura de aproximadamente 30 °C. En una modalidad alternativa, el método de la invención puede llevarse a cabo a una temperatura de aproximadamente 35 °C, o aproximadamente 37 °C.
La muestra biológica puede tratarse antes del método de la invención para concentrar la alfa-sinucleína en la muestra biológica. La muestra biológica puede tratarse antes del método de la invención para extraer la alfasinucleína de una muestra biológica compleja.
La muestra biológica puede tratarse con una población de perlas. Las perlas pueden comprender un material magnético. Por ejemplo, las perlas pueden comprender un material paramagnético, y las perlas pueden permitir la separación del material que se une específicamente a la superficie de las perlas mediante el uso de campos magnéticos aplicados externamente para extraer las perlas de una mezcla compleja. Las perlas magnéticas pueden permitir la extracción o concentración de la alfa-sinucleína en una muestra biológica antes del método de la invención.
Por ejemplo, las perlas pueden comprender óxido de hierro superparamagnético u otro material paramagnético, y la alfa-sinucleína puede unirse a las perlas y la aplicación de un campo magnético puede permitir que las perlas, y por lo tanto la alfa-sinucleína, se separen o se concentren en una muestra biológica.
En un segundo aspecto de la invención, se proporciona un método in vitro para diagnosticar alfa-sinucleinopatías, el método comprende las etapas:
(i) proporcionar una muestra de reacción que comprende:
(a) una población de perlas que comprende zirconia y/o sílice, o vidrio, en donde la población de perlas tiene un diámetro medio de 1 mm ±10 % a 0,1 mm ±10 %;
(b) tioflavina T; y
(c) alfa-sinucleína o una variante de esta que tiene de 1 a 10 sustituciones, inserciones o deleciones de aminoácidos que no afectan sustancialmente la capacidad del péptido para agregarse en las condiciones de reacción del método;
(ii) combinar una muestra biológica y la muestra de reacción para formar una mezcla de reacción;
(iii) incubar la mezcla de reacción con ciclos de agitación intermitentes;
(iv) iluminar la muestra con una longitud de onda de luz que excite la tioflavina T; y
(v) determinar el nivel de fluorescencia de la mezcla de reacción durante la incubación,
en donde las etapas (iii) a (v) se llevan a cabo al mismo tiempo, y un aumento significativo en la fluorescencia de la mezcla de reacción durante las etapas (iii) a (v) es indicativo de que el sujeto tiene una alfa-sinucleinopatía.
La alfa-sinucleinopatía es típicamente Parkinson o demencia con cuerpos de Lewy.
En un tercer aspecto que no forma parte de la invención reivindicada, se proporciona un kit de partes que comprende una solución tamponada acuosa, la solución tamponada acuosa comprende una población de perlas, un fluoróforo y alfa-sinucleína o un fragmento o variante de esta.
El kit de partes puede usarse como la muestra de reacción para los métodos del primer y segundo aspecto.
Las características preferidas y opcionales para el primer aspecto de la invención son características preferidas y opcionales para el segundo y tercer aspecto.
Breve descripción de las figuras
Las modalidades de la presente invención se describirán ahora, por medio de un ejemplo no limitante, con referencia a las figuras acompañantes.
