TWI549966B - 測定澱粉樣肽之抗體、套組及方法 - Google Patents

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Description

測定澱粉樣肽之抗體、套組及方法
本發明關於免疫檢測之領域，其允許藉由使用抗Aβ17抗體及使用該抗體之套組和方法以檢測Aβ17肽。本發明亦關於一種診斷或區別神經變性疾病之不同階段的方法。
阿茲海默(Alzheimer)氏症(AD)係中樞神經系統之進行性退化性疾病，其特徵為逐漸喪失記憶，接著喪失對肢體及身體功能之控制，最後導致死亡。到目前為止此為最常見之癡呆症原因，影響1至6%之65歲以上人口及10至20%之80歲以上人口。
AD之一些病理特性使其有別於其他類型之癡呆症，包括在病患腦中之神經元之間的細胞外空間進行性出現老年斑塊。該些斑塊具有澱粉樣沉積之中央核心，該核心主要係由被稱為澱粉樣β肽(Aβ)之40至42個胺基酸肽的纖維形成，該核心外圍係退化性神經炎及膠質細胞。此肽來自前體蛋白質β澱粉樣前體蛋白質(βAPP)之蛋白水解過程。
美國國家神經溝通疾病及中風協會(NINCDS)和阿茲海默氏症及相關疾病協會(ADRDA)於1984年建立最常被使用之NINCDS-ADRDA的阿茲海默氏症診斷標準。根據NINCDS/ADRDA，這些標準如下：
‧確定為阿茲海默氏症：病患符合可能為阿茲海默氏症之標準及具有經由屍體解剖或活體檢查之AD的組織病理學證據。
‧疑似為阿茲海默氏症或前驅性阿茲海默氏症：已經由臨床及神經心理學檢查確立為癡呆症。認知障礙亦必須為進行性且存在於二或多個認知領域。該些障礙之發病年齡介於40至90歲，最後必須沒有其他能產生癡呆症候群之疾病。
‧可能為阿茲海默氏症或非前驅性阿茲海默氏症：具有非典型發病、表現或進展且無已知病因之癡呆症症候群，但不具有能產生被認為是該癡呆症症候群之起源的癡呆症之共患疾病。
‧可能不是阿茲海默氏症：病患突然出現癡呆症症候群，並有局部性神經徵侯，或在該疾病之早期出現痙攣發作或步伐異常。
輕微認知障礙(MCI，亦稱為初期癡呆症或獨立性記憶障礙)之診斷係指該個體具有不符合彼之年齡及教育程度所預期之認知障礙，但該認知障礙不顯著影響該個體之日常活動(Petersen RC et al.(1999)Arch.Neurol.56(3)：303-8)。輕微認知障礙被認為是正常老化與癡呆症之交界或過渡期。雖然MCI可呈現多種症狀，當失憶係主要症狀時被稱為「失憶型MCI」，經常被認為是阿茲海默氏症之危險因子(Grundman M et al.(2004).Arch.Neurol.61(1)：59-66)。
研究顯示這些個體往往以每年大約10%至15%之速率進展成疑似為阿茲海默氏症或前驅性阿茲海默氏症(Grundman M et al，同上)。另外，當個體主要出現失憶以外之認知障礙時，其被稱為非失憶型單一類或多樣類MCI，一般認為這些個體比較容易轉變成其他癡呆症(Tabert MH et al.(2006).Arch.Gen.Psychiatry 63(8)：916-24)。
MCI之診斷需要周延之臨床判斷，因此完整之臨床評估最好包括臨床觀察、神經影像學、血檢及神經心理學檢查以排除其他鑑別診斷。類似評估通常也用於診斷阿茲海默氏症。符合下列條件者被診斷為MCI(Morris JC et al.(200l).Arch.Neurol.58(3)：397-405)：
- 記憶障礙之證據
- 保留一般認知能力及功能
- 無經診斷之癡呆症
過去十年間，多項研究嘗試利用血漿、血清或循環細胞以識別週邊標誌。特別是，由於澱粉樣斑塊係阿茲海默氏症神經病理學之確診特徵，且Aβ可於血漿中檢測，因此Aβ係引人注意之阿茲海默氏症的候選生物標誌。
在臨床上，AD之診斷係根據以出現典型臨床特徵為基礎之臨床準則，並利用神經影像技術及血液分析排除其他類型之癡呆症。利用這些標準，診斷可靠性係可接受的，雖然根據腦部屍檢之研究顯示10至20%之經診斷為AD之病患罹患不同疾病。另外，目前之診斷方法僅能在該神 經變性過程之非常晚期進行，此時病患已呈現嚴重癡呆症，腦部受損非常嚴重，因此治療選擇非常有限。確診需要死後腦組織之病理學檢查。
由於Aβ聚積於AD病患之腦部且為AD致病機轉之中心要件，此蛋白質被認為是最適合之候選AD生物標記。然而，使用Aβ作為AD血漿生物標記之問題在於該Aβ肽(Aβ(1-40)及Aβ(1-42))於血清中之濃度極低，因此沒有具有足夠敏感性之測試得以可靠地檢測該肽。
許多不同測試已被用於測定生物性樣本中之β澱粉樣肽(見例如下列文獻描述之方法：Scheuner et al(Nature Med.,1996,2：864-870)、Tamaoka A et al.(J Neurol Sci.,1996,141,65-68)、Suzuki,N.et al.(Science,1994,264：1336-1340)、WO200722015、Vanderstichele H et al.(Amyloid,2000,7,245-258)、Fukomoto y col.(Arch.Neurol.2003,60,958-964)、Mehta et al.(Arch.Neurol.57,2000,100-105)、Mayeux,R.et al.(Ann Neurol.1999,46,412-416)、Lanz,T.A and Schacthter,J.B.(J.Neuroscience Methods,2006,157：71-81)、WO200750359、WO0162801、WO0315617、WO0246237、WO0413172)。然而，所有目前已知之ELISA基底試驗皆具有較低之檢測極限，其檢測範圍最佳無法達個位數之pg/mL，但已足夠檢測腦脊液之Aβ40及Aβ42，以及家族性AD病患之血漿Aβ40及Aβ42，但不適用於檢測散發性AD病患之血漿Aβ42，因為該類病患之血漿Aβ42濃度低很多。
到目前為止，唯一顯示低於個位數pg/mL之Aβ肽檢測極限之測試係該些於WO200646644及WO2009015696中描述之測試。
WO200646644描述電化學發光(ECL)三明治式檢測，其中單株抗體21F12(其辨識Aβ42之胺基酸33-42)係與磁珠偶合，彼等接著被用於捕捉含有Aβ42之樣本中之Aβ42肽，並進一步與和釕複合體偶合之3D6單株抗體接觸。接著藉由檢測釕複合體在受到電能激發時所發射之光以得知該經結合之3D6抗體之量。利用此方法，發明人能檢測低至0.5 pg/mL之Aβ42標準物。然而，當使用相同方法以比較AD病患與健康對照者之血漿樣本內Aβ42時，兩組病患之間並未觀察到顯著差異，此導致發明人認為降解使血清內完整Aβ42之量變非常低之結論，因此轉而進行利用21F12 mAb之競爭性ELISA測定，其提供ng/mL範圍之較低敏感性。
WO2009015696描述高敏感性ELISA三明治式測試，其中該檢測抗體係與對該抗體具特異性之經生物素標記之試劑接觸。該試劑係與經過氧化酶偶合之鏈黴抗生物素蛋白接觸。接著藉由使用TMB或QuantaBlue螢光之比色計檢測過氧化酶之活性。
WO2006053251描述一種用於測定樣本中β澱粉樣肽之方法，該方法包含使樣本與變性劑接觸、自該樣本-變性劑之混合物中萃取肽庫、自該庫分離β澱粉樣肽及測定β澱粉樣肽之量。此方法在測定前需要分離肽之步驟，導 致增加之處理時間及增加之成本。
現有技術診斷AD之方法係藉由檢測存在於病人腦部或腦脊液中之生物標記之量。不同生物標記已被特徵化，彼等之測定係利用CSF進行。CSF直接反應中樞神經系統之細胞外空間之組成，因此提供較高濃度之生物標記。然而，CSF僅能藉由腰椎穿刺技術取得，腰椎穿刺並非癡呆症患者容易接受之例行診斷技術，更難在有記憶障礙病患身上施行。因此，需要能以非侵入性技術自身體取得之樣本中檢測之AD生物標記。
在先前技術中描述且可於血漿中檢測之適當AD生物標記包括：(i)源自澱粉樣斑塊之標記、(ii)抗Aβ或βAPP之自體抗體、(iii)發炎標記諸如IL-6、彼之受體或gp130、C反應性蛋白或氧化壓力(前列腺素異構物)、(iv)脂質代謝標記(apoE、氧基固醇)及(v)血管疾病標記(同半胱胺酸、脂蛋白b Clq)(Scheuner D et al.(1996)Nature Med 2,864-870)。
然而，由於Aβ聚積於AD病患之腦部且為AD致病機轉之中心要件，此蛋白質被認為是最適合之候選AD生物標記。然而，使用Aβ作為AD血漿生物標記之問題在於該Aβ肽(Aβ(1-40)及Aβ(1-42))於血清中之濃度極低，因此沒有具有足夠敏感性之測試得以可靠地檢測該肽。
另外，有些抗體已被描述於檢測Aβ肽及用於免疫測定。舉例來說，單株抗Aβ(1-17)(6E10)係以該Aβ肽之N端區Aβ(1-17)肽為目標產製之抗體(Kim KS,et al. Neurosci.Res.Comm.7；1988)，其辨識包括該區之Aβ肽，或以Aβ(1-28)肽為目標產製之單株抗體(皮爾斯(Pierce)公司)。
然而，該領域仍有改善檢測Aβ衍生性肽之免疫測試及套組之需求，以期克服該領域已知方法及套組之問題，特別是具有足夠之靈敏性以可靠地檢測散發性AD病患之血漿之Aβ肽。亦需要識別可用於AD早期診斷之具敏感性及特異性之生物標記，該生物標記能區別老化導致之認知障礙與該些和AD過程之早期症狀有關之認知障礙，同時區別因為AD以及因為其他退化狀況所致之變化。根據Growdon et al.(Neurobiol.Aging,1998,19：109-116)，理想之AD標記應符合下列條件：
- 應檢測該神經病理學之主要特徵
- 應於經神經病理學確診之該疾病病例中驗證
- 應顯示至少80%之診斷AD之敏感性
- 應顯示至少80%之鑑別診斷AD與其他類型癡呆症之特異性，及- 應具有可靠、可再現、非侵入性、易於操作及不貴之特性。
在一態樣中，本發明關於與Aβ(1-17)肽特異性結合之抗體。
在第二態樣中，本發明關於一種檢測Aβ(1-17)肽之套 組，該套組包含：(i)第一抗體，其係如申請專利範圍第1至3項中任一項之抗體，及(ii)第二抗體，其辨識該Aβ(1-17)肽之與該第一抗體所辨識之區域不同之區域。
在第三態樣中，本發明關於一種測定或檢測樣本中Aβ(1-17)肽之方法，該方法包含下列步驟：(i)利用第一抗體捕捉存在於樣本中之Aβ(1-17)肽，該第一抗體與該肽特異性結合，(ii)使步驟(i)形成之免疫複合體與第二抗體接觸，其中該第二抗體係如申請專利範圍第1至4項中任一者所定義者，其中該第二抗體辨識與該第一抗體不同之區域且與結合對之第一成員偶合，(iii)使步驟(ii)形成之複合體與結合對之第二成員接觸，該結合對之第二成員係與可檢測之標籤偶合，及(iv)檢測或測定該可檢測之標籤的活性或量。
在另一態樣中，本發明關於一種監測個體之神經變性疾病之方法，該方法包含：(a)在第一時間點測定該個體之血漿樣本內游離Aβ17肽量及該個體之血液樣本內與細胞結合之Aβ17肽量，(b)在第二時間點測定該個體之血漿樣本內游離Aβ17肽量及該個體之血液樣本內與細胞結合之Aβ17肽量，及(c)比較該第一及第二時間點之血漿樣本內游離 Aβ17肽量與血液樣本內與細胞結合之Aβ17肽量之比率，其中若第二時間點之該比率相較於第一時間點者增加，表示該個體之阿茲海默(Alzheimer)氏症在該第一與該第二時間點之間惡化。
在另一態樣中，本發明關於一種測定個體是否罹患輕微阿茲海默氏症之方法，該方法包含測定選自下列之一或多項參數之值：(a)該個體之血液樣本內與細胞結合之Aβ17、Aβ40及Aβ42肽量的相加值，(b)該個體之血漿樣本內Aβ17、Aβ40及Aβ42肽總量及該個體之血液樣本內與細胞結合之Aβ17、Aβ40及Aβ42肽量的相加值，(c)該個體之血漿樣本內Aβ42肽總量及該個體之血液樣本內與細胞結合之Aβ42肽量的相加值，(d)該個體之血漿樣本內Aβ40及Aβ42肽總量及該個體之血液樣本內與細胞結合之Aβ40及Aβ42肽量的相加值，及(e)該個體之血漿樣本內游離Aβ17肽量與該個體之血液樣本內與細胞結合之Aβ17肽量的比值，其中若該等參數之一或多者之值相較於健康個體之參考樣本的該等參數值增加，則該個體罹患輕微阿茲海默氏症。
在另一態樣中，本發明關於一種測定個體是否罹患伴隨前驅性阿茲海默氏症之輕微認知障礙(MCI)之方法， 該方法包含測定選自下列之一或多項參數之值：(a)該個體之血漿樣本內Aβ42肽總量及該個體之血液樣本內與細胞結合之Aβ42肽量的相加值，(b)該個體之血漿樣本內Aβ40及Aβ42肽總量及該個體之血液樣本內與細胞結合之Aβ40及Aβ42肽量的相加值，(c)該個體之血漿樣本內游離Aβ17肽量與該個體之血液樣本內與細胞結合之Aβ17肽量的比值，(d)血液樣本內與細胞結合之Aβ17肽量與血液樣本內與細胞結合之Aβ42肽量的比值，(e)二參數之比值，其中第一參數對應血漿樣本內Aβ17肽總量和血液樣本內與細胞結合之Aβ17肽量的相加量，且第二參數對應血漿樣本內Aβ42肽總量和血液樣本內與細胞結合之Aβ42肽量的相加量，(f)二參數之比值，其中第一參數對應血液樣本內與細胞結合之Aβ17肽量，且第二參數對應血液樣本內與細胞結合之Aβ40肽量和血液樣本內與細胞結合之Aβ42肽量的相加量，及(g)二參數之比值，其中第一參數對應該個體之血漿樣本內Aβ17肽總量和血液樣本內與細胞結合之Aβ17肽量的相加量，且第二參數對應血漿樣本內Aβ40及Aβ42肽總量和血液樣本內與細胞結合之Aβ40及Aβ42肽量的相加量，其中若參數(a)、(b)或(c)之一或多者之值相 較於健康個體之參考樣本之值增加，及/或參數(d)、(e)、(f)或(g)之一或多者之值相較於健康個體之參考樣本之值減少，該個體罹患伴隨前驅性阿茲海默氏症之MCI。
在另一態樣中，本發明關於一種測定個體是否罹患伴隨前驅性阿茲海默氏症之輕微認知障礙(MCI)之方法，該方法包含測定選自下列之一或多項參數之值：(a)該個體之血液樣本內與細胞結合之Aβ17、Aβ40及Aβ42肽量的相加值，(b)該個體之血液樣本內與細胞結合之Aβ17肽量與該個體之血液樣本內與細胞結合之Aβ42肽量的比值，(c)二參數之比值，其中第一參數對應該個體之血漿樣本內Aβ17肽總量和血液樣本內與細胞結合之Aβ17肽量的相加值，且第二參數對應該個體之血漿樣本內Aβ42肽總量和血液樣本內與細胞結合之Aβ42肽量的相加值，(d)二參數之比值，其中第一參數對應血液樣本內與細胞結合之Aβ17肽量，且第二參數對應血液樣本內與細胞結合之Aβ40和Aβ42肽量的相加值，及(e)二參數之比值，其中第一參數對應該個體之血漿樣本內Aβ17肽總量和血液樣本內與細胞結合之Aβ17肽量的相加值，且第二參數對應血漿樣本內Aβ40及Aβ42肽總量和血液樣本內與細胞結合之Aβ40及Aβ42肽量的相加值， 其中若(a)之值相較於罹患伴隨非前驅性阿茲海默氏症之MCI之個體的參考樣本之值增加及/或該等參數(b)、(c)、(d)或(e)之一或多者之值相較於罹患伴隨非前驅性阿茲海默氏症之MCI之個體的參考樣本之值減少，該個體罹患伴隨前驅性阿茲海默氏症之MCI。
