KR101602546B1

KR101602546B1 - 아밀로이드 펩티드를 측정하기 위한 항체, 키트 및 방법

Info

Publication number: KR101602546B1
Application number: KR1020137025856A
Authority: KR
Inventors: 마누엘 사라사 바리오
Original assignee: 아라클론 바이오테크, 에스.엘.
Priority date: 2011-04-12
Filing date: 2012-04-03
Publication date: 2016-03-10
Also published as: TWI549966B; MX2013011515A; US9863961B2; IL253794A0; EP2698381A4; EP2511296A1; MX337535B; RU2571213C2; SG194053A1; US9255932B2; TW201305201A; CN103547593B; RU2013139450A; CA2828307A1; AR085959A1; WO2012140296A1; EP2698381B1; CN103547593A; CA2828307C; BR112013023540A2

Abstract

본 발명은 항-Aβ17 항체의 사용에 의해 Aβ17 펩티드를 검출하는 면역분석법 및 상기 항체를 사용한 키트 및 방법의 분야에 관한 것이다. 본 발명은 또한 신경퇴행성 질환의 상이한 단계들을 진단 또는 구별하는 방법에 관한 것이다.

Description

아밀로이드 펩티드를 측정하기 위한 항체, 키트 및 방법{ANTIBODY, KIT AND METHOD FOR DETERMINING AMYLOID PEPTIDES}

알츠하이머 질환(AD)은 점증적 기억력 감소, 이어서 사지 및 신체 기능의 제어 상실 및 최후에는 사망을 특징으로 하는 중추신경계의 진행성 퇴행성 질환이다. 이는 분명히 65세 이상 인구의 1 내지 6% 및 80세 이상 인구의 10 내지 20%에 영향을 미치는 치매의 가장 일반적인 원인이다.

AD는 뉴런 사이의 세포외 공간에서 환자의 뇌에서 노인성 플라크의 진행성 출현을 포함하는, 몇몇 병리학적 특징에 의해 다른 유형의 치매와 구별된다. 상기 플라크는 퇴화된 신경염과 교질 세포로 둘러싸인 β 아밀로이드 펩티드(Aβ)로 지칭되는 40 내지 42개 아미노산 펩티드의 원섬유에 의해 주로 형성된 아밀로이드 침적물의 중심 코어를 갖는다. 이 펩티드는 β 아밀로이드 전구체 단백질(βAPP)로 불리우는 전구체 단백질의 단백질분해 과정에서 생긴다.

국립 신경 및 의사소통 질환 및 발작(The National Institute of Neurological and Communicative Disorders and Stroke; NINCDS) 및 알츠하이머 질환 및 관련 질환 협회(Alzheimer's Disease and Related Disorders Association; ADRDA)는 1984년에 가장 일반적으로 사용된 NINCDS-ADRDA 알츠하이머 기준을 확립했다. NINCDS/ADRDA에 따르면, 이들 기준은 다음과 같다:

· 명확한 알츠하이머 질환: 환자는 확실한 알츠하이머 질환에 대한 기준에 부합하고, 검시 또는 생검을 통해 AD의 조직병리학적 증거를 나타낸다.

· 유력한 또는 전구 알츠하이머 질환: 치매는 임상적 및 신경정신학적 검사에 의해 확립되었다. 인지 손상은 또한 진행성이고 2개 이상의 인지 영역에 존재해야 한다. 장해의 발병은 40 내지 90세 연령 사이에 존재했고, 결정적으로 치매 증상을 생성할 수 있는 다른 질환이 부재해야 한다.

· 잠재적 또는 비-전구 알츠하이머 질환: 비전형적 발병, 제시 또는 진행을 갖는 치매 증후군이 존재하고, 공지된 병인이 없지만, 치매를 생성할 수 있는 어떠한 공-병리 질환도 이의 기원에 존재하는 것으로 생각되지 않는다.

· 가능성이 낮은(unlikely) 알츠하이머 질환: 환자는 질병 과정에서 초기에 갑작스런 발병, 국소 신경학상 징후 또는 발작 또는 보행 장애를 갖는 치매 증후군을 나타낸다.

경도 인지 손상(Mild cognitive impairment; MCI, 또한 초기 치매, 또는 격리 기억 손상으로 공지됨)은, 이들의 연령 및 교육의 예상된 범위를 넘지만 이들의 1일 활동을 현저히 간섭하지 않는 인지 손상을 갖는 개인에게 제공된 진단이다[참조: Petersen RC et al. (1999) Arch. Neurol. 56 (3): 303-8]. 이는 정상 노화와 치매 사이의 경계 또는 일시적 상태인 것으로 생각된다. MCI는 다양한 증후군으로 존재할 수 있지만, 기억 손실이 주요 증상인 경우, "건망증 MCI"로 지칭되고 종종 알츠하이머 질환의 위험 요소인 것으로 나타난다[참조: Grundman M et al. (2004). Arch. Neurol. 61 (1): 59-66]. 연구들은 이들 개인들이 연간 대략 10% 내지 15%의 비율로 유력한 및 전구 알츠하이머 질환으로 진행되는 경향이 있음을 시사한다[참조: Grundman M et al ad supra .]. 추가로, 개인들이 기억 이외의 도메인에서 손상을 갖는 경우, 비-건망증 단일- 또는 복수-도메인 MCI로서 분류되고, 이들 개인들은 다른 치매로 전환될 가능성이 높은 것으로 생각된다[참조: Tabert MH et al. (2006). Arch. Gen. Psychiatry 63 (8): 916-24].

MCI의 진단은 상당한 임상적 판단을 필요로 하고, 따라서 대안적 진단을 배제하기 위해서는 임상적 관찰, 신경촬영, 혈액 시험 및 신경정신학적 시험을 포함하는 종합 임상적 평가가 최선이다. 유사한 평가는 알츠하이머 질환의 진단을 위해 통상적으로 수행된다. MCI는 다음이 존재하는 경우에 진단된다[참조: Morris JC et al. (2001). Arch. Neurol. 58 (3): 397-405]:

- 기억 손상의 증거

- 일반 인지 및 기능 능력의 보존

- 진단된 치매의 부재

지난 수십년 동안, 혈장, 혈청 또는 혈중 세포를 사용함으로써 말초 마커를 동정하기 위해 몇몇 시도가 수행되었다. 특히, 아밀로이드 플라크는 알츠하이머 질환 신경병리학의 규정 특징이고 Aβ가 혈장에서 검출될 수 있기 때문에, 이의 측정은 알츠하이머 질환에 대한 강력한 후보 생물마커이다.

임상적 실습에서, AD의 진단은 전형적인 임상적 특징의 존재 및 신경촬영 기술 및 혈액 분석을 사용하는 다른 유형의 치매의 배제에 기반한 임상 기준을 사용하여 수행된다. 이들 기준을 사용하여, 진단 신뢰도는, 뇌 검시를 사용하여 수행된 연구에 따라, AD로 진단된 환자 중 10 내지 20%가 상이한 질환을 앓고 있더라도 허용가능하다. 더욱이, 현재의 진단 방법은, 신경퇴행성 과정이 매우 진행되어 환자가 중증의 치매를 앓고 있는 경우 및 뇌 손상이 매우 광범위하여 다수의 치료학적 측정이 제한되는 경우에만 수행될 수 있다.

Aβ가 AD 환자의 뇌에서 축적되고 AD의 발병에 중요 요소인 사실에 비추어, 이러한 단백질은 AD 생물마커로서 가장 적합한 후보로서 생각되었다. 그러나, AD에 대한 혈장 생물마커로서 Aβ의 사용은, 혈청에서 Aβ 펩티드(Aβ(1-40) 및 Aβ(1-42))의 농도가 매우 낮고, 따라서 상기 펩티드 종의 확실한 검출을 허용하기에 충분히 감수성인 분석법이 없다는 문제에 직면한다.

다수의 상이한 분석법이 생물학적 샘플에서 아밀로이드 베타 펩티드의 수준을 측정하기 위해 사용되어 왔다(참조: 문헌[Scheuner et al (Nature Med., 1996, 2:864-870); Tamaoka A et al. (J Neurol Sci., 1996, 141, 65-68); Suzuki,N. et al. (Science, 1994, 264:1336-1340); WO200722015, Vanderstichele H et al. (Amyloid, 2000, 7, 245-258); Fukomoto y col. (Arch. Neurol. 2003, 60, 958-964); Mehta et al. (Arch. Neurol. 57, 2000, 100-105); Mayeux, R. et al. (Ann Neurol. 1999, 46, 412-416); Lanz, T.A and Schacthter, J.B. (J. Neuroscience Methods, 2006, 157:71-81), WO200750359, WO0162801, WO0315617, WO0246237, WO0413172]에 기재된 방법). 그러나, 현재까지 공지된 모든 ELISA-기반 분석법은 기껏해야 한자리수 pg/mL 범위로 존재하지 않는 최저 검출 한계를 갖고, 이는 가족성 AD를 앓고 있는 환자에서 혈장 중의 상기 종의 검출 뿐만 아니라 CSF에서 Aβ40 및 Aβ42의 검출에 충분하지만, Aβ42 혈장 농도가 매우 낮은 우발적 AD를 앓고 있는 환자의 혈장에서 Aβ42의 검출에 부적합하다.

현재까지, 한자리수 pg/mL보다 낮은 최저 검출 한계를 나타내는 유일한 Aβ 펩티드 분석법은 국제공개공보 제WO200646644호 및 제WO2009015696호에 기재된 분석법에 상응한다.

제WO200646644호에는 전기화학발광(ECL) 샌드위치 분석법이 기재되어 있고, 여기서 mAb 21F12(이는 Aβ42의 아미노산 33-42를 인식한다)은 마그네틱 비드에 결합되고, 이어서 Aβ42를 함유하는 샘플에서 Aβ42 펩티드를 포획하기 위해 사용되고 루테늄 착물에 결합된 3D6 mAb와 접촉된다. 이어서, 결합된 3D6 항체의 양은 전기 에너지가 사용되는 경우 루테늄 착물에 의해 방사된 발광으로 검출된다. 이 분석법을 사용하여, 본 발명자들은 Aβ42 기준의 0.5 pg/mL 만큼 낮은 양을 검출할 수 있다. 그러나, 동일한 분석법을 사용하여 AD 환자와 건강한 대조군의 혈장 샘플에서 Aβ42를 비교하는 경우, 환자 두 세트 간에는 유의적인 차이가 발견될 수 없었고, 본 발명자들은 혈청에서 순수한 Aβ42의 양이 퇴행으로 인해 매우 낮다고 결론지어 ng/mL 범위에서 더 낮은 감도 수준을 제공하는 21F12mAb를 사용하는 경쟁적 ELISA 분석법에 의지하게 되었다.

제WO2009015696호에는 고감도 ELISA 샌드위치 분석법이 기재되어 있는데, 여기서 검출 항체는 상기 항체에 대해 특이성을 나타내는 비오틴-표지된 시약과 접촉한다. 이 시약은 퍼옥시다제에 결합하는 스트렙트아비딘과 접촉한다. 이어서, 퍼옥시다제 활성은 TMB를 사용한 비색법 또는 콴타블루(QuantaBlue)를 사용한 형광법으로 검출된다.

제WO2006053251호에는 샘플을 변성제에 접촉시키는 단계, 샘플-변성제 혼합물에서 펩티드 풀을 추출하는 단계, 풀에서 아밀로이드 베타 펩티드 종을 분리하는 단계, 아밀로이드 베타 펩티드 종의 양을 측정하는 단계를 포함하는 샘플에서 아밀로이드 베타 펩티드 종을 측정하는 방법이 기재되어 있다. 이 방법은 측정전 펩티드의 분리 단계를 필요로 하여, 처리 시간과 비용이 증가하게 된다.

환자의 뇌 또는 CSF에 존재하는 생물마커의 수준을 검출함으로써 AD를 진단하는 방법들이 당업계에 공지되어 있다. 상이한 생물마커들은 이의 측정이 CSF에서 수행되는 것을 특징으로 한다. CSF는 중추신경계의 세포외 공간의 조성을 직접적으로 반영하고, 그에 따라 생물마커로서 더 높은 농도를 제공한다. 그러나, CSF는, 치매를 앓고 있는 환자가 쉽게 받아들이는 통상의 진단법이 아니며 기억 장애가 있는 환자를 혼자 두는 요추 천자에 의해서만 검색될 수 있다. 따라서, 신체에서 비침습적으로 검색될 수 있는 샘플에서 검출될 수 있는 AD 생물마커가 필요하다.

선행 기술에 기재되어 있고 혈장에서 검출될 수 있는 적합한 AD 생물마커에는 하기의 것이 포함된다: (i) 아밀로이드 플라크로부터 유래된 마커, (ii) Aβ 또는 βAPP에 대한 자가항체, (iii) 염증 마커, 예를 들면, IL-6, 이의 수용체 또는 gp130, C-반응성 단백질 또는 산화 스트레스(이소프로스탄), (iv) 지질 대사의 마커(apoE, 옥시스테롤) 및 (v) 혈관 질환 마커(호모시스테인, 지단백질 b C1q)[참조: Scheuner D et al. (1996) Nature Med 2, 864-870].

그러나, Aβ가 AD 환자의 뇌에 축적되며, AD의 병인에서 중심 요소라는 사실에 비추어, 이 단백질은 AD 생물마커로서 가장 적합한 후보물질로서 간주된다. 그러나, AD에 대한 혈장 생물마커로서의 Aβ의 사용은 혈청에서 Aβ 펩티드(Aβ(1-40) 및 Aβ(1-42))의 농도가 극히 낮고, 이에 따라 상기 펩티드 종들을 신뢰성있게 검출하기에 충분한 감도가 있는 분석법이 없다는 문제에 직면한다.

추가로, 몇몇 항체는 Aβ 펩티드을 검출하고 면역학적 분석에 사용되는 것으로 기재되어 있다. 예를 들면, 모노클로날 항-Aβ(1-17)(6E10)는, Aβ 펩티드의 N-말단 영역에 대해 지시되고, 펩티드 Aβ(1-17)에 대해 생성되고[참조: Kim KS, et al. Neurosci. Res. Comm. 7; 1988], 펩티드 Aβ(1-28)에 대해 생성된 모노클로날 항체(Pierce) 또는 상기 영역을 포함하는 Aβ 펩티드를 인식하는 항체이다.

그러나, 특히 우발적 AD를 앓고 있는 환자의 혈장에서 신뢰성 있는 방식으로 감도가 Aβ 펩티드를 검출하기에 감도가 높은, 당해 기술분야에 공지된 방법 및 키트의 문제를 극복하는 Aβ-유도된 펩티드를 검출하기 위한 개선된 면역학적 분석법 및 키트가 당해 기술분야에 요구되고 있다. 또한, 감도가 높고 특이적이며, 상기 과정의 조기 징후와 연관된 것들로부터 고령으로 인한 인지 손상을 구별하고, AD로 인한 변화와 기타 퇴행성 증상으로 인한 변화를 구별하는, AD의 조기 진단을 위한 생물마커를 동정할 필요가 있다. 그로돈 등[참조: Growdon et al., Neurobiol. Aging, 1998, 19:109-116]에 따르면, AD에 대한 이상적인 마커는 하기의 요건을 충족시켜야 한다:

- 신경병리학의 기본적인 특징을 검출해야 한다.

- 신경병리학적으로 확인된 경우의 질환에서 입증되어야 한다.

- AD 검출에 있어서 80% 이상의 감도를 나타내야 한다.

- AD를 기타 유형의 치매와 구별하는 80% 이상의 특이성을 나타내야 한다.

- 수행이 신뢰성이 있고, 재현가능하며, 비-침습적이고 단순해야 하며, 비용이 많이 들지 않아야 한다.

한 가지 측면에서, 본 발명은 Aβ(1-17) 펩티드에 특이적으로 결합하는 항체에 관한 것이다.

제2 측면에서, 본 발명은 하기를 포함하는 Aβ(1-17) 펩티드 검출용 키트에 관한 것이다:

(i) 제1항 내지 제3항 중의 어느 한 항에 정의된 항체인 제1 항체 및

(ii) 제1 항체에 의해 인식되는 영역과 상이한 Aβ(1-17) 펩티드의 영역을 인식하는 제2 항체.

제3 측면에서, 본 발명은 하기의 단계를 포함하는, 샘플에서 Aβ(1-17) 펩티드를 측정 또는 검출하는 방법에 관한 것이다:

(i) 샘플에 존재하는 Aβ(1-17) 펩티드를 상기 펩티드와 특이적으로 결합하는 제1 항체로 포획하는 단계,

(ii) 단계 (i)에서 형성된 면역 복합체를 제2 항체와 접촉시키는 단계로, 상기 제2 항체는 제1항 내지 제4항 중의 어느 한 항에 정의된 바와 같고, 상기 제2 항체는 제1 항체와는 상이한 영역을 인식하고 결합 쌍의 제1 구성원에 결합되는 것인 단계,

(iii) 단계 (ii)에서 형성된 복합체를 검출가능한 태그에 결합된 결합 쌍의 제2 구성원과 접촉시키는 단계, 및

(iv) 검출가능한 태그의 활성 또는 양을 검출 또는 측정하는 단계.

또 다른 측면에서, 본 발명은 하기의 단계를 포함하는, 대상체에서 신경퇴행성 질환을 모니터링하는 방법이다:

(a) 상기 대상체 샘플 중의 혈장 샘플에서 유리 Aβ17 펩티드의 수준 및 혈액 샘플에서 세포에 결합된 Aβ17 펩티드 수준을 제1 시점에서 상기 대상체로부터의 샘플에서 측정하는 단계;

(b) 상기 대상체 샘플 중의 혈장 샘플에서 유리 Aβ17 펩티드의 수준 및 혈액 샘플에서 세포에 결합된 Aβ17 펩티드 수준을 제2 시점에서 상기 대상체로부터의 샘플에서 측정하는 단계; 및

(c) 제1 시점과 제2 시점에서 혈장 샘플 중의 유리 Aβ17 펩티드의 수준 및 혈액 샘플 중의 세포에 결합된 Aβ17 펩티드의 수준의 비율을 비교하는 단계;

여기서, 상기 비율이 제1 시점에 대하여 제2 시점에서 증가되는 경우, 이는 상기 제1 시점과 제2 시점 사이에 대상체에서 알츠하이머 질환의 악화를 나타낸다.

또 다른 양태에서, 본 발명은 하기 단계를 포함하는, 대상체가 경도 알츠하이머 질환을 앓고 있는지를 측정하는 방법이다:

(a) 상기 대상체 샘플의 혈액 샘플 중의 세포에 결합된 Aβ17, Aβ40 및 Aβ42 펩티드 수준의 부가된 값;

(b) 상기 대상체의 혈장 샘플 중의 Aβ17, Aβ40 및 Aβ42 전체 펩티드 수준 및 상기 대상체의 혈액 샘플 중의 세포에 결합된 Aβ17, Aβ40 및 Aβ42 펩티드 수준의 부가된 값;

(c) 상기 대상체의 혈장 샘플 중의 전체 Aβ42 펩티드 수준 및 대상체의 혈액 샘플 중의 세포에 결합된 Aβ42 펩티드의 수준의 부가된 값;

(d) 상기 대상체의 혈장 샘플 중의 전체 Aβ40 및 Aβ42 펩티드 수준 및 상기 대상체의 혈액 샘플 중의 세포에 결합된 Aβ40 및 Aβ42 펩티드 수준의 부가된 값; 및

(e) 상기 대상체의 혈장 샘플 중의 유리 Aβ17의 수준 및 상기 대상체의 혈액 샘플 중의 세포에 결합된 Aβ17 펩티드 사이의 비율 값으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 파라미터 값을 측정하는 단계;

여기서, 하나 이상의 상기 파라미터 값이 건강한 대상체의 참조 샘플 중의 상기 파라미터 값에 대하여 증가되는 경우, 당해 대상체는 경도 알츠하이머 질환을 앓고 있다.

또 다른 측면에서, 본 발명은 하기 단계를 포함하는, 대상체가 전구 알츠하이머 질환을 갖는 MCI를 앓고 있는지를 측정하는 방법이다:

(a) 상기 대상체의 혈장 샘플 중의 전체 Aβ42 펩티드 수준 및 상기 대상체의 혈액 샘플 중의 세포에 결합된 Aβ42 펩티드 수준의 부가된 값;

(b) 상기 대상체의 혈장 샘플 중의 전체 Aβ40 및 Aβ42 펩티드 수준 및 상기 대상체의 혈액 샘플 중의 세포에 결합된 Aβ40 및 Aβ42 펩티드 수준의 부가된 값;

(c) 상기 대상체의 혈장 샘플 중의 유리 Aβ17 펩티드 수준 및 상기 대상체의 혈액 샘플 중의 세포에 결합된 Aβ17 펩티드 수준 사이의 비율 값;

(d) 상기 대상체의 혈액 샘플 중의 세포에 결합된 Aβ17 수준 및 혈액 샘플 중의 세포에 결합된 Aβ42 펩티드 수준 사이의 비율 값;

(e) 제1 파라미터가 혈장 샘플 중의 전체 Aβ17 펩티드의 부가된 수준 및 혈액 샘플 중의 세포에 결합된 Aβ17 펩티드의 수준에 상응하고, 제2 파라미터가 혈장 샘플 중의 전체 Aβ42 펩티드의 부가된 수준 및 혈액 샘플 중의 세포에 결합된 Aβ42 펩티드의 수준에 상응하는, 2개 파라미터 사이의 비율 값;

(f) 제1 파라미터가 혈액 샘플 중의 세포에 결합된 Aβ17 펩티드의 수준에 상응하고, 제2 파라미터가 혈액 샘플 중의 세포에 결합된 Aβ40 펩티드 수준 및 혈액 샘플 중의 세포에 결합된 Aβ42 펩티드 수준의 부가된 값에 상응하는, 2개 파라미터 사이의 비율 값; 및

(g) 제1 파라미터가 상기 대상체의 혈장 샘플 중의 전체 Aβ17 펩티드 수준 및 혈액 샘플 중의 세포에 결합된 Aβ17 펩티드 수준의 부가된 값에 상응하고, 제2 파라미터가 혈장 샘플 중의 전체 Aβ40 및 Aβ42 펩티드 수준 및 혈액 샘플 중의 세포에 결합된 Aβ40 및 Aβ42 펩티드 수준 사이의 부가된 값에 상응하는, 2개 파라미터 사이의 비율 값으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 파라미터 값을 측정하는 단계;

여기서, 건강한 대상체의 참조 샘플 중의 값에 대하여 파라미터 (a), (b) 또는 (c) 중 하나 이상의 파라미터 값이 증가되고/되거나 파라미터 (d), (e), (f) 또는 (g) 중 하나 이상의 파라미터 값이 감소되는 경우, 당해 대상체는 전구 알츠하이머 질환을 갖는 MCI를 앓고 있다.