Figura 1: Un diagrama esquemático que muestra el proceso de RT-QuIC estándar;
Figura 2: Diagramas de RT-QuIC para muestras de homogeneizado de cerebro (BH) de pacientes con demencia con cuerpos de Lewy (DLB), enfermedad de Alzheimer (AD) y enfermedad de Creutzfeldt-Jakob esporádica (sCJD) con pacientes sin evidencia neuropatológica de enfermedad que murieron súbitamente (SD) como controles;
Figura 3: Diagramas de RT-QuIC para muestras de BH de pacientes con patologías mixtas;
Figura 4: Diagramas de RT-QuIC para muestras de fluido cefalorraquídeo (CSF) de pacientes confirmados con DLB y sCJD;
Figura 5: Diagramas de RT-QuIC para muestras de CSF de control y una muestra de BH de un paciente con DLB; Figura 6: Diagramas de RT-QuIC para muestras de CSF de pacientes con AD y una muestra de BH de un paciente con DLB;
Figura 7: Diagramas de RT-QuIC para muestras de CSF de pacientes con DLB y una muestra de BH de un paciente con DLB;
Figura 8: Diagramas de RT-QuIC para muestras de CSF de pacientes con DLB y AD y una muestra de BH de un paciente con DLB;
Figura 9: Diagramas de RT-QuIC para muestras de CSF de pacientes con enfermedad de Parkinson (PD) y muestras de CSF de sujetos de control;
Figura 10: Diagramas de RT-QuIC para muestras de BH de SD A) con perlas y B) sin perlas;
Figura 11: Diagramas de RT-QuIC para muestras de BH de DLB A) con perlas y B) sin perlas;
Figura 12: Diagramas de RT-QuIC para muestras de fluido cefalorraquídeo (CSF) de enfermedad de Parkinson A) con perlas y B) sin perlas;
Figura 13: Diagramas de RT-QuIC para muestras de CSF de demencia con cuerpos de Lewy A) con perlas y B) sin perlas;
Figura 14: Diagramas de RT-QuIC para muestras de BH de demencia con cuerpos de Lewy con A) sin perlas B) 18,7 mg de perlas por pocillo y C) 37,5 mg de perlas por pocillo;
Figura 15: Diagramas de RT-QuIC para BH de sujetos de control (SDBH), pacientes con enfermedad de cuerpos de Lewy (LBDBH), enfermedad de Alzheimer (ADBH) o enfermedad de Creutzfeldt-Jakob esporádica (sCJDBH) o sin sembrar para (A) perlas de zirconio/sílice de 0,1 mm, (B ) perlas de zirconio/sílice de 0,5 mm y (C) perlas de zirconio/sílice de 2,3 mm;
Figura 16: Diagramas de RT-QuIC para muestras de CSF de pacientes con enfermedad de cuerpos de Lewy (LB) o de sujetos de control con la adición de 37 mg de (A) perlas de zirconio/sílice de 0,1 mm, (B) perlas de zirconio/sílice de 0,5 mm y (C) perlas de zirconio/sílice de 2,3 mm;
Figura 17: Diagramas de RT-QuIC para muestras de BH de sujetos de control (SDBH), pacientes con enfermedad de cuerpos de Lewy (LBDBH) y enfermedad de Alzheimer (ADBH) y comparados con aquellas reacciones que no se sembraron mediante el uso de (A) perlas de acero de 0,5 mm o (B) perlas de vidrio de 0,5 mm;
Figura 18: Diagramas de RT-QuIC para muestras de CSF de sujetos de control y pacientes con enfermedad de cuerpos de Lewy (LBDBH) y comparados con aquellas reacciones que no se sembraron mediante el uso de (A) perlas de acero de 0,5 mm o (B) perlas de vidrio de 0,5 mm; y
Figura 19: Diagramas de RT-QuIC para muestras de plaquetas aisladas de muestras de sangre anticoagulada con EDTA de sujetos con PD y de control.
Descripción Detallada de la Invención
Si bien la realización y el uso de diversas modalidades de la presente invención se analizan en detalle más abajo, se apreciará que la presente invención proporciona muchos conceptos inventivos aplicables que pueden incorporarse en una amplia variedad de contextos específicos. Las modalidades específicas analizadas en la presente descripción son meramente ilustrativas de formas específicas de realizar y usar la invención y no delimitan el alcance de la invención.
Para facilitar la comprensión de esta invención, se definen más abajo una serie de términos. Los términos definidos en la presente descripción tienen significados tal como los entiende comúnmente un experto en las áreas relevantes para la presente invención. Términos tales como "un", "una" y "el/la" no pretenden referirse sólo a una entidad singular, sino que incluyen la clase general de la cual puede usarse un ejemplo específico a modo de ilustración. La terminología en la presente descripción se usa para describir modalidades específicas de la invención, pero su uso no delimita la invención, excepto como se describe en las reivindicaciones.