在另一態樣中，本發明關於一種測定個體是否罹患輕微阿茲海默氏症之方法，該方法包含測定選自下列之一或多項參數之值：(a)血液樣本內與細胞結合之Aβ17、Aβ40及Aβ42肽量的相加值，(b)血漿樣本內Aβ17、Aβ40及Aβ42肽總量和血液樣本內與細胞結合之Aβ17、Aβ40及Aβ42肽量的相加值，(c)血漿樣本內Aβ42肽總量和血液樣本內與細胞結合之Aβ42肽量的相加值，(d)血漿樣本內Aβ40及Aβ42肽總量和血液樣本內與細胞結合之Aβ40及Aβ42肽量的相加值，(e)血漿樣本內Aβ40肽總量和血液樣本內與細胞結合之Aβ40肽量的相加值，(f)二參數之比值，其中第一參數對應血液樣本內與細胞結合之Aβ17肽量，且第二參數對應血液樣本內與細胞結合之Aβ40和Aβ42肽量的相加值，及(g)血漿樣本內游離Aβ17肽量與血液樣本內與細胞結合之Aβ17肽量的比值，其中若該等參數之一或多者之值相較於罹患伴隨非前 驅性阿茲海默氏症之MCI之個體之參考樣本的該等參數值增加，則該個體罹患輕微阿茲海默氏症。
在另一態樣中，本發明關於一種測定個體是否罹患輕微阿茲海默氏症之方法，該方法包含測定選自下列之一或多項參數之值：(a)血漿樣本內游離Aβ17肽量與血漿樣本內游離Aβ40肽量的比值，或(b)二參數之比值，其中第一參數對應血漿樣本內游離Aβ17肽量，且第二參數對應血漿樣本內游離Aβ40和Aβ42肽量的相加值，其中若該等參數之一或多者之值相較於前驅性輕微認知障礙個體之參考樣本的該等參數值增加，則該個體罹患輕微阿茲海默氏症。
本發明之詳細說明
本發明之作者產製一種對Aβ17肽具有高度特異性之抗體，該抗體無法辨識其他Aβ肽。舉例來說，圖1顯示該抗體以特定方式辨識Aβ17，而不對其他Aβ肽諸如Aβ15、Aβ16、Aβ38、Aβ40或Aβ42顯示任何實質交叉反應性。他們也設計一種用於檢測該Aβ17肽之套組，得以可靠地定量任何個體之任何樣本中之該分子，特別是疑似罹患AD個體之血漿之該分子。同樣地，作者顯示藉由測量不同參數之量有可能區別不同之個體群：健康、前驅性AD、非前驅性AD輕微認知障礙及輕微AD個體。
本發明之抗體
在第一態樣中，本發明關於一種抗體(以下稱為本發明之抗體)，該抗體與Aβ(1-17)肽(SEQ ID NO：1)特異性結合。
此處所使用之用語「特異性結合」係指抗體與該Aβ17肽結合而不與其他Aβ肽產生任何實質交叉反應。在特定實施態樣中，對該Aβ17肽之特異性係高於50%、高於60%、高於70%、高於80%或高於90%。更佳地，該抗體對Aβ17肽之特異性係高於95%。如圖1所示，本發明之作者檢測該抗Aβ17抗體之特異性，結果顯示該抗體對Aβ17肽具有高度特異性，且不顯示對其他Aβ肽(Aβ15、Aβ16、Aβ38、Aβ40及Aβ42)之實質交叉反應性。因此，在特定實施態樣中，本發明之抗體不顯示對於選自Aβ15、Aβ16、Aβ38、Aβ40、Aβ42之Aβ肽及彼等之一或多者之組合之實質交叉反應性。
本發明對抗體類型並無實際限制，只要該抗體包含至少一個對Aβ17具特異性之抗原結合部位。因此，適當之抗體分子包括：
- 「完整」抗體，其包含抗原結合可變區以及輕鏈恆定區(CL)及重鏈恆定區CH1、CH2及CH3。
- 「Fab」片段，其係由木瓜酶消化完整抗體得到，包含單一抗原結合部位及CL和CH1區。
- 「F(ab’)2」片段，其係由胃蛋白酶消化完整抗體得到 ，包含二個抗原結合部位。
- 「Fab’」片段，其包含輕鏈之恆定區及重鏈之第一恆定區(CH1)，且僅具有一個抗原結合部位。Fab’片段與Fab片段之不同處在於彼之重鏈CH1結構域的羧基端多增加數個殘基，包括一或多個來自抗體絞鏈區之半胱胺酸。
- 「Fv」係包含完整抗原辨識及抗原結合部位之最小抗體片段。此區係由一個重鏈可變區及一個輕鏈可變區以緊密、非共價連接所形成之二聚體組成。在這種配置下，各可變區之三個CDR交互作用以定義在VH-VL二聚體之表面上的抗原結合部位。這六個超變異區集體賦予抗原結合特異性給該抗體。然而，即使單一可變區(或僅包含3個具抗原專一性之超變異區的半個Fv)亦具有辨識及結合抗原之能力，只是親和性相較於完整結合部位為低。
- 單鏈FV或「scFv」抗體片段包含抗體之VL及VH結構域，其中這些結構域係存在於單一多肽鏈。較佳地，該VL及VH區係藉由多肽連接子連接，以允許該scFv形成所欲之抗原結合結構。
- 「雙價抗體」包含重鏈可變區(VH)與輕鏈可變區(VL)藉由肽連接子連接在同一條多肽鏈上(VH-VL)，該肽連接子過短因此不允許該相同鏈之二個結構域之間形成配對。此迫使彼等與另一鏈之互補結構域配對，促使組裝成為具有二個功能性抗原結合 部位之二聚分子。
- 「雙特異性抗體」(BAb)係單一、雙價抗體(或彼等之免疫治療有效片段)，其具有二個不同特異性之抗原結合部位。該二個抗原部位可能經該領域已知之化學或基因工程方法加以偶合。
所有這些抗體片段可利用該領域習知之技術經進一步修飾，例如單獨或組合使用該領域已知之胺基酸刪除、插入、取代、添加及/或重組、及/或任何其他修飾(例如轉譯後修飾及化學修飾，諸如糖基化及磷酸化)。導入該等修飾至免疫球蛋白鏈之胺基酸序列的DNA序列中之方法係該領域之技藝人士所廣為周知，見例如Sambrook et al.；Molecular Cloning：A Laboratory Manual；Cold Spring Harbor Laboratory Press,2nd edition 1989 and 3rd edition 2001。
適用於本發明之抗體包括多株及單株抗體兩者。在產製多株抗體方面，不同宿主包括山羊、兔、大鼠、小鼠、綿羊、犬、駱駝、單峰駱駝、駱馬、人、鳥及其他宿主可藉由注射對應具有免疫原性之Aβ17之片段的肽加以免疫化。根據宿主物種，可使用不同佐劑以增加免疫反應。該等佐劑包括但不限於弗氏(Freund’s)佐劑、礦物膠諸如氫氧化鋁及表面活性物質諸如溶脂酸卵磷脂、聚陰離子、肽、油乳液、KLH及二硝基苯酚。在用於人之佐劑當中，BCG(卡介苗)及短棒狀桿菌(Corynebacterium parvum)係特別較佳。在較佳之實施態樣中，用於產製本發明之 抗體的佐劑係完全弗氏佐劑、不完全弗氏佐劑、及Imject明礬佐劑。
可將抗原與對將免疫化之物種具免疫原性之蛋白質共軛。可用於與肽共軛之蛋白質係(不限於)鑰孔狀帽貝血藍素(KLH)、藍載體蛋白(自鮑貝(Concholepas concholepas)分離之血藍素)、牛甲狀腺球蛋白、或大豆胰蛋白酶抑制劑，使用雙官能劑或衍生劑例如順丁烯二醯亞胺基苯甲醯基磺基琥珀醯亞胺酯(經由半胱胺酸殘基共軛)、N-羥基琥珀醯亞胺(經由離胺酸殘基)、戊二醛、琥珀酸酐或SOCl2。在較佳之實施態樣中，用於共軛之蛋白質係KLH。在較佳之實施態樣中，該肽與KLH之間的共軛係經由交聯劑NHS-PEG4-順丁烯二醯亞胺進行，且該肽在N端具有半胱胺酸以實施該肽與KLH之共軛。
在產製單株抗體方面，習知技術可被利用。舉例來說，單株抗體可利用最先由Kohler et al.,Nature,256：495(1975)描述之雜交瘤方法製備，詳細製備過程係描述於Ausubel,F.M.et al.(Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley & Sons Inc；ring-bound edition,2003)之11.4至11.11單元。或者，可利用重組DNA方法，自利用McCafferty et al.,Nature,348：552-554(1990)所描述之技術製備之抗體噬菌體庫分離單株抗體。Clacksoii et al.,Nature,352：624-628(1991)及Marks et al.,J.Mol.Biol.,222：581-597(1991)分別說明利用噬菌體庫分離小鼠及人抗體。後續文獻說明藉由鏈洗牌(chain shuffling )產製高親和性(nM範圍)人抗體(Marks et al.,Bio/Technology,10：779-783(1992))，以及利用組合式感染及活體內重組作為策略以建構非常大型之噬菌體庫(Waterhouse et al.,Nucl.Acids.Res.,21：2265-2266(1993))。因此，這些技術係用於分離單株抗體之傳統單株抗體雜交瘤技術的可行替代技術。
多株抗體可利用自經免疫之宿主在採血及移除纖維蛋白凝塊後取得之抗血清直接使用。單株抗體可利用雜交瘤培養之上清液或將雜交瘤植入適當宿主之腹腔後產生之腹水液體直接使用。或者，該免疫球蛋白分子(不論是多株或單株)可在使用前經習用手段純化，諸如利用源自Aβ17之肽進行親和性純化、非變性膠體純化、HPLC或RP-HPLC、大小排除、蛋白A管柱純化或這些技術之任何組合。
在較佳之實施態樣中，本發明之抗體係多株抗體。在較佳之實施態樣中，產製本發明之抗體之方法包括下列步驟：
-第1劑：以100 μg之該肽免疫兔，使用完全弗氏佐劑作為佐劑。
-第2劑：以100 μg之該肽免疫兔，使用不完全弗氏佐劑作為佐劑。
-第3劑：以100 μg之該肽免疫兔，使用明礬作為佐劑。
-另外3劑200 μg之該肽，交換使用佐劑：不完全弗 氏佐劑-明礬-不完全弗氏佐劑。
在較佳之實施態樣中，用於產製本發明之抗體的該Aβ肽或免疫原之區係選自對應序列VHHQKL(SEQ ID NO：2)之Aβ(12-17)肽或對應序列EVHHQKL(SEQ ID NO：3)之Aβ(11-17)肽。
本發明之套組
在第二態樣中，本發明關於一種用於檢測或測定Aβ(1-17)肽之套組(以下稱為本發明之套組)，該套組包含：(i)第一抗體，其係本發明之對Aβ(1-17)具特異性之抗體，及(ii)第二抗體，其辨識該Aβ(1-17)肽之與該第一抗體所辨識之區域不同之區域。
此處使用之用語「β澱粉樣肽」可與Aβ、β澱粉樣蛋白、「A beta」、「beta AP」、「A beta肽」或「A beta肽」交換使用，係指一群在阿茲海默氏症(AD)、唐氏症及荷蘭型遺傳性澱粉樣變腦出血(HCHWA-D)之病患的腦部所發現之老年斑塊與血管澱粉樣沉積(澱粉樣血管病)之主要化學成份的肽。不論任何形式，β澱粉樣肽係β澱粉樣前體蛋白質(APP)之片段，其包含不同數量之胺基酸，係由β-及γ-分泌酶或由β-及α-分泌酶依序蛋白水解切割該澱粉樣前體蛋白質產生。
β澱粉樣肽通常以「Aβ(x-y)」表示，其中x代表β 澱粉樣肽之胺基端的胺基酸號碼，y代表羧基端之胺基酸號碼。此處所使用之「Aβ(1-17)」或「Aβ17」關於對應澱粉樣前體蛋白質之胺基酸672至688(SEQ ID NO：1)之17個胺基酸之肽，其係由β-及α-分泌酶依序蛋白水解切割該澱粉樣前體蛋白質(SEQ ID NO：4)產生。
在本發明之上下文中，「捕捉抗體」係指用來自樣本中取出該抗體所特異性結合之所有分子之抗體。對於可用來作為捕捉抗體之抗體類型並無實際限制，只要該抗體包含至少一個對Aβ17具特異性之抗原結合部位。原則上，對Aβ17肽具特異性之任何抗體可被用來作為捕捉抗體。該捕捉抗體結合之區域與第二抗體所結合之區域不同。在較佳之實施肽樣中，該捕捉抗體係以該Aβ17肽之N端區的表位為目標。在更佳之實施態樣中，可被捕捉抗體當成目標之表位包括位於Aβ17之胺基酸1至10之表位。在另一較佳實施態樣中，該捕捉抗體係單株抗體。在仍更佳之實施態樣中，該捕捉抗體辨識對應該Aβ肽之胺基酸1至16之區域。在仍更佳之實施態樣中，用來作為捕捉抗體之單株抗體係如Kim,K.S.(Neuroscience Res.Comm.1988,2：121-130)所述之6E10單株抗體。
本發明之套組的第二成份對應本發明之抗體，已於本發明先前說明。在本發明之上下文中，「檢測抗體」係將被用來檢測已被捕捉抗體捕捉之抗原的量之抗體。該第一抗體辨識與第二抗體辨識之不同區域，因為其必須與未被該捕捉抗體覆蓋之抗原的區域結合。
該第一及第二抗體可被無差異地用於本發明之套組作為捕捉及檢測抗體。
該二種抗體(第一或第二抗體)中之一者可能與結合對之第一成員偶合，以允許檢測與該捕捉抗體捕捉之抗原結合之抗體。該將被偶合之抗體將作為檢測抗體，其可能為第一或第二抗體。
在特定實施態樣中，該套組另包含與Aβ40及/或Aβ42特異性結合之抗體或抗體之組合。因此，在特定實施態樣中，該套組可被用於檢測Aβ17肽及Aβ40及/或Aβ42肽。
此處所使用之「Aβ42」關於對應胺基酸672至713(SEQ ID NO：5)之42個胺基酸之肽，其係由β-及γ-分泌酶依序蛋白水解切割該澱粉樣前體蛋白質(SEQ ID NO：4)產生。
此處所使用之「Aβ40」關於對應胺基酸672至711(SEQ ID NO：6)之40個胺基酸之肽，其係由β-及γ-分泌酶依序蛋白水解切割該澱粉樣前體蛋白質(SEQ ID NO：4)產生。
在較佳之實施肽樣中，該第一或第二抗體(視情況而定)係與結合對之第一成員偶合。若情況如此，與可檢測之標籤偶合之結合對的第二成員亦包括於該套組中。在特定實施態樣中，若該與結合對之第二成員偶合之可檢測之標籤係酶標籤，則該套組另包含可被該酶轉換成可檢測產物之受質。
適當之結合對的第一及第二成員包括但不限於：■半抗原或抗原/抗體，例如地高辛及抗地高辛抗體，■生物素或生物素類似物(例如胺基生物素、亞胺基生物素或去硫生物素)/抗生物素蛋白或鏈黴抗生物素蛋白，■糖/凝集素，■酶及輔因子，■葉酸/葉酸鹽，■選擇性與蛋白質結合之雙股寡核苷酸/轉錄因子，■核酸或核酸類似物/互補性核酸，及■受體/配體，例如類固醇荷爾蒙受體/類固醇荷爾蒙。
將了解的是，用語結合對之「第一」及「第二」成員係相對性，上述成員之一者可被視為結合對之第一或第二成員。在較佳之實施態樣中，該結合對之第一成員係生物素或彼之功能性相等變異體，該結合對之第二成員係抗生物素蛋白、鏈黴抗生物素蛋白或彼等之功能性相等變異體。在較佳之實施態樣中，該結合對之第二成員係鏈黴抗生物素蛋白。
適當之可檢測之標籤包括但不限於螢光基團(例如螢光素、若丹明、藻紅素、香豆素、、試鹵靈、花青及彼等之衍生物)、發光基團(例如QdotTM奈米粒子，由加州帕羅奧圖(Palo Alto,CA)量子點(Quantum Dot)公司提供)。若該可檢測之標籤係酶，則此酶必須能夠在添 加例如活化子、受質、放大劑及該類似物時產生可檢測之信號。適合作為本發明之可檢測之標籤的酶及彼之對應受質包括：
‧鹼性磷酸酶：
○顯色受質：以對硝基苯磷酸(p-NPP)、5-溴基-4-氯基-3-吲哚基磷酸鹽/硝基藍四氮唑(BCIP/NPT)、堅牢紅/萘酚-AS-TS磷酸鹽為基底之受質
○產螢光受質：4-甲基傘型酮磷酸酯(4-MUP)、2-(5'-氯基-2'-磷醯氧基苯基)-6-氯基-4-(3H)-喹唑啉酮(CPPCQ)、3,6-螢光素二磷酸酯(3,6-FDP)、堅牢藍BB、堅牢紅TR、或堅牢紅紫LB重氮鹽
‧過氧化酶：