(b) 상기 대상체의 혈액 샘플 중의 세포에 결합된 Aβ17 펩티드 수준 및 상기 대상체의 혈액 샘플 중의 세포에 결합된 Aβ42 펩티드 수준 사이의 비율 값;

(c) 제1 파라미터가 상기 대상체의 혈장 샘플 중의 전체 Aβ17 펩티드 수준 및 혈액 샘플 중의 세포에 결합된 Aβ 펩티드 수준의 부가된 값에 상응하고, 제2 파라미터가 상기 대상체의 전체 Aβ42 펩티드 수준 및 혈액 샘플 중의 세포에 결합된 Aβ42 펩티드 수준의 부가된 값에 상응하는, 2개 파라미터 사이의 비율 값;

(d) 제1 파라미터가 혈액 샘플 중의 세포에 결합된 Aβ17 펩티드 수준에 상응하고, 제2 파라미터가 혈액 샘플 중의 세포에 결합된 Aβ40 및 Aβ42 펩티드 수준의 부가된 값에 상응하는, 2개 파라미터 사이의 비율 값; 및

(e) 제1 파라미터가 상기 대상체의 혈장 샘플 중의 전체 Aβ17 펩티드 수준 및 혈액 샘플 중의 세포에 결합된 Aβ17 펩티드 수준의 부가된 값에 상응하고, 제2 파라미터가 혈장 샘플 중의 전체 Aβ40 및 Aβ42 펩티드 수준 및 혈액 샘플 중의 세포에 결합된 Aβ40 및 Aβ42 펩티드 수준의 부가된 값에 상응하는, 2개 파라미터 사이의 비율 값으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 파라미터 값을 측정하는 단계;

여기서, 비-전구 알츠하이머 질환을 갖는 MCI를 앓고 있는 대상체의 참조 샘플의 값에 대하여 파라미터 (a) 값이 증가되고/되거나 파라미터 (b), (c), (d) 또는 (e) 중 하나 이상의 파라미터 값이 증가되는 경우, 당해 대상체는 전구 알츠하이머 질환을 갖는 MCI를 앓고 있다.

또 다른 측면에서, 대상체가 경도 알츠하이머 질환을 앓고 있는지를 측정하는 방법으로서,

(a) 혈액 샘플 중의 세포에 결합된 Aβ17, Aβ40 및 Aβ42 펩티드 수준의 부가된 값;

(b) 혈장 샘플 중의 전체 Aβ17, Aβ40 및 Aβ42 펩티드 수준 및 혈액 샘플 중의 세포에 결합된 Aβ17, Aβ40 및 Aβ42 펩티드 수준의 부가된 값;

(c) 혈장 샘플 중의 전체 Aβ42 펩티드 수준 및 혈액 샘플 중의 세포에 결합된 Aβ42 펩티드 수준의 부가된 값;

(d) 혈장 샘플 중의 전체 Aβ40 및 Aβ42 펩티드 수준 및 혈액 샘플 중의 세포에 결합된 Aβ40 및 Aβ42 펩티드 수준의 부가된 값;

(e) 혈장 샘플 중의 전체 Aβ40 펩티드 수준 및 혈액 샘플 중의 세포에 결합된 Aβ40 펩티드 수준의 부가된 값;

(f) 제1 파라미터가 혈액 샘플 중의 세포에 결합된 Aβ17 펩티드 수준에 상응하고, 제2 파라미터가 혈액 샘플 중의 세포에 결합된 Aβ40 및 Aβ42 펩티드 수준의 부가된 값에 상응하는, 2개 파라미터 사이의 비율 값; 및

(g) 혈장 샘플 중의 유리 Aβ17 펩티드 수준 및 혈액 샘플 중의 세포에 결합된 Aβ17 펩티드 수준 사이의 비율 값으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 파라미터 값을 측정하는 단계;

여기서, 비-전구 알츠하이머 질환을 갖는 MCI를 갖는 대상체의 참조 샘플 값에 대하여 하나 이상의 상기 파라미터 값이 증가되는 경우, 당해 대상체는 경도 알츠하이머 질환을 앓고 있다.

또 다른 측면에서, 본 발명은 하기 단계를 포함하는, 대상체가 경도 알츠하이머 질환을 앓고 있는지를 측정하는 방법이다:

(a) 혈장 샘플 중의 유리 Aβ17 펩티드 수준 및 혈장 샘플 중의 유리 Aβ40 펩티드 수준 사이의 비율 값; 및

(b) 제1 파라미터가 혈장 샘플 중의 유리 Aβ17 펩티드 수준에 상응하고, 제2 파라미터가 혈장 샘플 중의 유리 Aβ40 및 Aβ42 펩티드의 부가된 수준에 상응하는, 2개 파라미터 사이의 비율로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 파라미터 값을 측정하는 단계;

여기서, 전구 경도 인지 손상 대상체의 참조 샘플의 값에 대하여 하나 이상의 상기 파라미터 값이 증가되는 경우, 당해 대상체는 경도 알츠하이머 질환을 앓고 있다.

도 1: 도트 블롯 분석 결과는 막에 흡수된 폴리클로날 항-Aβ(1-17) 항체 및 상이한 Aβ 펩티드를 사용하여 수행했다. 분석에 사용된 제2 항체는 염소 항-토끼 항체-HRP였다. 도트-블롯은 1분 및 3분 현시(exposition)에서 SNAP 기술과 함께 ECL로 나타냈다.
도 2는 CSF 샘플(2a) 및 혈장 샘플(2b)에 대한 질량 스펙트럼 분석을 나타내고, 여기서 Aβ17 피크는 화살표로 제시되어 있다.
도 3은 상이한 그룹의 환자에서 일부 마커의 평균 값을 나타낸다. FP: 혈장 중의 유리 Aβ; TP: 혈장 중의 전체 Aβ; CB: 세포에 결합된 Aβ; PIB: 혈액 중의 풀(혈장 중의 전체 Aβ + 세포에 결합된 Aβ). (A) 상이한 그룹에 대해 샌드위치 ELISA로 수득된 Aβ 마커의 농도(pg/mL): CS > 65(65세 이상의 건강한 대상체), 잠재적 MCI(잠재적 또는 비-전구 AD와 함께 경도 인지 손상을 갖는 대상체), 유력한 MCI(유력한 또는 전구 AD와 함께 경도 인지 손상을 갖는 대상체) 및 경도 AD(경도 알츠하이머 질환을 갖는 대상체). (B) 및 (C): 상이한 그룹의 몇몇 마커에 대한 ELISA로 수득한 흡광도를 나타내는 그래프.
도 4는 상이한 그룹의 환자에서 일부 마커의 평균 값을 나타낸다. FP: 혈장 중의 유리 Aβ; TP: 혈장 중의 전체 Aβ; CB: 세포에 결합된 Aβ; PIB: 혈액 중의 풀(혈장 중의 전체 Aβ + 세포에 결합된 Aβ). (A) 상이한 그룹에 대해 샌드위치 ELISA로 수득된 Aβ 마커의 농도(pg/mL): CS > 65(65세 이상의 건강한 대상체), 잠재적 MCI(잠재적 또는 비-전구의 경도 인지 손상) 유력한 MCI(유력한 또는 전구의 경도 인지 손상) 및 경도 AD(경도 알츠하이머 질환). (B): 상이한 그룹의 몇몇 마커에 대한 ELISA로 수득한 흡광도를 나타내는 그래프.
도 5는 상이한 그룹의 환자에서 일부 마커의 평균 값을 나타낸다. FP: 혈장 중의 유리 Aβ; TP: 혈장 중의 전체 Aβ; CB: 세포에 결합된 Aβ; PIB: 혈액 중의 풀(혈장 중의 전체 Aβ + 세포에 결합된 Aβ). (A) 상이한 그룹에 대해 샌드위치 ELISA로 수득된 Aβ 마커의 농도(pg/mL): CS > 65(65세 이상의 건강한 대상체), 잠재적 MCI(잠재적 또는 비-전구의 경도 인지 손상), 유력한 MCI(유력한 또는 전구의 경도 인지 손상) 및 경도 AD(경도 알츠하이머 질환). (B): 상이한 그룹의 몇몇 마커에 대한 ELISA로 수득한 흡광도를 나타내는 그래프.
도 6은 상이한 그룹 사이의 구별을 위해 혈장 중의 유리 Aβ(FP) 및 세포에 결합된 Aβ17(CB) 사이의 비율을 나타낸다. (A) 상이한 그룹에 대해 샌드위치 ELISA로 수득한 Aβ 마커의 농도(pg/mL): CS > 65(65세 이상의 건강한 대상체), 잠재적 MCI(잠재적 또는 비-전구의 경도 인지 손상), 유력한 MCI(유력한 또는 전구의 경도 인지 손상) 및 경도 AD(경도 알츠하이머 질환). (B): 상이한 그룹의 몇몇 마커에 대한 ELISA로 수득한 흡광도를 나타내는 그래프.

본 발명의 발명자들은 다른 Aβ 종을 인식하지 않는 Aβ17 펩티드에 고도로 특이적인 항체를 생성했다. 예를 들면, 도 1은 당해 항체가 다른 종, 예를 들면, Aβ15, Aβ16, Aβ38, Aβ40 또는 Aβ42에 대해 어떠한 실질적인 가교-반응성을 나타내지 않는 특이적 방식으로 Aβ17을 인식함을 나타낸다. 이들은 또한 임의 대상체 및 특히 AD를 앓는 것으로 의심되는 대상체의 혈장에서 상기 분자 종의 신뢰성 있는 정량화를 가능하게 하는 Aβ17 펩티드를 검출하기 위한 키트를 설계했다. 마찬가지로, 본 발명자들은 상이한 파라미터의 수준을 측정함으로써 상이한 그룹의 대상체: 건강한, 전구 AD, 비-전구 경도 인지 손상 및 경도 AD 대상체를 구별할 수 있음을 밝혀냈다.

본 발명의 항체

제1 측면에서, 본 발명은 Aβ(1-17) 펩티드(서열번호 1)에 특이적으로 결합하는 항체(이하, 본 발명의 항체라 함)에 관한 것이다.

본원에 사용된 용어 "특이적으로 결합하는"은 다른 Aβ 펩티드와의 실질적 가교-반응을 제공하지 않고서 Aβ17 펩티드에 결합하는 항체를 지칭한다. 특정한 양태에서, Aβ17에 대한 특이성은 50% 초과, 60% 초과, 70% 초과, 80% 초과 또는 90% 초과이다. 보다 바람직하게는, Aβ17 펩티드에 대한 항체의 특이성은 90% 초과이다. 도 1에서 볼 수 있는 바와 같이, 본 발명의 발명자들은 항-Aβ17 항체의 특이성을 분석했고, Aβ17에 대해 고도로 특이적이고 다른 Aβ 펩티드(Aβ15, Aβ16, Aβ38, Aβ40 및 Aβ42)와의 실질적 가교-반응성을 나타내지 않음을 밝혀냈다. 따라서, 특정한 양태에서, 본 발명의 항체는 Aβ15, Aβ16, Aβ38, Aβ40, Aβ42 및 이들의 하나 이상의 조합으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 Aβ 펩티드에 대하 실질적 가교-반응성을 나타내지 않는다.

Aβ17에 특이적인 적어도 하나의 항원 결합 부위를 함유하는 한, 본 발명에 따르는 항체 유형과 관련하여 실제로 어떠한 제한도 없다. 따라서, 적합한 항체 분자는 다음을 포함한다:

- 경쇄 불변 도메인(CL) 및 중쇄 불변 도메인, CH1, CH2, 및 CH3 뿐만 아니라 항원-결합 가변 영역을 포함하는 "순수(intact)" 항체,

- 단일 항원-결합 부위 및 CL 및 CH1 영역을 포함하는, 순수 항체의 파파인 소화로부터 생기는 "Fab" 단편,

- 2개의 항원-결합 부위를 포함하는 순수 항체의 펩신 소화로부터 생기는 "F(ab')₂" 단편,

- 경쇄 불변 영역 및 중쇄 제1 불변 영역(CH1)을 포함하며 1개의 항원-결합 부위만 갖고 있는 "Fab'" 단편. Fab' 단편은 항체 힌지 영역에 하나 이상의 시스테인을 포함하는 중쇄 CH1 도메인의 카복시 말단에서 몇몇 잔기의 부가에 의해 Fab 단편과 상이하다.

- "Fv"는 완전한 항원-인식 및 항원-결합 부위를 함유하는 최소 항체 단편이다. 이 영역은 단단한 비-공유 결합으로 1개의 중쇄 및 1개의 경쇄 가변 도메인의 다이머로 이루어진다. 이 배열에서 각 가변 도메인의 3개 초가변(hypervariable) 영역(CDRs)은 VH - VL 다이머의 표면에 항원-결합 부위를 정하기 위해 상호작용한다. 결과적으로, 6개의 초가변 영역은 항체에 항원-결합 특이성을 부여한다. 그러나, 단일 가변 도메인(또는 항원에 특이적인 3개 초가변 영역만을 포함하는 Fv의 절반)은, 전체 결합 부위 보다는 친화성이 낮지만, 항원을 인식하고 결합하는 능력을 갖는다.

- 일본쇄 FV 또는 "scFv" 항체 단편은 VL 및 VH, 항체 도메인을 포함하며, 여기서, 이들 도메인은 단일 폴리펩티드 쇄에 존재한다. 바람직하게는, VL 및 VH 영역은 scFv가 항원 결합을 위해 목적하는 구조를 형성할 수 있게 하는 폴리펩티드 링커에 의해 연결된다.

- 너무 짧아서 동일한 쇄 상의 2개 도메인 사이에 쌍을 이룰 수 없는 펩티드 링커에 의해 연결된 동일한 폴리펩티드 쇄(VH-VL) 상에서 경쇄 가변 도메인(VL)에 연결된 중쇄 가변 도메인(VH)을 포함하는 "디아바디(Diabodie)". 이것은 또 다른 쇄의 보조 도메인과 쌍을 이루게 하고 이합체 분자와 2개의 작용성 항원 결합 부위가 조립하는 것을 촉진한다.

- "이중 특이적(bispecific) 항체"(BAb)는 2개의 상이하게 특이적인 항원 결합 부위를 갖는 단일, 2가 항체(또는 이의 면역치료학적으로 효과적인 단편)이다. 2개의 항원 부위는 당해 기술분야에서 공지된 화학적 또는 유전공학적 방법과 함께 결합될 수 있다.

이들 항체 단편 모두는 당해 기술분야에서 공지된 통상의 기술, 예를 들면, 당해 기술분야에서 공지된 아미노산 결실(들), 삽입(들), 치환(들), 부가(들) 및/또는 재조합[및/또는 임의적 다른 변형(들)(예를 들면, 글리코실화 및 포스포릴화 등의 해독후 및 화학적 변형)]을 단독으로 또는 조합하여 사용함으로써 추가로 변형될 수 있다. 면역글로불린 쇄의 아미노산 서열에 놓여있는 DNA 서열에서 이러한 변형을 도입하는 방법은 당해 기술분야의 통상의 기술자에게 잘 알려져 있다[참조: Sambrook et al.; Molecular Cloning: A Laboratory Manual; Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2^nd edition 1989 and 3rd edition 2001].

본 발명에 적합한 항체는 폴리클로날 및 모노클로날 항체를 포함한다. 폴리클로날 항체의 제조에 있어서, 염소, 토끼, 래트, 마우스, 양, 개, 낙타, 단봉낙타, 라마, 인간, 새 등을 포함한 다양한 숙주가 면역원성 특성을 갖는 Aβ17의 단편에 상응하는 펩티드를 주입함으로써 면역화될 수 있다. 숙주의 종에 따라, 면역 반응을 증가시키기 위해 다양한 보조제가 사용될 수 있다. 이러한 보조제는, 이로써 한정되는 것은 아니지만, 프로인트(Freund's), 수산화알루미늄 등의 미네랄 겔 및 리소레시틴, 다중음이온(polyanion), 펩티드, 오일 에멀젼, KLH 및 디니트로페놀 등의 계면 활성 물질을 포함한다. 인간에게 사용되는 보조제 중에서, BCG(bacilli Calmette-Guerin) 및 코리네박테리움 파르붐(Corynebacterium parvum)이 특히 바람직하다. 바람직한 양태에서, 본 발명의 항체의 생성에 사용된 보조제는 프로인트 완전 보조제, 프로인트 불완전 보조제 및 임제트 알룸(Imject Alum)이다.

면역화되는 종에서 면역원성인 단백질에 항원을 접합시키는 것이 유용할 수 있다. 펩티드와의 접합에 유용한 단백질은, 이로써 한정되는 것은 아니지만, 이관능성 또는 유도화제, 예를 들면, 말레이미도벤조일 설포석신이미드 에스테르(시스테인 잔기를 통해 접합), N-하이드록시석신이미드(라이신 잔기를 통해), 글루타르알데히드, 석신산 무수물 또는 SOCl₂를 이용하는, 키홀 림페트 헤모시아닌 (keyhole limpet hemocyanin(KLH)), 블루 캐리어(Blue Carrier)(콘콜레파스 콘콜레파스 (Concholepas concholepas)로부터 분리한 헤모시아닌), 소 티로글로불린 또는 대두 트립신 억제제이다. 바람직한 양태에서, 접합에 사용된 단백질은 KLH이다. 바람직한 양태에서, 펩티드와 KLH 사이의 접합은 가교링커 NHS-PEG₄-말레이미드를 통해 수행되고, 상기 펩티드는 KLH에 대한 당해 펩티드의 접합을 수행하기 위해 N 말단에 시스테인을 갖는다.

모노클로날 항체의 제조에 있어서, 통상의 기술이 사용될 수 있다. 예를 들면, 모노클로날 항체는 문헌[참조: Ausubel, F.M. et al. (Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons Inc; ring-bound edition, 2003]의 유닛 11.4 내지 11.11에 상세히 기재된 과정을 사용하여 문헌[참조: Kohler et al., Nature, 256:495 (1975)]에 처음 기재된 하이브리도마 방법을 사용하여 제조될 수 있다. 대안적으로, 모노클로날 항체는 재조합 DNA 방법에 의해 문헌[참조: McCafferty et al., Nature, 348:552-554 (1990)]에 기재된 기술을 사용하여 제조된 항체 파지 라이브러리로부터 분리될 수 있다. 문헌[참조: Clacksoii et al., Nature, 352:624-628 (1991) and Marks et al., J. Mol. Biol., 222:581-597 (1991)]에는, 파지 라이브러리를 사용하여, 쥐 및 인간 항체 각각을 분리하는 것이 기재되어 있다. 후속 논문에는, 매우 큰 파지 라이브러리를 구축하는 전략으로서 조합 감염 및 생체내 재조합 뿐만 아니라[참조: Waterhouse et al., Nucl. Acids. Res., 21:2265-2266 (1993)], 쇄 셔플링[참조: Marks et al., Bio/Technology, 10:779-783 (1992)]에 의해 친화성(nM 범위)이 높은 인간 항체를 제조하는 방법이 기재되어 있다. 따라서, 이들 기술은 모노클로날 항체의 분리에 있어서 전통적인 모노클로날 항체 하이브리도마 기술의 대안이 될 수 있다.

폴리클로날 항체는 채혈 및 피브린 응결의 제거 후 면역화된 숙주로부터 수득된 항혈청으로 직접 사용될 수 있다. 모노클로날 항체는 적합한 숙주의 복강에서 하이브리도마의 이식후 하이브리도마 배양액의 상청액 또는 복수액으로 직접 사용될 수 있다. 또는, 폴리클로날 또는 모노클로날이든, 면역글로불린 분자는, Aβ17로부터 유도된 펩티드를 사용한 친화성 정제, 비-변성 겔 정제, HPLC 또는 RP-HPLC, 크기 배제, 단백질 A 컬럼 상에서의 정제, 또는 이들 기술의 임의의 조합 등의 통상의 방법을 사용하여 사용 전에 정제될 수 있다.

바람직한 양태에서, 본 발명의 항체는 폴리클로날 항체이다. 바람직한 양태에서, 본 발명의 항체의 제조 방법은 다음 단계를 포함한다:

- 1차 투약: 보조제로서 프로인트 완전 보조제를 사용하여 펩티드 100㎍으로 토끼를 면역화.

- 2차 투약: 보조제로서 프로인트 불완전 보조제를 사용하여 펩티드 100㎍으로 토끼를 면역화.

- 3차 투약: 보조제로서 알룸을 사용하여 펩티드 100㎍로 토끼를 면역화.

- 보조제를 교체하는 펩티드 200㎍로 3회차 이상 투약: 프로인트 불완전 보조제-알룸-프로인트 불완전 보조제.

바람직한 양태에서, 본 발명의 항체의 생성에 사용되는 Aβ 펩티드 또는 면역원의 영역은 서열 VHHQKL(서열번호 2)에 상응하는 펩티드 Aβ(12-17) 및 서열 EVHHQKL(서열번호 3)에 상응하는 펩티드 Aβ(11-17)로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.

본 발명의 키트

제2 양태에서, 본 발명은

(i) 본 발명에 따르는 Aβ(1-17)에 특이적인 항체인 제1 항체 및

(ii) 제1 항체에 의해 인식되는 영역과 상이한 Aβ(1-17) 펩티드의 영역을 인식하는 제2 항체를 포함하는, Aβ(1-17) 펩티드를 검출 또는 측정하기 위한 키트(이하, 본 발명의 키트라 함)에 관한 것이다.

용어 "아밀로이드 베타 펩티드(amlyoid beta peptide)"는 Aβ, 아밀로이드 베타 단백질, "A 베타", "베타 AP" 또는 "A 베타 펩티드"와 상호 교대로 본원에서 사용되고, 알츠하이머 질환(AD), 다운 증후군, 및 더치-타입 아밀로이드증을 가진 유전성 뇌출혈(HCHWA-D)의 환자 뇌에서 발견되는 노인성 플라크 및 혈관 아밀로이드 침착증(아밀로이드 맥관병증)의 주요 화학적 성분인 펩티드 계열을 지칭한다. 어떠한 형태로든, 아밀로이드 베타 펩티드는, β- 및 γ-세크레타제 또는 β- 및 α-세크라타제에 의한 아밀로이드 전구체 단백질의 연속 단백질분해 절단으로 생성되는 다양한 수의 아미노산을 포함하는 베타-아밀로이드 전구체 단백질(APP)의 단편이다.