Materiales y métodos generales
Agregación inducida por agitación en tiempo real para la alfa-sinucleína
El tampón de reacción para RT-QuIC (RB) estaba compuesto portampón fosfato 100 mM (pH 8,2), tioflavina T (ThT) 10 |<j>M y 0,1 mg/ml de alfa-sinucleína humana recombinante de longitud completa (1-140 aa) (Stratech, Cambridge, Reino Unido). Cada pocillo de una placa negra de 96 pocillos con fondo transparente (Nalgene Nunc International, Fisher Scientific Ltd, Reino Unido) contenía 98 jl, 90 j l u 85 j l de RB (en dependencia del volumen de semilla añadida) y 37 ± 3 mg de perlas de zirconio/sílice de 0,5 mm (Thistle Scientific Ltd, Glasgow, Reino Unido). Las reacciones se sembraron con 2 j l de homogeneizado de cerebro (BH) de concentración de trabajo, 5 jl, 10 j l o 15 j l de CSF sin diluir hasta un volumen de reacción final de 100 jl. Las placas se sellaron con una película selladora de placas (Fisher Scientific Ltd, Reino Unido) y se incubaron en un lector de placas BMG OPTIMA FluoSTAR a 30 °C durante 120 h con ciclos de sacudidas intermitentes: doble orbital con sacudidas de 1 minuto (200 rpm), descanso de 14 minutos. Se tomaron mediciones de fluorescencia de ThT (excitación a 450 nm y emisión a 480 nm) cada 15 minutos. Cada muestra se analizó por duplicado, lo que permitió someter a prueba en una placa 2 muestras de control negativo (reacciones sembradas con BH de SD y AD), 1 control positivo (reacción sembrada con BH de DLB), una reacción sin sembrar y 44 muestras de CSF.
Grupos de pacientes
La fase inicial del desarrollo de RT-QuIC de CSF se llevó a cabo en 99 muestras de CSF obtenidas de la cohorte OPTIMA (Proyecto Oxford para investigar la memoria y el envejecimiento) con diagnóstico confirmado clínica y neuropatológicamente de DLB pura (n=12), PD (n=2), parálisis supranuclear progresiva (PSP) (n=2), degeneración corticobasal (n=3), DLB con patología de AD (n=17), AD con LB incidentales (n=13), AD pura (n=30) y controles (n=20). OPTIMA, iniciado en 1988, es un estudio clínico-patológico longitudinal prospectivo de la demencia y el envejecimiento que incluye la recolección de CSF en múltiples tiempos temporales durante el seguimiento clínico. Todos los protocolos clínicos y patológicos se han descrito detalladamente13 y se aprobaron por el comité de ética local y los participantes proporcionaron su consentimiento informado antes de la inscripción.
La fase de validación de la RT-QuIC se llevó a cabo en muestras de CSF (20 PD, 15 controles y 3 en riesgo) obtenidas de la cohorte Oxford Discovery, que es una de las cohortes longitudinales de PD más grandes y clínicamente mejor caracterizadas hasta la fecha. Los detalles clínicos completos de esta cohorte se describieron anteriormente.14 Brevemente, pacientes con PD idiopática diagnosticada dentro de los 3,5 años de acuerdo con los criterios de diagnóstico del UK PD Society Brain Bank15 se reclutaron entre septiembre de 2010 y septiembre de 2014 de una población de 2,9 millones (estudio de ética 10/H0505/71). La duración media de la enfermedad entre 20 pacientes con PD fue de 1,6 ± 1,1 años (intervalo 0,1 - 3,2 años) y el estadio de Hoehn y Yahr fue 1,9 ± 0,4 (intervalo 1-3, puntuación máxima posible 5). La población de control se reclutó entre los cónyuges y amigos de los pacientes que participaron en el estudio, así como también entre el público en general. El grupo de riesgo comprendió pacientes con comportamiento de sueño REM confirmado mediante polisomnografía nocturna,16 el 80 % de los cuales han demostrado desarrollar un trastorno con cuerpos de Lewy con el tiempo.17 La información demográfica se proporciona en la Tabla 1.
Tabla 1: Información demográfica para los pacientes de Optima y Discovery investigados Homogeneizados de cerebro
El tejido cerebral se proporcionó al MRC Brain Bank en el NCJDRSU (licencia ética 11/ES/0022). Todo el tejido se congeló a -80 °C dentro de las 2 horas posteriores a la toma de muestras y se almacenó a -80 °C antes del análisis. Los tejidos cerebrales se habían almacenado entre 2-18 años antes de su uso.