○以2,2-次偶氮基二(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)(ABTS)、鄰苯二胺(OPT)、3,3',5,5'-四甲基聯苯胺(TMB)、o-聯大茴香胺、5-胺基水楊酸、3-二甲基胺基苯甲酸(DMAB)及3-甲基-2-苯并噻唑啉腙(MBTH)、3-胺基-9-乙基咔唑(AEC)-及3,3'-二胺基聯苯胺四鹽酸鹽(DAB)為基底之顯色受質
○產螢光受質：4-羥基-3-甲氧基苯乙酸、經還原之啡及經還原之苯并噻，包括Amplex®紅試劑、Amplex UltraRed及經還原之二氫。
‧糖苷酶：
○顯色受質：β-D-半乳糖苷酶之o-硝苯基-β-D-半乳糖 苷(o-NPG)、p-硝苯基-β-D-半乳糖苷及4-甲基傘型基苯基-β-D-半乳糖苷(MUG)。
○產螢光受質：試鹵靈β-D-吡喃半乳糖苷、螢光素雙半乳糖苷(FDG)、螢光素二葡糖苷酸、4-甲基傘型酮β-D-吡喃半乳糖苷、羧基傘型酮β-D-吡喃半乳糖苷及氟化香豆素β-D-吡喃半乳糖苷。
‧氧化還原酶(螢光素酶)：
○發光受質：螢光素。
在特定實施態樣中，該可檢測之標籤係螢光分子、發光分子或酶。在較佳之實施態樣中，該可檢測之標籤係辣根過氧化酶及該檢測劑係TMB。
在較佳之實施態樣中，該套組另包含固體支持物。此處所使用之用語「支持」或「表面」係指呈孔狀或非孔狀不溶水性材料之固相，其可具有任一種形狀，諸如條狀、桿狀、顆粒包括乳膠顆粒、磁性顆粒、微粒、珠狀、膜、微滴定孔及塑膠管。原則上，任何材料皆適合用作固體支持物，惟其能結合足量之捕捉抗體。因此，固相材料之選擇係取決於所欲之檢測格式表現特徵。適合用來作為固相支持之材料包括聚合性材料，特別是纖維素性材料及衍生自纖維素之材料，諸如含纖維紙，例如濾紙、色層分析紙、玻璃纖維紙等；合成性或經改良之天然發生聚合物，諸如硝化纖維素、醋酸纖維、聚(氯乙烯)、聚丙醯胺、經交聯之葡聚糖、洋菜糖、聚丙烯酸酯、聚乙烯、聚丙烯、聚(4-甲基丁烯)、聚苯乙烯、聚甲基丙烯酸酯、聚對苯二甲 酸乙酯、尼龍、聚乙烯丁酸酯等；彼等被獨自使用或與其他材料一起使用；玻璃諸如可用來作為生物玻璃之玻璃、陶瓷、金屬及該類似材料。苯乙烯及羧基化苯乙烯或具有其他活性官能基諸如胺基、羥基、鹵基及該類似基團之苯乙烯的非交聯聚合物係較佳。在一些情況中，經取代之苯乙烯與二烯諸如丁二烯之共聚物將被使用。
在特定實施態樣中，未與結合對之第一成份偶合之抗體係與固體支持物預結合，該抗體可為第一或第二抗體。該固體支持物及該第一或第二抗體可被分開提供於套組中，或二者擇一地該支持物可能已經預先覆蓋該抗體。在此情況中，該支持物在該抗體結合後可能經封片液處理。若該支持物係經預先覆蓋，較佳的是使該支持物經濃縮海藻糖溶液處理，並允許其乾燥，該乾燥之海藻糖在該支持物上形成光圈狀。這些包含乾燥海藻糖之支持物相當穩定，在4℃暗室中可保存長達二年。
該套組之其他成份可能包括：
‧自病患取得欲分析樣本之裝置
‧製備該目標肽之標準曲線所需之緩衝液及溶液
‧在測試期間清洗及封閉該固體支持物之緩衝液及溶液
‧用於以該覆蓋抗體覆蓋該固體支持物之緩衝液及溶液
‧自該可檢測之標籤顯示該顏色或螢光信號之試劑
‧自該可檢測之標籤停止該顏色或螢光產物形成之 試劑(例如1N H2SO4)
‧使該肽維持不摺疊狀態之裝置(例如經濃縮之鹽酸胍)
‧含有Aβ17肽及額外地Aβ40肽及/或Aβ42肽或彼等之組合之原液樣本
將抗體固定在固體支持物可在該目標肽之結合被檢測前實施，或當該肽/蛋白質與該抗體一旦結合後實施。在任何情況中，若使用固體支持物，即可很方便地在添加含有該欲測定之目標肽的樣本之前封閉該載體上之多餘的蛋白質結合位置。較佳地，封閉或淬熄該支持物上之肽結合位置係利用在每次結合反應之後用於清洗該複合體之相同緩衝液進行(例如50 mM Tris-HCl，pH 8，可任選之PBS或TBS，包含Tween 20)，添加濃度自約0.05%至10%，較佳地1至5%，更佳地約3%之巨分子化合物(例如牛血清白蛋白、脫脂乾燥奶、西方墨點封片劑、酪蛋白、乳白蛋白、卵白蛋白)。若包含該經固定之捕捉抗體的支持物必須儲存若干時間，較佳的是使該支持物經濃縮海藻糖溶液處理，並允許其乾燥，該乾燥之海藻糖在該支持物上形成光圈狀。這些包含乾燥海藻糖之支持物相當穩定，在4℃暗室中可保存長達二年。
本發明之套組允許以高敏感性及特異性檢測或測定肽或多種肽，該肽或多種肽係由該套組之第一及第二抗體成份特異性辨識。因此，在其他態樣中，本發明關於使用本發明之套組以檢測樣本中之Aβ17肽。在特定實施態樣中 ，該套組係用於任意選擇地檢測樣本中之Aβ40及/或Aβ42肽及彼等之組合。
由於本發明之套組提供以高敏感性及特異性測定任何樣本中Aβ17肽之濃度的能力，因此其可被用於診斷其中任何細胞液或組織之此肽的濃度有所改變之任何疾病，特別是退化性疾病及更特別是神經變性疾病。可根據Aβ17之量改變或Aβ40或Aβ42之量改變的出現加以診斷之退化性疾病的非限制性實例包括：
‧骨退化性疾病諸如骨量減少、骨軟化病、骨質疏鬆症、骨髓瘤、骨營養不良、佩吉特氏(Paget's)病、成骨不全、骨硬化症、再生不良性骨疾病、體液性高鈣血症骨髓瘤、多發性骨髓瘤及轉移後之骨變薄
‧軟骨退化性疾病諸如戈漢-史圖(Gorham-Stout)症候群、關節炎性疾病、骨關節炎、類風濕性關節炎、牛皮癬性關節炎、類風濕性疾病及脆骨病
‧肌肉退化性疾病諸如肌肉營養不良、肌肉萎縮、鬱血性阻塞性肺病、肌肉消耗症候群、肌少症、惡病質
‧心臟退化性疾病包括因缺血導致心肌細胞死亡、因移植排斥導致組織及器官死亡、因自毒性導致聽力喪失
‧視網膜退化性疾病諸如色素性視網膜炎
‧神經系統之退化性疾病諸如亞歷山大(Alexander )氏病、阿爾帕(Alper)氏病、阿茲海默氏症、肌萎縮性脊髓側索硬化、共濟失調微血管擴張症候群、巴登(Batten)氏病、牛海綿狀腦病(BSE)、康納丸(Canavan)氏病、柯凱因氏(Cockayne)症候群、皮質基底核退化症、克-亞二氏(Creutzfeldt-Jakob)症、亨丁頓氏(Huntington)症、HIV相關性癡呆症、甘迺迪氏(Kennedy's)症、克拉培(Krabbe)氏病、路易氏體癡呆症、馬查多-約瑟夫(Machado-Joseph)病(第三型脊髓小腦萎縮症)、多發性硬化症、多發性系統退化症、神經疏螺旋體病、巴金森氏症、佩-梅二氏(Pelizaeus-Merzbacher)病、皮克(Pick's)病、原發性脊髓側索硬化、病原性蛋白顆粒病、瑞福森氏(Refsum's)病、山德霍夫(Sandhoff)氏病、謝耳德氏(Schilder's)病、精神分裂症、施皮麥耶-沃格特-修格倫-巴登(Spielmeyer-Vogt-Sjogren-Batten)病(又名巴登氏病)、脊髓小腦萎縮症、脊髓肌肉萎縮症、斯-里-奧三氏(Steele-Richardson-Olszewski)病、脊髓癆。在較佳之實施肽樣中，利用本發明之套組診斷之神經變性疾病係阿茲海默氏症。
測定或檢測Aβ17肽之方法
本發明之套組能夠用於實施一種測定或檢測樣本中 Aβ17肽之方法。因此，在另一態樣中，本發明關於一種測定或檢測樣本中Aβ(1-17)肽之方法(以下稱為本發明之檢測方法)，該方法包含下列步驟：(i)利用第一抗體捕捉存在於樣本中之Aβ(1-17)肽，該第一抗體與該肽特異性結合，(ii)使步驟(i)形成之免疫複合體與第二抗體接觸，其中該第二抗體係如申請專利範圍第1至4項中任一者所定義者，其中該第二抗體辨識與該第一抗體不同之區域且與結合對之第一成員偶合，(iii)使步驟(ii)形成之複合體與結合對之第二成員接觸，該結合對之第二成員係與可檢測之標籤偶合，及(iv)檢測或測定該可檢測之標籤的活性或量。
本發明所述之「樣本」包括組織培養、血漿、血清、唾液、精液、痰、腦脊髓液(CSF)、淚液、黏液、汗液、乳汁、腦組織萃取物、周邊組織萃取物及該類似物之任一者。在較佳之實施態樣中，該樣本係選自血液、血清、血漿或CSF。在更佳之實施態樣中，該樣本係血漿樣本。
在較佳之實施態樣中，該經檢測之肽對應該肽之非寡聚形式，更佳地Aβ17之單體形式。
本方法之各步驟中使用之試劑及抗體係於上述本發明之套組中詳細說明。
在本發明之方法的第一步驟中，包含Aβ17肽之樣本係與第一抗體接觸以形成第一免疫複合體。在較佳之實施 態樣中，該第一抗體係單株抗體。在更佳之實施態樣中，該單株抗體係6E10抗體。
在第一個結合步驟完成之後，該複合體可被清洗以移除該原始樣本中任何多餘之不與該捕捉抗體結合之蛋白質/肽。可用於本發明之上下文中的較佳之清洗緩衝液包括任何pH近似生理之緩衝液(例如50 mM Tris-HCl)，可任意選擇地包含鹽類(例如150 mM NaCl)及可任意選擇地包含低濃度之清潔劑(例0.05% Tween-20)。
在第二步驟中，該捕捉抗體與樣本中Aβ肽形成之複合體接著與該第二抗體接觸以形成「三明治式」免疫複合體。該第一抗體與第二抗體將與該Aβ17肽之不同區域結合，因此彼此之間互不干擾。
本方法之第一及第二步驟可互相交換，捕捉該Aβ17肽可由該第二抗體(本發明之抗體)進行。該複合體接著與該第一抗體接觸，該第一抗體將與該第二抗體結合之不同區域結合。該二種抗體中之一者將與結合對之第一成員偶合，該抗體將為不是用於該捕捉步驟之抗體。
在第二步驟進行之後，該免疫複合體可利用實質上與上述相同之緩衝液及方法清洗以清除非特異性結合之抗體。
在第三步驟中，本發明之方法關於使該捕捉抗體-抗原與該經結合對之第一成員偶合之檢測抗體所形成之複合體與結合對之第二成員接觸，該第二成員係與可檢測之標籤偶合。在較佳之實施態樣中，該結合對之第一成員係生物素，該結合對之第二成員係抗生物素蛋白、鏈黴抗生物 素蛋白或彼等之功能性相等變異體。
在本發明之方法的第四步驟中，該方法關於檢測該可檢測之標籤。將了解的是，檢測及/或定量該可檢測之標籤取決於該標籤之性質，且係該領域已知之技術。當完整受質或可檢測之標籤包含發光或染料成份時，檢測可於紫外線觀察箱進行目視觀察，或藉由使用以UV為基底之電荷耦合元件(CCD)相機檢測系統、以雷射為基底之膠體掃描儀、以氙弧為基底之CCD相機檢測系統、結合UV觀察箱之Polaroid相機，以及各種其他用於檢測發光之裝置。當該可檢測之標籤係酶時，本發明之方法的第四步驟涉及使該經標籤標記之免疫複合體(例如該經捕捉之肽、該檢測抗體及該經可檢測之標籤標記之試劑)暴露於作為可檢測之標籤的該酶之活化子、受質或放大劑。能產生可檢測之信號的廣為周知之可檢測之標籤包括經酶標示之抗體。用於此目的之廣為周知的示範性酶包括辣根過氧化酶、鹼性磷酸酶及糖苷酶，包括β-半乳糖苷酶、β-葡萄糖苷酶及β-葡萄糖苷酸酶。舉例來說，與檢測抗體特異性結合之試劑可利用辣根過氧化酶標記。當形成捕捉基團-檢測抗體-試劑複合體時，接著可利用作為可檢測之標籤的酶之多種廣為周知之受質之任一者實施檢測。在較佳之實施態樣中，該可檢測之標籤係螢光分子、發光分子或酶。
在特定實施態樣中，本發明之檢測方法另包含檢測Aβ40及/或Aβ42肽。
監測神經變性疾病進展之方法
在另一態樣中，本發明關於一種監測個體之神經變性疾病之方法(以下稱為本發明之監測方法)，該方法包含在第一時間點測定該個體之血漿樣本內游離Aβ17肽量及樣本內與細胞結合之Aβ17肽量，並將該些量與在第二時間點測定之該些量比較，其中若第二時間點之血漿內游離Aβ17肽和與細胞結合之Aβ17肽之比率相較於第一時間點者增加，表示該個體之阿茲海默氏症惡化。
此處所使用之用語「神經變性疾病」係指神經細胞因為細胞死亡而喪失之狀況或疾病，導致認知功能惡化或導致以神經性、神經變性、生理性、心理性或行為異常為特徵之損害、功能障礙、或併發症。可利用本發明之方法診斷之適當神經變性疾病包括但不限於年齡相關性黃斑變性、克-亞二氏(Creutzfeldt-Jakob)症、阿茲海默氏症、伴隨澱粉樣病之腦血管病、血管性痴呆症、放射線治療誘導之癡呆症、軸突損傷、急性皮質擴散性抑制、α共核蛋白病、腦缺血、亨丁頓氏病、永久性局部腦缺血、週邊神經再生、癲癇持續發作後模式、脊髓受損、散發性肌萎縮性脊髓側索硬化及傳染性海綿狀腦病。
在較佳之實施態樣中，利用本發明之方法監測之神經變性疾病係阿茲海默氏症或彼之前驅形式，包括輕微認知障礙、伴隨疑似阿茲海默氏症之輕微認知障礙或伴隨可能為阿茲海默氏症之輕微認知障礙。
本發明之監測方法係用於評估個體之阿茲海默氏症之 進展。因此，本發明之作者顯示血漿內游離Aβ17肽量/與細胞結合之Aβ17肽量之比率增加表示AD惡化。
在特定實施態樣中，本發明之監測方法包括下列步驟：
(a)在第一時間點測定個體之血漿內游離Aβ17肽濃度及樣本內與細胞結合之Aβ17肽量(FP Aβ17/CB Aβ17)；(b)在第二時間點測定該相同個體之血漿內游離Aβ17肽濃度及樣本內與細胞結合之Aβ17肽量；時間點之選擇係由該領域之技藝人士依每位個體情況決定。
(c)比較第一時間點及第二時間點之血漿內游離Aβ17肽量/與細胞結合之Aβ17肽量之比率；(d)若第二時間點之該等參數之比率相較於第一時間點者增加，表示該個體之阿茲海默氏症惡化。
此處所使用之用語「阿茲海默氏症惡化」係指該疾病進展至相較於測量之第一時間點之期的後期。技藝人士將能藉由分析其他指標特徵以辨識及證實該疾病之進展是否惡化。在疾病後期出現且能代表該疾病進展之特徵或指標係(不限於)出現澱粉樣斑塊、神經纖維糾結及認知功能快速下降。在較佳之實施態樣中，若第二時間點之血漿內游離Aβ17肽量/與細胞結合之Aβ17肽量之比率相較於第一時間點者增加，表示該個體出現認知障礙之比率增高。因此在血漿內發現之較高之游離Aβ17肽量表示較高程度之認知障礙。
任何適用於測定肽之方法可被用於本發明。舉例來說，β澱粉樣肽之濃度可利用選自下列之一或多種技術測定：西方墨點法、免疫沉澱法、酶連接免疫吸附測定(ELISA)、表面電漿共振、沉澱反應、膠體擴散免疫擴散試驗、放射性免疫測定(RIA)、螢光激活細胞分選(FACS)、二維膠體電泳、毛細管電泳、質譜分析(MS)、基質輔助雷射脫附離子化飛行時間MS(MALDI-TOF)、表面增強雷射脫附離子化飛行時間(SELDI-TOF)、高效液相層析法(HPLC)、快速蛋白質液相層析法(FPLC)、多維液相層析(LC)接著串聯質譜分析(MS/MS)、薄層層析法、蛋白晶片表現分析及雷射密度分析。在特定實施態樣中，該等參數之量的測定係由ELISA進行。在較佳之實施態樣中，用於ELISA之抗體之一係本發明之以Aβ17肽之C端區域為目標之抗體。
此處所使用之用語「血漿內游離Aβ17肽」(以下稱為FP Aβ17)係指未與生物樣本中之任何成份相連之β澱粉樣肽之量，其能輕易地被用來與特異性抗體結合。此肽可利用使生物樣本與對該肽具特異性之抗體接觸之習知免疫技術測定。在較佳之實施態樣中，游離澱粉樣肽之量係於血漿測定。