아밀로이드 베타 펩티드는 통상 "Aβ(x-y)"로 표현되며, 여기서 x는 아밀로이드 베타 펩티드의 아미노 말단의 아미노산 수를 나타내고, y는 카복시 말단의 아미노산 수를 나타낸다. 본원에서 사용된 Aβ(1-17) 또는 "Aβ17"은 아밀로이드 전구체 단백질의 아미노산 672 내지 688(서열번호 1)에 상응하는 17개 아미노산 펩티드에 관한 것이고, 이는 β- 및 α-세크레타제에 의한 아밀로이드 전구체 단백질(서열번호 4)의 연속 단백질분해 절단으로 생성된다.

본 발명과 관련하여, "포획 항체"는 샘플에서 당해 항체가 특이적으로 결합하는 모든 분자 종을 검색하는데 사용되는 항체이다. Aβ17에 특이적인 적어도 하나의 항원 결합 부위를 함유하는 한, 포획 항체로서 사용될 수 있는 항체의 종류와 관련하여 어떠한 제한도 없다. 원칙적으로, Aβ17 펩티드에 특이적인 어떠한 항체도 포획 항체로서 사용될 수 있다. 포획 항체는 제2 항체와는 상이한 영역에 결합한다. 바람직한 양태에서, 포획 항체는 Aβ17 펩티드의 N-말단 영역의 에피토프에 대해 지시된다. 보다 바람직한 양태에서, 포획 항체에 의해 표적화될 수 있는 에피토프는 Aβ17의 아미노산 1 내지 10 내에 위치된 에피토프를 포함한다. 또 다른 바람직한 양태에서, 포획 항체는 모노클로날 항체이다. 보다 바람직한 양태에서, 포획 항체는 Aβ 펩티드의 아미노산 1 내지 16에 상응하는 영역을 인식한다. 보다 더 바람직한 양태에서, 포획 항체로서 사용되는 모노클로날 항체는 문헌[참조: Kim, K.S., Neuroscience Res. Comm. 1988, 2: 121-130]에 기재된 6E10 mAb이다.

본 발명의 키트의 제2 성분은 본 발명에서 이미 앞서 기재한 본 발명의 항체에 상응한다. 본 발명과 관련하여, "검출 항체"는 포획 항체에 의해 보유된 항원의 양을 검출하기 위해 사용될 수 있는 항체이다. 제1 항체는, 포획 항체에 의해 커버되지 않는 항원 영역에 결합해야 하기 때문에, 제2 항체와는 상이한 영역을 인식한다.

제1 및 제2 항체는 포획 및 검출 항체로서 본 발명의 키트에서 뚜렷하지 않게 사용될 수 있다.

2개 항체(제1 및 제2 항체) 중의 하나는 결합 쌍의 제1 구성원에 결합되어, 포획 항체에 의해 포획된 항원에 결합되는 항체를 검출할 수 있다. 상기 결합되는 항체는 검출 항체로서 작용할 것이고, 제1 또는 제2 항체일 수 있다.

특정 양태에서, 키트는 Aβ40 및/또는 Aβ42에 특이적으로 결합하는 항체 또는 항체 조합을 추가로 포함한다. 따라서, 특정한 양태에서, 상기 키트는 Aβ17 펩티드 및 Aβ40 및/또는 Aβ42의 검출에 유용할 수 있다.

본원에 사용된 "Aβ42"는 β- 및 γ-세크레타제에 의한 아밀로이드 전구체 단백질(서열번호 4)의 연속 단백질분해 절단으로 생성되는 아미노산 672 내지 713(서열번호 5)에 상응하는 42개 아미노산 펩티드에 관한 것이다.

본원에 사용된 "Aβ40"은 β- 및 γ-세크레타제에 의한 아밀로이드 전구체 단백질(서열번호 4)의 연속 단백질분해 절단으로 생성되는 아미노산 672 내지 711(서열번호 6)에 상응하는 40개 아미노산 펩티드에 관한 것이다.

바람직한 양태에서, 제1 또는 제2 항체는, 경우에 따라, 결합 쌍의 제1 구성원에 결합된다. 이 경우, 검출가능한 태그에 결합된 결합 쌍의 구성원은 또한 키트에 포함된다. 특정한 양태에서, 결합 쌍의 제2 구성원에 결합되는 검출가능한 태그가 효소 태그인 경우, 당해 키트는 상기 효소에 의해 검출가능한 생성물로 전환될 수 있는 기질을 추가로 포함한다.

결합 쌍의 적합한 제1 및 제2 구성원은, 이로써 한정되는 것은 아니지만, 다음을 포함한다:

. 헵텐 또는 항원/항체, 예를 들면, 디곡신 및 안티-디곡신 항체,

. 비오틴 또는 비오틴 유사체(예를 들면, 아미노비오틴, 이미노비오틴 또는 데스티오비오틴)/아비딘 또는 스트렙트아비딘,

. 슈가/렉틴,

. 효소 및 보조인자,

. 폴산/폴레이트,

. 단백질/전사 인자에 선택적으로 결합하는 이본쇄 올리고뉴클레오타이드,

. 핵산 또는 핵산 유사체/보조 핵산 및

. 수용체/리간드, 예를 들면, 스테로이드 호르몬 수용체/스테로이드 호르몬.

결합 쌍의 "제1" 및 "제2" 구성원이라는 용어는 상대적이고 상기 구성원 각각은 결합 쌍의 제1 또는 제2 구성원으로 나타낼 수 있다고 이해될 것이다. 바람직한 양태에서, 결합 쌍의 제1 구성원은 비오틴 또는 이의 기능적으로 동등한 변이체이고 결합 쌍의 제2 구성원은 아비딘, 스트렙트아비딘 또는 이의 기능적으로 동등한 변이체이다. 바람직한 양태에서, 결합 쌍의 제2 구성원은 스트렙트아비딘이다.

적합한 검출가능한 태그는, 이로써 한정되는 것은 아니지만, 형광성 잔기(예를 들면, 플루오레스세인, 로다민, 피코에리트린, 쿠마린, 옥사진, 레소루핀, 시아닌 및 이들의 유도체), 발광성 잔기(예를 들면, Quantum Dot Corporation(Palo Alto, CA 소재)에서 제공하는 Qdot^TM 나노파티클)을 포함한다. 검출가능한 태그가 효소인 경우, 이 효소는, 예를 들면, 활성인자, 기질, 증폭제 등을 첨가하면, 검출가능한 시그널을 발생시킬 수 있어야 한다. 본 발명에 있어서 검출가능한 태그로 적합한 효소 및 이의 상응하는 기질은 다음을 포함한다:

. 알칼리성 포스파타제:

。발색성 기질: p-니트로페닐 포스페이트(p-NPP), 5-브로모-4-클로로-3-인돌릴 포스페이트/니트로블루 테트라졸륨(BCIP/NPT), 패스트-레드/나프톨-AS-TS 포스페이트에 기반한 기질

。형광성 기질: 4-메틸룸벨리페릴 포스페이트(4-MUP), 2-(5'-클로로-2'-포스포릴옥시페닐)-6-클로로-4-(3H)-퀴나졸리논(CPPCQ), 3,6-플루오레스세인 디포스페이트(3,6-FDP), 패스트(Fast) 블루 BB, 패스트 레드 TR, 또는 패스트 레드 바이올렛 LB 디아조늄 염

. 퍼옥시다제:

。발색성 기질: 2,2-아지노비스(3-에틸벤조티아졸린-6-설포닌산) (ABTS), o-페닐렌디아민(OPT), 3,3',5,5'-테트라메틸벤지딘(TMB), o-디아니시딘, 5-아미노살리실산, 3-디메틸아미노벤조산(DMAB) 및 3-메틸-2-벤조티아졸린히드라존(MBTH), 3-아미노-9-에틸카바졸(AEC)- 및 3,3'-디아미노벤지딘 테트라하이드로클로라이드(DAB)에 기반.

。형광성 기질: 4-하이드록시-3-메톡시페닐아세트산, Amplex® 레드 시약을 포함하여 환원 페녹사진 및 환원 벤조티아진, Amplex 울트라레드 및 환원 디하이드록산텐.

. 글리코시다제:

。발색성 기질: β-D-갈락토시드에 대한, o-니트로페닐-β-D-갈락토시드(o-NPG), p-니트로페닐-β-D-갈락토시드 및 4-메틸룸벨리페닐-β-D-갈락토시드(MUG)

。형광성 기질: 레소루핀 β-D-갈락토피라노시드, 플루오레스세인 디갈락토시드(FDG), 플루오레스세인 디글루쿠로니드, 4-메틸룸벨리페릴 β-D-갈락토피라노시드, 카복시움벨리페릴 β-D-갈락토피라노시드 및 플루오르화 쿠마린 β-D-갈락토피라노시드.

. 옥시도리덕타제(루시퍼라제):

。발광성 기질: 루시페린.

특정한 양태에서, 검출가능한 태그는 형광 분자, 발광 분자 또는 효소이다. 바람직한 양태에서, 검출가능한 태그는 호스래디쉬 퍼옥시다제이고, 검출 시약은 TMB이다.

바람직한 양태에서, 키트는 추가로 고체 지지체를 포함한다. 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "지지체" 또는 "표면"은 다양한 형상, 예를 들면, 스트립, 로드, 라텍스 입자, 자석 입자, 미세입자를 포함하는 입자형, 비드, 막, 미세역가 웰 및 플라스틱 튜브 중 임의의 하나를 가질 수 있는 다공성 또는 비다공성 수불용성 재료인 고체상을 지칭한다. 원칙적으로, 충분한 양의 포획 항체와 결합할 수 있다면, 임의의 재료가 고체 지지체로서 적합하다. 따라서, 고체상 재료의 선택은 목적하는 분석 포맷 성능 특징을 근거로 결정된다. 고체 지지체에 적합한 재료에는, 중합체 재료, 특히 셀룰로즈계 재료, 및 예를 들면, 종이, 예를 들면, 여과지, 크로마토그래피 용지, 유리 섬유지 등을 함유하는 섬유와 같은 셀룰로오즈로부터 유도된 재료; 합성 또는 변형된 자연 발생 중합체, 예를 들면, 니트로셀룰로오즈, 셀룰로오즈 아세테이트, 폴리(비닐 클로라이드), 폴리아크릴아미드, 가교결합된 덱스트란, 아가로즈, 폴리아크릴레이트, 폴리에틸렌, 폴리프로필렌, 폴리(4-메틸부텐), 폴리스티렌, 폴리메타크릴레이트, 폴리(에틸렌 테레프탈레이트), 나일론, 폴리비닐 부티레이트) 등; 자체로 또는 기타 재료와 함께 사용됨; 예를 들면, 바이오글라스로서 이용가능한 유리와 같은 유리, 세라믹, 금속 등이 포함된다. 스티렌 및 카복실화 스티렌 또는 아미노, 하이드록실, 할로 등과 같은 기타 활성 그룹들로 관능화된 스티렌의 비가교결합 중합체가 바람직하다. 일부의 경우, 부타디엔과 같은 디엔으로 치환된 스티렌의 공중합체가 사용될 수 있다.

특정 양태에서, 결합 쌍의 제1 구성원에 결합되지 않은 항체는 제1 또는 제2 항체일 수 있는 고체 지지체에 예비 결합된다. 고체 지지체 및 포획 항체는 키트에서 별도로 제공될 수 있거나, 또는 대안적으로는 지지체는 항체로 미리 코팅되어 전달될 수 있다. 이 경우, 지지체는 항체의 결합후 차단 용액으로 처리될 수 있다. 지지체를 미리 코팅하는 경우, 지지체를 농축 트레할로즈 용액으로 처리하고 건조시키는 것이 바람직하며, 이 경우 건조 트레할로즈는 지지체 상에 할로(halo)를 형성한다. 건조 트레할로즈를 포함하는 상기 지지체는 예외적으로 안정하며, 암실에서 4℃로 유지되는 경우에 2년까지 저장될 수 있다.

키트의 추가적인 성분은 하기를 포함할 수 있다:

· 환자로부터 분석할 시료를 회수하는 수단.

· 표적 펩티드의 기준 곡선 제작에 필요한 완충액 및 용액.

· 분석 동안 고체 지지체를 세척 및 차단하기 위한 완충액 및 용액.

· 고체 지지체를 코팅 항체로 코팅하기 위한 완충액 및 용액.

· 검출가능한 태그로부터의 발색 또는 형광 시그널을 발생시키기 위한 시약.

· 검출가능한 태그로부터의 발색 또는 형광 생성물의 형성을 종료시키기 위한 시약(예: 1N H₂SO₄).

· 펩티드를 비중첩 상태로 유지시키기 위한 수단(예: 농축 구아니디늄 하이드로클로라이드).

· Aβ17 펩티드 및 추가로 Aβ40 또는 Aβ42 펩티드 또는 이들의 조합의 원액 용액을 포함하는 샘플.

고체 지지체에 대한 항체의 고정은 검출할 표적 펩티드의 결합 이전에 또는 펩티드/단백질이 항체에 결합되었을 때에 수행될 수 있다. 어느 경우든, 고체 지지체가 사용되면, 측정할 표적 펩티드를 함유하는 샘플의 첨가 전에 담체 상의 과다한 단백질 결합 부위를 차단하는 것이 편리하다. 바람직하게는, 지지체 상의 펩티드 결합 부위의 차단 또는 켄칭(quenching)은, 각각의 결합 반응 후에 복합체를 세척하기 위해 사용되는 것과 동일한 완충액(예: 50mM Tris-HCl, pH 8, PBS 또는 TBS, 임의로 Tween 20 함유)에 거대분자 화합물(예: 소 혈청 알부민, 전지 분유, 웨스턴 블롯 시약, 카세인, 락토알부민, 난알부민)이 약 0.05% 내지 10%, 바람직하게는 1 내지 5%, 더욱 바람직하게는 약 3%의 농도로 보충된 것을 사용하여 수행된다. 고정된 포획 항체를 포함하는 지지체를 소정 시간 동안 저장해야 하는 경우, 지지체를 농축 트레할로즈 용액으로 처리하고 건조시키는 것이 바람직한데, 이 경우 건조 트레할로즈는 지지체 상에 할로를 형성한다. 건조 트레할로즈를 함유하는 이들 지지체는 예외적으로 안정하며 암실에서 4℃로 유지되는 경우에 2년까지 저장될 수 있다.

본 발명의 키트는 키트의 제1 및 제2 항체 성분에 의해 특이적으로 인식되는 펩티드 또는 펩티드들의 고감도 및 특이성을 검출 또는 측정한다. 따라서, 추가의 측면에서, 본 발명은 샘플에서 Aβ17 펩티드를 검출하기 위한 본 발명의 키트의 용도에 관한 것이다. 특정한 양태에서, 키트는 샘플에서 Aβ40 및/또는 Aβ42 펩티드 및 이들의 조합을 임의로 검출하는데 사용된다.

임의의 샘플에서 Aβ17 펩티드의 농도의 고감도 및 특이성 측정을 제공하는 본 발명의 키트의 능력에 비추어, 임의의 세포액 또는 조직 중의 이러한 임의의 펩티드의 농도 변화가 있는 임의의 질환, 특히 퇴행성 질환, 더욱 특히는 신경퇴행성 질환의 진단에 이용될 수 있다. Aβ17의 수준 변화 또는 Aβ40 및/또는 Aβ42의 수준 변화의 출현에 기반하여 진단될 수 있는 퇴행성 질환의 비제한적 예에는 다음을 포함한다:

· 뼈 퇴행성 질환, 예를 들면, 골감소증, 골연화증, 골다공증, 뼈 골수종(osteomyeloma), 골형성장애, 파제트병(Paget's disease), 불완전 골생성증, 뼈 경화증(bone sclerosis), 재생불량성 뼈 장애(aplastic bone disorder), 체액성 고칼슘혈증 골수종(humoral hypercalcemic myeloma), 다발성 골수종(multiple myeloma) 및 전이에 후속하는 뼈 박화(bone thinning following metastasis).

· 연골 퇴행성 질환, 예를 들면, 고함-스타우트 증후군(Gorham-Stout syndrome); 관절염성 질환; 골관절염; 류마티스 관절염; 건선 관절염; 류마티스성 질환; 및 파쇄골.

· 근육 퇴행성 질환, 예를 들면, 근육 퇴행 위축, 근위축, 충혈성 폐색성 폐질환, 근육 종말 증후군(muscle wasting syndrome), 사르코페니아(sarcopenia), 악액질.

· 허혈로 인한 심근 세포 괴사를 포함하는 심장 퇴행성 질환, 이식 거부로 인한 조직 및 장기 괴사, 자가독성으로 인한 청력 소실.

· 망막 퇴행성 질환, 예를 들면, 색소성 망막염.

· 신경계의 퇴행성 질환, 예를 들면, 알렉산더 질환, 알퍼스 질환(Alper's disease), 알츠하이머 질환, 근위축성 측삭 경화증, 모세혈관확장성조화운동불능, 소 해면양뇌증(Bovine spongiform encephalopathy(BSE)), 카나반 질환(Canavan disease), 코케인 증후군(Cockayne syndrome), 피질 기저핵 퇴행증(Corticobasal degeneration), 크로츠펠트-야콥병(Creutzfeldt-Jakob disease), 헌팅턴병, HIV-연관성 치매, 케네디병(Kennedy's disease), 크라베병(Krabbe disease), 루이 소체 치매(Lewy body dementia), 운동 실조증[Machado-Joseph disease(Spinocerebellar ataxia type 3)], 다발성 경화증, 다발계 위축증, 신경보렐리아증(Neuroborreliosis), 파킨슨병, 펠리체우스-메르츠바허병(Pelizaeus-Merzbacher Disease), 피크병(Pick's disease), 원발성 측삭경화증, 프리온병(Prion diseases), 렙숨 질환(Refsum's disease), 샌드호프병(Sandhoff disease), 쉴더병(Schilder's disease), 정신분열병, 스피엘메이어-보그트-쉬그렌-바텐 병 (Spielmeyer-Vogt-Sjogren-Batten disease(바텐 병으로도 공지되어 있음), 척수소뇌성 실조증, 척수 근육 위축, 진행성 핵상성 안근마비(Steele-Richardson-Olszewski disease), 척수매독. 바람직한 양태에서, 본 발명의 키트를 이용하여 진단되는 신경퇴행성 질환은 알츠하이머 질환이다.

Aβ17 펩티드를 측정 또는 검출하는 방법

본 발명의 키트는 샘플에서 Aβ17 펩티드를 측정 또는 검출하는 방법을 수행하게 한다. 따라서, 또 다른 측면에서, 본 발명은 하기 단계를 포함하는 샘플에서 Aβ(1-17) 펩티드를 측정 또는 검출하는 방법(이하, 본 발명의 검출 방법이라 함)에 관한 것이다:

본 발명에서 이해되는 바와 같이, "샘플"은 조직 배양물, 혈장, 혈청, 타액, 정액, 가래, 뇌척수액(CSF), 눈물, 점액, 땀, 젖, 뇌 또는 말초 조직 추출물 등 중의 임의의 것을 포함한다. 바람직한 양태에서, 샘플는 혈장 혈액, 혈청, 혈장 및 CSF로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 보다 바람직한 양태에서, 샘플은 혈장 샘플이다.

바람직한 양태에서, 검출되는 펩티드는 상기 펩티드의 비-올리고머성 형태, 보다 바람직하게는 Aβ17의 단량체성 형태에 상응한다.

방법의 각 단계에서 사용된 시약 및 항체는 본 발명의 키트에 대해 상기 상세히 기재되어 있다.

본 발명에 따르는 방법의 제1 단계에서, Aβ17 펩티드를 함유하는 샘플은 제1 항체와 접촉시켜 제1 면역 복합체를 형성하도록 한다. 바람직한 양태에서, 제1 항체는 모노클로날 항체이다. 보다 바람직한 양태에서, 모노클로날 항체는 6E10 항체이다.

제1 결합 단계를 수행한 후, 복합체는 세척하여, 포획 항체에 결합하지 않은 원래 샘플에서 발견되는 과량의 임의의 단백질/펩티드를 제거할 수 있다. 본 발명과 관련하여 사용될 수 있는 바람직한 세척 완충액에는, 임의로 염(예를 들면, 150 mM NaCl)을 포함하고 선택적으로 저농도의 세정제(예를 들면, 0.05% Tween-20)를 포함하는, 생리학적 값에 근접한 pH의 임의의 완충액(예를 들면, 50mM Tris-HCl)이 포함된다.

제2 단계에서, 포획 항체와 샘플 내의 Aβ 펩티드 사이에서 형성된 복합체는 제2 항체와 접촉시켜, "샌드위치-유형" 면역 복합체를 형성한다. 제1 항체 및 제2 항체는 Aβ17 펩티드의 상이한 영역 결합하고, 따라서 이들 사이에 간섭은 없다.

본 발명의 방법의 제1 및 제2 단계는 교환될 수 있고, Aβ17 펩티드의 포획은 제2 항체(본 발명의 항체)에 의해 수행될 수 있다. 이어서, 상기 복합체는 제2 항체와는 상이한 영역에서 결합하는 제1 항체와 접촉시킨다. 2개 항체 중의 하나는, 포획 단계에서 사용되지 않은 항체에 상응하는 결합 쌍의 제1 구성원에 결합할 것이다.

제2 단계를 수행한 후, 면역 복합체는 앞서 기재된 것과 실질적으로 동일한 완충액 및 과정으로 세척하여 비특이적으로 결합된 항체를 제거할 수 있다.

제3 단계에서, 본 발명의 방법은 결합 쌍의 제1 구성원과 결합된 포획 항체-항원과 검출 항체 사이에서 형성된 복합체를 검출 가능한 태그에 결합된 결합 쌍의 제2 구성원과 접촉시키는 것을 포함한다. 바람직한 양태에서, 결합 쌍의 제1 구성원은 비오틴이고, 결합 쌍의 제2 구성원은 아비딘, 스트렙트아비딘 또는 기능적으로 동등한 이의 변이체이다.