Se tomó tejido de la corteza frontal de pacientes con enfermedad de Alzheimer (AD); enfermedad de Creutzfeldt-Jakob esporádica (sCJD); y demencia difusa con cuerpos de Lewy (DLB). Además, se obtuvo corteza frontal de individuos sin enfermedades neurodegenerativas del MRC Sudden Death Brain and Tissue Bank (controles de muerte súbita (SD)). Tanto el tejido de la corteza frontal como el de la sustancia negra se obtuvieron de pacientes con PD/DLB mixta; sCJD/DLB mixta y AD/PD mixta. Todos los casos usados se habían examinado histológicamente y el diagnóstico se alcanzó mediante el uso de criterios aceptados internacionalmente.18 Se prepararon homogeneizados de cerebro (BH) iniciales al 10 % p/v mediante el uso de solución salina tamponada con fosfato (PBS) que contenía EDTA 1 mM, NaCl 150 mM, Tritón X al 0,5 % y un cóctel inhibidor de proteasas completo de Roche. Se prepararon los BH de concentración de trabajo subsecuentes al diluir lo anterior 1:20000 con PBS. Muestras de fluido cefalorraquídeo
Las muestras de CSF se almacenaron en alícuotas de 0,5 ml en tubos de polipropileno a -80 °C antes del análisis. Se recibieron 99 muestras de CSF de la cohorte OPTIMA y 38 muestras de CSF del estudio Discovery del Oxford Parkinson's Disease Center (OPDC) del Nuffield Department of Clinical Neurosciences de la Universidad de Oxford. Todas las muestras de CSF se transportaron desde Oxford a Edimburgo en hielo seco y se almacenaron a -80 °C a su llegada. Además, se analizaron muestras de CSF de pacientes con sCJD o DLB confirmada neuropatológicamente del NCJDRSU CSF Bank. La aprobación ética para el uso de las muestras de CSF del NCJDRSU CSF Bank estuvo cubierta por el Multi-centre Research Ethics Committee para Escocia 05/MRE00/67. Todo el CSF se centrifugó y almacenó a -80 °C antes del análisis.
Resultados
El desarrollo de la RT-QuIC se llevó a cabo mediante el uso de BH de la corteza frontal de pacientes con diagnóstico clínico-patológico de DLB, enfermedad de Alzheimer (AD) y sCJD. Se usaron como controles (SD) pacientes sin evidencia neuropatológica de enfermedad neurológica que murieron súbitamente y formaban parte del MRC Sudden Death Brain Bank (Figura 2). Las reacciones de RT-QuIC sembradas con BH de DLB tuvieron una fase de retraso de 50 horas, después de lo cual se observó un aumento de la señal fluorescente de la tioflavina T que alcanzó su máximo a las 70 horas. Ninguna de las reacciones sembradas con BH de pacientes con otros trastornos de plegamiento anómalo de proteínas (AD o sCJD) o los controles de SD dieron una respuesta positiva incluso después de 120 horas.
Muchas patologías coexisten comúnmente, especialmente la patología relacionada con la AD y la a-sin19. Para investigar si la presencia de un trastorno de plegamiento anómalo de proteínas alternativo puede interferir con la agregación de a-sin inducida por DLB o PD, se examinaron los BH de la corteza frontal de pacientes con patologías mixtas (Figura 3). La presencia de un segundo trastorno de plegamiento anómalo de proteínas, tal como AD o sCJD, no inhibe la reacción de RT-QuIC inducida por los BH de<d>L<b>o PD (Figuras 2 y 3). Para investigar si el método RT-QuIC desarrollado era lo suficientemente sensible como para detectar la a-sin en el CSF, se analizaron dos muestras de CSF de pacientes con DLB confirmada neuropatológicamente y 1 CSF de un caso de sCJD confirmada neuropatológicamente (Figura 4). Ambas muestras de CSF de los pacientes con DCL dieron respuestas positivas con una fase de retraso de entre 60-100 horas.
Se analizó un conjunto exploratorio de 99 muestras de CSF in vivo obtenidas como parte del estudio OPTIMA de pacientes con la enfermedad subsecuentemente confirmada neuropatológicamente en tres volúmenes diferentes (es decir, 5, 10 y 15 jl) para investigar la sensibilidad y especificidad de la RT-QuIC y para calcular el volumen de CSF óptimo para el análisis (Tabla 2). Mediante el uso de un volumen de 15 j l se obtuvo una sensibilidad del 92 % para las muestras de CSF de DLB (Figuras 7 y 8) y se obtuvo una sensibilidad del 65 % para las muestras de CSF de pacientes con patología DLB/AD mixta. Ninguna de las muestras de CSF de los sujetos de control (Figura 5) o de pacientes con AD pura (Figura 6), CBD o PSP fue positiva. Mediante el uso de este conjunto exploratorio de muestras de CSF, se definió una respuesta positiva como un valor de unidad de fluorescencia relativa (rfu) de >2SD por encima de la media de los controles negativos a las 120 horas de al menos uno de los duplicados de CSF.