此處所使用之用語「與細胞結合之Aβ17肽量」(以下稱為CB Aβ17)係指與存在於生物樣本中之細胞表面非共價相連之β澱粉樣肽，其無法被用來與添加至該樣本中之抗體結合，因此無法經免疫檢測。通常，若該生物樣本係 血液，β澱粉樣肽係與紅血球、白血球(包括嗜中性球、嗜酸性球、嗜鹼性球、淋巴球及單核球)及血小板相連。在給定樣本中與細胞相連之β澱粉樣肽之量可被測定，此值可被單獨用於本發明之方法，或與其他β澱粉樣肽之相關參數一起用於本發明之方法。就此目的而言，首先需要自生物樣本分離細胞組分。此可利用該領域之技藝人士熟知之任何技術進行，諸如離心、沉降、過濾及該類似技術。一旦該生物樣本之細胞組分被分離後，使細胞與蛋白助溶劑接觸。
在給定樣本中與細胞相連之β澱粉樣肽之量可被測定，此值可被單獨用於本發明之方法，或與其他β澱粉樣肽之相關參數一起用於本發明之方法。就此目的而言，首先需要自生物樣本分離細胞組分。此可利用該領域之技藝人士熟知之任何技術進行，諸如離心、沉降、過濾及該類似技術。一旦該生物樣本之細胞組分被分離後，使細胞與蛋白助溶劑接觸。
在較佳之實施態樣中，個體之樣本係選自血液、血清、血漿或CSF。在更佳之實施態樣中，該樣本係血漿樣本。
測定個體是否罹患阿茲海默氏症或早期阿茲海默氏症之方法
本發明之作者已經知道某些種類之β澱粉樣肽的量(不論是直接測定或藉由計算獲得)可被用於測定病患是否罹患輕微阿茲海默氏症、用於測定個體是否罹患前驅性阿 茲海默氏症、用於區別罹患非前驅性輕微認知障礙之個體與罹患前驅性阿茲海默氏症之個體、用於區別罹患非前驅性輕微認知障礙之個體與罹患輕微阿茲海默氏症之個體、或用於區別罹患前驅性阿茲海默氏症之個體與罹患輕微阿茲海默氏症之個體。
因此，在另一態樣中，本發明關於一種測定個體是否罹患輕微阿茲海默氏症之方法，該方法包含測定選自下列之一或多項參數之值：(a)該個體之血液樣本內與細胞結合之Aβ17、Aβ40及Aβ42肽量的相加值，(b)該個體之血漿樣本內Aβ17、Aβ40及Aβ42肽總量及該個體之血液樣本內與細胞結合之Aβ17、Aβ40及Aβ42肽量的相加值，(c)該個體之血漿樣本內Aβ42肽總量及該個體之血液樣本內與細胞結合之Aβ42肽量的相加值，(d)該個體之血漿樣本內Aβ40及Aβ42肽總量及該個體之血液樣本內與細胞結合之Aβ40及Aβ42肽量的相加值，及(e)該個體之血漿樣本內游離Aβ17肽量與該個體之血液樣本內與細胞結合之Aβ17肽量的比值，其中若該等參數之一或多者之值相較於健康個體之參考樣本之值增加，則該個體罹患輕微阿茲海默氏症。
因此，欲經測量以區別健康個體與罹患輕微阿茲海默氏症之個體的參數係下列參數：
(a)CB Aβ17+CB Aβ40+CB Aβ42
(b)(CB Aβ17+CB Aβ40+CB Aβ42)+(TP Aβ17+TP Aβ40+TP Aβ42)
(c)TP Aβ42+CB Aβ42
(d)(TP Aβ40+TP Aβ42)+(TP Aβ40+TP Aβ42)
(e)FP Aβ17/CB Aβ17
一種測定個體是否罹患伴隨前驅性阿茲海默氏症之輕微認知障礙(MCI)之方法，該方法包含測定選自下列之一或多項參數之值：(a)該個體之血漿樣本內Aβ42肽總量及該個體之血液樣本內與細胞結合之Aβ42肽量的相加值，(b)該個體之血漿樣本內Aβ40及Aβ42肽總量及該個體之血液樣本內與細胞結合之Aβ40及Aβ42肽量的相加值，(c)該個體之血漿樣本內游離Aβ17肽量與該個體之血液樣本內與細胞結合之Aβ17肽量的比值，(d)血液樣本內與細胞結合之Aβ17肽量與血液樣本內與細胞結合之Aβ42肽量的比值，(e)二參數之比值，其中第一參數對應血漿樣本內Aβ17肽總量和血液樣本內與細胞結合之Aβ17肽量的相加量，且第二參數對應血漿樣本內Aβ42肽總量和血液樣本內與細胞結合之Aβ42肽量的相加量，(f)二參數之比值，其中第一參數對應血液樣本內與 細胞結合之Aβ17肽量，且第二參數對應血液樣本內與細胞結合之Aβ40肽量與血液樣本內與細胞結合之Aβ42肽量的相加量，及(g)二參數之比值，其中第一參數對應該個體之血漿樣本內Aβ17肽總量和血液樣本內與細胞結合之Aβ17肽量的相加量，且第二參數對應血漿樣本內Aβ40及Aβ42肽總量和血液樣本內與細胞結合之Aβ40及Aβ42肽量的相加量，其中若參數(a)、(b)或(c)之一或多者之值相較於健康個體之參考樣本之值增加，及/或參數(d)、(e)、(f)或(g)之一或多者之值相較於健康個體之參考樣本之值減少，該個體罹患輕微阿茲海默氏症。
因此，欲經測量以區別健康個體與罹患伴隨前驅性阿茲海默氏症之MCI之個體的參數係下列參數：
(a)TP Aβ42+CB Aβ42
(b)(TP Aβ40+TP Aβ42)+(CB Aβ40+CB Aβ42)
(c)FP Aβ17/CB Aβ17
(d)CB Aβ17/CB Aβ42
(e)(TP Aβ17+CB Aβ17)/(TP Aβ42+CB Aβ42)
(f)CB Aβ17/(CB Aβ40+CB Aβ42)
(g)(TP Aβ17+CB Aβ17)/(TP Aβ40+TP Aβ42)+(CB Aβ40+CB Aβ42)
在另一態樣中，本發明關於一種區別罹患伴隨非前驅性阿茲海默氏症之MCI之個體與罹患伴隨前驅性阿茲海默 氏症之MCI之個體之方法，該方法包含測定選自下列之一或多項參數之值：(a)該個體之血液樣本內與細胞結合之Aβ17、Aβ40及Aβ42肽量的相加值，(b)該個體之血液樣本內與細胞結合之Aβ17肽量與該個體之血液樣本內與細胞結合之Aβ42肽量的比值，(c)二參數之比值，其中第一參數對應該個體之血漿樣本內Aβ17肽總量和血液樣本內與細胞結合之Aβ17肽量的相加值，且第二參數對應該個體之血漿樣本內Aβ42肽總量和血液樣本內與細胞結合之Aβ42肽量的相加值，(d)二參數之比值，其中第一參數對應血液樣本內與細胞結合之Aβ17肽量，且第二參數對應血液樣本內與細胞結合之Aβ40和Aβ42肽量的相加值，及(e)二參數之比值，其中第一參數對應該個體之血漿樣本內Aβ17肽總量和血液樣本內與細胞結合之Aβ17肽量的相加值，且第二參數對應血漿樣本內Aβ40及Aβ42肽總量和血液樣本內與細胞結合之Aβ40及Aβ42肽量的相加值，其中若(a)之值相較於罹患伴隨非前驅性阿茲海默氏症之MCI之個體的參考樣本之值增加及/或該等參數(b)、(c)、(d)或(e)之一或多者之值相較於罹患伴 隨非前驅性阿茲海默氏症之MCI之個體的參考樣本之值減少，該個體罹患伴隨前驅性阿茲海默氏症之MCI。
因此，欲經測量以允許區別罹患伴隨非前驅性阿茲海默氏症之MCI之個體與罹患伴隨前驅性阿茲海默氏症之MCI之個體的參數係下列參數：
(a)CB Aβ17+CB Aβ40+CB Aβ42
(b)CB Aβ17/CB Aβ42
(c)(TP Aβ17+CB Aβ17)/(TP Aβ42+CB Aβ42)
(d)CB Aβ17/(CB Aβ40+CB Aβ42)
(e)(TP Aβ17+CB Aβ17)/(TP Aβ40+TP Aβ42)+(CB Aβ40+CB Aβ42)
在另一態樣中，本發明關於一種區別罹患伴隨非前驅性阿茲海默氏症之MCI之個體與罹患輕微阿茲海默氏症之個體之方法，該方法包含測定選自下列之一或多項參數之值：(a)血液樣本內與細胞結合之Aβ17、Aβ40及Aβ42肽量的相加值，(b)血漿樣本內Aβ17、Aβ40及Aβ42肽總量和血液樣本內與細胞結合之Aβ17、Aβ40及Aβ42肽量的相加值，(c)血漿樣本內Aβ42肽總量和血液樣本內與細胞結合之Aβ42肽量的相加值，(d)血漿樣本內Aβ40及Aβ42肽總量和血液樣本內與細胞結合之Aβ40及Aβ42肽量的相加值， (e)血漿樣本內Aβ40肽總量和血液樣本內與細胞結合之Aβ40肽量的相加值，(f)二參數之比值，其中第一參數對應血液樣本內與細胞結合之Aβ17肽量，且第二參數對應血液樣本內與細胞結合之Aβ40和Aβ42肽量的相加值，及(g)血漿樣本內游離Aβ17肽量與血液樣本內與細胞結合之Aβ17肽量的比值，其中若該等參數之一或多者之值相較於伴隨非前驅性阿茲海默氏症之MCI之參考樣本之值增加，則該個體罹患輕微阿茲海默氏症。
因此，欲經測量以區別罹患伴隨非前驅性阿茲海默氏症之MCI之個體與罹患輕微阿茲海默氏症之個體的參數係下列參數：
(a)CB Aβ17+CB Aβ40+CB Aβ42
(b)(TP Aβ17+TP Aβ40+TP Aβ42)+(CB Aβ17+CB Aβ40+CB Aβ42)
(c)TP Aβ42+CB Aβ42
(d)(TP Aβ40+TP Aβ42)+(CB Aβ40+CB Aβ42)
(e)TP Aβ40+CB Aβ40
(f)CB Aβ17/(CB Aβ40+CB Aβ42)
(g)FP Aβ17/CB Aβ17
在另一態樣中，本發明關於一種區別罹患伴隨前驅性阿茲海默氏症之MCI之個體與罹患輕微阿茲海默氏症之個 體之方法，該方法包含測定選自下列之一或多項參數之值：(a)血漿樣本內游離Aβ17肽量與血漿樣本內游離Aβ40肽量的比值，及(b)二參數之比值，其中第一參數對應血漿樣本內游離Aβ17肽量，且第二參數對應血漿樣本內游離Aβ40和Aβ42肽量的相加值，其中若該等參數之一或多者之值相較於伴隨前驅性阿茲海默氏症之MCI之參考樣本之值增加，則該個體罹患輕微阿茲海默氏症。
因此，欲經測量以區別罹患伴隨前驅性阿茲海默氏症之MCI之個體與罹患輕微阿茲海默氏症之個體的參數係下列參數：
(a)FP Aβ17/FP Aβ40
(b)FP Aβ17/FP Aβ40+FP Aβ42
此處所使用之用語「診斷」包括評估個體對疾病之感受性(susceptibility)、決定個體目前是否罹患該疾病，也包括評估受該疾病影響之個體的預後。該領域之技藝人士將了解的是，該等對個體之診斷評估通常不會百分之百正確，雖然最好是正確。然而，該用語需要具統計顯著性部分之個體可被識別為罹患該疾病或具有罹患該疾病之傾向。若一部分具統計顯著性，其可輕易地由該領域之技藝人士利用多種廣為周知之統計評估工具決定，例如決定信賴區間、決定p值、學生t檢定、曼-惠特尼(Mann-Whitney)檢定等。詳細說明提供於Dowdy and Wearden, Statistics for Research,John Wiley & Sons,New York 1983。該較佳之信賴區間係至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90%、至少95%。P值較佳係0.2、0.1或0.05。
此處所使用之用語「個體」關於所有被分類為哺乳動物之動物，包括但不限於家畜、農場動物、靈長動物及人類，例如人、非人靈長動物、牛、馬、豬、綿羊、山羊、犬、貓或齧齒動物。較佳地，該個體係任何年齡或人種之男性或女性人類。
用語「阿茲海默(Alzheimer)氏症」(或「老年性癡呆症」)係指與特定退化性腦疾病有關之心智退化，其特徵為老年斑塊、神經炎糾結及進行性神經元喪失，臨床表徵為進行性記憶障礙、紊亂、行為問題、無法自理、逐漸生理惡化及最終死亡。
在本發明之上下文中，「輕微阿茲海默氏症」之用語係指阿茲海默氏症之早期階段，其中該個體經歷：
‧對最近事件之記憶喪失
‧無法解決問題、無法進行複雜任務及無法做出正確判斷
‧性格改變
‧無法組織及表達想法
‧迷路或遺失物品
罹患輕微阿茲海默氏症之病患係利用NINCDS-ADRDA標準識別(CDR=1，MMSE介於16至24點，謝爾 登氏(Scheltens)量表之內顳葉萎縮(由MRI測定)>3分)。
用語「輕微認知障礙」或MCI係指正常老化及早期阿茲海默氏症之間的認知障礙過渡期。若病患符合梅約診所(Mayo Clinic)之標準，他們通常被判定為具有MCI(CDR=0.5，謝爾登氏(Scheltens)量表高於3分之內顳葉萎縮(由MRI測定)，18-氟去氧葡萄糖之正電子發射斷層攝影(PET-FDG)顯示頂葉及/或顳葉代謝低下之模式(可能為AD))。
用語「前驅性阿茲海默氏症」又稱為「伴隨疑似阿茲海默氏症之MCI」係指顯示MCI且被認為具有高度轉變成阿茲海默氏症之風險的病患。診斷疑似AD病患之標準係該些如NINCDS-ADRDA標準所定義者(McKhann G.et al.,1984,Neurology,34：939-44)，換句話說，由臨床及神經心理檢查確立之癡呆症、存在二或多個認知領域之進行性認知障礙、障礙開始年齡介於40至90歲之間、及沒有其他能產生癡呆症症候群之疾病。
用語「非前驅性阿茲海默氏症」又稱為「伴隨可能為阿茲海默氏症之MCI」係指顯示MCI且被認為具有低度發展成阿茲海默氏症之風險的病患。診斷病患可能為AD之標準係該些如NINCDS-ADRDA標準所定義者(McKhann G.et al.,1984,Neurology,34：939-44)，換句話說，具有非典型發病、表現或進展且無已知病因之癡呆症症候群，但不具有能產生被認為是該癡呆症症候群之起源的癡呆症之 共患疾病。
本發明所使用之用語「健康個體」係指具有良好健康之個體。在較佳之實施態樣中，該個體之年齡在65歲以上。該用語代表無神經變性疾病或無任何神經變性疾病病史之個體。較佳地，該健康個體係無失憶主訴、神經心理學檢查表現正常及MRI無結構改變之病患。健康個體可能健康而無其他疾病，或者可能具有除MCI及AD以外之疾病。
用語「區別健康個體與罹患前驅性阿茲海默氏症之個體」係指鑑別不具有阿茲海默氏症(AD)之症狀的個體與罹患前驅性阿茲海默氏症之個體之能力。
用語「區別健康個體與罹患輕微阿茲海默氏症之個體」係指鑑別不具有阿茲海默氏症(AD)之症狀的個體與呈現AD早期(輕微阿茲海默氏症)之個體之能力。
用語「區別罹患非前驅性MCI之個體與罹患前驅性阿茲海默氏症之個體」係指鑑別具有非前驅性MCI之症狀的個體與罹患前驅性阿茲海默氏症之個體之能力。
用語「區別罹患非前驅性MCI之個體與罹患輕微阿茲海默氏症之個體」係指鑑別具有非前驅性MCI之症狀的個體與呈現AD早期(輕微阿茲海默氏症)之個體之能力。
用語「區別罹患前驅性AD之個體與罹患輕微阿茲海默氏症之個體」係指鑑別具有前驅性AD之症狀的個體與呈現AD早期(輕微阿茲海默氏症)之個體之能力。
用語「血漿」係指全血中之流體成份。依照所使用之分離技術，血漿可能完全不含細胞成份，或可能包含不同量 之血小板及/或少量之其他細胞成份。
此處所使用之用語「與細胞結合之Aβ17、Aβ40或Aβ42肽量」(以下分別稱為CB Aβ17、CB Aβ40或CB Aβ42)係指與存在於生物樣本中之細胞表面非共價相連之β澱粉樣肽，其無法被用來與添加至該樣本中之抗體結合，因此無法經免疫檢測。通常，若該生物樣本係血液，β澱粉樣肽係與紅血球、白血球(包括嗜中性球、嗜酸性球、嗜鹼性球、淋巴球及單核球)及血小板相連。在給定樣本中與細胞相連之β澱粉樣肽之量可被測定，此值可被單獨用於本發明之方法，或與其他β澱粉樣肽之相關參數一起用於本發明之方法。就此目的而言，首先需要自生物樣本分離細胞組分。此可利用該領域之技藝人士熟知之任何技術進行，諸如離心、沉降、過濾及該類似技術。一旦該生物樣本之細胞組分被分離後，使細胞與蛋白助溶劑接觸。