본 발명에 따르는 방법의 제4 단계에서, 상기 방법은 검출가능한 태그의 검출을 수반한다. 검출 및/또는 검출가능한 태그의 정량은 태그의 특징에 좌우되며 당업계에 공지되어 있음을 이해할 것이다. 순수한 기질 또는 검출가능한 태그가 발광 또는 염료 성분을 함유하는 경우, UV 트랜스일루미네이터 상의 시각적인 관찰에 의해 또는 UV-기반의 전하 결합 소자(CCD) 카메라 검출 시스템, 레이저-기반의 겔 스캐너, 크세논-아크-기반의 CCD 카메라 검출 시스템, UV-트랜스일루미네이터가 조합된 폴라로이드 카메라 뿐만 아니라 발광의 검출에 사용된 각종 기타 기기들을 이용하여 검출이 가능하다. 검출가능한 태그가 효소인 경우, 본 발명에 따르는 방법의 제4 단계는 태그로 표지된 면역복합체(예를 들면, 검출가능한 태그로 표지된 포획된 펩티드, 검출 항체 및 시약)를 검출가능한 태그로서 사용된 효소의 활성화제, 기질 또는 증폭제에 노출시키는 것을 수반한다. 검출가능한 시그널을 생성할 수 있는 공지된 검출가능한 태그에는 효소로 표지된 항체가 포함된다. 상기 목적을 위해 공지된 예시적 효소에는, 호스래디쉬 퍼옥시다제, 알칼리성 포스파타제 및, β-갈락토시다제, β-글루코시다제 및 β-글루쿠로니다제를 포함하는 글리코시다제가 포함된다. 예를 들면, 검출 항체에 특이적으로 결합하는 시약은 호스래디쉬 퍼옥시다아제로 태그될 수 있다. 포획 잔기-검출 항체-시약 복합체의 형성시, 검출은 검출가능한 태그로서 사용된 효소에 대해 공지된 임의의 광범위한 기질을 사용하여 수행될 수 있다. 바람직한 양태에서, 검출가능한 태그는 형광 분자, 발광 분자 또는 효소이다.

특정한 양태에서, 본 발명의 검출 방법은 Aβ40 및/또는 Aβ42 펩티드의 검출을 추가로 포함한다.

신경퇴행성 질환의 진행을 모니터링하는 방법

또 다른 측면에서, 본 발명은 대상체에서 신경퇴행성 질환을 모니터링하는 방법(이하, 본 발명의 모니터링 방법이라 함)으로서, 상기 대상체의 샘플 중의 혈장에서 유리 Aβ17 펩티드의 수준 및 세포에 결합된 Aβ17 펩티드 수준을 제1 시점에서 샘플에서 측정하는 단계, 및 상기 수준을 제2 시점에서 상기 수준과 비교하는 단계로, 여기서, 혈장 중의 유리 Aβ17 펩티드 및 세포에 결합된 Aβ17 펩티드의 비율이 제1 시점에 대하여 제2 시점에서 증가되는 경우, 이는 대상체에서 알츠하이머 질환의 악화를 나타내는 것인 단계를 포함하는, 방법에 관한 것이다.

본원에서 사용된 용어 "신경퇴행성 질병"은, 신경 세포가 세포 사멸로 상실되어 인지 기능의 악화 또는 신경학적, 신경퇴행성, 생리학적, 정신적 또는 행동적 일탈로 특징지워질 수 있는 손상, 기능이상 또는 합병증을 초래하는 상태 또는 장애를 의미한다. 본 발명의 방법으로 진단될 수 있는 적합한 신경퇴행성 질환은, 이로써 한정되는 것은 아니지만, 연령과 관련된 황반 퇴화(age-related macular degeneration), 크로이츠펠트 야곱병(Creutzfeldt-Jakob disease), 알츠하이머 질환, 아밀로이드증을 갖는 뇌 혈관증, 혈관성 치매, 방사선치료로 유도된 치매(radiotherapy induced dementia), 축색 돌기 상해(axon injury), 급성 확산성 피질 억제(acute cortical spreading depression), 알파-시누클레인성 병태(alpha-synucleinopathies), 뇌허혈(brain ischemia), 헌팅턴병(Huntington's disease), 영구 중뇌 허혈(permanent focal cerebral ischemia), 말초 신경 재생(peripheral nerve regeneration), 중첩성 간질후 모델(post-status epilepticus model), 척수손상(spinal cord injury), 산발성 루게릭병(sporadic amyotrophic lateral sclerosis) 및 전염성 해면양뇌증(sporadic amyotrophic lateral sclerosis)을 포함한다.

바람직한 양태에서, 본 발명의 방법에 따라 모니터링되는 신경퇴행성 질환은 경도 인지 손상, 유력한 알츠하이머 질환을 갖는 경도 인지 손상 또는 잠재적 알츠하이머 질환을 갖는 경도 인지 손상을 포함하는 알츠하이머 질환 또는 이의 전구 형태이다.

본 발명의 모니터링 방법은 대상체에서 알츠하이머 질환의 진행을 평가하는데 유용하다. 따라서, 본 발명의 발명자들은 혈장중 유리 Aβ17 펩티드 수준/세포에 결합된 Aβ17 펩티드 수준의 비율 증가가 AD의 악화를 나타냄을 밝혀내었다.

특정한 양태에서, 본 발명의 모니터링 방법은 하기의 단계를 포함한다:

(a) 대상체 샘플에서 혈장 중의 유리 Aβ17 펩티드의 농도 및 세포에 결합된 Aβ17 펩티드의 수준을 제1 시점에서 측정하는 단계(FP Aβ17/CB Aβ17),

(b) 동일한 대상체 샘플에서 혈장 중의 유리 Aβ17 펩티드의 농도 및 세포에 결합된 Aβ17 펩티드의 수준을 제2 시점에서 측정하는 단계;

(c) 혈장 중의 유리 Aβ17 펩티드 수준/세포에 결합된 Aβ17 펩티드 수준의 비율을 제1 시점과 제2 시점 사이에서 비교하는 단계; 및

(d) 상기 파라미터의 비율이 제1 시점에 대하여 제2 시점에서 보다 높은 경우, 이는 대상체에서 알츠하이머 질환의 악화를 나타내는 단계.

본원에 사용된 바와 같이, 용어 "알츠하이머 질환의 악화"는 측정된 제1 시점에서의 단계와 관련하여 후기 단계로 진행하고 있음을 의미한다. 당해 기술분야의 기술자는 당해 질환의 진행이 기타 지시 특징을 분석함으로써 악화되고 있는지를 인지하고 확인할 것이다. 후기 단계에서 나타나고 질환의 진행을 지시하는 특징 또는 지표는, 이로써 한정되는 것은 아니지만, 아밀로이드 플라크 및 신경섬유 엉킴의 출현 및 인지 기능의 감소를 포함한다. 바람직한 양태에서, 혈장 중의 유리 Aβ17 펩티드의 수준/세포에 결합된 Aβ17 펩티드의 수준의 비율이 제1 시점에 대하여 제2 시점에서 증가되는 경우, 이는 대상체의 보다 높은 비율의 인지 손상을 나타낸다. 따라서, 혈장 중의 유리 Aβ17 펩티드의 보다 높은 수준은 보다 높은 인지 손상을 나타낸다.

펩티드의 측정에 적합한 임의의 방법을 본 발명에서 사용할 수 있다. 예를 들면, 아밀로이드 베타 펩티드의 농도는 웨스턴 블롯, 면역침강법, 효소-결합 면역흡착제 분석법(ELISA), 표면 플라즈몬 공명, 침강 반응, 겔 확산 면역확산 분석, 방사면역측정법(RIA), 형광 활성화된 세포 분류(FACS), 2차원 겔 전기영동, 모세관 전기이동, 질량 분광분석(MS), 매트릭스-보조 레이저 탈착/이온화-플라이트 타임-MS(MALDI-TOF), 표면-향상 레이저 탈착 이온화-플라이트 타임(SELDI-TOF), 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC), 고속 단백질 액체 크로마토그래피(FPLC), 다차원 액체 크로마토그래피(LC), 이어서 이중 질량 분석기(MS/MS), 박층 크로마토그래피, 단백질 칩 발현 분석 및 레이저 밀도측정으로부터 선택된 하나 이상의 기술을 사용하여 측정할 수 있다. 특정한 양태에서, 상기 파라미터 수준의 측정은 ELISA에 의해 측정된다. 바람직한 양태에서, ELISA에 사용된 항체 중 하나는 Aβ17 펩티드의 C-말단 영역에 대해 지시된 본 발명의 항체이다.

본원에 사용된 용어 "혈장 중의 유리 Aβ17 펩티드"(이하, FP Aβ17로서 공지됨)은 생물학적 샘플의 임의의 성분과 결합하지 않고 특이적 항체에 대한 결합에 용이하게 이용가능한 아밀로이드 베타 펩티드의 수준을 지칭한다. 이 펩티드는 생물학적 샘플을 상기 펩티드에 특이적인 항체와 접촉시킴으로써 통상의 면역학적 기술로 측정할 수 있다. 바람직한 양태에서, 유리 아밀로이드 펩티드의 수준은 혈장에서 측정된다.

본원에 사용된 용어 "세포에 결합된 Aβ17 펩티드 수준"(이하, CB Aβ17로서공지됨)은 생물학적 샘플에 존재하는 세포 표면에 비공유 결합되고 샘플에 부가된 항체에 대한 결합에 이용불가능하여 면역학적으로 검출가능한 아밀로이드 베타 펩티드를 지칭한다. 전형적으로, 생물학적 샘플이 혈액인 경우, 아밀로이드 베타 펩티드는 적혈구, 백혈구, 내포 호중구, 호산구, 호염기, 림프구 및 단핵구, 및 혈소판에 결합된다. 주어진 샘플 중의 세포에 결합된 아밀로이드 베타 펩티드의 양은 측정될 수 있고, 이 값은 단독으로 또는 본 발명의 방법에서 아밀로이드 베타 펩티드에 관련된 다른 파라미터와 조합되어 사용될 수 있다. 이를 위해, 우선, 생물학적 샘플에서 세포 분획을 분리하는 것이 필요하다. 이것은 원심분리, 침전, 여과 등의 당해 기술분야의 통상의 기술자에게 공지된 임의의 기술을 사용하여 실시할 수 있다. 생물학적 샘플의 세포 분획이 분리되면, 세포는 단백질 가용화제와 접촉한다.

주어진 샘플 중의 세포에 결합된 아밀로이드 베타 펩티드의 양은 측정될 수 있고, 이 값은 단독으로 또는 본 발명의 방법에서 아밀로이드 베타 펩티드에 관련된 다른 파라미터와 조합되어 사용될 수 있다. 이를 위해, 우선, 생물학적 샘플에서 세포 분획을 분리하는 것이 필요하다. 이것은 원심분리, 침전, 여과 등의 당해 기술분야의 통상의 기술자에게 공지된 임의의 기술을 사용하여 실시할 수 있다. 생물학적 샘플의 세포 분획이 분리되면, 세포는 단백질 가용화제와 접촉한다.

바람직한 양태에서, 대상체의 샘플은 혈액, 혈청, 혈장 및 CSF의 그룹으로부터 선택된다. 보다 바람직한 양태에서, 샘플은 혈장 샘플이다.

대상체가 알츠하이머 질환 또는 초기 단계의 알츠하이머 질환을 앓고 있는지를 측정하는 방법

본 발명의 발명자들은, 직접 측정되거나 이들 중에서 특정한 계산을 적용하여 측정된 아밀로이드 베타 펩티드의 특정 모집단의 수준을 사용하여, 환자가 경도 알츠하이머 질환 앓고 있는지를 측정하거나, 대상체가 전구 알츠하이머 질환을 앓고 있는지를 측정하거나, 전구 알츠하이머 질환을 앓고 있는 대상체로부터 비-전구 경도 인지 손상을 앓고 있는 대상체를 구별하거나, 경도 알츠하이머 질환을 앓고 있는 대상체로부터 비-전구 경도 알츠하이머 질환을 앓고 있는 대상체를 구별하거나, 경도 알츠하이머 질환을 앓고 있는 대상체로부터 전구 알츠하이머 질환을 앓고 있는 대상체를 구별할 수 있음을 확인했다.

따라서, 또 다른 측면에서, 본 발명은 하기의 단계를 포함하는, 대상체가 경도 알츠하이머 질환을 앓고 있는지를 측정하는 방법이다:

따라서, 경도 알츠하이머 질환을 앓고 있는 대상체로부터 건강한 대상체를 구별하기 위해 측정되는 파라미터는 다음과 같다:

(a) CB Aβ17 + CB Aβ40 + CB Aβ42

(b) (CB Aβ17 + CB Aβ40 + CB Aβ42) + (TP Aβ17 + TP Aβ40 + TP Aβ42)

(c) TP Aβ42 + CB Aβ42

(d) (TP Aβ40 + TP Aβ42) + (CB Aβ40 + CB Aβ42)

(e) FP Aβ17/ CB Aβ17

대상체가 전구 알츠하이머 질환을 갖는 MCI를 앓고 있는지를 측정하는 방법은 하기의 단계를 포함한다:

따라서, 전구 알츠하이머 질환을 앓고 있는 대상체로부터 건강한 대상체를 구별하기 위해 측정되는 파라미터는 다음과 같다:

(a) TP Aβ42 + CB Aβ42

(b) (TP Aβ40 + TP Aβ42) + (CB Aβ40 + CB Aβ42)

(c) FP Aβ17/ CB Aβ17

(d) CB Aβ17/ CB Aβ42

(e) (TP Aβ17 + CB Aβ17)/(TP Aβ42 + CB Aβ42)

(f) CB Aβ17/(CB Aβ40 + CB Aβ42)

(g) (TP Aβ17 + CB Aβ17)/(TP Aβ40 + TP Aβ42)+ (CB Aβ40 + CB Aβ42)

또 다른 측면에서, 본 발명은 하기의 단계를 포함하는, 전구 알츠하이머 질환을 갖는 MCI를 앓고 있는 대상체로부터 비-전구 알츠하이머 질환을 갖는 MCI를 앓고 있는 대상체를 구별하는 방법이다:

(c) 제1 파라미터가 상기 대상체의 혈장 샘플 중의 전체 Aβ17 펩티드 수준 및 혈액 샘플 중의 세포에 결합된 Aβ17 펩티드 수준의 부가된 값에 상응하고, 제2 파라미터가 상기 대상체의 전체 Aβ42 펩티드 수준 및 혈액 샘플 중의 세포에 결합된 Aβ42 펩티드 수준의 부가된 값에 상응하는, 2개 파라미터 사이의 비율 값;

여기서, 비-전구 알츠하이머 질환을 갖는 MCI를 앓고 있는 대상체의 참조 샘플의 값에 대하여 파라미터 (a) 값이 증가되고/되거나 파라미터 (b), (c), (d) 또는 (e) 중 하나 이상의 파라미터 값이 증가되는 경우, 당해 대상체는 전구 알츠하이머 질환을 갖는 MCI를 앓고 있다. .

따라서, 비-전구 알츠하이머 질환을 갖는 MCI를 앓고 있는 대상체와 전구 알츠하이머 질환을 갖는 MCI를 앓고 있는 대상체를 구별하게 하는, 측정되는 파라미터는 다음과 같다:

(a) CB Aβ17 + CB Aβ40 + CB Aβ42

(b) CB Aβ17/ CB Aβ42

(c) (TP Aβ17 + CB Aβ17)/(TP Aβ42 + CB Aβ42)

(d) CB Aβ17 / (CB Aβ40 + CB Aβ42)

(e) (TP Aβ17 + CB Aβ17)/(TP Aβ40 + TP Aβ42)+(CB Aβ40 + CB Aβ42)

또 다른 측면에서, 본 발명은 하기의 단계를 포함하는, 경도 알츠하이머 질환을 앓고 있는 대상체로부터 비-전구 알츠하이머 질환을 갖는 MCI를 앓고 있는 대상체를 구별하는 방법이다:

따라서, 경도 알츠하이머 질환을 앓고 있는 대상체로부터 비-전구 알츠하이머 질환을 갖는 MCI를 앓고 있는 대상체를 구별하기 위해 측정되는 파라미터는 다음과 같다:

(a) CB Aβ17 + CB Aβ40 + CB Aβ42

(b) (TP Aβ17 + TP Aβ40 + TP Aβ42)+ (CB Aβ17 + CB Aβ40 + CB Aβ42)

(c) TP Aβ42 + CB Aβ42

(d) (TP Aβ40 + TP Aβ42)+(CB Aβ40 + CB Aβ42)

(e) TP Aβ40 + CB Aβ40

(f) CB Aβ17 / (CB Aβ40 + CB Aβ42)

(g) FP Aβ17 / CB Aβ17

또 다른 측면에서, 본 발명은 하기 단계를 포함하는, 경도 알츠하이머 질환을 앓고 있는 대상체로부터 전구 알츠하이머 질환을 갖는 MCI를 앓고 있는 대상체를 구별하는 방법이다:

여기서, 전구 알츠하이머 질환을 갖는 MCI를 갖는 대상체의 참조 샘플의 값에 대하여 하나 이상의 상기 파라미터 값이 증가되는 경우, 당해 대상체는 경도 알츠하이머 질환을 앓고 있다.

따라서, 전구 알츠하이머 질환을 갖는 MCI를 앓고 있는 대상체와 경도 알츠하이머 질환을 앓고 있는 대상체를 구별하기 위해 측정되는 파라미터는 다음과 같다:

(a) FP Aβ17/FP Aβ40

(b) FP Aβ17/FP Aβ40+ FP Aβ42

본원에서 사용된 용어 "진단"은 대상체의 질환에 대한 감수성(susceptibility)의 평가, 대상체가 현재 질병을 가지고 있는지에 대한 측정, 및 질환에 의해 영향받은 대상체의 예후를 포함한다. 당해 기술분야의 통상의 기술자에게 이해되듯이, 이러한 평가는 바람직하게는 정확하다 해도, 통상 진단받는 대상체 100%에서 정확하지 않을 수 있다. 이 용어는, 그러나, 대상체의 통계적으로 유의한 부분이 질환을 앓고 있거나 그러한 경향을 갖는다는 것이 확인될 수 있는 것을 요구한다. 일부가 통계적으로 유의하다면, 몇몇 잘 알려진 통계 평가 도구, 예를 들면, 신뢰 구간의 결정, p값 결정, 스튜던트 t-시험(Student's t-test), 만-위트니 시험(Mann-Whitney test) 등을 사용하여 당해 기술분야의 통상의 기술자에 의해 간단히 측정될 수 있다. 세부 내용은 문헌[참조: Dowdy and Wearden, Statistics for Research, John Wiley & Sons, New York 1983]에서 제공된다. 바람직한 신뢰 구간은 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%이다. p값은 바람직하게는 0.2, 0.1 또는 0.05이다.

본원에서 사용된 용어 "대상체(subject)"는 포유동물로 분류된 모든 동물에 관련되고, 이로써 한정되는 것은 아니지만, 가축 및 농장 동물, 영장류 및 인간, 예를 들면, 인간, 비-인간 영장류, 소, 말, 돼지, 양, 염소, 개, 고양이 또는 설치류를 포함한다. 바람직하게는, 대상체는 모든 연령 또는 인종의 남성 또는 여성 인간이다.

용어 "알츠하이머 질환"(또는 "노인성 치매")은, 노인성 플라크, 신경다발증, 및 임상적으로 진행성 기억상실, 혼동, 행동성 문제, 자신을 돌보는 능력상실, 점진적 물리적 퇴행 및, 궁극적으로는 사망을 나타내는 진행성 신경 손실로 특징되는 특정한 퇴행성 뇌 질환과 연관된 정신적 퇴행을 의미한다.

본 발명과 관련하여, 표현 "경도 알츠하이머 질환"은 알츠하이머의 초기 단계를 지칭하며, 여기서 당해 대상체는 다음 증상을 경험한다:

ㆍ 최근 사건에 대한 기억 손실

ㆍ 문제 해결, 복잡한 직무 및 청각 판단의 곤란

ㆍ 성격의 변화

ㆍ 사고의 정리 및 표시의 곤란

ㆍ 소지품의 분실 또는 제자리에 두지 않기

경도 알츠하이머병을 앓고 있는 환자들은 NINCDS-ADRDA 기준(CDR = 1, 셸텐(scheltens) 스케일에서 MMSE 16-24점 및 내측두엽 위축증(MRI로 측정)>3)을 사용하여 확인된다.

용어 "경도 인지 손상" 또는 MCI는 정상 연령 및 초기 알츠하이머 질환 사이의 인지 손상의 일시적 단계를 지칭한다. 환자는 통상 마요 클리닉 기준(Mayo Clinic criteria)[CDR=5, 이들은 셸턴 스케일에서 3점 이상인 내측두엽 위축증(MRI로 측정)을 나타내고, 18-플루오로데옥시글루코스의 양전자 방출 단층촬영술(PET-FDG)에서 측막(parietal) 및/또는 측두엽(temporal) 대사저하의 형태를 나타낸다(AD의 암시)]을 만족하는 경우에 MCI를 갖는 것으로 확인된다.

표현 "전구 알츠하이머 질환"(또한 "유력한 알츠하이머 질환을 갖는 MCI"로서 공지됨)은 MCI를 나타내고 알츠하이머 질환으로 전환될 높은 위험을 나타내는 것으로 간주되는 환자를 지칭한다. 유력한 AD로서의 환자를 확인하는 기준은 NINCDS-ADRDA 기준[참조: McKhann G. et al., 1984, neurology, 34:939-44]에 규정된 것들, 즉 임상적 및 신경정신학적 검사, 2개 이상의 인지 부분에 존재하는 진행성 인지 손상, 40 내지 90세 연령 사이에 장해의 개시 및 치매 증상을 생성할 수 있는 다른 질환이 부재에 의해 확립된 치매이다.

표현 "비-전구 알츠하이머 질환"(또한 "잠재적 알츠하이머 질환을 갖는 MCI"로서 공지됨)은 MCI를 나타내고 알츠하이머 질환으로 발달될 낮은 위험을 나타내는 것으로 간주되는 환자를 지칭한다. 잠재적 AD로서의 환자를 확인하는 기준은 NINCDS-ADRDA 기준[참조: McKhann G. et al., 1984, neurology, 34:939-44]에 규정된 것들, 즉 비전형적 발병, 제시 또는 진행, 및 공지된 병인이 없지만 치매를 생성할 수 있는 어떠한 공-병리 질환도 이의 기원에 존재하는 것으로 생각되지 않는 치매 증후군이다.

본 발명에 사용된 용어 "건강한 대상체"는 건강이 양호한 대상체를 지칭한다. 바람직한 양태에서, 상기 대상체는 65세 이상이다. 이는 신경퇴행성 질환을 앓지 않거나 신경퇴행성 질환의 어떠한 병력도 없는 대상체에 상응한다. 바람직하게는, 건강한 대상체는 기억력 불평의 부재, 신경정신학적 시험의 정상 행동 및 MRI에서 구조적 변화의 부재를 나타내는 환자이다. 건강한 대상체는 건강하고 다른 질환이 없거나, MCI 및 AD 이외의 질환을 가질 수 있다.

"전구 알츠하이머 질환을 앓고 있는 대상체로부터 건강한 대상체를 구별하는"은 알츠하이머 질환(AD)의 증상을 갖지 않는 대상체와 전구 알츠하이머 질환을 앓고 있는 대상체를 구별하는 능력을 지칭한다.