Tabla 2. Reacciones de RT-QuIC positivas sembradas con muestras de CSF de pacientes con DLB confirmada neuropatológicamente, DLB/AD mixta, AD con LB incidental, AD, PD y controles sanos (Grupo exploratorio) y pacientes con PD clínicamente diagnosticada, en riesgo de PD, degeneración corticobasal y parálisis supranuclear confirmada neuropatológicamente y controles de PD (Grupo confirmatorio). Una respuesta RT-QuIC positiva se clasificó como un valor de unidad de fluorescencia relativa (rfu) de >2SD por encima de la media de los controles negativos a las 120 horas de al menos uno de los duplicados del CSF.
La segunda fase del estudio consistió en aplicar estas condiciones analíticas y criterios de corte a un conjunto de muestras confirmatorias de CSF in vivo de 20 pacientes con PD clínicamente diagnosticada, 15 pacientes de control y 3 pacientes con trastorno de conducta del sueño REM (RBD) reconocido como tener un alto riesgo de desarrollar futuras alfa-sinucleinopatías,20 obtenido de la gran cohorte prospectiva de OPDC Discovery20. Estas muestras de CSF se codificaron, analizaron y reportaron sin conocimiento previo del diagnóstico final. Después de decodificar las muestras, los resultados mostraron que 19 de los 20 pacientes con PD tuvieron una respuesta RT-QuIC positiva (Figura 9) y ninguno de los 15 controles resultó positivo. Esto dio como resultado una sensibilidad y especificidad de la RT-QuIC para la PD del 95 % y 100 %, respectivamente (Tabla 2). Curiosamente, los tres pacientes en riesgo de desarrollar PD tuvieron una respuesta de RT-QuIC positiva. Estos pacientes tenían RBD, de los cuales se ha demostrado que el 80 % progresa hasta desarrollar un trastorno de cuerpos de Lewy.20
Análisis
El diagnóstico temprano tanto de la DLB como de la PD se ve obstaculizado por la ausencia de pruebas de diagnóstico clínico sensibles y confiables. Ambas afecciones están sustentadas por el depósito neuropatológico de una forma agregada de a-sin que se libera en el CSF. Hemos explotado la capacidad de la a-sin agregada para inducir una mayor agregación de a-sin no agregada de manera cíclica para desarrollar una técnica que puede detectar la a-sin anómala en el CSF en la DLB y la PD con una sensibilidad del 92 % y 95 %, respectivamente, con 100 % de especificidad. De manera única, encontramos que 3 pacientes con RBD con alto riesgo futuro de desarrollar un trastorno de cuerpos de Lewy dieron una respuesta de RT-QuIC positiva, lo que sugiere que esta prueba podría usarse como una prueba de diagnóstico temprano para la PD prodrómica. El trabajo futuro centrado en la validación de la prueba en una cohorte más grande de pacientes con RBD, seguido de una evaluación longitudinal continua, probará la utilidad del ensayo para estratificar el riesgo de aquellos individuos prodrómicos con mayor riesgo de conversión temprana de PD en quienes se podrían ensayar terapias neuroprotectoras. También descubrimos que las muestras de CSF de pacientes con CBD y PSP no dan respuestas de RT-QuIC positivas. Estos son trastornos del movimiento asociados con anomalías en la proteína tau en lugar de la a-sin, que pueden confundirse con la PD en las etapas tempranas. Por lo tanto, la RT-QuIC ofrece un nuevo enfoque para la detección de la a-sin anómala y tiene el potencial de mejorar el diagnóstico clínico temprano de la PD y la DLB, además de otras alfa-sinucleinopatías tales como la MSA.
El papel de las perlas en un ensayo RT-QuiC modificado para la detección de la alfa-sinucleína
Con referencia a las Figuras 10-13, para mostrar el papel que desempeñan las perlas usadas en los ensayos anteriores, se llevaron a cabo ensayos paralelos para muestras de homogeneizado cerebral (BH) de muerte súbita (SD) A) con perlas y B) sin perlas, muestras de BH de demencia con cuerpos de Lewy A) con perlas y B) sin perlas, muestras de fluido cefalorraquídeo (CSF) de enfermedad de Parkinson A) con perlas y B) sin perlas, y muestras de CSF de demencia con cuerpos de Lewy A) con perlas y B) sin perlas. Estos ensayos se llevaron a cabo mediante el uso del mismo método general descrito anteriormente. Como puede observarse en la Figura 10, no se observó ninguna lectura para las muestras de SD. Además, aquellas muestras con enfermedad de cuerpos de Lewy y enfermedad de Parkinson sin perlas (Figura 11B, Figura 12B o Figura 13B) no mostraron lectura. Sin embargo, se observan claramente lecturas para aquellas muestras con la enfermedad de cuerpos de Lewy o la enfermedad de Parkinson con las perlas. Por lo tanto, la presencia de las perlas es vital para la capacidad de detectar la presencia de agregados de a-sin mediante el uso de RT-QuiC.