在給定樣本中與細胞相連之β澱粉樣肽之量可被測定，此值可被單獨用於本發明之方法，或與其他β澱粉樣肽之相關參數一起用於本發明之方法。就此目的而言，首先需要自生物樣本分離細胞組分。此可利用該領域之技藝人士熟知之任何技術進行，諸如離心、沉降、過濾及該類似技術。一旦該生物樣本之細胞組分被分離後，使細胞與蛋白助溶劑接觸。
適當之蛋白助溶劑包括如下定義之清潔劑、離液劑及還原劑，通常以適當濃度提供於緩衝液中。適當之劑、緩衝液及緩衝液中之劑濃度係於下說明。該接觸步驟實質上 係於釋放與生物性樣本之成份(蛋白質及脂質)連接之澱粉樣肽的方法中如下述實施。在較佳之實施態樣中，該蛋白助溶劑係清潔劑。在更佳之實施態樣中，該清潔劑係Tween 20。作為如上述定義之蛋白助溶劑之Tween 20的適當濃度係介於0.004至0.02%，更佳地0.005至0.01%(w/v)。
該接觸步驟較佳係於低溫進行，以抑制存在於樣本中之蛋白水解作用。適當溫度係約0至10℃，較佳約3至5℃，例如約4℃。
通常，該接觸步驟係藉由使該生物樣本中之細胞組分重懸於包含該蛋白助溶劑之溶液中進行。該重懸可藉由輕柔抽吸混合、攪拌、較佳地搖晃、更佳地高速搖晃、最佳地震盪至少5秒、較佳地至少10秒、更佳地至少15秒(例如15至50秒)加以實施。該等混合、攪拌、搖晃、高速搖晃或震盪之理想速度包含至少250 rpm、較佳地至少500 rpm、更佳地至少1,000 rpm、最佳地約2,000至2,500 rpm之速度。
該接觸步驟係於能達成該β澱粉樣肽自存在於生物樣本中之細胞部分解離或較佳地完全解離之適當條件下實施。該等條件可由該領域之一般技藝人士在該接觸步驟之前以及在該接觸步驟進行之後的不同時間點逐步監測可檢測之β澱粉樣肽之量加以適當決定。
此處所使用之用語「血漿內總Aβ肽」(以下稱為TP Aβ17、TP Aβ40或TP Aβ42)係指「血漿內游離Aβ肽」加 上「與巨分子成份相連之β澱粉樣肽」。此處所使用之用語「與巨分子成份相連之β澱粉樣肽」係指與測試生物樣本內發現之分子非共價結合或連接之β澱粉樣肽。此肽通常無法直接經由免疫方法檢測，因此需要預處理該生物樣本以使該肽與該等成份分開。在該些條件下，與巨分子成份連接之β澱粉樣肽將自該等成份釋放且變成能夠利用特異性抗體進行免疫檢測。由於該生物樣本已經包含一定量之游離β澱粉樣肽，在使該樣本與蛋白助溶劑接觸後之游離澱粉樣肽之總量將為原本存在之游離β澱粉樣肽量與經蛋白助溶劑處理所釋放之β澱粉樣肽之量的總和。若需要測定與存在於生物樣本中之巨分子成份相連之β澱粉樣肽之量，通常可藉由在蛋白助溶劑處理之前先測定游離β澱粉樣肽之量，接著在蛋白助溶劑處理之後測定游離β澱粉樣肽之量，將第二數值減去第一數值可得。以本發明之目的而言，測定游離β澱粉樣肽之總量通常係恰當的，該游離β澱粉樣肽之總量包括原本存在之游離β澱粉樣肽量以及經蛋白助溶劑處理後自巨分子成份釋放之β澱粉樣肽量。因此，當樣本經處理以使該澱粉樣肽自巨分子成份解離時所通常測定之參數對應存在於樣本內之游離肽以及與巨分子成份相連之肽的相加值。
在樣本中可能與β澱粉樣肽結合且導致與巨分子成份相連之β澱粉樣肽之庫的巨分子成份包括蛋白質及脂質兩者。在該方法係於血液或血漿樣本中進行之特定情況中，該巨分子成份包括但不限於血液蛋白質及脂質。示範性血 液蛋白質包括白蛋白、免疫球蛋白G、免疫球蛋白E、免疫球蛋白M、免疫球蛋白A、纖維蛋白原(纖維蛋白及彼之降解產物)、α-1抗胰蛋白酶、前白蛋白、α1抗胰蛋白酶、α1酸性糖蛋白、α1胎兒蛋白、α2肝球蛋白、大球蛋白、銅藍血漿蛋白、運鐵蛋白、C3/C4 β2微球蛋白、β脂蛋白、α球蛋白、β球蛋白、γ球蛋白、C反應性蛋白(CRP)、凝血酶原、甲狀腺素結合蛋白、運甲狀腺素蛋白及該類似物。示範性血液脂質包括游離脂肪酸、膽固醇、三酸甘油脂、磷脂質、神經鞘脂質及該類似物。
與巨分子成份相連之β澱粉樣肽之量可藉由使不含細胞之生物樣本與蛋白助溶劑在誘導該β澱粉樣肽自該巨分子成份釋放之適當條件下接觸加以測定。
此處所謂的接觸是指添加足量之包含蛋白助溶劑之溶液至該樣本，以使該混合物中之蛋白助溶劑之濃度足以有效地使該與樣本中之蛋白質及細胞結合之β澱粉樣肽增溶。較佳地，該蛋白助溶劑係存在於緩衝溶液中，以使得添加該蛋白助溶劑不會導致該樣本之pH的顯著改變。
此處所使用之用語「蛋白助溶劑」係指任何能改變多肽之二級、三級及/或四級結構但仍維持完整之一級結構之組成化合物。利用這些特性，蛋白助溶劑能增加蛋白質於樣本中之溶解性，同時防止蛋白質之分子間及分子內聚集。適合用於本發明之蛋白助溶劑包括但不限於清潔劑、離液劑、還原劑或彼等之混合物。
此處所使用之用語「清潔劑」係一般界面活性劑之同義 字，係指當添加至液體時減少該液體相較於未添加該清潔劑之該相同液體的表面張力之兩親性表面活性劑。清潔劑也能防止蛋白質聚集及防止污染物與受到關注之蛋白質的非特異性交互作用或結合。適合用於本發明之清潔劑包括但不限於非離子(中性)、陰離子、陽離子或兩性離子清潔劑。
非離子或中性清潔劑之實例包括但不限於Tween系列之清潔劑(諸如Tween® 20、Tween® 21、Tween® 40、Tween® 60、Tween® 61、Tween® 65、Tween® 80、Tween® 81、Tween® 85)、Span®系列之清潔劑(諸如Span® 20)、Tergitol系列之清潔劑(諸如Tergitol Type 15-S-12)、Brij®系列之清潔劑(諸如Brij® 35、Brij® 56、Brij® 72、Brij® 76、Brij® 92V、Brij® 97、Brij® 58P)、Tween系列之清潔劑(諸如Tween® 20、Tween® 21、Tween® 40、Tween® 60、Tween® 61、Tween® 65、Tween® 80、Tween® 81、Tween® 85)、Triton®系列之清潔劑(諸如Triton® X-100、Triton® X-114、Triton® CF-21、Triton® CF-32、Triton® DF-12、Triton® DF-16、Triton® GR-5M、Triton® X-102、Triton® X-15、Triton® X-151、Triton® X-207、Triton® X-165、Triton® X-305、Triton® X-405、Triton® X-45、Triton® X-705-70)、或至少一種該清潔劑之非離子保守性變異體。
陰離子清潔劑之實例包括但不限於膽酸及彼之衍生物、牛膽酸、Triton X-200、Triton W-30、Triton-30、 Triton-770、二辛基磺基琥珀酸鹽、N5N-二甲基十二基胺N-氧化物、1-烷基磺酸鈉、N-月桂醯基肌胺酸或脂肪酸鹽類。
陽離子清潔劑之實例包括但不限於單及二-甲基脂肪胺、烷基三甲基銨鹽、二烷基二甲基銨鹽、烷基胺醋酸鹽、三烷基銨醋酸鹽、烷基二甲基苯甲基銨鹽、二烷基甲基苯甲基銨鹽、烷基吡啶鎓鹵化物及烷基(經烷基取代之)吡啶鎓鹽、烷硫基甲基吡啶鎓鹽、烷醯胺基甲基吡啶鎓鹽、烷基喹啉鎓鹽、烷基異喹啉鎓鹽、N,N-烷基甲基吡咯鎓鹽、1,1-二烷基哌啶鎓鹽、4,4-二烷基噻嗎啉鎓鹽、4,4-二烷基噻嗎啉鎓-1-氧化物鹽、甲基二(烷基乙基)-2-烷基咪唑啉鎓甲基硫酸鹽(及其他鹽類)、甲基二(烷基醯胺乙基)-2-羥基乙基銨甲基硫酸鹽(及其他鹽類)、烷基醯胺丙基-二甲基苯甲基銨鹽、羧基烷基-烷基二甲基銨鹽、烷基胺氧化物、烷基二甲基胺氧化物、聚(乙烯基甲基吡啶鎓)鹽、聚(乙烯基吡啶)鹽、聚乙亞胺、三烷基鏻碳酸氫鹽(及其他鹽類)、三烷基甲基鏻鹽、烷基乙基甲基鋶鹽、及烷基二甲基亞碸鎓鹽。
兩性離子清潔劑之實例包括但不限於3-[(3-膽醯胺丙基)二甲銨基]-1-丙烷磺酸鹽(CHAPS)、3-[(3-膽醯胺丙基)二甲銨基]-2-羥基-1-丙烷磺酸鹽(CHAPSO)、N-(烷基C10-C16)-N,N-二甲基甘胺酸甜菜鹼(EMPIGEN BB)、辛醯基磺基甜菜鹼(SB3-10)、3-[N,N-二甲基(3-肉豆蔻醯基胺基丙基)銨基]丙烷磺酸鹽(醯胺 基磺基甜菜鹼-14，ASB-14)、N-十四基-N,N-二甲基-3-銨基-1-丙烷磺酸鹽(3-14清潔劑，ZWITTERGENT)、N-十二基-N,N'-二甲基-3-銨基-1-丙烷磺酸鹽、N-十八基-N,N-二甲基-3-銨基-1-丙烷磺酸鹽、N-癸基-N,N-二甲基-3-銨-1-丙烷磺酸鹽、Mirataine CB、Mirataine BB、Mirataine CBR、Mirataine ACS、Miracare 2MHT及Miracare 2MCA。
在較佳之實施態樣中，該蛋白助溶劑係清潔劑。在更佳之實施態樣中，該清潔劑係Tween 20。在仍更佳之實施態樣中，Tween 20係以0.5%之濃度使用。
此處所使用之「離液劑」關於一種擾亂蛋白質之間及蛋白質之內的氫鍵及疏水性交互作用之化合物或化合物之混合物。當以高濃度使用時，離液劑擾亂二級蛋白質結構並使本來不可溶之蛋白質溶於溶液。適當之離液劑包括但不限於尿素、異硫氰酸胍、硫氰化鈉(NaSCN)、鹽酸胍、氯化胍、硫氰酸胍、四氯乙酸鋰、過氯酸鈉、四氯乙酸銣、碘化鉀或三氟乙酸銫。
此處使用之用語「還原劑」係指維持氫硫基之還原狀態且減少分子內或分子間之雙硫鍵之任何化合物或物質。舉例來說，適合用於本發明之方法的還原劑包括氫硫基還原劑或膦還原劑。氫硫基還原劑之實例包括二硫蘇糖醇(DTT)、二硫赤蘚糖醇(DTE)及β-巰乙醇。膦還原劑之實例包括三丁基膦(TBP)及三-羧基乙基膦(TCFP)。
通常，生物樣本首先經處理以移除細胞組分。該不含 細胞之樣本接著與蛋白助溶劑接觸。在較佳之實施態樣中，該樣本係利用包含蛋白助溶劑之緩衝液稀釋。通常，該樣本係利用包含Tween 20之緩衝液稀釋5倍。
此處所使用之「緩衝液」係能中和酸及鹼而不明顯改變溶液之原始酸性或鹼性之溶液中之任何物質或化合物之混合物。適用於本發明之方法之緩衝液包括但不限於Tris緩衝液、磷酸鹽緩衝液、硼酸鹽緩衝液、碳酸鹽緩衝液、甘胺酸-氫氧化鈉緩衝液或該類似物。較佳地，該緩衝液係磷酸鹽緩衝液諸如磷酸鹽緩衝鹽水或PBS。
添加至生物樣本中之含有蛋白助溶劑之溶液之量並不重要，只要達成足夠之β澱粉樣肽解離即可。舉例來說，該生物流體/包含蛋白助溶劑之溶液之稀釋比可能至少為1/2(v/v)、1/3(v/v)、1/4(v/v)、1/5(v/v)、1/6(v/v)、1/7(v/v)、1/8(v/v)、1/9(v/v)、1/10(v/v)、1/20(v/v)、1/50(v/v)、1/60(v/v)、1/80(v/v)、1/90(v/v)、1/100(v/v)或稀釋更多。技藝人士將了解任何該等稀釋比及該蛋白助溶劑濃度之組合皆可被使用，只要該蛋白助溶劑之最後濃度能夠達成該所欲效果即可。舉例來說，包含蛋白助溶劑之溶液可能包含濃度介於0.001%至0.5%(w/v)之該經選擇之蛋白助溶劑。該生物流體在經包含蛋白助溶劑之該溶液稀釋之後通常包含少於0.1%(w/v)、較佳地少於0.6%(w/v)、更佳地不超過0.5%(w/v)、最佳地不超過0.45%(w/v)及甚至最佳地0.5%之該界面活性劑。
用於本發明之適當緩衝系統包括Tris-HCl緩衝液，其 包含諸如氯化鈉(NaCl)或氯化鉀(KCl)之鹽及可任意選擇地BSA。特定緩衝系統包括但不限於下列：50 mM Tris-HCl pH 8，0.5M NaCl，0.05%；BSA，0.05% Tween-20；50 mM Tris-HCl pH 8，0.5M NaCl，0.05%；BSA，0.05% Tween-20，1M GuHCl；50 mM Tris-HCl pH 8，0.5M KCl，0.05%；BSA，0.05% Tween-20；50 mM Tris-HCl pH 8，0.5M KCl，0.05%；BSA，0.05% Tween-20，1M GuHCl；50 mM Tris-HCl pH 8，0.5M NaCl，0.05%；BSA，0.05% Tween-80；50 mM Tris-HCl pH 8，0.5M KCl，0.05%；BSA，0.05% Tween-80；50 mM Tris-HCl pH 8，0.5M NaCl，0.05%；BSA，0.05% Triton X-100；50 mM Tris-HCl pH 8，0.5M KCl，0.05%；BSA，0.05% Triton X-100；50 mM Tris-HCl pH 8；0.05%；BSA，0.05% Tween-20；50 mM Tris-HCl pH 8，0.5M NaCl，0.1%；BSA，0.05% Tween-20；50 mM Tris-HCl pH 8，0.5M NaCl，0.05%；BSA，0.1% Tween-20； 50 mM Tris-HCl pH 8，0.5M NaCl，0.1%；BSA，0.1% Tween-20；50 mM Tris-HCl pH 8，1M NaCl，0.05%；BSA，0.05% Tween-20；50 mM Tris-HCl pH 8，1.5M NaCl，0.05%；BSA，0.05% Tween-20；50 mM Tris-HCl pH 8，2M NaCl，0.05%；BSA，0.05% Tween-20；50 mM Tris-HCl pH 8，2.5M NaCl， 0.05%；BSA，0.05% Tween-20；50 mM Tris-HCl pH 8，3M NaCl，0.05%；BSA，0.05% Tween-20；50 mM Tris-HCl pH 8，0.5M NaCl，0.05%；BSA，0.05% Tween-20，10% DMSO；50 mM Tris-HCl pH 8，0.5M NaCl，0.05%；BSA，0.05% Tween-20，0.5 M GuHCl；50 mM Tris-HCl pH 6，0.5M NaCl，0.05%；BSA，0.05% Tween-20；50 mM Tris-HCl pH 7，0.5M NaCl，0.05%；BSA，0.05% Tween-20；50 mM Tris-HCl pH 9，0.5M NaCl，0.05%；BSA，0.05% Tween-20；50 mM Tris-HCl pH 8，0.5M NaCl，0.05%；BSA
舉例來說，當Tween 20係用來作為蛋白助溶劑時， 該較佳之濃度係0.004至0.02%，更佳為0.005至0.01%(w/v)。
該接觸步驟較佳係於低溫進行，以抑制存在於樣本中之蛋白水解作用。適當溫度係約0至10℃，較佳約3至5℃，例如約4℃。
一旦生物流體與包含蛋白助溶劑之溶液接觸之後，二種流體可被混合。混合可藉由攪拌、較佳地搖晃、更佳地高速搖晃、最佳地震盪至少5秒、較佳地至少10秒、更佳地至少15秒(例如15至50秒)加以實施。該等混合、攪拌、搖晃、高速搖晃或震盪之理想速度包含至少250 rpm、較佳地至少500 rpm、更佳地至少1,000 rpm、最佳地約2,000至2,500 rpm之速度。