용어 "경도 알츠하이머 질환을 앓고 있는 대상체로부터 건강한 대상체를 구별하는"은 알츠하이머 질환(AD)의 증상을 갖지 않는 대상체와 초기 단계 AD의 대상체(경도 알츠하이머 질환)를 구별하는 능력을 지칭한다.

용어 "전구 알츠하이머 질환을 앓고 있는 대상체로부터 비-전구 MCI를 앓고 있는 대상체를 구별하는"은 비-전구 MCI의 증상을 갖는 대상체와 전구 알츠하이머 질환을 앓고 있는 대상체를 구별하는 능력을 지칭한다.

용어 "경도 알츠하이머 질환을 앓고 있는 대상체로부터 비-전구 MCI를 앓고 있는 대상체를 구별하는"은 비-전구 MCI의 증상을 갖는 대상체와 초기 단계 AD의 대상체(경도 알츠하이머 질환)를 구별하는 능력을 지칭한다.

용어 "경도 알츠하이머 질환을 앓고 있는 대상체로부터 전구 AD를 앓고 있는 대상체를 구별하는"은 전구 AD의 증상을 갖는 대상체와 초기 단계 AD의 대상체(경도 알츠하이머 질환)를 구별하는 능력을 지칭한다.

용어 "혈장"은 전혈의 액체 성분을 의미한다. 사용된 분리 방법에 따라, 혈장은 세포 성분에서 완전히 유리되거나, 다양한 양의 혈소판 및/또는 소량의 다른 세포 성분을 함유할 수 있다.

용어 "세포에 결합된 Aβ17, Aβ40 또는 Aβ42의 수준"(이하, 각각 CB Aβ17, CB Aβ40 또는 CB Aβ42로서 공지됨)은 생물학적 샘플에 존재하는 세포 표면에 비공유 결합되고 샘플에 부가된 항체에 대한 결합에 이용불가능하여 면역학적으로 검출가능한 아밀로이드 베타 펩티드를 지칭한다. 전형적으로, 생물학적 샘플이 혈액인 경우, 아밀로이드 베타 펩티드는 적혈구, 백혈구, 내포 호중구, 호산구, 호염기, 림프구 및 단핵구, 및 혈소판에 결합된다. 주어진 샘플 중의 세포에 결합된 아밀로이드 베타 펩티드의 양은 측정될 수 있고, 이 값은 단독으로 또는 본 발명의 방법에서 아밀로이드 베타 펩티드에 관련된 다른 파라미터와 조합되어 사용될 수 있다. 이를 위해, 우선, 생물학적 샘플에서 세포 분획을 분리하는 것이 필요하다. 이것은 원심분리, 침전, 여과 등의 당해 기술분야의 통상의 기술자에게 공지된 임의의 기술을 사용하여 실시할 수 있다. 생물학적 샘플의 세포 분획이 분리되면, 세포는 단백질 가용화제와 접촉한다.

적합한 단백질 가용화제는 하기 정의된 바와 같은 세정제, 카오트로픽제 및 환원제를 포함하고, 통상 완충액에 적절한 농도로 제공된다. 적합한 제제, 완충액, 및 완충액 중의 제제 농도는 하기에 기재되어 있다. 접촉 단계는 생물학적 샘플으 성분(단백질 및 지질)에 부착된 아밀로이드 펩티드를 분리하는 방법으로 하기 설명된 바와 같이 본질적으로 수행된다. 바람직한 양태에서, 단백질 가용화제는 세정제이다. 보다 더 바람직한 양태에서, 세정제는 트윈 20이다. 단백질 가용화제로서 사용하기 위한 트윈 20의 적합한 농도는 상기 정의된 같고, 즉 0.004 내지 0.02%, 보다 바람직하게는 0.005 내지 0.01%(w/v)이다.

접촉 단계는 바람직하게는 샘플에 존재하는 단백질분해 활성을 억제하기 위해 저온에서 실시한다. 적합한 온도는 약 0-10℃, 바람직하게는 약 3-5℃, 예를 들면, 약 4℃이다.

전형적으로, 접촉 단계는 단백질 가용화제를 포함하는 용액과 함께 생물학적 샘플 중의 세포 분획을 재현탁시킴으로써 수행된다. 상기 재현탁은 부드러운 상하 피펫팅, 교반, 바람직하게는 진탕, 보다 바람직하게는 고속 진탕, 가장 바람직하게는 와동에 의해 적어도 5초, 바람직하게는 적어도 10초, 보다 바람직하게는 적어도 15초(예를 들면, 15-50초) 동안 실시될 수 있다. 상기 혼합, 교반, 진탕, 고속 진탕 또는 와동에 유리한 속도는 적어도 250rpm, 바람직하게는 적어도 500rpm, 보다 바람직하게는 적어도 1,000rpm, 가장 바람직하게는 약 2,000-2,500rpm의 속도를 포함한다.

접촉 단계는 생물학적 샘플에 존재하는 세포로부터 아밀로이드 베타 펩티드를 부분적으로 또는 바람직하게는 완전히 해리하기에 적합한 조건하에서 실시된다. 당해 조건은 접촉 단계전 및 접촉 단계가 실시된 후 다른 시점에서 계속적으로 검출할 수 있는 아밀로이드 베타 펩티드의 양을 모니터링함으로써 당해 기술분야의 통상의 기술자에 의해 적절하게 결정될 수 있다.

본원에서 사용된 용어 "혈장 중의 전체 Aβ 펩티드"(이하, TP Aβ17, TP Aβ40 또는 TP Aβ42로서 공지됨)은 "혈장 중의 유리 Aβ 펩티드" + "거대분자 성분에 결합된 아밀로이드 베타 펩티드"를 지칭한다. 본원에서 사용된 용어 "거대분자 성분에 결합된 아밀로이드 베타 펩티드"는 연구하의 생물학적 샘플에서 발견된 분자에 비공유적으로 결합되거나 부착된 아밀로이드 베타 펩티드를 지칭한다. 이 펩티드는 통상 면역학적 검출법으로 쉽게 접근할 수 없고, 따라서 당해 성분에서 펩티드를 분리하기 위해 생물학적 샘플을 전처리하는 것이 필요하다. 이들 조건하에서, 거대분자 성분에 결합된 아밀로이드 베타 펩티드는 상기 성분으로부터 방출되고 특이적 항체를 사용한 면역학적 검출에 이용가능하다. 생물학적 샘플은 이미 소정량의 유리 아밀로이드 베타 펩티드를 함유하기 때문에, 샘플을 단백질 가용화제와 접촉시킨 후의 유리 아밀로이드 펩티드의 전체 양은 처음에 존재하는 유리 아밀로이드 베타 펩티드의 수준과 단백질 가용화제로 처리하여 방출된 아밀로이드 베타 펩티드의 수준을 합한 것이다. 생물학적 샘플에 존재하는 거대 분자 성분에 결합된 아밀로이드 베타 펩티드의 수준을 측정해야 하는 경우에, 이는 통상적으로, 단백질 가용화제로 처리하기 전에 아밀로이드 베타 펩티드의 수준과 단백질 가용화제로 처리한 후에 유리 아밀로이드 베타 펩티드의 수준을 측정하고, 제2 값에서 제1 값을 뺌으로써 수행할 수 있다. 본 발명의 목적에 있어서, 이는 통상 최초 유리 아밀로이드 베타 펩티드 뿐만 아니라 단백질 가용화제로 처리한 후에 거대분자 성분으로부터 방출된 아밀로이드 베타 펩티드의 수준을 포함하는 유리 아밀로이드 베타 펩티드의 합계 수준을 측정하는 데에 적합하다. 따라서, 샘플이 처리되어 거대분자 성분으로부터 아밀로이드 펩티드를 해리하는 경우에 통상 측정되는 변수는 샘플 내에 존재하는 유리 펩티드 및 거대분자 성분에 결합된 펩티드의 부가에 상응한다.

아밀로이드 베타 펩티드에 결합할 수 있고 거대분자 성분에 결합된 아밀로이드 베타 펩티드의 풀에 기여하는 샘플의 거대분자 성분은 단백질 및 지질 둘 다를 포함한다. 당해 방법이 혈액 또는 혈장 샘플에서 수행되는 특별한 경우에, 거대분자 성분은, 이로써 한정되는 것은 아니지만, 혈액 단백질 및 지질을 포함한다. 혈액 단백질의 예로는 알부민, 면역글로불린 G, 면역글로불린 E, 면역글로불린 M, 면역글로불린 A, 피브리노겐(피브린과 이의 분해 산물), 알파-1 안티트립신, 프리알부민, 알파 1 산성 당단백질, 알파 1 태아단백질, 알파 2 헵토글로빈, 마크로글로불린, 세룰로플라스민, 트랜스페린, C3/C4 베타 2 마이크로글로불린, 베타 지단백질, 알파, 베타 및 감마 글로불린, C-반응성 단백질(CRP), 프로트롬빈, 티록신-결합 단백질, 트랜스티레틴 등이 포함된다. 혈액 지질의 예로는, 유리 지방산, 콜레스테롤, 트리글리세라이드, 인지질, 스핑고지질 등을 포함한다.

거대 분자 성분에 결합된 아밀로이드 베타 펩티드의 양은 상기 아밀로이드 베타 펩티드를 거대 분자 성분으로부터 방출하기에 적당한 조건하에서 생물학적 샘플의 세포 비함유 샘플을 단백질 가용화제와 접촉시켜 측정할 수 있다.

접촉시킨다는 것은, 단백질 가용화제를 함유하는 충분한 양의 용액을 샘플에 첨가하여, 혼합물에서 단백질 가용화제의 농도가 샘플 중의 단백질과 세포에 결합된 아밀로이드 베타 펩티드를 효과적으로 용해하기에 충분하다는 것을 의미한다. 바람직하게는, 단백질 가용화제는 완충액 중의 용액에서 발견되어, 단백질 가용화제의 첨가는 샘플의 pH를 실질적으로 변경시키지 않는다.

본원에서 사용된 용어 "단백질 가용화제"는, 폴리펩티드의 1차 구조는 그대로 유지하면서, 2차, 3차 및/또는 4차 구조를 변경시킬 수 있는 조성의 임의의 화합물을 지칭한다. 이들 특성에 비추어, 단백질 가용화제는 단백질내 및 분자간 응집을 방해할 뿐만 아니라 샘플 중의 단백질의 용해도를 증가시킬 수 있다. 본 발명에서 사용하기에 적합한 단백질 가용화제는, 이로써 한정되는 되는 것은 아니지만, 세정제, 카오트로픽제(chaotropic agents), 환원제 또는 이들의 혼합물을 포함한다.

본원에서 사용된 용어 "세정제"는 일반적으로 계면활성제와 유사하게 사용되며, 액체에 첨가될때 세정제가 없는 동일 액체와 비교하여 액체의 표면 장력을 감소시키는 양친매성 표면 활성제를 지칭한다. 세정제는 단백질의 응고를 방해할 수 있고 오염물이 목적 단백질에 비-특이적 상호작용 또는 결합하는 것을 방해할 수 있다. 본 발명에서 사용하기에 적합한 세정제는, 이로써 한정되는 것은 아니지만, 비-이온성(중성), 음이온성, 양이온성 또는 쌍성이온성 세정제를 포함한다.

비-이온성 또는 중성 세정제의 예는, 이로써 한정되는 것은 아니지만, 트윈® 20, 트윈® 21, 트윈® 40, 트윈® 60, 트윈® 61, 트윈® 65, 트윈® 80, 트윈® 81, 트윈® 85 등의 트윈 시리즈 세정제, Span® 20 등의 Span® 시리즈 세정제; Tergitol 타입 15-S-12 등의 Tergitol 시리즈 세정제; Brij® 35, Brij® 56, Brij® 72, Brij® 76, Brij® 92V, Brij® 97, Brij® 58P 등의 Brij® 시리즈 세정제; 트리톤® X-100, 트리톤® X-114, 트리톤® CF-21, 트리톤® CF-32, 트리톤® DF-12, 트리톤® DF-16, 트리톤® GR-5M, 트리톤® X-102, 트리톤® X-15, 트리톤® X-151, 트리톤® X-207, 트리톤® X-165, 트리톤® X-305, 트리톤® X-405, 트리톤® X-45, 트리톤® X-705-70 등의 트리톤® 시리즈 세정제, 또는 적어도 하나의 상기 세정제의 비-이온성 보존적 변이체를 포함한다.

음이온성 세정제의 예는, 이로써 한정되는 것은 아니지만, 콜린산 및 이의 유도체, 타우로콜린산, 트리톤 X-200, 트리톤 W-30, 트리톤- 30, 트리톤-770, 디옥틸 설포석시네이트, N₅N-디메틸도데실아민 N-옥사이드, 나트륨 1-알킬설포네이트, N-라우로일사르코신 또는 지방산 염을 포함한다.

양이온성 세정제의 예는, 이로써 한정되는 것은 아니지만, 모노 및 디-메틸 지방 아민, 알킬 트리메틸 암모늄 염, 디알킬 디메틸 암모늄 염, 알킬 아민 아세테이트, 트리알킬암모늄 아세테이트, 알킬디메틸벤질 암모늄 염, 디알킬메틸벤질 암모늄 염, 알킬피리디늄 할라이드 및 알킬(알킬 치환된)피리디늄 염, 알킬티오메틸피리디늄 염, 알킬아미도메틸피리디늄 염, 알킬퀴놀리늄 염, 알킬이소퀴놀리늄 염, N,N-알킬메틸피롤리도늄 염, 1,1-디알킬피페리디늄 염, 4,4-디알킬티아모르폴리늄 염, 4,4-디알킬티아모르폴리늄-1-옥사이드 염, 메틸 히스(알킬 에틸)-2-알킬 이미다졸리늄 메틸 설페이트(및 다른 염), 메틸 비스(알킬아미도 에틸)-2-하이드록시에틸 암모늄 메틸 설페이트(및 다른 염), 알킬아미도프로필-디메틸벤질 암모늄 염, 카복시알킬-알킬디메틸 암모늄 염, 알킬아민 옥사이드, 알킬디메틸 아민 옥사이드, 폴리(비닐메틸피리디늄) 염, 폴리(비닐피리딘) 염, 폴리에틸렌이민, 트리알킬 포스포늄 바이카보네이트(및 다른 염), 트리알킬메틸 포스포늄 염, 알킬에틸메틸설포늄 염 및 알킬디메틸설폭소늄 염을 포함한다.

쌍성이온성(zwitterionic) 세정제의 예는, 이로써 한정되는 것은 아니지만, 3-[(3-콜아미도프로필)디메틸아미노]-1-프로판설포네이트(CHAPS); 3-[(3-콜아미도프로필)디메틸아미노]-2-하이드록시-1-로로판설포네이트(CHAPSO); N-(알킬 C10-C16)-N,N-디메틸글리신 베타인(EMPIGEN BB); 카프릴릴 설포베타인(SB3-10); 3-[N,N-디메틸(3-미리스토일아미노프로필)암모니오]프로판설포네이트(아미도설포베타인-14; ASB-14); N-테트라데실-N,N-디메틸-3-암모니오-1-프로포안설포네이트(3-14 세정제; ZWITTERGENT); N-도데실-N,N'-디메틸-3-암모니오-1-프로판설포네이트; N-옥타데실-N,N-디메틸-3-암모니오-1-프로판설포네이트; N-데실-N,N-디메틸-3-암모늄-1-프로판설포네이트; 미라타인 CB; 미라타인 BB; 미라타인 CBR; 미라타인 ACS; 미라케어 2MHT 및 미라케어 2MCA를 포함한다.

바람직한 양태에서, 단백질 가용화제는 세정제이다. 보다 바람직한 양태에서, 세정제는 트윈 20이다. 보다 더 바람직한 양태에서, 트윈 20은 0.5% 농도로 사용된다.

본원에서 사용되는 "카오트로픽제"는 단백질 사이 및 단백질 내에서 수소결합 및 소수성 상호작용을 방해하는 화합물 및 이의 혼합물에 관련된다. 고농도로 사용될 때, 카오트로픽제는 2차 단백질 구조를 방해하고, 달리 용해되지 않는 용액 단백질을 생성한다. 적합한 카오트로픽제는, 이로써 한정되는 것은 아니지만, 우레아, 구아니디늄 이소티오시아네이트, 나트륨 티오시아네이트(NaSCN), 구아니딘 HCl, 구아니디늄 클로라이드, 구아니디늄 티오시아네이트, 리튬 테트라클로로아세테이트, 나트륨 퍼클로레이트, 루비듐 테트라클로로아세테이트, 칼륨 요오다이드 또는 세슘 트리플루오로아세테이트를 포함한다.

본원에서 사용되는 용어 "환원제"는 환원 상태에서 설프하이드릴 그룹을 유지하고 분자간 또는 분자내 디설파이드 결합을 환원시키는 임의의 화합물 또는 물질을 의미한다. 예를 들면, 본 발명의 방법에 적합한 환원제는 설프하이드릴 또는 포스핀 환원제를 포함한다. 설프하이드릴 환원제의 예는 디티오트레이톨(DTT), 디티오에리트리톨(DTE) 및 β-머캡토에탄올을 포함한다. 포스핀 환원제의 예는 트리부틸포스핀(TBP) 및 트리스-카복시에틸포스핀(TCEP)를 포함한다.

통상적으로, 생물학적 샘플은 우선 세포 분획을 제거하기 위해 처리된다. 이어서, 세포 비함유 샘플은 단백질 가용화제와 접촉된다. 바람직한 양태에서, 샘플은 단백질 가용화제로 이루어진 완충제를 사용하여 희석된다. 통상적으로, 샘플은 트윈 20을 함유하는 완충액으로 5배 희석된다.

본원에서 사용되는 "완충액"은 본래 용액의 산성 또는 알칼리성을 눈에 띄게 변화시키지 않으면서 산과 염기를 중화할 수 있는 용액중 물질 또는 화합물의 혼합물이다. 본 발명의 방법에서 사용되는 적합한 완충액은, 이로써 한정되는 것은 아니지만, 트리스 완충액, 포스페이트 완충액, 보레이트 완충액, 카보네이트 완충액, 글리신-나트륨 하이드록사이드 완충액 등을 포함한다. 바람직하게는, 완충액은 포스페이트-완충된 식염수 또는 PBS 등의 포스페이트 완충액이다.

생물학적 샘플에 첨가되는 단백질 가용화제를 포함하는 용액의 양은, 아밀로이드 베타 펩티드의 충분한 해리가 달성되는 한 필수적인 것은 아니다. 예를 들면, 생물학적 유체는 단백질 가용화제를 포함하는 용액 중에서 1/2 (v/v), 1/3 (v/v), 1/4 (v/v), 1/5 (v/v), 1/6 (v/v), 1/7 (v/v), 1/8 (v/v), 1/9 (v/v), 1/10 (v/v), 1/20 (v/v), 1/50 (v/v), 1/60 (v/v), 1/80 (v/v), 1/90 (v/v), 1/100 (v/v) 또는 그 이상 희석될 수 있다. 당해 기술분야의 통상의 기술자는, 단백질 가용화제의 최종 농도가 목적하는 효과를 달성하는데 적합한 한, 상기 희석률과 상기 단백질 가용화제 농도의 어떠한 조합도 사용될 수 있다는 것을 인식할 것이다. 예를 들면, 단백질 가용화제를 함유하는 용액은 상기 선택된 단백질 가용화제를 0.001% 내지 0.5%(w/v) 농도로 함유할 수 있다. 단백질 가용화제를 함유하는 상기 용액 중에서 희석된 후, 상기 생물학적 유체는 통상 상기 계면활성제를 0.1%(w/v) 미만, 바람직하게는 0.6%(w/v) 미만, 보다 바람직하게는 0.5%(w/v) 이하, 가장 바람직하게는 0.45% (w/v) 이하 및 가장 더 바람직하게는 0.5%로 함유한다.

본 발명에서 사용하기에 적합한 완충 시스템은 NaCl 또는 KCl, 및 임의로 BSA 등의 염을 포함하는 트리스-HCl 완충액을 포함한다. 특히 완충 시스템은, 이로써 한정되는 것은 아니지만, 다음을 포함한다.

50 mM 트리스-HCl pH 8, 0.5M NaCl, 0.05 %; BSA, 0.05 % 트윈-20;

50 mM 트리스-HCl pH 8, 0.5M NaCl, 0.05 %; BSA, 0.05 % 트윈-20, 1M GuHCl;

50 mM 트리스-HCl pH 8, 0.5M KCl, 0.05 %; BSA, 0.05 % 트윈-20 ;

50 mM 트리스-HCl pH 8, 0.5M KCl, 0.05 %; BSA, 0.05 % 트윈-20, 1M GuHCl;

50 mM 트리스-HCl pH 8, 0.5M NaCl, 0.05 %; BSA, 0.05 % 트윈-80;

50 mM 트리스-HCl pH 8, 0.5M KCl, 0.05 %; BSA, 0.05 % 트윈-80;

50 mM 트리스-HCl pH 8, 0.5M NaCl; 0.05 %; BSA, 0.05 % 트리톤 X-100

50 mM 트리스-HCl pH 8, 0.5M KCl, 0.05 %; BSA, 0.05 % 트리톤 X-100;

50 mM 트리스-HCl pH 8; 0.05 %; BSA, 0.05 % 트윈-20;

50 mM 트리스-HCl pH 8, 0.5M NaCl, 0.1 %; BSA, 0.05 % 트윈-20;

50 mM 트리스-HCl pH 8, 0.5M NaCl, 0.05 %; BSA, 0.1 % 트윈-20;

50 mM 트리스-HCl pH 8, 0.5M NaCl, 0.1 %; BSA, 0.1 % 트윈-20;

50 mM 트리스-HCl pH 8, 1M NaCl, 0.05 %; BSA, 0.05 % 트윈-20;

50 mM 트리스-HCl pH 8, 1.5M NaCl, 0.05 %; BSA, 0.05 % 트윈-20;

50 mM 트리스-HCl pH 8, 2M NaCl, 0.05 %; BSA, 0.05 % 트윈-20;

50 mM 트리스-HCl pH 8, 2,5M NaCl, 0.05 %; BSA, 0.05 % 트윈-20;

50 mM 트리스-HCl pH 8, 3M NaCl, 0.05 %; BSA, 0.05 % 트윈-20;

50 mM 트리스-HCl pH 8, 0.5M NaCl, 0.05 %; BSA, 0.05 % 트윈-20, 10% DMSO;

50 mM 트리스-HCl pH 8, 0.5M NaCl, 0.05 %; BSA, 0.05 % 트윈-20, 0.5 M GuHCl;

50 mM 트리스-HCl pH 6, 0.5M NaCl, 0.05 %; BSA, 0.05 % 트윈-20;

50 mM 트리스-HCl pH 7, 0.5M NaCl, 0.05 %; BSA, 0.05 % 트윈-20;

50 mM 트리스-HCl pH 9, 0.5M NaCl, 0.05 %; BSA, 0.05 % 트윈-20;

50 mM 트리스-HCl pH 8, 0.5M NaCl, 0.05 %; BSA

예를 들면, 트윈 20이 단백질 가용화제로 사용될 때, 바람직한 농도는 0.004-0.02%이고, 보다 바람직하게는 0.005-0.01%(w/v)이다.