Con referencia a la Figura 14, el efecto de la concentración de las perlas se investigó mediante el uso de muestras de homogeneizado de cerebro de demencia con cuerpos de Lewy. Las muestras sin perlas presentes en la mezcla de reacción mostraron una señal fluorescente constante, lo que indicó un resultado de RT-QuiC negativo. Por el contrario, las muestras con 18,7 mg de perlas por pocillo y 37,5 mg de perlas por pocillo dieron un claro aumento en la fluorescencia y la mayor concentración de perlas proporcionó una señal más clara y temprana.
Por lo tanto, es evidente que la presencia de las perlas en la mezcla de reacción es crucial para obtener una señal para la detección de los agregados de alfa-sinucleína.
1. Reacciones de RT-QuIC de a-sin mediante el uso de perlas de zirconio/sílice de 0,1 mm, 0,5 mm y 2,3 mm (aproximadamente 37 ± 3 mg) y sembradas con BH
Las reacciones de RT-QuIC con la adición de 37 mg de perlas de 0,1 mm, 0,5 mm o 2,3 mm se sembraron con 5 pl de dilución 1:200000 de BH idéntico de sujetos de control (SDBH), pacientes con enfermedad de cuerpos de Lewy (LBDBH), enfermedad de Alzheimer (ADBH) o enfermedad de Creutzfeldt-Jakob esporádica (sCJDBH) o sin sembrar. Las respuestas de RT-QuIC de a-sin obtenidas con perlas de zirconio/sílice de 0,1 mm se muestran en la Figura 15A, aquellas con perlas de zirconio/sílice de 0,5 mm se muestran en la Figura 15B y aquellas con perlas de zirconio/sílice de 2,3 mm se muestran en la Figura 15C.
Se puede observar a partir de las Figuras 15A, B, C, que aumentar el tamaño de las perlas de zirconio/sílice da como resultado un aumento en el tiempo necesario para provocar una respuesta de RT-QuIC de a-sin positiva con reacciones sembradas con LBDBH. Sin embargo, a pesar de tener un tiempo de respuesta más rápido mediante el uso de perlas de zirconio/sílice de 0,1 mm, la RT-QuIC de a-sin dio reacciones positivas con reacciones sembradas con ADBH.
2. Reacciones de RT-QuIC de a-sin mediante el uso de perlas de zirconio/sílice de 0,1 mm, 0,5 mm y 2,3 mm (aproximadamente 37 ± 3 mg) y sembradas con muestras de CSF
Las reacciones de RT-QuIC con la adición de 37 mg de perlas de 0,1 mm, 0,5 mm o 2,3 mm se sembraron con muestras de 15 j l de CSF de pacientes con enfermedad de cuerpos de Lewy (LB) o de sujetos de control. Las respuestas de RT-QuIC de a-sin obtenidas con perlas de zirconio/sílice de 0,1 mm se muestran en la Figura 16A, aquellas con perlas de zirconio/sílice de 0,5 mm se muestran en la Figura 16B y aquellas con perlas de zirconio/sílice de 2,3 mm se muestran en la Figura 16C.
El uso de perlas de zirconio/sílice de 0,1 mm y 0,5 mm dio como resultado reacciones de RT-QuIC de a-sin positivas sembradas con muestras de CSF de LB, pero no con muestras de CSF de control. Por el contrario, el uso de perlas de zirconio/sílice de 2,3 mm no admitió reacciones RT-QuIC de a-sin sembradas con muestras de CSF de pacientes con LB. Se usaron muestras de CSF idénticas en los experimentos ilustrados en la Figura 16A, B y C.
Los resultados de los experimentos ilustrados en las Figuras 15 y 16 demuestran que el uso de zirconio/sílice de 2,3 mm no acelera la reacción RT-QuIC de a-sin sembrada por BH o CSF de pacientes con LB. Los resultados de las reacciones RT-QuIC de a-sin mediante el uso de perlas de zirconio/sílice de 0,1 mm o de 0,5 mm fueron similares, aunque las reacciones RT-QuIC de a-sin mediante el uso de perlas de zirconio/sílice de 0,1 mm dieron como resultado que ADBH indujera una reacción positiva. Manipular perlas de zirconio/sílice de 0,1 mm fue difícil ya que su tamaño muy pequeño significaba que eran más propensas a la estática que las perlas de zirconio/sílice más grandes de 0,5 mm. Por lo tanto, todas las investigaciones posteriores sobre la composición de las perlas se llevaron a cabo con perlas de 0,5 mm de diámetro.