該接觸步驟係於能達成該β澱粉樣肽自存在於生物樣本中之蛋白質及脂質部分解離或較佳地完全解離之適當條件下實施。該等條件可由該領域之一般技藝人士在該接觸步驟之前以及在該接觸步驟進行之後的不同時間點逐步監測可檢測之β澱粉樣肽之量加以適當決定。該不同時間點之試驗可如實施方式中之實施例所述進行。
技藝人士將了解，當β澱粉樣肽之量係藉由以包含蛋白助溶劑之緩衝液稀釋生物樣本測定時，由免疫試驗測定之游離β澱粉樣肽之量將必須經過校正，以顧及先前使用於該生物樣品之稀釋因子。
此處所使用之用語「血漿內游離Aβ17、Aβ40或Aβ42肽」(以下分別稱為FP Aβ17、FP Aβ40或FP Aβ42)係指 未與生物樣本中之任何成份相連之β澱粉樣肽之量，其能輕易地被用來與特異性抗體結合。此肽可利用使生物樣本與對該肽具特異性之抗體接觸之習知免疫技術測定。在較佳之實施態樣中，游離澱粉樣肽之量係於血漿測定。
此處所使用之用語「參考值」係指參數之值，其係用於比較，且係於無神經變性疾病或無任何神經變性疾病病史之個體測得。較佳地，不同參數及經計算之參數的參考值所取自之個體係無失憶主訴、神經心理學檢查表現正常及MRI無結構改變之病患。
特別是，參考值係經選擇以允許高於85%之敏感性及高於75%之特異性。在另一較佳之實施態樣中，參考值係經選擇以獲得高於70%之敏感性及高於70%之特異性。較佳地，該參考值允許獲得正確性或精準性至少80%之預測。
一旦參數之值係經測定，若參數之值或經計算之參數之值相較於參考值有所改變，即可據以決定個體是否罹患輕微阿茲海默氏症。
任何適用於測定肽之方法可被用於本發明。舉例來說，β澱粉樣肽之濃度可利用選自下列之一或多種技術測定：西方墨點法、免疫沉澱法、酶連接免疫吸附測定(ELISA)、表面電漿共振、沉澱反應、膠體擴散免疫擴散試驗、放射性免疫測定(RIA)、螢光激活細胞分選(FACS)、二維膠體電泳、毛細管電泳、質譜分析(MS)、基質輔助雷射脫附離子化飛行時間MS(MALDI-TOF) 、表面增強雷射脫附離子化飛行時間(SELDI-TOF)、高效液相層析法(HPLC)、快速蛋白質液相層析法(FPLC)、多維液相層析(LC)接著串聯質譜分析(MS/MS)、薄層層析法、蛋白晶片表現分析及雷射密度分析。
在較佳之實施態樣中，本發明之方法之測定係藉由免疫方法進行。此處所使用之用於測定之「免疫方法」關於任何涉及使用一或多種對標靶物質具特異性之抗體之方法，以測定樣本中之該標靶物質不包括其他物質之量/濃度。適當之免疫方法包括但不限於西方墨點、免疫沉澱、酶連接免疫吸附測定(ELISA)、表面電漿共振、放射性免疫測定(RIA)。在較佳之實施態樣中，β澱粉樣肽之測定或檢測係利用ELISA進行。
技藝人士將了解，任何類型之抗體皆適合用於實施本發明之免疫檢測方法，惟其該抗體對β澱粉樣肽之特異性足以有效地區別β澱粉樣肽與樣本中之其他物質。
此處所使用之用語「ELISA」代表酶連接免疫吸附測定，關於一種將未知量之標靶物質(β澱粉樣肽)固定於表面上，接著利用特異性抗體沖洗過該表面以使該抗體可與該抗原結合之測定。此抗體係與酶連接，在最後步驟添加物質以使該酶可將其轉換成某些可檢測之信號。不同類型之ELISA測定係已知且可被應用於本發明之方法，包括直接ELISA、三明治式ELISA、競爭型ELISA及ELISA反向方法及裝置(ELISA-R m&d)。
直接ELISA之執行方式係使包含β澱粉樣肽之測試樣 本與固體支持物接觸，該固體支持物已先經非反應性蛋白質或試劑(牛血清白蛋白，酪蛋白)之濃縮溶液包覆。一旦存在於測試樣本中之β澱粉樣肽係吸附於支持物上，對β澱粉樣肽具特異性之抗體係於適合與該β澱粉樣肽結合之條件下加入。該經結合之抗體接著利用二級抗體檢測，該二級抗體係與可檢測之標籤或受質改質酶偶合。自該可檢測之標籤或該受質產生之信號係與結合至支持物上之抗體量成正比，該抗體量又與該樣本中之β澱粉樣肽之量直接相關。
競爭型ELISA測定之第一步驟係使包含未知量之β澱粉樣肽的測試樣本與如上定義之第一抗體接觸。該抗體-抗原複合體被添加至經抗原包覆之孔。一旦該支持物經清洗以移除任何非特異性結合之複合體，該第一抗體之量係利用與可檢測之基團偶合之第二抗體檢測。在此種測定中，原始抗原之濃度越高，最後信號之強度越弱。另一種競爭型ELISA測定係包括酶連接之抗原而非酶連接之抗體。該經標記之抗原與該樣本抗原(未經標記)競爭一級抗體之結合部位。在此種測定中，樣本中之抗原濃度導致與孔槽中經標記之抗原的量呈反比，因此導致較弱信號。
ELISA反向方法及裝置(ELISA-R m&d)利用有4至12個突出卵形頭(ogive)之免疫吸附性聚苯乙烯桿作為創新之固體相，該整個裝置適合被導入含有採集樣本之測試試管中，後續步驟(清洗、共軛培養及呈色培養)可輕易地藉由將該卵形頭浸入標準微量盤之孔槽中進行，該微 量盤事先裝填試劑、密封及儲存直到使用。
在較佳之實施態樣中，該ELISA測定係ELISA三明治式測定。ELISA三明治式測定涉及利用對β澱粉樣肽具特異性之第一抗體包覆支持物，加入含有該β澱粉樣肽之樣本(此將導致該β澱粉樣肽與該第一抗體結合)，及加入亦對該β澱粉樣肽具特異性之第二抗體，其中該第二抗體通常係與可檢測之標籤或受質改質酶偶合。由該標籤或經轉變之受質產生之信號與樣本中之抗原量成正比。
本方法之不同步驟最好同時利用欲測定之樣本及一些參考樣本進行，該些參考樣本具有已知濃度之該預測定之化合物。Aβ17肽之標準曲線必須利用漸增之濃度製備以決定上述參數之濃度。該標準曲線符合二種目的：(i)建立信號隨標靶肽之濃度線性增加之濃度範圍，及(ii)藉由將測試樣本或標準樣本獲得之信號內插至曲線以獲得濃度值，以測定測試樣本中之肽濃度。由於本發明之測定具高敏感性，該測試樣本之較佳濃度係例如3.125、6.25、12.5、25、50、100及200 pg/mL。將了解的是，用於獲得標準曲線之樣本的濃度將隨各種測試受質而異。然而，決定該測定之線性範圍可輕易地由技藝人士以習用手段決定。
用語「改變」係指考慮之參數值相較於參考值呈統計顯著性增加或減少。
此處所使用之「統計顯著性」關於二或多個結果、終點或後果之間非隨機相關之可能性的統計分析，即以一定程 度之數學保證某參數之值相較於參考值係與特定病患族群有關。
數值改變之統計顯著性可利用p值決定。舉例來說，在使用p值時，當p值小於0.1、較佳地小於0.05、更佳地小於0.01、甚至更佳地小於0.005、最佳地小於0.001時，參數被認為顯示顯著改變。
通常，當所考慮之參數值超過參考值至少1.1倍、1.5倍、5倍、10倍、20倍、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍、100倍、或甚至超過該參考值更多倍時，該值可被視為「增加」。另一方面，當參數值係參考值之至少0.9倍、0.75倍、0.2倍、0.1倍、0.05倍、0.025倍、0.02倍、0.01倍、0.005倍、或甚至更低時，該值可被視為「減少」。在特定實施態樣中，參數值或經計算之參數值相較於參考值之改變係增加。
本發明之其他實施態樣係如下述：
[1]一種抗體，其與Aβ(1-17)肽特異性結合。
[2]如[1]所述之抗體，其未顯示對選自下列Aβ肽或彼等之一或多者之組合的實質交叉反應性：Aβ(1-15)、Aβ(1-16)、Aβ(1-38)、Aβ(1-40)及Aβ(1-42)。
[3]如[1]或[2]所述之抗體，其係多株抗體。
[4]如[1]至[3]中任一者所述之抗體，其中該抗體係利用選自SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2之Aβ肽作為免疫原獲得。
[5]一種檢測Aβ(1-17)肽之套組，該套組包含： (i)第一抗體，其係如[1]至[3]中任一者之抗體，及(ii)第二抗體，其辨識該Aβ(1-17)肽之與該第一抗體所辨識之區域不同之區域。
[6]如[5]之套組，其中該第一或第二抗體係與結合對之第一成員偶合。
[7]如[6]之套組，其另包含該結合對之第二成員，其中該結合對之第二成員係與可檢測之標籤偶合。
[8]如[7]之套組，其中若該與結合對之第二成員偶合之可檢測之標籤係酶標籤，則該套組另包含可被該酶轉換成可檢測產物之受質。
[9]如[5]至[8]中任一者之套組，該套組另包含與Aβ40及/或Aβ42特異性結合之抗體或抗體之組合。
[10]如[5]至[9]中任一者之套組，該套組另包含固體支持物。
[11]如[10]之套組，其中未與結合對之第一成員偶合之抗體係與該固體支持物預結合。
[12]如[5]至[11]中任一者之套組，其另包含含有Aβ17、Aβ40及/或Aβ42肽之樣本。
[13]一種測定或檢測樣本中Aβ(1-17)肽之方法，該方法包含下列步驟：(i)利用第一抗體捕捉存在於樣本中之Aβ(1-17)肽，該第一抗體與該肽特異性結合，(ii)使步驟(i)形成之免疫複合體與第二抗體接觸，其中該第二抗體係如[1]至[4]中任一者所定義 者，其中該第二抗體辨識與該第一抗體不同之區域且與結合對之第一成員偶合，(iii)使步驟(ii)形成之複合體與結合對之第二成員接觸，該結合對之第二成員係與可檢測之標籤偶合，及(iv)檢測或測定該可檢測之標籤的活性或量。
[14]如[13]至[17]中任一者之方法，其中該生物樣本係選自血液、血清、血漿或CSF。
[15]如[1]至[12]中任一者之套組或如[13]或[14]之方法，其中該第一抗體係單株抗體。
[16]如[15]之套組或方法，其中該單株抗體係6E10抗體。
[17]如[1]至[16]中任一者之套組或方法，其中該結合對之第一成員係生物素，該結合對之第二成員係抗生物素蛋白、鏈黴抗生物素蛋白或彼等之功能性相等變異體。
[18]如[1]至[17]中任一者之套組或方法，其中該可檢測之標籤係螢光分子、發光分子或酶。
[19]一種監測個體之神經變性疾病之方法，該方法包含：(a)在第一時間點測定該個體之血漿樣本內游離Aβ17肽量及該個體之血液樣本內與細胞結合之Aβ17肽量，(b)在第二時間點測定該個體之血漿樣本內游離Aβ17肽量及該個體之血液樣本內與細胞結合之 Aβ17肽量，及(c)比較該第一及第二時間點之血漿樣本內游離Aβ17肽量與血液樣本內與細胞結合之Aβ17肽量之比率，其中若第二時間點之該比率相較於第一時間點者增加，表示該個體之阿茲海默(Alzheimer)氏症在該第一與該第二時間點之間惡化。
[20]如[19]之方法，其中該神經變性疾病係阿茲海默氏症。
[21]如[19]或[20]中任一者之方法，其中測定Aβ17肽之量係藉由ELISA實施。
[22]如[21]之方法，其中Aβ17肽量之測定係利用如[13]至[18]中任一者之方法進行。
[23]一種測定個體是否罹患輕微阿茲海默氏症之方法，該方法包含測定選自下列之一或多項參數之值：(a)該個體之血液樣本內與細胞結合之Aβ17、Aβ40及Aβ42肽量的相加值，(b)該個體之血漿樣本內Aβ17、Aβ40及Aβ42肽總量及該個體之血液樣本內與細胞結合之Aβ17、Aβ40及Aβ42肽量的相加值，(c)該個體之血漿樣本內Aβ42肽總量及該個體之血液樣本內與細胞結合之Aβ42肽量的相加值，(d)該個體之血漿樣本內Aβ40及Aβ42肽總量及該個體之血液樣本內與細胞結合之Aβ40及Aβ42 肽量的相加值，及(e)該個體之血漿樣本內游離Aβ17肽量與該個體之血液樣本內與細胞結合之Aβ17肽量的比值，其中若該等參數之一或多者之值相較於健康個體之參考樣本的該等參數值增加，則該個體罹患輕微阿茲海默氏症。
[24]一種測定個體是否罹患伴隨前驅性阿茲海默氏症之輕微認知障礙(MCI)之方法，該方法包含測定選自下列之一或多項參數之值：(a)該個體之血漿樣本內Aβ42肽總量及該個體之血液樣本內與細胞結合之Aβ42肽量的相加值，(b)該個體之血漿樣本內Aβ40及Aβ42肽總量及該個體之血液樣本內與細胞結合之Aβ40及Aβ42肽量的相加值，(c)該個體之血漿樣本內游離Aβ17肽量與該個體之血液樣本內與細胞結合之Aβ17肽量的比值，(d)血液樣本內與細胞結合之Aβ17肽量與血液樣本內與細胞結合之Aβ42肽量的比值，(e)二參數之比值，其中第一參數對應血漿樣本內Aβ17肽總量和血液樣本內與細胞結合之Aβ17肽量的相加量，且第二參數對應血漿樣本內Aβ42肽總量和血液樣本內與細胞結合之Aβ42肽量的相加量，(f)二參數之比值，其中第一參數對應血液樣本內與 細胞結合之Aβ17肽量，且第二參數對應血液樣本內與細胞結合之Aβ40肽量與血液樣本內與細胞結合之Aβ42肽量的相加量，及(g)二參數之比值，其中第一參數對應該個體之血漿樣本內Aβ17肽總量和血液樣本內與細胞結合之Aβ17肽量的相加量，且第二參數對應血漿樣本內Aβ40及Aβ42肽總量和血液樣本內與細胞結合之Aβ40及Aβ42肽量的相加量，其中若參數(a)、(b)或(c)之一或多者之值相較於健康個體之參考樣本之值增加，及/或參數(d)、(e)、(f)或(g)之一或多者之值相較於健康個體之參考樣本之值減少，該個體罹患伴隨前驅性阿茲海默氏症之MCI。
[25]一種區別罹患伴隨非前驅性阿茲海默氏症之MCI之個體與罹患伴隨前驅性阿茲海默氏症之MCI之個體之方法，該方法包含測定選自下列之一或多項參數之值：(a)該個體之血液樣本內與細胞結合之Aβ17、Aβ40及Aβ42肽量的相加值，(b)該個體之血液樣本內與細胞結合之Aβ17肽量與該個體之血液樣本內與細胞結合之Aβ42肽量的比值，(c)二參數之比值，其中第一參數對應該個體之血漿樣本內Aβ17肽總量和血液樣本內與細胞結合之Aβ17肽量的相加值，且第二參數對應該個體之 血漿樣本內Aβ42肽總量和血液樣本內與細胞結合之Aβ42肽量的相加值，(d)二參數之比值，其中第一參數對應血液樣本內與細胞結合之Aβ17肽量，且第二參數對應血液樣本內與細胞結合之Aβ40和Aβ42肽量的相加值，及(e)二參數之比值，其中第一參數對應該個體之血漿樣本內Aβ17肽總量和血液樣本內與細胞結合之Aβ17肽量的相加值，且第二參數對應血漿樣本內Aβ40及Aβ42肽總量和血液樣本內與細胞結合之Aβ40及Aβ42肽量的相加值，其中若(a)之值相較於罹患伴隨非前驅性阿茲海默氏症之MCI之個體的參考樣本之值增加及/或該等參數(b)、(c)、(d)或(e)之一或多者之值相較於罹患伴隨非前驅性阿茲海默氏症之MCI之個體的參考樣本之值減少，該個體罹患伴隨前驅性阿茲海默氏症之MCI。
[26]一種區別罹患伴隨非前驅性阿茲海默氏症之MCI之個體與罹患輕微阿茲海默氏症之個體之方法，該方法包含測定選自下列之一或多項參數之值：(a)血液樣本內與細胞結合之Aβ17、Aβ40及Aβ42肽量的相加值，(b)血漿樣本內Aβ17、Aβ40及Aβ42肽總量和血液樣本內與細胞結合之Aβ17、Aβ40及Aβ42肽量的相加值， (c)血漿樣本內Aβ42肽總量和血液樣本內與細胞結合之Aβ42肽量的相加值，(d)血漿樣本內Aβ40及Aβ42肽總量和血液樣本內與細胞結合之Aβ40及Aβ42肽量的相加值，(e)血漿樣本內Aβ40肽總量和血液樣本內與細胞結合之Aβ40肽量的相加值，(f)二參數之比值，其中第一參數對應血液樣本內與細胞結合之Aβ17肽量，且第二參數對應血液樣本內與細胞結合之Aβ40和Aβ42肽量的相加值，及(g)血漿樣本內游離Aβ17肽量與血液樣本內與細胞結合之Aβ17肽量的比值，其中若該等參數之一或多者之值相較於罹患伴隨非前驅性阿茲海默氏症之MCI之個體之參考樣本的該等參數值增加，則該個體罹患輕微阿茲海默氏症。