생물학적 유체가 단백질 가용화제를 포함하는 용액과 접촉하면, 이들 유체는 혼합될 수 있다. 혼합은 교반, 바람직하게는 진탕, 보다 바람직하게는 고속 진탕, 가장 바람직하게는 와동에 의해 적어도 5초, 바람직하게는 적어도 10초, 보다 바람직하게는 적어도 15초(예를 들면, 15-50초) 동안 실시될 수 있다. 상기 혼합, 교반, 진탕, 고속 진탕 또는 와동에 유리한 속도는 적어도 250rpm, 바람직하게는 적어도 500rpm, 보다 바람직하게는 적어도 1,000rpm, 가장 바람직하게는 약 2,000-2,500rpm의 속도를 포함한다.

접촉 단계는 생물학적 샘플에 존재하는 단백질과 지질로부터 아밀로이드 베타 펩티드를 부분적으로 또는 바람직하게는 완전히 해리하기에 적합한 조건하에서 실시된다. 당해 조건은 접촉 단계전 및 접촉 단계가 실시된 후 다른 시점에서 계속적으로 검출할 수 있는 아밀로이드 베타 펩티드의 양을 모니터링함으로써 당해 기술분야의 통상의 기술자에 의해 적절하게 측정될 수 있다. 시간 과정 실험은 실험부의 실시예에 기재된 바와 같이 측정될 수 있다.

당해 기술분야의 통상의 기술자는, 생물학적 샘플을 단백질 가용화제를 함유하는 완충액으로 희석함으로써 아밀로이드 베타 펩티드의 수준을 측정하는 경우, 면역학적 측정에 의해 수득된 유리 아밀로이드 베타 펩티드의 수준이 생물학적 샘플에 사전 적용된 희석 인자를 고려하기 위해 보정되어야 한다는 것을 인식할 것이다.

본원에서 사용된 용어 "혈장 중의 유리 Aβ17, Aβ40 또는 Aβ42 펩티드"(이하, 각각 FP Aβ17, FP Aβ40 또는 FP Aβ42로서 공지됨)은 생물학적 샘플의 임의의 성분과 결합하지 않고 특이적 항체에 대한 결합에 용이하게 이용가능한 아밀로이드 베타 펩티드의 수준을 지칭한다. 이 펩티드는 생물학적 샘플을 상기 펩티드에 특이적인 항체와 접촉시킴으로써 통상의 면역학적 기술에 의해 측정될 수 있다. 바람직한 양태에서, 유리 아밀로이드 펩티드의 수준은 혈장에서 측정된다.

본원에서 사용된 용어 "참조 값"은 비교용으로 사용되는 파라미터 값을 지칭하고, 신경퇴행성 질환을 앓고 있지 않거나 신경퇴행성 질병의 병력이 없는 대상체에서 측정한다. 바람직하게는, 상이한 파라미터 및 계산된 파라미터에 대한 참조 값이 수득되는 대상체는 기억력 불평을 하지 않고, 신경심리 시험에서 정상 행동 및 MRI에서 구조 변경의 부재를 나타내는 환자들이다.

특히, 참조 값은 85% 이상의 감도 및 75% 이상의 특이성이 가능한 것을 선택한다. 다른 바람직한 양태에서, 참조 값은 70% 이상의 감도 및 70% 이상의 특이성을 수득하기 위해 선택한다. 바람직하게는, 참조 값은 80% 이상의 정확도 또는 정밀도로 예측할 수 있게 한다.

파라미터 값이 측정되면, 대상체가 알츠하이머 질환을 앓고 있는지의 측정은 참조 값에 대하여 당해 파라미터 값 또는 계산된 파라미터 값의 변경이 있는 경우에 수행된다.

펩티드의 측정에 적합한 임의의 방법을 본 발명에서 사용할 수 있다. 예를 들면, 아밀로이드 베타 펩티드의 농도는 웨스턴 블롯, 면역침강법, 효소-결합 면역흡착제 분석법(ELISA), 표면 플라즈몬 공명, 침강 반응, 겔 확산 면역확산 분석, 방사면역측정법(RIA), 형광 활성화된 세포 분류(FACS), 2차원 겔 전기영동, 모세관 전기이동, 질량 분광분석(MS), 매트릭스-보조 레이저 탈착/이온화-플라이트 타임-MS(MALDI-TOF), 표면-향상 레이저 탈착 이온화-플라이트 타임(SELDI-TOF), 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC), 고속 단백질 액체 크로마토그래피(FPLC), 다차원 액체 크로마토그래피(LC), 이어서 이중 질량 분석기(MS/MS), 박층 크로마토그래피, 단백질 칩 발현 분석 및 레이저 밀도측정으로부터 선택된 하나 이상의 기술을 사용하여 측정할 수 있다.

바람직한 양태에서, 본 발명의 방법의 측정은 면역학적 방법에 의해 수행된다. 본원에서 사용된 바와 같이, "면역학적 방법"은, 측정에 사용될 때, 샘플에서 발견되는 다른 물질을 제외하고 표적 물질의 양/농도를 측정하기 위해 표적 물질에 특이적인 하나 이상의 항체를 사용하는 임의의 방법에 관계한다. 적합한 면역학적 방법은, 이로써 한정되는 것은 아니지만, 웨스턴 블롯, 면역침강법, 효소결합면역흡착제 검정법(ELISA), 표면 플라즈몬 공명, 방사면역측정법(RIA)을 포함한다. 바람직한 양태에서, 아밀로이드 베타 펩티드의 측정 또는 검출은 ELISA에 의해 수행된다.

당해 기술분야의 통상의 기술자는, 항체가 다른 물질로부터 샘플 중의 아밀로이드 베타 펩티드 종을 효과적으로 구별하는데 충분히 특이적인 경우, 어떠한 형태의 항체라도 본 발명에 따른 면역학적 검출 방법을 실시하는데 적합하다고 인식할 것이다.

본원에서 사용되는 용어 "ELISA"는 효소-결합된 면역 흡착제 분석법을 의미하며, 미지량의 표적 물질(아밀로이드 베타 펩티드)이 표면에 부착되고, 이어서 특이적 항체가 표면에서 세척되어 항원에 결합할 수 있는 분석법과 관련된다. 이 항체는 효소에 결합되고, 최종 단계에서 물질이 첨가되어 효소는 몇몇 검출가능한 시그널로 전환할 수 있다. 상이한 형태의 ELISA 분석법이 공지되어 있고, 본 발명의 방법에 사용될 수 있으며, 직접 ELISA, 샌드위치 ELISA, 경쟁적 ELISA 및 ELISA 역방법 & 장치(ELISA-R m&d)를 포함한다.

직접 ELISA는 아밀로이드 베타 펩티드를 포함하는 시험 샘플을 비-상호작용성 단백질 또는 시약(소 혈청 알부민, 카제인)의 농축액으로 사전 코팅된 고형 지지체과 접촉시켜 실시할 수 있다. 시험 샘플에 존재하는 아밀로이드 베타 펩티드가 지지체에 흡착되면, 아밀로이드 베타 펩티드에 특이적인 항체는 아밀로이드 베타 펩티드에 결합하기에 적합한 조건하에서 첨가된다. 이어서, 결합된 항체는 검출 태그 또는 기질 변형 효소에 결합된 제2 항체와 함께 검출된다. 이어서, 검출 태그 또는 기질에서 발생한 시그널은 지지체에 결합된 항체의 양에 비례하고, 또한 샘플에서 아밀로이드 베타 펩티드의 양과 직접적으로 연관성이 있다.

경쟁적 ELISA 분석법은, 미지량의 아밀로이드 베타 펩티드를 포함하는 시험 샘플을 상기 정의한 제1 항체와 접촉시키는 제1 단계를 포함한다. 항체-항원 복합체는 항원 코팅된 웰에 첨가된다. 임의의 비-특이적으로 결합된 복합체를 제거하기 위해 지지체가 세척되면, 제1 항체의 양은 검출가능한 잔기에 결합된 제2 항체로 검출된다. 이러한 형태의 분석법에서, 최초 항원 농도가 높을 수록, 최종 시그널은 약해진다. 다른 경쟁적 ELISA 분석법은 효소-결합된 항체가 아닌 효소-결합된 항원을 포함한다. 표지된 항원은 주요 항체 결합 부위에 대해 샘플 항원(비표지)과 경쟁한다. 이러한 형태의 분석법을 사용하여, 샘플 중의 항원의 농도는 웰에서 보유된 표지된 항원의 양과 반비례하고, 따라서 시그널이 더 약하다.

역 ELISA 방법 & 장치(ELISA-R m&d)는 4-12 돌출 오자이브(ogive)를 가진 면역 흡착 폴리스티렌 로드로 구성된 새로운 고형 상을 사용한다. 장치 전체는 수집된 샘플을 함유하는 시험관내에 도입되기에 적합하고, 후속 단계(세척, 접합체에서 배양 및 발색체에서 배양)는 시약으로 사전 충전된 표준 마이크로플레이트의 마이크로웰 내에서 오자이브를 침지시키고 밀봉하고 사용할 때까지 보관함으로써 용이하게 실시된다.

바람직한 양태에서, ELISA 분석법은 ELISA 샌드위치 분석법이다. ELISA 샌드위치 분석법은 지지체를 아밀로이드 베타 펩티드에 특이한 제1 항체로 코팅하고, 아밀로이드 베타 펩티드를 함유하는 샘플을 적용하여 아밀로이드 베타 펩티드가 제1 항체에 결합하게 하고, 아밀로이드 베타 펩티드에 특이한 제2 항체를 적용하는 것을 포함하고, 여기서 상기 제2 항체는 통상적으로 검출 태그 또는 기질-변형 효소에 결합된다. 태그 또는 전환된 기질에 의해 발생한 시그널은 샘플 중의 항원의 양에 비례한다.

측정되는 샘플 및 측정되는 화합물의 공지된 농도를 갖는 다수의 참조 샘플을 사용하는 상이한 단계의 방법을 수행하는 것이 바람직하다. Aβ17 펩티드에 대한 표준 곡선은 상기 언급된 파라미터의 농도를 측정하는 농도 증가를 사용하여 작성되어야 한다. 표준 곡선은 (i) 시그날이 표적 펩티드의 농도에 따라 선형으로 증가하는 농도 범위를 확립하고 (ii) 농도 값을 수득하기 위해 곡선 중의 시험 또는 표준 샘플로 수득된 시그날의 도입에 의해 시험 샘플 중의 펩티드의 농도를 측정할 이중 목적을 만족시킨다. 본 발명의 분석법의 고감도에 비추어, 시험 샘플의 바람직한 농도는, 예를 들면, 3.125; 6.25; 12.5; 25; 50; 100 및 200pg/mL이다. 표준 곡선의 수득에 사용된 샘플의 농도는 각 시험 기질에 따라 달라질 수 있음은 명백할 것이다. 그러나, 선형 범위의 분석의 측정은 통상의 방법에 의해 당해 기술분야의 기술자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.

용어 "변경"은 참조 값에 대하여 고려하의 파라미터 값의 통계학적으로 유의한 증가 또는 감소를 지칭한다.

본원에서 사용된 바와 같이, "통계학적으로 유의한"은 둘 이상의 결과, 종말점 또는 성과 사이에 작위적 연계가 있다는 확률, 즉 파라미터 값이 참조 값에 대하여 특정 환자 모집단과 관계가 있다는 어느 정도의 수학적 확신이 있다는 확률의 통계적 분석에 관련된다.

수치 변경의 통계적 유의성은 p-값을 사용하여 결정될 수 있다. 예를 들면, p-값을 사용할 때, 파라미터는, p-값이 0.1 미만, 바람직하게는 0.05 미만, 보다 바람직하게는 0.01 미만, 더욱 바람직하게는 0.005 미만, 가장 바람직하게는 0.001 미만일 때 유의한 변경을 나타내는 것으로 확인된다.

통상적으로, 고려하는 파라미터 값은 참조 값 이상의 값이, 참조 값과 비교하여, 적어도 1.1배, 1.5배, 5배, 10배, 20배, 30배, 40배, 50배, 60배, 70배, 80배, 90배, 100배 또는 심지어 그 이상인 경우에 "증가"한 것으로 지정할 수 있다. 반면, 파라미터 값이, 참조값과 비교하여, 적어도 0.9배, 0.75배, 0.2배, 0.1배, 0.05배, 0.025배, 0.02배, 0.01배, 0.005배 또는 심지어 그 이하인 경우에 "감소"한 것으로 간주할 수 있다. 특정 양태에서, 참조 값에 대한 파라미터 값 또는 계산된 파라미터 값의 변경은 증가이다.

본 발명의 추가의 양태는 다음과 같다:

[1] Aβ(1-17) 펩티드에 특이적으로 결합하는 항체.

[2] Aβ(1-15), Aβ(1-16), Aβ(1-38), Aβ(1-40), Aβ(1-42) 및 이들 중 하나 이상의 배합물로 이루어진 그룹으로부터 선택된 Aβ 펩티드에 대해 실질적인 가교-반응성을 나타내지 않는, 상기 [1]에 정의된 항체.

[3] 폴리클로날 항체인, 상기 [1] 또는 [2]에 정의된 항체.

[4] 상기 항체가 서열번호 1 또는 서열번호 2로 이루어진 그룹으로부터 선택된 Aβ 펩티드를 면역원으로 사용하여 수득된, 상기 [1] 내지 [3]에 정의된 항체.

[5] (i) 상기 [1] 내지 [3] 중의 어느 하나에 정의된 항체인 제1 항체,

(ii) 제1 항체에 의해 인식되는 영역과 상이한 Aβ(1-17) 펩티드의 영역을 인식하는 제2 항체를 포함하는, Aβ(1-17) 펩티드 검출용 키트.

[6] 제1 또는 제2 항체가 결합 쌍의 제1 구성원에 결합되는, 상기 [5]에 따르는 키트.

[7] 결합 쌍의 제2 구성원이 검출가능한 태그에 결합되는 상기 결합 쌍의 제2 구성원을 추가로 포함하는, 상기 [6]에 따르는 키트.

[8] 결합 쌍의 제2 구성원에 결합되는 검출가능한 태그가 효소 태그인 경우, 당해 키트가 상기 효소에 의해 검출가능한 생성물로 전환될 수 있는 기질을 추가로 포함하는, 상기 [7]에 정의된 키트.

[9] Aβ40 및/또는 Aβ42에 특이적으로 결합하는 항체 또는 항체 조합을 추가로 포함하는, 상기 [5] 내지 [8] 중의 어느 하나에 정의된 키트.

[10] 고형 지지체를 추가로 포함하는, 상기 [5] 내지 [9] 중의 어느 하나에 정의된 키트.

[11] 결합 쌍의 제1 구성원에 결합되지 않은 항체가 고형 지지체에 사전 결합되는, 상기 [10]에 정의된 키트.

[12] Aβ17, Aβ40 및/또는 Aβ42 펩티드를 함유하는 샘플을 추가로 포함하는, 상기 [5] 내지 [11] 중의 어느 하나에 정의된 키트.

[13] 하기 단계를 포함하는, 샘플에서 Aβ(1-17) 펩티드를 측정 또는 검출하는 방법:

(ii) 단계(i)에서 형성된 면역 복합체를 제2 항체와 접촉시키는 단계로, 상기 제2 항체는 상기 [1] 내지 [4] 중의 어느 하나에 정의된 바와 같고, 상기 제2 항체는 제1 항체와는 상이한 영역을 인식하고 결합 쌍의 제1 구성원에 결합되는 것인 단계,

(iii) 단계(ii)에서 형성된 복합체를 검출가능한 태그에 결합된 결합 쌍의 제2 구성원과 접촉시키는 단계, 및

[14] 생물학적 샘플이 혈액, 혈청, 혈장 및 CSF의 그룹으로부터 선택되는, 상기 [13] 내지 [17] 중의 어느 하나에 정의된 방법.

[15] 제1 항체가 모노클로날 항체인, 상기 [1] 내지 [12] 중의 어느 하나에 정의된 키트 또는 상기 [13] 또는 [14]에 정의된 방법.

[16] 모노클로날 항체가 6E10 항체인, 상기 [15]에 정의된 키트 또는 방법.

[17] 결합 쌍의 상기 제1 구성원이 비오틴이고, 결합 쌍의 제2 구성원이 아비딘, 스트렙트아비딘 또는 이의 기능적으로 동등한 변이체인, 상기 [1] 내지 [16] 중의 어느 하나에 정의된 키트 또는 방법.

[18] 검출가능한 태그가 형광 분자, 발광 분자 또는 효소인, 상기 [1] 내지 [17] 중의 어느 하나에 정의된 키트 또는 방법.

[19] 하기 단계를 포함하는, 대상체에서 신경퇴행성 질환을 모니터링하는 방법:

(a) 상기 대상체 샘플 중의 혈장 샘플에서 유리 Aβ17 펩티드의 수준 및 혈액 샘플에서 세포에 결합된 Aβ17 펩티드 수준을 제1 시점에서 상기 대상체의 샘플로부터 측정하는 단계;

(b) 상기 대상체 샘플 중의 혈장 샘플에서 유리 Aβ17 펩티드의 수준 및 혈액 샘플에서 세포에 결합된 Aβ17 펩티드 수준을 제2 시점에서 상기 대상체의 샘플로부터 측정하는 단계; 및

여기서 상기 비율이 제1 시점에 대하여 제2 시점에서 증가되는 경우, 이는 상기 제1 시점과 제2 시점 사이에 대상체에서 알츠하이머 질환의 악화를 나타낸다.

[20] 신경퇴행성 질환이 알츠하이머 질환인, 상기 [19]에 따르는 방법.

[21] Aβ17 펩티드 수준의 당해 수준의 측정이 ELISA에 의해 수행되는, 상기 [21]에 따르는 방법.

[22] Aβ17 펩티드 수준의 측정이 상기 [13] 내지 [18] 중의 어느 하나에 넝의된 방법을 사용하여 수행되는, 상기 [21]에 따르는 방법.

[23] 하기 단계를 포함하는, 대상체가 경도 알츠하이머 질환을 앓고 있는지를 측정하는 방법:

[24] 하기를 포함하는,대상체가 전구 알츠하이머 질환을 갖는 MCI를 앓고 있는지를 측정하는 방법:

(d) 혈액 샘플 중의 세포에 결합된 Aβ17 수준 및 혈액 샘플 중의 세포에 결합된 Aβ42 펩티드 수준 사이의 비율 값;

[25] 하기 단계를 포함하는, 전구 알츠하이머 질환을 갖는 MCI를 앓고 있는 대상체로부터 비-전구 알츠하이머 질환을 갖는 MCI를 앓고 있는 대상체를 구별하는 방법:

(c) 제1 파라미터가 상기 대상체의 혈장 샘플 중의 전체 Aβ17 펩티드 수준 및 혈액 샘플 중의 세포에 결합된 Aβ 펩티드 수준의 부가된 값에 상응하고, 제2 파라미터가 상기 대상체의 혈장 샘플 중의 전체 Aβ42 펩티드 수준 및 혈액 샘플 중의 세포에 결합된 Aβ42 펩티드 수준의 부가된 값에 상응하는, 2개 파라미터 사이의 비율 값;

여기서, 비-전구 알츠하이머 질환을 갖는 MCI를 앓고 있는 대상체의 참조 샘플의 값에 대하여 파라미터 (a) 값이 증가되고/되거나 파라미터 (b), (c), (d) 또는 (e) 중 하나 이상의 파라미터 값이 감소되는 경우, 당해 대상체는 전구 알츠하이머 질환을 갖는 MCI를 앓고 있다.

[26] 하기 단계를 포함하는, 경도 알츠하이머 질환을 앓고 있는 대상체로부터 비-전구 알츠하이머 질환을 갖는 MCI를 앓고 있는 대상체를 구별하는 방법:

[27] 하기 단계를 포함하는, 경도 알츠하이머 질환을 앓고 있는 대상체로부터 전구 알츠하이머 질환을 갖는 MCI를 앓고 있는 대상체를 구별하는 방법:

여기서, 전구 경도 인지 손상 대상체의 참조 샘플의 값에 대하여 하나 이상의 상기 파라미터 값이 증가되는 경우, 당해 대상체는 경도 알츠하이머 질환을 앓고 있다..

[28] 하나 이상의 Aβ17, Aβ40 및 Aβ42의 수준의 측정이 ELISA에 의해 측정되는, 상기 [23] 내지 [27] 중의 어느 하나에 따르는 방법.

하기 실시예는 설명으로서 제공되며, 본 발명의 범위를 한정하는 것으로 간주되지 않아야 한다.

실시예

실시예 1

항-Aβ7 항체의 발생

4마리 토끼를 Aβ(12-17)(서열번호 2)에 상응하는 펩티드 VHHQKL 및 Aβ(11-17)(서열번호 3)에 상응하는 펩티드 EVHHQKL로 면역화하고, 이들 중 둘은 제1 펩티드로, 두 마리의 추가 토끼를 제2 펩티드로 면역화했다. 두 펩티드는 N-말단에 접합을 위해 추가의 아미노산 시스테인을 함유한다.

접합에 사용된 담체는 키홀 림페트 헤모시아닌(KLH)이었다[참조: Pierce, ref. 77600]. 접합은 가교링커 NHS-PEG₄-말레이미드로 수행했다[참조: Pierce, ref. 22104]. 보조제로서, 3종류가 사용되었다: 프로인트 완전 보조제[참조: Sigma, ref. F5881], 프로인트 불완전 보조제[참조: Sigma, ref. F5506] 및 임제트 알룸[참조: Pierce, ref. 77161].

면역화 프로토콜은 다음과 같다:

- 4마리 토끼를 100㎍의 펩티드로 매주 면역화시켰다.

- 제1 투여량을 보조제로서 프로인트 완전 보조제를 사용하여 투여하고, 또 다른 투여량은 프로인트 불완전 보조제를 사용하고, 제3 투여량은 알룸을 사용하여 투여했다.

- 1차 3개 투여 후, 수득된 항체 역가는 너무 낮아서 정제할 수 없었다. 따라서, 투여량을 3개 추가 투여에서 보조제: 프로인트 불완전 보조제-알룸-프로인트 불완전 보조제를 교환시키면서 200㎍의 펩티드로 증가시켰다.

- 4마리의 토끼에 대해 수득된 항체 역가는 매우 높았고, 정제는 친화도 크로마토그래피(Aβ17 펩티드 사용)로 수행했다.