3. Reacciones de RT-QuIC de a-sin mediante el uso de perlas de acero de 0,5 mm y perlas de vidrio de 0,5 mm sembradas con BH
Las reacciones de RT-QuIC con la adición de 37 mg de perlas de acero o vidrio de 0,5 mm se sembraron con 5 j l de dilución 1:200 000 de BH idéntico de sujetos de control (SDBH), pacientes con enfermedad de cuerpos de Lewy (LBDBH) y enfermedad de Alzheimer (ADBH) y se compararon con aquellas reacciones que no se sembraron. Las reacciones de RT-QuIC de a-sin mediante el uso de perlas de acero de 0,5 m se muestran en la Figura 17A y las de perlas de vidrio se muestran en la Figura 17B.
El uso de perlas de acero de 0,5 mm no admite reacciones RT-QuIC de a-sin sembradas con LBDBH. Por el contrario, el uso de perlas de vidrio de 0,5 mm sí da como resultado reacciones RT-QuIC de a-sin positivas sembradas con LBDBH; sin embargo, las reacciones no sembradas y sembradas con ADBH muestran un aumento gradual en la fluorescencia, lo que da como resultado la carencia de una línea de base estable.
4. Reacciones de RT-QuIC de a-sin mediante el uso de perlas de acero de 0,5 mm y perlas de vidrio de 0,5 mm sembradas con muestras de CSF
Las reacciones de RT-QuIC con la adición de 37 mg de perlas de acero o vidrio de 0,5 mm se sembraron con muestras de 15 j l de CSF de pacientes con enfermedad de cuerpos de Lewy (LB) o de sujetos de control. Las reacciones de RT-QuIC de a-sin sembradas con CSF mediante el uso de perlas de acero de 0,5 m se muestran en la Figura 18A y las de perlas de vidrio se muestran en la Figura 18B. El uso de perlas de acero inhibe la capacidad de las muestras de CSF de pacientes con LB para sembrar el RT-QuIC de a-sin, mientras que el uso de perlas de vidrio da como resultado un aumento no específico en la fluorescencia y tampoco admite la reacción RT-QuIC de asin.
La conclusión general de los experimentos anteriores es que la adición de 37 mg/pocillo de perlas de zirconio/sílice de 0,5 mm es el mejor promotor de reacciones RT-QuIC de a-sin sembradas con muestras de BH o CSF de pacientes con LBD.
Investigación de la capacidad de los componentes de la sangre de pacientes con enfermedad de Parkinson (PD) para sembrar la conversión inducida por agitación en tiempo real (RT-QuIC) de la alfa-sinucleína (a-sin)
Se aislaron plaquetas de muestras de sangre anticoagulada con EDTA de dos pacientes con PD y un sujeto de control. Al aumentar la velocidad de sacudida de 200 rpm a 600 rpm y la temperatura de la reacción a 42 °C, fue posible sembrar la reacción RT-QuIC de a-sin mediante el uso de 15 j l de plaquetas de estos 2 pacientes con PD (Figura 19). Por el contrario, las plaquetas del sujeto de control no lograron sembrar la reacción. Por lo tanto, esto demostró que el método de la invención es efectivo para determinar si una muestra de sangre comprende agregados de a-sin y, por lo tanto, para diagnosticar potencialmente si el sujeto del que se originó la muestra de sangre tiene una alfa-sinucleinopatía tal como la enfermedad de Parkinson o la demencia con cuerpos de Lewy.