[27]一種區別罹患伴隨前驅性阿茲海默氏症之MCI之個體與罹患輕微阿茲海默氏症之個體之方法，該方法包含測定選自下列之一或多項參數之值：(a)血漿樣本內游離Aβ17肽量與血漿樣本內游離Aβ40肽量的比值，或(b)二參數之比值，其中第一參數對應血漿樣本內游離Aβ17肽量，且第二參數對應血漿樣本內游離Aβ40和Aβ42肽量的相加值，其中若該等參數之一或多者之值相較於前驅性輕微認 知障礙個體之參考樣本的該等參數值增加，則該個體罹患輕微阿茲海默氏症。
[28]如[23]至[27]中任一者之方法，其中Aβ17、Aβ40及Aβ42肽量之一或多者之測定係藉由ELISA實施。
下列實施例係示範說明之用，不應被視為限制本發明之範圍。
實施例1 產製抗Aβ17抗體
四隻兔子係利用肽VHHQKL(對應Aβ(12-17)(SEQ ID NO：2))及EVHHQKL(對應Aβ(11-17)(SEQ ID NO：3))免疫接種，其中兩隻以第一肽接種，另外兩隻以第二肽接種。兩種肽皆在N端包含額外之胺基酸半胱胺酸以供共軛。
用於共軛之載劑係鑰孔狀帽貝血藍素(KLH)(皮爾斯(Pierce)公司，產品編號77600)。該共軛係利用交聯劑NHS-PEG4-順丁烯二醯亞胺進行(Pierce，產品編號22104)。至於佐劑，使用三種佐劑：完全弗氏(Freund's)佐劑(西格瑪(Sigma)公司，產品編號F5881)、不完全弗氏佐劑(Sigma，產品編號F5506)及Imject明礬(Pierce，產品編號77161)。
免疫接種之程序如下：
- 該四隻兔子每周利用100 μg之肽進行免疫接種。
- 第一劑係利用完全弗氏佐劑作為佐劑投予，接著 第二劑利用不完全弗氏佐劑及第三劑利用明礬作為佐劑。
- 在前三次投予之後，所獲得之抗體力價過低而無法純化。因此，增加肽之劑量至200 μg以另外投予三次，改變佐劑為：不完全弗氏佐劑-明礬-不完全弗氏佐劑。
- 在四隻兔子獲得之抗體力價非常高，利用親和性層析(使用Aβ17肽)進行純化。
進行圓點墨點以測定抗Aβ17抗體之特異性，其中包括其他Aβ肽(圖1)。該抗Aβ17抗體係以二種稀釋比添加(1：1000及1：2000)，所使用之二級抗體係山羊抗兔HRP 1：2000。500 ng之各肽係添加至2.5 μl中。該圓點墨點係於1分鐘及3分鐘暴露後利用SNAP技術以ECL呈色。如該圖所示，該抗體對Aβ17肽具高度特異性，且無法特異性辨識Aβ15、Aβ16、Aβ38、Aβ40及Aβ42。
實施例2 測定樣本中之Aβ17肽 (1)質譜儀測定 試劑
甲酸、氯化鈉、α-氰基-4-羥基肉桂酸(α-CHCA)、三氟乙酸(TFA)、DL-二硫蘇糖醇(DTT)、三乙醇胺、Tris及牛血清白蛋白(BSA)係來自西格瑪(Sigma)公司(德國史坦海姆(Steimheim,Germany))。乙腈係購自卡羅爾巴(Carlo-Erba)公司(義大利米蘭省羅丹諾市(Rodano,MI,Italy))。二甲基庚二亞胺二鹽酸鹽(DMP )係得自Pierce公司(美國伊利諾州羅克福市(Rockford,IL))。三(羥甲基)甲基甘胺酸樣本緩衝液係購自Bio-Rad公司(美國加州赫克利斯市(Hercules,CA))。
免疫沉澱(IP)程序
IP-MALDI程序係如Portelius et al.2007(J.Proteome.Res.6(11),4433-4439)所述實施，並加入一些修改以使該程序適用於分析犬樣本。首先，使用不同量之Aβ特異性抗體(6E10及4G8分別對胺基酸4-9及18-22之Aβ表位具特異性，席內實驗室(Signet Laboratories)公司，美國麻塞諸塞州德哈姆市(Dedham,MA))及SAR2(對抗Aβ40羧基端表位具特異性，艾拉克隆生物技術(Araclon Biotech S.L.)公司，西班牙薩拉戈薩(Zaragoza,Spain))以利用西方墨點法測定各抗體之理想量。該最優化程序涉及不同步驟。每種抗體根據廠商說明書被分開添加至50 μL Dynabeads Protein G(英維特基戴諾(Invitrogen Dynal AS)公司，挪威奧斯陸市(Oslo,Norway))。磁珠與不同量之抗體培養、清洗，接著在含有DTT之三(羥甲基)甲基甘胺酸樣本緩衝液中煮沸磁珠以洗脫抗體。各種抗體之飽和量係藉由西方墨點法測定。
另外，磁珠與抗體及該複合體磁珠-抗體與樣本之培養時間(1小時及隔夜)及溫度(4℃、室溫及37℃)亦經最優化。另一最優化之參數係洗脫條件(0.5、2.5及5% 甲酸，以及數個百分比之有機溶劑諸如乙腈)。
二種不同程序係用於本試驗。第一程序基本上根據廠商說明配合最優化參數進行：一等分之Aβ特異性抗體(4μg之6E10或8μg之4G8或6μg之SAR 2)係與50μL之Dynabeads Protein G於室溫中旋轉振盪器培養1小時。之後，以磷酸鹽緩衝鹽水清洗三次(PBS：1mM NaH2PO4 H2O，5 mM Na2HPO4‧2H2O，138mM NaCl)。添加1 mL之CSF，於室溫中旋轉振盪器培養隔夜。在培養後藉由磁鐵之幫助(DynaMag-2或DynaMag-15，Invitrogen Dynal AS公司，挪威奧斯陸市)自磁珠移除CSF並予以丟棄。用1 mL 100mM Tris pH=6.8清洗磁珠三次，最後用25 μL之5%甲酸進行洗脫。該洗出液係於室溫中之恆溫混合器中培養5分鐘。該經洗出之化合物係經ZipTip C18吸頭(密里博(Millipore)公司，美國麻塞諸塞州畢萊卡市(Billerica,MA))去鹽。該ZipTip C18程序包括數個步驟：利用乙腈溶合吸頭，以0.1%TFA條件化(重複此步驟數次)，裝載樣本(以吸頭抽吸數次)，0.1% TFA之清洗步驟及最後以3μL之α-CHCA(5 mg/mL)洗脫。
在第二程序中，檸檬酸磷酸鹽緩衝液pH=5.0(24.5mM檸檬酸，52mM Na2HPO4‧2H2O)取代PBS被用於清洗及結合步驟。在洗脫之前，磁珠係以PBS清洗，而非使用100 mM Tris pH=6.8。此第二程序導致較低背景雜訊及較強波峰之質譜，因此被用於後續其他實驗。
在免疫沉降人樣本時，50 μl之Dynabeads綿羊抗小 鼠磁珠(Invitrogen Dynal AS公司，挪威奧斯陸市)係經使用。磁珠以PBS清洗三次，然後與理想量之特異性抗體(8 μg之6E10或8 μg之4G8)於室溫中旋轉振盪器中培養1小時。之後清除上清液，用1mL之0.2 M三乙醇胺pH=8.2清洗磁珠。在添加1 mL之20mM DMP(具有胺反應基之同型雙官能性交聯劑(Greg T Hermanson,2010))至0.2 M三乙醇胺pH=8.2後發生交聯反應。磁珠及抗體係於室溫中培養30分鐘，接著丟棄上清液，藉由添加1 mL之50mM Tris pH=7.5至旋轉振盪器15分鐘以停止該反應。該經交聯之磁珠用含0.1% BSA之1ml PBS清洗三次。添加1 mL之組合人CSF，於室溫中隔夜培養。丟棄上清液，用PBS清洗磁珠數次。用25 μL之5%甲酸洗脫Aβ肽。該經洗出之化合物係利用和上述相同之程序經ZipTip C18去鹽。
MALDI-TOF及MALDI-TOF/TOF質譜分析(MS)
取0.7 μl之該經洗脫之樣本直接加樣於MALDI標靶上待其完全蒸發。所有質譜皆利用ABI4800 MALDI-TOF/TOF質譜儀(AB/Sciex)取得，該質譜儀配備工作重複率200 Hz之二極體激發固態Nd：YAG雷射(355 nm)。要獲得MS譜圖，該儀器係於反射模式操作，所有實驗皆在正離子模式進行。雷射發射400奈秒之後，施予20 kV之加速電壓。離子再聚焦於二階段反射器，最後於第二檢測器檢測。鏡面2與來源1電壓之比值維持固定於 1.105。要得到MS/MS，來源1電壓維持於8 kV，雷射值設定於高出MS實驗1000單位。前驅離子係經選擇以利用時間離子選擇器(Timed Ion Selector)於解析度250(半峰全寬)碎裂。經選擇之離子在到達碰撞室之前於減速電極處減速，在以1 keV之動能與空氣碰撞時解離(高能碰撞誘導解離)。經短暫延遲時間後，碎裂之離子於第二來源以15 kV被再度加速。在所有MS/MS實驗中啟動亞穩離子抑制器(Metastable Suppressor)以避免偵測到其餘前驅離子及非所欲之亞穩衰變片段。資料瀏覽(Data Explorer)軟體係用於圖譜處理(平滑化及/或雜訊過濾)。僅報告單同位素m/z比。質譜儀係經廠商提供之肽混合物外部校正，涵蓋900至4000 Da之質量範圍。若需要時，該儀器係經胰島素(M+H+=5730.609 Da)校正。
腦脊液(CSF)樣本及血漿樣本之質譜分析結果係顯示於圖2，其中對應Aβ17之波峰係以箭頭標示。
(2)ELISA測定 試劑及溶液
- 人來源之β-澱粉樣1-17標準物。20 ng/ml之原液。
- 微量盤經最優化以吸附抗體至彼之表面。
- 對人Aβ肽之NH2端具特異性之捕捉單株抗體(6E10抗體)。
- 特異性辨識結束於胺基酸17之人Aβ肽之經生物 素共軛之檢測多株抗體。
- 鏈黴抗生物素蛋白-HRP共軛物之擴增溶液。
- 穩定之色原體TMB。
- 包覆緩衝液：100mM Na2CO3/NaHCO3 pH 9.6。
- 清洗緩衝液：50mM Tris，0.05% Tween20，150mM NaCl，pH 8.0。
- 封閉緩衝液：50mM tris，0.2% Tween20，0.5% BSA，pH 8.0。
- 保存溶液：20mg/ml海藻糖，50mM tris，pH 8.0。
- 抗體稀釋劑：50mM tris，0.05% BSA，0.5M NaCl，0.05% Tween20，pH 8.0。
- PBST：80mM Na2HPO4，20mM NaH2PO4，100mM NaCl，0.5% Tween20，pH 7.5。
- 標準/樣本稀釋劑：合成性封閉試劑1：100於PBST中。
- 停止溶液：1N H2SO4。
方法
該微量盤係利用6E10單株捕捉抗體包覆，該抗體辨識Aβ澱粉樣肽之胺基酸1至17。使用濃度係根據該抗體之飽和濃度決定，因此不會是該抗原-抗體反應之限制因子。就此目的而言，於450nm之吸光度係與各孔中之抗體濃度有關，藉由加入經HRP共軛之抗小鼠IgG抗體於室溫中搖晃培養1小時，添加色原體受質培養後停止反應以 監測吸附於孔槽中之抗體。選擇信號不再隨抗體濃度增加而增加之濃度。
一旦選擇飽和濃度，該微量盤係經100μl之於包覆緩衝液中之捕捉抗體包覆，於4℃隔夜(ON)培養大約20小時。
該盤接著以清洗緩衝液清洗5次，每孔添加300μl之封閉緩衝液。孔盤於室溫(RT)中培養3小時。
該盤接著以清洗緩衝液清洗5次，每孔添加100μl之保存溶液。靜置孔盤待液體蒸發，直到出現白色光圈狀海藻糖(室溫中2至3天)。經如此處理之孔盤可用鋁箔覆蓋保存於4℃，將可穩定保存二年。
樣本製備
樣本可未經稀釋使用或經樣本/標準稀釋劑以1：2至1：10稀釋後使用。血漿樣本建議稀釋1：3，血液細胞樣本建議稀釋1：5。要確保正確定量，標準曲線及空白樣本必須以和樣本使用之相同稀釋劑或緩衝液製備。
人Aβ17(hAβ17)之標準曲線之樣本係利用肽Aß17之200 pg/ml原液於包覆6E10 mAb及經海藻糖處理之孔盤上製備。在這些溶液中，利用樣本/標準稀釋劑連續稀釋1：2，以得到200、100、50、25、12.5、6.25及3.125 pg/ml之濃度。添加100 μl之各樣本，於4℃隔夜培養(或於37℃培養2小時)。
檢測步驟
檢測抗體係經生物素共軛之抗人Aβ肽之多株抗體，該人Aβ肽結束於胺基酸17。該抗體與生物素之共軛發生在活化步驟之後，並於RT暗室中隔夜培養。多餘之生物素係於後續步驟不活化。該檢測抗體係經抗體稀釋劑稀釋後添加。各孔添加100 μl，接著於室溫中搖晃培養1小時。接著，100 μl之經抗體稀釋劑1/50稀釋之經HRP偶合之鏈黴抗生物素蛋白(來自SIGMA公司)被添加至各孔，於室溫中搖晃培養1小時。100 μl之顯色受質TMB(ZEU Inmunotec公司)係用於使孔盤顯色。添加TMB後於暗處培養45分鐘。每孔加入50 μl之停止溶液。於450 nm之吸光度係於孔盤讀取儀Synergy HT(BioTek Instruments公司)上讀取。
Aβ17定量
結果可利用任何免疫測定套裝軟體計算。用於曲線擬合之方法係線性回歸，Aβ17之濃度係如下述計算：
(i)如下述計算各標準稀釋及樣本之平均淨OD：平均淨OD(nm)=平均結合OD(nm)-平均零OD(nm)。
(ii)在方格紙上，以標準稀釋之平均淨OD(nm)對Aß標準物之濃度(pg/ml)作圖。畫出這些點之最佳曲線以建構標準曲線。
(iii)在未知樣本及對照中之Aß濃度可藉由標準曲線 內插決定。
(iv)將樣本獲得之數值乘以各樣本之稀釋因數。
(v)產生高於200 pg/ml標準物之信號的樣本將被進一步稀釋及測定。
實施例3 偵測及定量極限之可再現性及測定
為了分析該免疫測定之可再現性，測量血漿樣本之盤內變異性、測定內變異性、測定間變異性及細胞樣本內之測定間變異性。
該盤內變異性係藉由分析相同盤內樣本、標準樣本及參考樣本之三重孔槽之間的差異計算。在測定內可再現性方面，在相同測定中分析11個不同孔盤所得到之4個參考血漿樣本之濃度係經比較。在血漿樣本之測定間變異性方面，在二個不同且獨立之測定中分析二個血漿樣本所得到之濃度差異係經測量。在細胞樣本內之測定間變異性係指8個細胞對照樣本之二個不同且獨立測定之間的Aβ17量之比較。
得到之結果顯示於表1：
偵測極限(DL)及定量極限(QL)係由二種不同方法計算：
(a)方法1：
DL=濃度blank+3σblank
QL=濃度blank+10σblank
(b)方法2：
DL=3.3 σblank/m
QL=10σblank/m
其中σblank係空白樣本之標準差，m係校正線之斜率。
利用二種方法得到之偵測極限(DL)及定量極限( QL)係顯示於表2：
實施例4 AD診斷與Aβ17/Aβ40/Aβ42量之間的相關性
來自年齡超過65歲之對照健康個體(CS>65或HC>65)世代(19名個體)、來自罹患輕微阿茲海默氏症(輕微AD)之個體世代(17名個體)、來自罹患前驅性或疑似輕微認知障礙(MCI)之個體世代(16名個體)及來自罹患非前驅性或可能為輕微認知障礙(MCI)之個體世代(16名個體)的血漿樣本之Aβ17、Aβ40及Aβ42量係利用實施例1所述之ELISA三明治式法測定。得到之該 等肽之濃度(pg/mL)係顯示於圖3A、圖4A、圖5A及圖6A之表。