도트-블롯을 수행하여 항-Aβ17 항체의 특이성을 측정하였고, 여기서 기타 Aβ펩티드가 포함되었다(도 1). 항-Aβ17를 두 희석물(1:1000 및 1:2000)에 첨가하였고, 사용된 제2 항체는 염소 항-토끼-HRP 1:2000이었다. 500ng의 각 펩티드를 2.5㎕에 적재시켰다. 도트-블롯은 1분 및 3분 현시에서 SNAP 기술과 함께 ECL로 나타냈다. 상기 도면에 제시된 바와 같이, 항체는 Aβ17 펩티드에 매우 특이적이고, 이는 구체적으로 Aβ15, Aβ16, Aβ38, Aβ40 및 Aβ42를 인식하지 않는다.

실시예 2

샘플 중의 Aβ17 펩티드의 측정

(1) 질량 분석법에 의한 측정

시약

시그마(Sigma)(Steimheim, Germany)로부터의 포름산, 염화나트륨, α-시아노-4-하이드록시신남산(α-CHCA), 트리플루오로아세트산(TFA), DL-디티오트레이톨(DTT), 트리에탄올아민, 트리스 및 소 혈청 알부민(BSA)이었다. 아세토니트릴은카를로-에르바(Carlo-Erba)(Rodano, MI, Italy)로부터 구입했다. 디메틸 피멜이미데이트·2HCl(DMP)은 피어스(Pierce)(Rockford, IL, USA)로부터 입수했다. 트리신 샘플 완충제는 바이오-라드(Bio-Rad)(Hercules, CA, USA)로부터 구입했다.

면역침강법 ( IP ) 절차

IP-MALDI 절차를 개 샘플 분석에 절차를 적응시키기 위해 일부 변형과 함께 문헌[참조: Portelius et al. 2007 (J. Proteome. Res. 6 (11), 4433-4439)]에 기재된 바와 같이 수행했다. 제1 장소에서, 상이한 양의 Aβ 특이적 항체((각각, 아미노산 4-9 및 18-22 중의 Aβ 에피토프에 특이적인 6E10 및 4G8, Signet Laboratories, Inc., Dedham, MA, USA) 및 SAR2(항-Aβ40 카복시 말단 에피토프에 특이적, Araclon Biotech S.L., Zaragoza, Spain))를 사용하여 웨스턴-블롯팅에 의해 각 항체의 최적량을 측정했다. 최적화 절차는 상이한 단계를 포함했다. 각 항체를 제조업자의 설명서에 따라 50㎕ 다이나비드(Dynabeads) 단백질 G(Invitrogen Dynal AS, Oslo, Norway)에 개별적으로 첨가했다. 비드를 상이한 양의 항체로 배양하고, 세척한 다음, 비드를 DTT를 갖는 트리신 샘플 완충제 중에서 비등시켜 항체를 용출시켰다. 각 항체의 포화량은 웨스턴-블롯팅으로 측정했다. 또한, 항체에 의한 비드 및 샘플에 의한 복합체 비드-항체의 배양 시간(1시간 및 밤새) 및 온도(4℃, 실온 및 37℃)를 또한 최적화했다. 또 다른 최적화된 파라미터는 용출 조건(0.5, 2.5 및 5% 포름산 뿐만 아니라 다양한 비율의 유기 용매, 예를 들면, 아세토니트릴)이었다.

2개의 상이한 프로토콜을 이 연구 동안 적용했다. 첫번째 것은 기본적으로 최적화된 파라미터와 함께 제조업자의 지침을 기본으로 한다: Aβ 특이적 항체의 부분표본(4㎍의 6E10 또는 8㎍의 4G8 또는 6㎍의 SAR 2)을 회전 진탕기에서 실온에서 1시간 동안 50㎕의 다이나비드 단백질 G와 함께 배양했다. 그 후, 포스페이트 완충 식염수(PBS: 1mM NaH₂PO₄ H₂O, 5mM Na₂HPO₄·H₂O, 138mM NaCl)에 의한 3회 세척을 수행했다. 1mL의 CSF를 첨가하고, 회전 진탕기에서 실온에서 밤새 배양했다. CSF를 자석(DynaMag-2 또는 DynaMag-15, Invitrogen Dynal AS, Oslo, Norway)의 도움으로 배양 후 비드로부터 제거하고, 버렸다. 비드를 1mL 100mM 트리스 pH=6.8로 3회 세척하고, 최종적으로 용출을 5% 포름산 25㎕로 수행했다. 용출액을 열혼합기(Thermomixer)에서 실온에서 5분 동안 배양했다. 용출된 화합물을 ZipTip C₁₈ 팁(Millipore, Billerica, MA, USA)으로 탈염시켰다. ZipTip C₁₈ 프로토콜은 다수 단계로 이루어진다: 아세토니트릴에 의한 팁 용매화, 0.1%TFA에 의한 컨디셔닝(이 단계는 수회 반복), 샘플 적재(수회 상하 피펫팅으로), 0.1% TFA에 의한 세척 단계 및 3㎕의 α-CHCA(5mg/mL)에 의한 최종 용출.

제2 프로토콜에서, 시트레이트-포스페이트 완충제, pH=5.0(24.5mM 시트르산, 52mM Na₂HPO₄·2H₂O)을 세척 및 결합 단계용으로 PBS 대신 사용했다. 용출 전, 비드를 100mM 트리스 pH=6.8 대신 PBS로 세척했다. 이 제2 프로토콜은 보다 적은 배경 소음과 보다 강한 피크를 갖는 질량 스펙트럼을 생성하였고, 이는 나머지 실험에 사용되었다.

인간 샘플의 면역침강법을 위해, 50㎕의 다이나비드 양 항-마우스(Invitrogen Dynal AS, Oslo, Norway)를 사용했다. 비드를 PBS로 3회 세척하고, 최적량의 특이적 항체(8㎍의 6E10 또는 8㎍의 4G8)로 회전 진탕기에서 실온에서 1시간 동안 배양했다. 그 후, 상청액을 제거하고, 비드를 1mL의 0.2M 트리에탄올아민 pH=8.2로 세척했다. 가교결합 반응은 0.2M 트리에탄올아민 pH= 8.2에 1mL의 20mM DMP(아민 반응성 그룹을 갖는 동종이작용성 가교결합제;[Greg T Hermanson, 2010]) 첨가 후 발생했다. 비드 및 항체를 실온에서 30분 동안 배양한 후, 상청액을 버리고, 반응을 회전 진탕기에서 15분 동안 1mL의 50mM 트리스 pH=7.5를 첨가하여 중지시켰다. 가교결합된 비드를 0.1% BSA를 함유하는 1mL의 PBS로 3회 세척했다. 1mL의 풀링된 인간 CSF를 첨가하고, 실온에서 밤새 배양했다. 상청액을 버리고, 비드를 PBS로 수회 세척했다. Aβ 종을 25㎕의 5% 포름산으로 용출시켰다. 용출된 화합물을 상기한 동일 프로토콜을 사용하여 ZipTip C₁₈로 탈염시켰다.

MALDI - TOF 및 MALDI - TOF / TOF 질량 분석법( MS )

0.7㎕의 용출된 샘플을 완전한 증발 때까지 MALDI 표적 상에 직접 위치시켰다. 스펙트럼은 모두 200Hz 반복 속도에서 작동하는 다이오드-펌핑된 고체 상태 Nd:YAG 레이저(355㎚)가 장착된 ABI4800 MALDI-TOF/TOF 질량 분광계(AB/Sciex)로 획득했다. MS 스펙트럼을 수득하기 위해, 기구는 반사기 모드로 작동되었고, 실험은 모두 플러스 이온 모드로 수행되었다. 레이저 발사 후 400나노초에, 가속 전압 20kV를 인가했다. 이온을 2-단계 반사기로 재집중시키고, 최종적으로 제2 검출기로 검출했다. 공급원 1에 대한 미러 2의 전압차를 1.105의 비 값에서 일정하게 유지시켰다. MS/MS 획득을 위해, 공급원 1 전압을 8kV에서 유지시켰고, 레이저 값은 MS 실험에서보다 1000단위 더 높게 설정했다. 전구체 이온은 해상도 값 250(1/2 최대에서 전체 폭)에서 시간 이온 선별기에 의한 단편화용으로 선택했다. 선택된 이온을 감속 스택에서 충돌 챔버에 도착하기 전에 감속시켰고, 운동 에너지 1keV에서 공기와 충돌시 해리되었다(고-에너지 충돌 유도 해리). 단편 이온을 짧은 지연 시간 후 15kV에서 초 공급원에서 재가속시켰다. 준안정성 억제인자를 모든 MS/MS 실험에서 활성화시켜 나머지 전구체 이온 및 불필요한 준안정성 붕해 단편의 검출을 피했다. 데이터 탐색기 소프트웨어를 스펙트럼 처리를 위해 사용했다(스무딩 및/또는 노이즈 필터링). 단지 모노동위원소 m/z 비가 보고되었다. 질량 분광계는 제조업자에 의해 제공된 펩티드 혼합물로 외부적으로 보정되어 900-4000Da의 질량 범위를 커버했다. 필요할 경우, 기구는 인슐린으로 보정했다(M+H⁺= 5730.609 Da).

뇌척수액(CSF) 샘플 및 혈장 샘플에 대한 질량 분광법의 결과는 도 2에 제시하고, 여기서 Aβ17에 상응하는 피크는 화살표로 나타낸다.

(2) ELISA 에 의한 측정

시약 및 용액

- β-아밀로이드 1-17 표준, 인간 기원. 저장액 20ng/ml.

- 이의 표면에서 항체를 흡수하도록 최적화된 마이크로플레이트.

- 인간 Aβ 펩티드의 NH₂ 말단에 특이적인 포획 모노클로날 항체(6E10 항체).

- 구체적으로 아미노산 17에서 인간 Aβ 펩티드를 인식하는 접합된 검출 폴리클로날 항체-비오틴.

- 스트렙트아비딘-HRP 접합체의 증폭 용액.

- 안정화된 크로모겐 TMB.

- 코팅 완충제: 100mM Na₂CO₃/NaHCO₃ pH 9.6.

- 세척 완충제: 50mM Tris, 0.05% Tween20, 150mM NaCl, pH 8.0.

- 차단 완충제: 50mM tris, 0.2% Tween20, 0.5% BSA, pH 8.0.

- 방부제 용액: 20mg/ml 트레할로스, 50mM tris, pH 8.0.

- 항체 희석제: 50mM tris, 0.05% BSA, 0.5M NaCl, 0.05% Tween20, pH 8.0.

- PBST: 80mM Na₂HPO₄, 20mM NaH₂PO₄, 100mM NaCl, 0.5% Tween20, pH 7.5.

- 표준/샘플 희석제: 합성 차단 시약 PBST 중의 1:100.

- 정지 용액: 1N H₂SO₄.

방법

플레이트를 Aβ 아밀로이드 펩티드 중의 아미노산 1-17을 인식하는 6E10 모노클로날 포획 항체를 사용하여 코팅시켰다. 사용된 농도는 항체의 포화 농도에 따라 측정되어 이는 항원-항체 반응에서 제한 인자가 되지 않는다. 이 목적을 위해, 450nm에서 흡광도는 실온에서 1시간 진탕 및 반응의 정지가 후속되는 크로모겐 기질에 의한 배양 단계 동안 배양된 항-마우스 IgG HRP 접합 항체가 겸비된 웰에 흡수된 항체를 모니터링함으로써 각 웰 중의 항체 농도와 관련되었다. 시그날이 항체 농도로 증가하지 않는 농도를 선택했다.

포화 농도가 선택되면, 마이크로플레이트를 코팅 완충제 중의 100㎕의 포획 항체로 코팅시키고, 약 20시간 동안 4℃에서 밤새(ON) 배양했다.

이어서, 플레이트를 세척 완충제로 5회 세척하였고, 웰당 300㎕의 차단 완충제를 첨가했다. 플레이트를 실온에서 3시간 동안 배양했다. 이어서, 플레이트를 세척 완충제로 5회 세척하였고, 100㎕의 방부제 용액을 첨가했다. 플레이트를 트레할로즈의 백색 할로 특색이 나타날 때까지(실온에서 2-3일) 증발하도록 방치했다. 이렇게 처리된 플레이트는 알루미늄 호일로 싸서 4℃에서 유지시킬 수 있었고, 2년 동안 안정하다.

샘플 제조

희석되지 않거나 샘플/표준 희석액 중에서 1:2 내지 1:10 희석된 샘플을 사용했다. 혈장 샘플에 대해 희석 1:3이, 혈액 세포 샘플의 경우 1:5가 권장된다. 정확한 정량화를 보장하기 위해, 표준 곡선 및 블랭크가 샘플로서 동일한 희석액 또는 완충제에서 생성되어야만 한다.

인간 Aβ17(hAβ17)의 표준 곡선의 샘플은 6E10 mAb로 코팅되고 트레할로즈로 처리된 플레이트 상에서 펩티드 Aβ17의 저장액 200pg/ml로부터 제조했다. 이 용액으로부터, 샘플/표준 희석액 중의 일련의 희석액 1:2를 제조하여 200, 100, 50, 25, 12.5, 6.25 및 3.125pg/ml의 농도를 수득했다. 각 샘플 100㎕를 첨가하고, 4℃에서 밤새(또는 37℃에서 2시간 동안) 배양했다.

검출 단계

검출 항체는 아미노산 17에서 종결하는 인간 Aβ펩티드에 대한 폴리클로날 비오틴-접합된 항체이다. 비오틴에 대한 항체의 접합은 활성화 단계 및 암실에서 실온에서 밤새 배양 후 발생한다. 비오틴 과량은 추가 단계에서 불활성화된다. 항체 희석액으로 희석된 검출 항체를 첨가했다. 100㎕를 각 웰에 첨가한 다음, 실온에서 1시간 진탕 동안 배양했다. 이어서, HRP-결합된 스트렙트아비틴(SIGMA로부터)의 항체 희석액 중의 100㎕의 1/50 희석액을 각 웰에 첨가하였고 실온에서 1시간 진탕 동안 배양했다. 플레이트를 나타내기 위해, 100㎕의 발원성 기질 TMB(ZEU Inmunotec)을 사용했다. TMB를 첨가하고, 어둠 속에서 45분 동안 배양했다. 웰당 50㎕의 정지 용액을 첨가했다. 450㎚에서 흡광도는 플레이트 판독기 시너지 HT BioTek Instruments)로 판독했다.

Aβ17 정량화

결과는 면역검정 소프트웨어 패키지를 사용하여 계산할 수 있다. 곡선 적합화에 사용된 방법은 선형 회귀이고, Aβ17의 농도는 다음과 같이 계산했다:

(i) 다음과 같이 각 표준 희석액 및 샘플에 대한 평균 순수 OD를 계산한다:

평균 순수 OD(㎚)= 평균 결합 OD(㎚)- 평균 제로 OD(㎚).

(ii) 그래프 용지에, 표준 희석액의 평균 순수 OD(㎚)를 표준에 대한 Aβ의 농도에 대해 플롯팅한다. 표준 곡선을 작제하기 위해 이들 점을 통해 최선의 곡선을 그린다.

(iii) 미지의 샘플 및 대조군에서 Aβ 농도는 표준 곡선으로부터 내삽에 의해 측정될 수 있다.

(iv) 샘플에 대해 수득된 값들을 각 샘플의 희석 인자와 곱한다.

(v) 200pg/ml 표준보다 높은 신호를 생성하는 샘플을 추가로 희석시키고, 분석했다.

실시예 3

검출 및 정량 한계의 재현성 및 측정

면역분석의 재현성을 분석하기 위해, 플레이트내 변산도, 분석내 변산도, 혈장 샘플 중의 분석간 변산도 및 세포 샘플 중의 분석간 변산도를 측정했다.

플레이트내 변산도는 샘플, 표준 샘플 및 동일한 플레이트 중의 참조 샘플에서 웰 사이의 차이를 삼중으로 분석함으로써 계산했다. 분석내 재현성에 있어서, 동일한 분석법으로 11개의 상이한 플레이트에서 분석한 4개 참조 혈장 샘플에 대해 수득한 농도를 비교했다. 혈장 샘플 중의 분석간 변산도에 있어서, 2개의 상이한 및 독립적인 분석법으로 2개 혈장 샘플을 분석할 때에 수득한 농도 차이를 측정했다. 세포 샘플 중의 분석간 변산도는 8개 세포 대조군 샘플의 2개의 상이한 및 독립적인 측정 사이의 Aβ17 수준의 비교를 지칭한다.

수득된 결과는 표 1에 제시되어 있다:

[표 1]

검출 한계(DL) 및 정량 한계(QL)은 2개의 상이한 방법으로 계산했다:

(a) 방법 1:

DL = 농도_블랭크 + 3σ_블랭크

QL = 농도_블랭크 + 10σ_블랭크

(b) 방법 2:

DL = 3.3σ_블랭크/m

QL = 10σ_블랭크/m

여기서, σ_블랭크는 블랭크의 표준 편차이고, m은 보정선의 기울기이다.

두 방법을 사용하여 수득한 검출 한계(DL) 및 정량 한계(QL)은 표 2에 제시되어 있다:

[표 2]

실시예 4

AD 진단 및 Aβ17/Aβ40/Aβ42 수준 사이의 관계

Aβ17, Aβ40 및 Aβ42 수준은, 65세 이상의 건강한 대조군 대상체(19명 대상체)(CS>65 또는 HC>65)의 코호트, 경도 알츠하이머 질환(경도 AD)을 앓고 있는 대상체(17명 대상체)의 코호트, 전구 또는 유력한 경도 인지 손상(MCI)을 갖는 대상체(16명 대상체)의 코호트 및 비-전구 또는 잠재적 경도 인지 손상(MCI)을 갖는 대상체(16명 대상체)의 코호트로부터 혈장 샘플에서 실시예 1에 기재된 ELISA 샌드위치 분석을 사용하여 측정했다. 펩티드에 대해 수득한 농도(pg/mL)는 도 3A, 도 4A, 도 5A 및 도 6A의 표에 제시되어 있다.

경도 AD에서 혈장 중의 Aβ17, Aβ40 및 Aβ42 펩티드 수준(혈장 중의 전체 펩티드 + 세포에 결합된 펩티드)(PIB (17+40+42))은 경도 알츠하이머 질환 대상체에 대하여 건강한 대조군 대상체 및 MCI 잠재적 또는 비-전구 대상체에서 현저히 상이하다. 그러나, 마커 PIB(17+40+42)는 HC>65 대상체 및 유력한 MCI 사이에서 상이하지 않은 반면, PIB(40+42)는 고도로 유의적이다(도 3B).

그룹 사이를 구별할 수 있는, 측정되는 다른 관련 파라미터는 다음과 같다(도 3, 4, 5 및 6):

- 세포에 결합된 Aβ17, Aβ40 및 Aβ42 펩티드 수준(CB(17+40+42)). 도 3에 제시된 바와 같이, 세포에 결합된 이들 펩티드의 수준은 잠재적 MCI 및 건강한 대상체보다 유력한 MCI 및 경도 AD 대상체에서 더욱 높았다. 또한, 건강한 대상체와 경도 AD, 잠재적 MCI 및 유력한 MCI 사이 및 잠재적 MCI와 경도 AD 사이를 고도의 유의성으로 구별할 수 있다.

- 혈장 중의 전체 Aβ42 펩티드 수준 + 세포에 결합된 Aβ42 펩티드 수준(TP42+CB42). 도 3에 제시된 바와 같이, 이들 마커의 수준은 잠재적 MCI 및 건강한 대상체보다 잠재적 MCI 및 경도 AD 대상체에서 더욱 높았다. 또한, 건강한 대상체와 경도 AD 또는 유력한 MCI 사이 및 잠재적 MCI와 경도 AD 사이를 고도의 유의성으로 구별할 수 있다.

- 세포에 결합된 Aβ40 펩티드 수준에 부가된 혈장 중의 전체 Aβ40 펩티드 수준(TP40+CB40). 도 3에 제시된 바와 같이, 이들 마커의 수준은 잠재적 MCI 및 건강한 대상체보다 유력한 MCI 및 경도 AD 대상체에서 더욱 높았다. 또한, 잠재적 MCI와 경도 AD 사이를 고도의 유의성으로 구별할 수 있다.

- 혈장 중의 유리 Aβ17 펩티드 수준 및 혈장 중의 유리 Aβ40 펩티드 수준사이의 비율(FP 17/40)은 유력한 MCI와 경도 AD 사이를 구별할 수 있다(도 4).

- 세포에 결합된 Aβ17 펩티드 수준 및 세포에 결합된 Aβ42 펩티드 수준의 비율(CB17/42)은 건강한 대상체 또는 잠재적 MCI 대상체 및 유력한 MCI 사이를 구별할 수 있다(도 4).

- 혈장 중의 전체 Aβ17 펩티드 수준 + 세포에 결합된 Aβ17 펩티드 수준 및 세포에 결합된 Aβ42 펩티드 수준에 부가된 혈장 중의 전체 Aβ42 펩티드 수준 사이의 비율(TP17+CB17/TP42+CB42)은 건강한 대상체 또는 잠재적 MCI 대상체와 유력한 MCI를 구별할 수 있다(도 4).

- 혈장 중의 유리 Aβ17 펩티드 수준 및 혈장 중의 유리 Aβ40 및 Aβ42 펩티드 수준 사이의 비율(FP17/FP40+FP42)은 유력한 MCI와 경도 AD를 구별할 수 있다(도 5).

- 세포에 결합된 Aβ17 펩티드 수준 및 세포에 결합된 Aβ40 및 Aβ42 펩티드 수준 사이의 비율(CB17/CB40+CB42)은 건강한 대상체 또는 잠재적 MCI 대상체와 유력한 MCI 사이 및 건강한 대상체와 경도 AD를 구별할 수 있다(도 5).

- 혈장 중의 전체 Aβ17 펩티드 수준 + 세포에 결합된 Aβ17 펩티드 수준 및 혈장 중의 전체 Aβ40 및 Aβ42 펩티드 수준 사이의 비율(PIB(40+42))은 잠재적 MCI로부터 건강한 대상 또는 잠재적 MCI 대상체를 구별할 수 있다(도 5).

- 혈장 중의 유리 Aβ17 펩티드 수준 및 세포에 결합된 Aβ17 펩티드 수준 사이의 비율(FP17/CB17)은 경도 AD로부터 건강한 대상체 또는 잠재적 MCI 대상체를 구별하고 건강한 대상체와 잠재적 MCI를 구별할 수 있다(도 6). 모든 Aβ17 비율에서 통계학적 분석(U 만-휘트니 시험)은 혈장 중의 마커 유리 Aβ17 펩티드 수준/세포에 결합된 Aβ17 펩티드 수준(FP17/CB17)에서만 통계학적 유의차를 나타낸다(표 3 참조).