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Claims (13)

REIVINDICACIONES
1. Un método in vitro para detectar la presencia de agregación de alfa-sinucleína en una muestra biológica, el método comprende las etapas:
(i) proporcionar una muestra de reacción que comprende
(a) una población de perlas que comprende zirconia y/o sílice, o vidrio, en donde la población de perlas tiene un diámetro medio de 1 mm ±10 % a 0,1 mm ±10 %,
(b) tioflavina T; y
(c) alfa-sinucleína o una variante de esta que tiene de 1 a 10 sustituciones, inserciones o deleciones de aminoácidos que no afectan sustancialmente la capacidad del péptido para agregarse en las condiciones de reacción del método;
(ii) combinar una muestra biológica y la muestra de reacción para formar una mezcla de reacción;
(iii) incubar la mezcla de reacción con ciclos de agitación intermitentes;
(iv) iluminar la mezcla de reacción con una longitud de onda de luz que excite la tioflavina T; y
(v) determinar el nivel de fluorescencia de la mezcla de reacción durante la incubación,
en donde las etapas (iii) a (v) se llevan a cabo al mismo tiempo, y un aumento significativo en la fluorescencia de la mezcla de reacción durante las etapas (iii) a (v) es indicativo de la presencia de agregados de alfasinucleína en la mezcla de reacción, y en donde la presencia de agregados de alfa-sinucleína en la mezcla de reacción es indicativa de la presencia de agregados de alfa-sinucleína en la muestra biológica.
2. El método de acuerdo con la reivindicación 1, en donde la muestra biológica es una muestra de fluido corporal seleccionada del grupo que consiste en fluido cefalorraquídeo, sangre, fracciones de la sangre, fluido nasal, tejido nasal, orina, heces y linfa.
3. El método de acuerdo con la reivindicación 1 o 2, en donde la muestra de reacción es una muestra de reacción tamponada que comprende tris(hidroximetil)aminometano (TRIS), solución salina tamponada con fosfato (PBS), ácido 4-(2-hidroxietil)-1-piperazinetanosulfónico (HEPES), ácido piperazin-N,N'-bis(2-etanosulfónico) (PIPES), o tampón fosfato de Sorensen.
4. El método de acuerdo con cualquier reivindicación anterior, en donde la muestra de reacción es una muestra de reacción tamponada y está tamponada para mantener el pH de la muestra de reacción de pH 6 a pH 8,5.
5. El método de acuerdo con cualquier reivindicación anterior, en donde la muestra de reacción comprende de 0,01 mg/ml de alfa-sinucleína o una variante de esta a 10 mg/ml de alfa-sinucleína o una variante de esta para que actúe como sustrato para la agregación.
6. El método de acuerdo con cualquier reivindicación anterior, en donde la alfa-sinucleína o variante de esta es alfasinucleína humana recombinante de longitud completa (aminoácidos 1-140) o una variante de esta.
7. El método de acuerdo con cualquier reivindicación anterior, en donde las perlas de la población de perlas de la muestra de reacción comprenden zirconia o sílice.
8. El método de acuerdo con cualquier reivindicación anterior, en donde el diámetro medio de la población de perlas es 0,1 mm ±10 %.
9. El método de acuerdo con cualquier reivindicación anterior, en donde la mezcla de reacción se incuba durante más de 40 horas, más de 60 horas, más de 80 horas o más de 120 horas.
10. El método de acuerdo con cualquier reivindicación anterior, en donde el método se lleva a cabo a una temperatura de 25 °C a 45 °C.
11. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-6 y 8-10, en donde las perlas de la población de perlas de la muestra de reacción comprenden vidrio.
12. Un método in vitro para diagnosticar las alfa-sinucleinopatías, el método comprende las etapas:
(i) proporcionar una muestra de reacción que comprende:
(a) una población de perlas que comprende zirconia y/o sílice, o vidrio, en donde la población de perlas tiene un diámetro medio de 1 mm ±10 % a 0,1 mm ±10 %;
(b) tioflavina T; y
(c) alfa-sinucleína o una variante de esta que tiene de 1 a 10 sustituciones, inserciones o deleciones de aminoácidos que no afectan sustancialmente la capacidad del péptido para agregarse en las condiciones de reacción del método;
(ii) combinar una muestra biológica y la muestra de reacción para formar una mezcla de reacción;
(iii) incubar la mezcla de reacción con ciclos de agitación intermitentes;
(iv) iluminar la mezcla de reacción con una longitud de onda de luz que excite la tioflavina T; y
(v) determinar el nivel de fluorescencia de la mezcla de reacción durante la incubación,
en donde las etapas (iii) a (v) se llevan a cabo al mismo tiempo, y un aumento significativo en la fluorescencia de la mezcla de reacción durante las etapas (iii) a (v) es indicativo de que el sujeto tiene una alfa-sinucleinopatía.
13. El método de acuerdo con la reivindicación 12, en donde la alfa-sinucleinopatía es la enfermedad de Parkinson o la demencia con cuerpos de Lewy.
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