輕微AD個體之血漿內Aβ17、Aβ40及Aβ42肽量(血漿內總肽+與細胞結合之肽(PIB(17+40+42))與對照健康個體及可能或非前驅性MCI之個體兩者有顯著差異。然而，HC>65個體與疑似MCI之個體之間的標記PIB(17+40+42)並無差異，但二者之PIB(40+42)則有高度顯著差異(圖3B)。
其他將被測量而能區別不同組之重要參數係下列參數(圖3、4、5及6)：
- 與細胞結合之Aβ17、Aβ40及Aβ42肽量(CB(14+40+42))。如圖3所示，這些與細胞結合之肽的量在疑似MCI及輕微AD之個體高於可能為MCI及健康之個體。可能可以高度顯著地區別健康個體與輕微AD、區別可能為MCI與疑似MCI，以及區別可能為MCI與輕微AD。
- 血漿內Aβ42總肽量+與細胞結合之Aβ42肽量(TP42+CB42)。如圖3所示，這些標記之量在疑似MCI及輕微AD之個體高於可能為MCI及健康之個體。可能可以高度顯著地區別健康個體與輕微AD或疑似MCI，以及區別可能為MCI與輕微AD。
- 血漿內Aβ40總肽量+與細胞結合之Aβ40肽量(TP40+CB40)。如圖3所示，這些標記之量在疑似MCI及輕微AD之個體高於可能為MCI及健康之個體。可能可以高度顯著地區別可能為MCI與輕微AD。
- 血漿內游離Aβ17肽量與血漿內游離Aβ40肽量之比(FP17/40)能區別疑似MCI與輕微AD(圖4)。
- 與細胞結合之Aβ17肽量及與細胞結合之Aβ42肽量之比(CB17/42)能區別健康個體或可能為MCI之個體與疑似MCI(圖4)。
- 血漿內Aβ17總肽量+與細胞結合之Aβ17肽量與血漿內Aβ42總肽量+與細胞結合之Aβ42肽量之比(TP17+CB17/TP42+CB42)能區別健康個體或可能為MCI之個體與疑似MCI(圖4)。
- 血漿內游離Aβ17肽量與血漿內游離Aβ40及Aβ42肽量之比(FP17/FP40+FP42)能區別疑似MCI與輕微AD(圖5)。
- 與細胞結合之Aβ17肽量及與細胞結合之Aβ40及Aβ42肽量之比(CB17/CB40+CB42)能區別健康個體或可能為MCI之個體與疑似MCI及區別健康個體與輕微AD(圖5)。
- 血漿內Aβ17總肽量+與細胞結合之Aβ17肽量與血漿內Aβ40及Aβ42總肽量之比(PIB(40+42))能區別健康個體或可能為MCI之個體與疑似MCI(圖5)。
- 血漿內游離Aβ17肽量及與細胞結合之Aβ17肽量之比(FP17/CB17)能區別健康個體或可能為MCI之個體與輕微AD，及區別健康個體與疑似MCI(圖6)。所有Aβ17比值之統計分析(U曼-惠特尼(Mann-Whitney)檢定)顯示僅血漿內游離標記Aβ17肽量/與細胞結合之 Aβ17肽量(FP17/CB17)具統計顯著差異(見表3)。
同樣地，血漿內游離Aβ17肽量及與細胞結合之Aβ17肽量之比值和AD進展之間有相關性。認知障礙越嚴重，血漿內游離Aβ17肽量越高，因此血漿內游離Aβ17肽量及與細胞結合之Aβ17肽量之比值(FP17/CB17)亦越高。
圖1顯示圓點墨點試驗之結果，利用多株抗Aβ(1-17)抗體及吸附於膜之不同的Aβ肽進行。用於此試驗之二級抗體係山羊抗兔抗體-HRP。該圓點墨點係於1分鐘及3分鐘暴露後利用SNAP技術以ECL呈色。
圖2顯示CSF樣本(2A)及血漿樣本(2B)之質譜分析，其中Aβ17波峰係以箭頭標示。
圖3顯示不同病患組中之一些標記的平均值。FP：血 漿內游離Aβ；TP：血漿內總Aβ；CB：與細胞結合之Aβ；PIB：血中之總和(血漿內總Aβ+與細胞結合之Aβ)。(A)不同組別利用三明治式ELISA所獲得之Aβ標記之濃度(以pg/mL表示)：CS>65(年齡超過65歲之健康個體)、可能為MCI(罹患伴隨可能或非前驅性AD之輕微認知障礙之個體)、疑似MCI(罹患伴隨疑似或前驅性AD之輕微認知障礙之個體)及輕微AD(罹患輕微阿茲海默氏症之個體)。(B)及(C)：顯示不同組別之一些標記以ELISA分析獲得之吸光度。
圖4顯示不同病患組中之一些標記的平均值。FP：血漿內游離Aβ；TP：血漿內總Aβ；CB：與細胞結合之Aβ；PIB：血中之總和(血漿內總Aβ+與細胞結合之Aβ)。(A)不同組別利用三明治式ELISA所獲得之Aβ標記之濃度比(以pg/mL表示)：CS>65(年齡超過65歲之健康個體)、可能為MCI(可能或非前驅性輕微認知障礙)、疑似MCI(疑似或前驅性輕微認知障礙)及輕微AD(輕微阿茲海默氏症)。(B)圖顯示不同組別之一些標記以ELISA分析獲得之吸光度。
圖5顯示不同病患組中之一些標記的平均值。FP：血漿內游離Aβ；TP：血漿內總Aβ；CB：與細胞結合之Aβ；PIB：血中之總和(血漿內總Aβ+與細胞結合之Aβ)。(A)不同組別利用三明治式ELISA所獲得之Aβ標記之濃度比(以pg/mL表示)：CS>65(年齡超過65歲之健康個體)、可能為MCI(可能或非前驅性輕微認知障 礙)、疑似MCI(疑似或前驅性輕微認知障礙)及輕微AD(輕微阿茲海默氏症)。(B)圖顯示不同組別之一些標記以ELISA分析獲得之吸光度。
圖6顯示用來區別不同組別之血漿內游離Aβ17(FP)及與細胞結合之Aβ17(CB)之比。(A)不同組別利用三明治式ELISA所獲得之Aβ標記之濃度(以pg/mL表示)：CS>65(年齡超過65歲之健康個體)、可能為MCI(可能或非前驅性輕微認知障礙)、疑似MCI(疑似或前驅性輕微認知障礙)及輕微AD(輕微阿茲海默氏症)。(B)圖顯示不同組別之該標記以ELISA分析獲得之吸光度。
<110> 亞拉克隆生物技術有限公司(ARACLON BIOTECH,S.L.)
<120> 測定澱粉樣肽之抗體、套組及方法
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<212> PRT
<213> 人工序列
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<223> 用於製備抗Aβ17特異性多株抗體之肽
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<213> 人工序列
<220>
<223> 用於製備抗Aβ17特異性多株抗體之肽
<400> 3
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<212> PRT
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<400> 5
<210> 6
<211> 40
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 6

Claims (15)

  1. 一種抗體，其與β澱粉樣(Aβ)(1-17)肽之胺基酸11至17或12至17的表位特異性結合，且不與Aβ(1-17)肽之胺基酸4至9的表位結合，且其未顯示對選自下列Aβ肽或彼等之一或多者之組合的交叉反應性：Aβ(1-15)、Aβ(1-16)、Aβ(1-38)、Aβ(1-40)及Aβ(1-42)。
  2. 如申請專利範圍第1項之抗體，其係多株抗體。
  3. 如申請專利範圍第1項之抗體，其係單株抗體。
  4. 一種檢測Aβ(1-17)肽之套組，該套組包含：(i)第一抗體，其係如申請專利範圍第1項之抗體，及(ii)第二抗體，其辨識該Aβ(1-17)肽之與該第一抗體所辨識之區域不同之區域。
  5. 如申請專利範圍第4項之套組，其中該第一或第二抗體係與結合對之第一成員偶合。
  6. 如申請專利範圍第5項之套組，其另包含該結合對之第二成員，其中該結合對之第二成員係與可檢測之標籤偶合。
  7. 一種測定或檢測樣本中Aβ(1-17)肽之方法，該方法包含下列步驟：(i)利用第一抗體捕捉存在於樣本中之Aβ(1-17)肽，該第一抗體與該肽特異性結合，(ii)使步驟(i)形成之免疫複合體與第二抗體接 觸，其中該第二抗體係如申請專利範圍第1至6項中任一者所定義者，其中該第二抗體辨識與該第一抗體不同之區域且與結合對之第一成員偶合，(iii)使步驟(ii)形成之複合體與結合對之第二成員接觸，該結合對之第二成員係與可檢測之標籤偶合，及(iv)檢測或測定該可檢測之標籤的活性或量。
  8. 如申請專利範圍第7項之方法，其中該樣本係選自血液、血清、血漿或腦脊髓液(CSF)。
  9. 一種監測個體之神經變性疾病之方法，該方法包含：(a)在第一時間點測定該個體之血漿樣本內游離Aβ17肽量及該個體之血液樣本內與細胞結合之Aβ17肽量，(b)在第二時間點測定該個體之血漿樣本內游離Aβ17肽量及該個體之血液樣本內與細胞結合之Aβ17肽量，及(c)比較該第一及第二時間點之血漿樣本內游離Aβ17肽量與血液樣本內與細胞結合之Aβ17肽量之比率，其中Aβ17肽量之測定係利用如申請專利範圍第7或8項之方法進行，且其中若第二時間點之該比率相較於第一時間點者增加，表示該個體之阿茲海默(Alzheimer) 氏症在該第一與該第二時間點之間惡化。
  10. 如申請專利範圍第9項之方法，其中該神經變性疾病係阿茲海默氏症。
  11. 一種測定個體是否罹患輕微阿茲海默氏症之方法，該方法包含測定選自下列之一或多項參數之值：(a)該個體之血液樣本內與細胞結合之Aβ17、Aβ40及Aβ42肽量的相加值，(b)該個體之血漿樣本內Aβ17、Aβ40及Aβ42肽總量及該個體之血液樣本內與細胞結合之Aβ17、Aβ40及Aβ42肽量的相加值，(c)該個體之血漿樣本內Aβ42肽總量及該個體之血液樣本內與細胞結合之Aβ42肽量的相加值，(d)該個體之血漿樣本內Aβ40及Aβ42肽總量及該個體之血液樣本內與細胞結合之Aβ40及Aβ42肽量的相加值，及(e)該個體之血漿樣本內游離Aβ17肽量與該個體之血液樣本內與細胞結合之Aβ17肽量的比值，其中Aβ17肽量之測定係利用如申請專利範圍第7或8項之方法進行，且其中若該等參數之一或多者之值相較於健康個體之參考樣本的該等參數值增加，則該個體罹患輕微阿茲海默氏症。
  12. 一種測定個體是否罹患伴隨疑似阿茲海默氏症之輕微認知障礙(MCI)之方法，該方法包含測定選自下列之一或多項參數之值： (a)該個體之血漿樣本內Aβ42肽總量及該個體之血液樣本內與細胞結合之Aβ42肽量的相加值，(b)該個體之血漿樣本內Aβ40及Aβ42肽總量及該個體之血液樣本內與細胞結合之Aβ40及Aβ42肽量的相加值，(c)該個體之血漿樣本內游離Aβ17肽量與該個體之血液樣本內與細胞結合之Aβ17肽量的比值，(d)血液樣本內與細胞結合之Aβ17肽量與血液樣本內與細胞結合之Aβ42肽量的比值，(e)二參數之比值，其中第一參數對應血漿樣本內Aβ17肽總量和血液樣本內與細胞結合之Aβ17肽量的相加量，且第二參數對應血漿樣本內Aβ42肽總量和血液樣本內與細胞結合之Aβ42肽量的相加量，(f)二參數之比值，其中第一參數對應血液樣本內與細胞結合之Aβ17肽量，且第二參數對應血液樣本內與細胞結合之Aβ40肽量與血液樣本內與細胞結合之Aβ42肽量的相加量，及(g)二參數之比值，其中第一參數對應該個體之血漿樣本內Aβ17肽總量和血液樣本內與細胞結合之Aβ17肽量的相加量，且第二參數對應血漿樣本內Aβ40及Aβ42肽總量和血液樣本內與細胞結合之Aβ40及Aβ42肽量的相加量，其中Aβ17肽量之測定係利用如申請專利範圍第7或 8項之方法進行，且其中若參數(a)、(b)或(c)之一或多者之值相較於健康個體之參考樣本之值增加，及/或參數(d)、(e)、(f)或(g)之一或多者之值相較於健康個體之參考樣本之值減少，該個體罹患伴隨疑似阿茲海默氏症之輕微認知障礙(MCI)。
  13. 一種測定個體是否罹患伴隨疑似阿茲海默氏症之輕微認知障礙(MCI)之方法，該方法包含測定選自下列之一或多項參數之值：(a)該個體之血液樣本內與細胞結合之Aβ17、Aβ40及Aβ42肽量的相加值，(b)該個體之血液樣本內與細胞結合之Aβ17肽量與該個體之血液樣本內與細胞結合之Aβ42肽量的比值，(c)二參數之比值，其中第一參數對應該個體之血漿樣本內Aβ17肽總量和血液樣本內與細胞結合之Aβ17肽量的相加值，且第二參數對應該個體之血漿樣本內Aβ42肽總量和血液樣本內與細胞結合之Aβ42肽量的相加值，(d)二參數之比值，其中第一參數對應血液樣本內與細胞結合之Aβ17肽量，且第二參數對應血液樣本內與細胞結合之Aβ40和Aβ42肽量的相加值，及(e)二參數之比值，其中第一參數對應該個體之血漿樣本內Aβ17肽總量和血液樣本內與細胞結合之 Aβ17肽量的相加值，且第二參數對應血漿樣本內Aβ40及Aβ42肽總量和血液樣本內與細胞結合之Aβ40及Aβ42肽量的相加值，其中Aβ17肽量之測定係利用如申請專利範圍第7或8項之方法進行，且其中若(a)之值相較於罹患伴隨可能為阿茲海默氏症之輕微認知障礙(MCI)之個體的參考樣本之值增加及/或該等參數(b)、(c)、(d)或(e)之一或多者之值相較於罹患伴隨可能為阿茲海默氏症之輕微認知障礙(MCI)之個體的參考樣本之值減少，該個體罹患伴隨疑似阿茲海默氏症之輕微認知障礙(MCI)。
  14. 一種測定個體是否罹患輕微阿茲海默氏症之方法，該方法包含測定選自下列之一或多項參數之值：(a)血液樣本內與細胞結合之Aβ17、Aβ40及Aβ42肽量的相加值，(b)血漿樣本內Aβ17、Aβ40及Aβ42肽總量和血液樣本內與細胞結合之Aβ17、Aβ40及Aβ42肽量的相加值，(c)血漿樣本內Aβ42肽總量和血液樣本內與細胞結合之Aβ42肽量的相加值，(d)血漿樣本內Aβ40及Aβ42肽總量和血液樣本內與細胞結合之Aβ40及Aβ42肽量的相加值，(e)血漿樣本內Aβ40肽總量和血液樣本內與細胞結合之Aβ40肽量的相加值，(f)二參數之比值，其中第一參數對應血液樣本內與 細胞結合之Aβ17肽量，且第二參數對應血液樣本內與細胞結合之Aβ40和Aβ42肽量的相加值，及(g)血漿樣本內游離Aβ17肽量與血液樣本內與細胞結合之Aβ17肽量的比值，其中Aβ17肽量之測定係利用如申請專利範圍第7或8項之方法進行，且其中若該等參數之一或多者之值相較於罹患伴隨可能為阿茲海默氏症之輕微認知障礙(MCI)之個體之參考樣本的該等參數值增加，則該個體罹患輕微阿茲海默氏症。
  15. 一種測定個體是否罹患輕微阿茲海默氏症之方法，該方法包含測定選自下列之一或多項參數之值：(a)血漿樣本內游離Aβ17肽量與血漿樣本內游離Aβ40肽量的比值，及(b)二參數之比值，其中第一參數對應血漿樣本內游離Aβ17肽量，且第二參數對應血漿樣本內游離Aβ40和Aβ42肽量的相加值，其中Aβ17肽量之測定係利用如申請專利範圍第7或8項之方法進行，且其中若該等參數之一或多者之值相較於罹患伴隨疑似阿茲海默氏症之輕微認知障礙(MCI)之個體之參考樣本的該等參數值增加，則該個體罹患輕微阿茲海默氏症。
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