마찬가지로, 혈장 중의 유리 Aβ17 펩티드 수준 및 세포에 결합된 Aβ17 펩티드 수준 사이의 비율이 AD의 발달과 상관관계가 있다. 인지 손상이 더욱 진행되면, 혈장 중의 유리 Aβ17 펩티드 수준이 보다 높고, 따라서 혈장 중의 유리 Aβ17 펩티드 수준 및 세포에 결합된 Aβ17 펩티드 수준 사이의 비율(FP17/CB17)도 또한 더욱 높다.

[표 3]

<110> ARACLON BIOTECH, S.L. <120> ANTIBODY, KIT AND METHOD FOR DETERMINING AMYLOID PEPTIDE <130> IPA130825 <150> EP 11382107.8 <151> 2011-04-12 <160> 6 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 17 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val His His Gln Lys 1 5 10 15 Leu <210> 2 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Peptide used to prepare the anti-Abeta17-specific polyclonal Ab <400> 2 Val His His Gln Lys Leu 1 5 <210> 3 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Peptide used to prepare the anti-Abeta17-specific polyclonal Ab <400> 3 Glu Val His His Gln Lys Leu 1 5 <210> 4 <211> 770 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 4 Met Leu Pro Gly Leu Ala Leu Leu Leu Leu Ala Ala Trp Thr Ala Arg 1 5 10 15 Ala Leu Glu Val Pro Thr Asp Gly Asn Ala Gly Leu Leu Ala Glu Pro 20 25 30 Gln Ile Ala Met Phe Cys Gly Arg Leu Asn Met His Met Asn Val Gln 35 40 45 Asn Gly Lys Trp Asp Ser Asp Pro Ser Gly Thr Lys Thr Cys Ile Asp 50 55 60 Thr Lys Glu Gly Ile Leu Gln Tyr Cys Gln Glu Val Tyr Pro Glu Leu 65 70 75 80 Gln Ile Thr Asn Val Val Glu Ala Asn Gln Pro Val Thr Ile Gln Asn 85 90 95 Trp Cys Lys Arg Gly Arg Lys Gln Cys Lys Thr His Pro His Phe Val 100 105 110 Ile Pro Tyr Arg Cys Leu Val Gly Glu Phe Val Ser Asp Ala Leu Leu 115 120 125 Val Pro Asp Lys Cys Lys Phe Leu His Gln Glu Arg Met Asp Val Cys 130 135 140 Glu Thr His Leu His Trp His Thr Val Ala Lys Glu Thr Cys Ser Glu 145 150 155 160 Lys Ser Thr Asn Leu His Asp Tyr Gly Met Leu Leu Pro Cys Gly Ile 165 170 175 Asp Lys Phe Arg Gly Val Glu Phe Val Cys Cys Pro Leu Ala Glu Glu 180 185 190 Ser Asp Asn Val Asp Ser Ala Asp Ala Glu Glu Asp Asp Ser Asp Val 195 200 205 Trp Trp Gly Gly Ala Asp Thr Asp Tyr Ala Asp Gly Ser Glu Asp Lys 210 215 220 Val Val Glu Val Ala Glu Glu Glu Glu Val Ala Glu Val Glu Glu Glu 225 230 235 240 Glu Ala Asp Asp Asp Glu Asp Asp Glu Asp Gly Asp Glu Val Glu Glu 245 250 255 Glu Ala Glu Glu Pro Tyr Glu Glu Ala Thr Glu Arg Thr Thr Ser Ile 260 265 270 Ala Thr Thr Thr Thr Thr Thr Thr Glu Ser Val Glu Glu Val Val Arg 275 280 285 Glu Val Cys Ser Glu Gln Ala Glu Thr Gly Pro Cys Arg Ala Met Ile 290 295 300 Ser Arg Trp Tyr Phe Asp Val Thr Glu Gly Lys Cys Ala Pro Phe Phe 305 310 315 320 Tyr Gly Gly Cys Gly Gly Asn Arg Asn Asn Phe Asp Thr Glu Glu Tyr 325 330 335 Cys Met Ala Val Cys Gly Ser Ala Met Ser Gln Ser Leu Leu Lys Thr 340 345 350 Thr Gln Glu Pro Leu Ala Arg Asp Pro Val Lys Leu Pro Thr Thr Ala 355 360 365 Ala Ser Thr Pro Asp Ala Val Asp Lys Tyr Leu Glu Thr Pro Gly Asp 370 375 380 Glu Asn Glu His Ala His Phe Gln Lys Ala Lys Glu Arg Leu Glu Ala 385 390 395 400 Lys His Arg Glu Arg Met Ser Gln Val Met Arg Glu Trp Glu Glu Ala 405 410 415 Glu Arg Gln Ala Lys Asn Leu Pro Lys Ala Asp Lys Lys Ala Val Ile 420 425 430 Gln His Phe Gln Glu Lys Val Glu Ser Leu Glu Gln Glu Ala Ala Asn 435 440 445 Glu Arg Gln Gln Leu Val Glu Thr His Met Ala Arg Val Glu Ala Met 450 455 460 Leu Asn Asp Arg Arg Arg Leu Ala Leu Glu Asn Tyr Ile Thr Ala Leu 465 470 475 480 Gln Ala Val Pro Pro Arg Pro Arg His Val Phe Asn Met Leu Lys Lys 485 490 495 Tyr Val Arg Ala Glu Gln Lys Asp Arg Gln His Thr Leu Lys His Phe 500 505 510 Glu His Val Arg Met Val Asp Pro Lys Lys Ala Ala Gln Ile Arg Ser 515 520 525 Gln Val Met Thr His Leu Arg Val Ile Tyr Glu Arg Met Asn Gln Ser 530 535 540 Leu Ser Leu Leu Tyr Asn Val Pro Ala Val Ala Glu Glu Ile Gln Asp 545 550 555 560 Glu Val Asp Glu Leu Leu Gln Lys Glu Gln Asn Tyr Ser Asp Asp Val 565 570 575 Leu Ala Asn Met Ile Ser Glu Pro Arg Ile Ser Tyr Gly Asn Asp Ala 580 585 590 Leu Met Pro Ser Leu Thr Glu Thr Lys Thr Thr Val Glu Leu Leu Pro 595 600 605 Val Asn Gly Glu Phe Ser Leu Asp Asp Leu Gln Pro Trp His Ser Phe 610 615 620 Gly Ala Asp Ser Val Pro Ala Asn Thr Glu Asn Glu Val Glu Pro Val 625 630 635 640 Asp Ala Arg Pro Ala Ala Asp Arg Gly Leu Thr Thr Arg Pro Gly Ser 645 650 655 Gly Leu Thr Asn Ile Lys Thr Glu Glu Ile Ser Glu Val Lys Met Asp 660 665 670 Ala Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val His His Gln Lys Leu 675 680 685 Val Phe Phe Ala Glu Asp Val Gly Ser Asn Lys Gly Ala Ile Ile Gly 690 695 700 Leu Met Val Gly Gly Val Val Ile Ala Thr Val Ile Val Ile Thr Leu 705 710 715 720 Val Met Leu Lys Lys Lys Gln Tyr Thr Ser Ile His His Gly Val Val 725 730 735 Glu Val Asp Ala Ala Val Thr Pro Glu Glu Arg His Leu Ser Lys Met 740 745 750 Gln Gln Asn Gly Tyr Glu Asn Pro Thr Tyr Lys Phe Phe Glu Gln Met 755 760 765 Gln Asn 770 <210> 5 <211> 42 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 5 Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val His His Gln Lys 1 5 10 15 Leu Val Phe Phe Ala Glu Asp Val Gly Ser Asn Lys Gly Ala Ile Ile 20 25 30 Gly Leu Met Val Gly Gly Val Val Ile Ala 35 40 <210> 6 <211> 40 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 6 Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val His His Gln Lys 1 5 10 15 Leu Val Phe Phe Ala Glu Asp Val Gly Ser Asn Lys Gly Ala Ile Ile 20 25 30 Gly Leu Met Val Gly Gly Val Val 35 40

Claims

Aβ(1-17) 펩티드의 아미노산 12번 내지 17번에 상응하는 VHHQKL 펩티드 (서열번호: 2) 또는 Aβ(1-17) 펩티드의 아미노산 11번 내지 17번에 상응하는 EVHHQKL 펩티드 (서열번호: 3)를 인식하고,
Aβ(1-15), Aβ(1-16), Aβ(1-38), Aβ(1-40), Aβ(1-42) 및 이들 중 하나 이상의 배합물로 이루어진 그룹으로부터 선택된 Aβ 펩티드에 대해 가교-반응성을 나타내지 않는, Aβ(1-17) 펩티드에 특이적으로 결합하는 항체.
제1항에 있어서, 상기 항체는 VHHQKL 펩티드 (서열번호: 2) 또는 EVHHQKL 펩티드 (서열번호: 3)을 항원으로 사용하여 수득된 폴리클로날 항체인, 항체.
(i) 제1항 또는 제2항에 정의된 항체인 제1 항체,
(ii) 제1 항체에 의해 인식되는 영역과 상이한 Aβ(1-17) 펩티드의 영역을 인식하는 제2 항체를 포함하는, Aβ(1-17) 펩티드 검출용 키트.
제3항에 있어서, 제1 또는 제2 항체가 결합 쌍의 제1 구성원에 결합되고,
상기 결합 쌍은 하기 (a) 내지 (g)로부터 선택되는, 키트:
(a) 항체, 및 합텐 또는 항원의 결합 쌍;
(b) 비오틴 또는 비오틴 유사체, 및 아비딘 또는 스트렙트아비딘의 결합 쌍;
(c) 슈가 및 렉틴의 결합 쌍;
(d) 효소 및 보조인자의 결합 쌍;
(e) 단백질에 선택적으로 결합하는 이본쇄 올리고뉴클레오타이드 및 전사인자의 결합 쌍;
(f) 핵산 또는 핵산 유사체; 및 상기 핵산 또는 핵산 유사체에 상보적인 핵산의 결합 쌍; 및
(g) 수용체 및 리간드의 결합 쌍.
제4항에 있어서, 결합 쌍의 제2 구성원을 추가로 포함하고, 상기 결합 쌍의 제2 구성원이 검출가능한 태그에 결합되어 있는, 키트.
하기 단계를 포함하는, 샘플에서 Aβ(1-17) 펩티드를 측정 또는 검출하는 방법:
(i) 샘플에 존재하는 Aβ(1-17) 펩티드를 상기 펩티드와 특이적으로 결합하는 제1 항체로 포획하는 단계,
(ii) 단계 (i)에서 형성된 면역 복합체를 제2 항체와 접촉시키는 단계로, 상기 제2 항체는 제1항에 정의된 바와 같고, 상기 제2 항체는 제1 항체와는 상이한 영역을 인식하고 결합 쌍의 제1 구성원에 결합되는 것인 단계,
(iii) 단계 (ii)에서 형성된 복합체를 검출가능한 태그에 결합된 결합 쌍의 제2 구성원과 접촉시키는 단계, 및
(iv) 검출가능한 태그의 활성 또는 양을 검출 또는 측정하는 단계;
여기서, 상기 결합 쌍은 하기 (a) 내지 (g)에서 선택되는 것임:
(a) 항체, 및 합텐 또는 항원의 결합 쌍;
(b) 비오틴 또는 비오틴 유사체, 및 아비딘 또는 스트렙트아비딘의 결합 쌍;
(c) 슈가 및 렉틴의 결합 쌍;
(d) 효소 및 보조인자의 결합 쌍;
(e) 단백질에 선택적으로 결합하는 이본쇄 올리고뉴클레오타이드 및 전사인자의 결합 쌍;
(f) 핵산 또는 핵산 유사체; 및 상기 핵산 또는 핵산 유사체에 상보적인 핵산의 결합 쌍; 및
(g) 수용체 및 리간드의 결합 쌍.
제6항에 있어서, 샘플이 혈액, 혈청, 혈장 및 CSF의 그룹으로부터 선택되는, 방법.
하기 단계를 포함하는, 대상체에서 알츠하이머 질환을 모니터링하는 방법:
(a) 상기 대상체 샘플 중의 혈장 샘플에서 유리 Aβ17 펩티드의 수준 및 혈액 샘플에서 세포에 결합된 Aβ17 펩티드 수준을 제1 시점에서 상기 대상체로부터의 샘플에서 측정하는 단계;
(b) 상기 대상체 샘플 중의 혈장 샘플에서 유리 Aβ17 펩티드의 수준 및 혈액 샘플에서 세포에 결합된 Aβ17 펩티드 수준을 제2 시점에서 상기 대상체로부터의 샘플에서 측정하는 단계; 및
(c) 제1 시점과 제2 시점에서 혈장 샘플 중의 유리 Aβ17 펩티드의 수준 및 혈액 샘플 중의 세포에 결합된 Aβ17 펩티드의 수준의 비율을 비교하는 단계;
여기서, 상기 Aβ17 펩티드의 수준은 제1항의 항체를 사용하여 결정되며, 상기 비율이 제1 시점에 대하여 제2 시점에서 증가되는 경우, 이는 상기 제1 시점과 제2 시점 사이에서 대상체에서 알츠하이머 질환의 악화를 나타내는 것임.
제8항에 있어서, Aβ17 펩티드 수준의 측정이 제6항에 정의된 바와 같은 방법을 사용하여 수행되는, 방법.
하기 단계를 포함하는, 대상체가 경도 알츠하이머 질환을 앓고 있는지를 측정하는 방법:
(a) 상기 대상체 샘플의 혈액 샘플 중의 세포에 결합된 Aβ17, Aβ40 및 Aβ42 펩티드 수준의 부가된 값;
(b) 상기 대상체의 혈장 샘플 중의 Aβ17, Aβ40 및 Aβ42 전체 펩티드 수준 및 상기 대상체의 혈액 샘플 중의 세포에 결합된 Aβ17, Aβ40 및 Aβ42 펩티드 수준의 부가된 값; 및
(c) 상기 대상체의 혈액 샘플 중의 세포에 결합된 Aβ17 펩티드에 대한 상기 대상체의 혈장 샘플 중 유리 Aβ17의 수준의 비율 값으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 파라미터 값을 측정하는 단계;
여기서, 상기 Aβ17 펩티드의 수준은 제1항 또는 제2항의 항체를 사용하여 결정되며, 하나 이상의 상기 파라미터 값이 건강한 대상체의 참조 샘플 중의 상기 파라미터 값에 대하여 증가되는 경우, 당해 대상체는 경도 알츠하이머 질환을 앓고 있는 것임.
하기 단계를 포함하는, 대상체가 전구 알츠하이머 질환을 갖는 MCI를 앓고 있는지를 측정하는 방법:
(a) 상기 대상체의 혈액 샘플 중의 세포에 결합된 Aβ17 펩티드 수준에 대한 상기 대상체의 혈장 샘플 중의 유리 Aβ17 펩티드 수준의 비율 값;
(b) 혈액 샘플 중의 세포에 결합된 Aβ42 펩티드 수준에 대한 상기 대상체의 혈액 샘플 중의 세포에 결합된 Aβ17 수준의 비율 값;
(c) 제1 파라미터가 혈장 샘플 중의 전체 Aβ17 펩티드의 부가된 수준 및 혈액 샘플 중의 세포에 결합된 Aβ17 펩티드의 수준에 상응하고, 제2 파라미터가 혈장 샘플 중의 전체 Aβ42 펩티드의 부가된 수준 및 혈액 샘플 중의 세포에 결합된 Aβ42 펩티드의 수준에 상응하는, 제2 파라미터에 대한 제1 파라미터의 비율 값;
(d) 제1 파라미터가 혈액 샘플 중의 세포에 결합된 Aβ17 펩티드의 수준에 상응하고, 제2 파라미터가 혈액 샘플 중의 세포에 결합된 Aβ40 펩티드 수준 및 혈액 샘플 중의 세포에 결합된 Aβ42 펩티드 수준의 부가된 값에 상응하는, 제2 파라미터에 대한 제1 파라미터의 비율 값; 및
(e) 제1 파라미터가 상기 대상체의 혈장 샘플 중의 전체 Aβ17 펩티드 수준 및 혈액 샘플 중의 세포에 결합된 Aβ17 펩티드 수준의 부가된 값에 상응하고, 제2 파라미터가 혈장 샘플 중의 전체 Aβ40 및 Aβ42 펩티드 수준 및 혈액 샘플 중의 세포에 결합된 Aβ40 및 Aβ42 펩티드 수준의 부가된 값에 상응하는, 제2 파라미터에 대한 제1 파라미터의 비율 값으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 파라미터 값을 측정하는 단계;
여기서, 상기 Aβ17 펩티드의 수준은 제1항 또는 제2항의 항체를 사용하여 결정되며, 건강한 대상체의 참조 샘플 중의 값에 대하여 파라미터 (a) 값이 증가되거나, 파라미터 (b), (c), (d) 또는 (e) 중 하나 이상의 파라미터 값이 감소되거나, 파라미터 (a) 값이 증가되고 파라미터 (b), (c), (d) 또는 (e) 중 하나 이상의 파라미터 값이 감소되는 경우, 당해 대상체는 전구 알츠하이머 질환을 갖는 MCI를 앓고 있는 것임.
하기 단계를 포함하는, 대상체가 전구 알츠하이머 질환을 갖는 MCI를 앓고 있는지를 측정하는 방법:
(a) 상기 대상체의 혈액 샘플 중의 세포에 결합된 Aβ17, Aβ40 및 Aβ42 펩티드 수준의 부가된 값;
(b) 상기 대상체의 혈액 샘플 중의 세포에 결합된 Aβ42 펩티드 수준에 대한 상기 대상체의 혈액 샘플 중의 세포에 결합된 Aβ17 펩티드 수준의 비율 값;
(c) 제1 파라미터가 상기 대상체의 혈장 샘플 중의 전체 Aβ17 펩티드 수준 및 혈액 샘플 중의 세포에 결합된 Aβ17 펩티드 수준의 부가된 값에 상응하고, 제2 파라미터가 상기 대상체의 혈장 샘플 중의 전체 Aβ42 펩티드 수준 및 혈액 샘플 중의 세포에 결합된 Aβ42 펩티드 수준의 부가된 값에 상응하는, 제2 파라미터에 대한 제1 파라미터의 비율 값;
(d) 제1 파라미터가 혈액 샘플 중의 세포에 결합된 Aβ17 펩티드 수준에 상응하고, 제2 파라미터가 혈액 샘플 중의 세포에 결합된 Aβ40 및 Aβ42 펩티드 수준의 부가된 값에 상응하는, 제2 파라미터에 대한 제1 파라미터의 비율 값; 및
(e) 제1 파라미터가 상기 대상체의 혈장 샘플 중의 전체 Aβ17 펩티드 수준 및 혈액 샘플 중의 세포에 결합된 Aβ17 펩티드 수준의 부가된 값에 상응하고, 제2 파라미터가 혈장 샘플 중의 전체 Aβ40 및 Aβ42 펩티드 수준 및 혈액 샘플 중의 세포에 결합된 Aβ40 및 Aβ42 펩티드 수준의 부가된 값에 상응하는, 제2 파라미터에 대한 제1 파라미터의 비율 값으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 파라미터 값을 측정하는 단계;
여기서, 상기 Aβ17 펩티드의 수준은 제1항 또는 제2항의 항체를 사용하여 결정되며, 비-전구 알츠하이머 질환을 갖는 MCI를 앓고 있는 대상체의 참조 샘플의 값에 대하여 파라미터 (a) 값이 증가되거나, 파라미터 (b), (c), (d) 또는 (e) 중 하나 이상의 파라미터 값이 감소되거나, 파라미터 (a) 값이 증가되고 파라미터 (b), (c), (d) 또는 (e) 중 하나 이상의 파라미터 값이 감소되는 경우, 당해 대상체는 전구 알츠하이머 질환을 갖는 MCI를 앓고 있는 것임.
하기 단계를 포함하는, 대상체가 경도 알츠하이머 질환을 앓고 있는지를 측정하는 방법:
(a) 혈액 샘플 중의 세포에 결합된 Aβ17, Aβ40 및 Aβ42 펩티드 수준의 부가된 값;
(b) 혈장 샘플 중의 전체 Aβ17, Aβ40 및 Aβ42 펩티드 수준 및 혈액 샘플 중의 세포에 결합된 Aβ17, Aβ40 및 Aβ42 펩티드 수준의 부가된 값;
(c) 제1 파라미터가 혈액 샘플 중의 세포에 결합된 Aβ17 펩티드 수준에 상응하고, 제2 파라미터가 혈액 샘플 중의 세포에 결합된 Aβ40 및 Aβ42 펩티드 수준의 부가된 값에 상응하는, 제2 파라미터에 대한 제1 파라미터의 비율 값; 및
(d) 혈액 샘플 중의 세포에 결합된 Aβ17 펩티드 수준에 대한 혈장 샘플 중의 유리 Aβ17 펩티드 수준의 비율 값으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 파라미터 값을 측정하는 단계;
여기서, 상기 Aβ17 펩티드의 수준은 제1항 또는 제2항의 항체를 사용하여 결정되며, 비-전구 알츠하이머 질환을 갖는 MCI를 갖는 대상체의 참조 샘플 값에 대하여 파라미터 (a), (b), 또는 (d) 값이 증가되거나, 파라미터 (c) 값이 감소되거나, 파라미터 (a), (b), 또는 (d) 중 하나 이상의 값이 증가되고 파라미터 (c) 값이 감소되는 경우, 당해 대상체는 경도 알츠하이머 질환을 앓고 있는 것임.
하기의 단계를 포함하는, 대상체가 경도 알츠하이머 질환을 앓고 있는지를 측정하는 방법:
(a) 혈장 샘플 중의 유리 Aβ40 펩티드 수준에 대한 혈장 샘플 중의 유리 Aβ17 펩티드 수준의 비율 값; 및
(b) 제1 파라미터가 혈장 샘플 중의 유리 Aβ17 펩티드 수준에 상응하고, 제2 파라미터가 혈장 샘플 중의 유리 Aβ40 및 Aβ42 펩티드의 부가된 수준에 상응하는, 제2 파라미터에 대한 제1 파라미터의 비율로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 파라미터 값을 측정하는 단계;
여기서, 상기 Aβ17 펩티드의 수준은 제1항 또는 제2항의 항체를 사용하여 결정되며, 전구 경도 인지 손상 대상체의 참조 샘플의 값에 대하여 하나 이상의 상기 파라미터 값이 증가되는 경우, 당해 대상체는 경도 알츠하이머 질환을 앓고 있는 것임.