JP6875623B2 - 遺伝性疾患に関わるタンパク質の測定方法及び測定キット - Google Patents
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Description
(1)遺伝子疾患に関わるタンパク質と、前記タンパク質を認識する捕捉抗体とを結合させる抗原結合工程、前記捕捉抗体に結合した前記タンパク質と、前記タンパク質の前記捕捉抗体が認識する領域とは別の領域を認識し且つ発光性金属錯体が標識される検出抗体とを結合させる検出抗体結合工程、及び前記タンパク質に結合し且つ前記発光性金属錯体が標識された前記検出抗体を、電気化学的刺激によって生じる電気化学発光量を測定することによって検出する測定工程を備えることを特徴とする、タンパク質の測定方法。
(3)前記捕捉抗体がポリクローナル抗体であり、前記検出抗体がモノクローナル抗体である、上記(1)に記載のタンパク質の測定方法。
(4)前記捕捉抗体が前記タンパク質のC末端領域を認識する抗体であり、前記検出抗体が前記タンパク質のN末端領域を認識する抗体である、上記(1)〜(3)のいずれか1項に記載のタンパク質の測定方法。
(5)前記捕捉抗体が前記タンパク質のN末端領域を認識する抗体であり、前記検出抗体が前記タンパク質のC末端領域を認識する抗体である、上記(1)〜(3)のいずれか1項に記載のタンパク質の測定方法。
(7)前記可溶化工程において、前記生体試料として、筋肉、脳、血液、もしくは心臓に由来する細胞もしくは組織、または生体の細胞に由来する幹細胞から誘導されるもしくは培養される細胞もしくは組織を用いる、上記(6)に記載のタンパク質の測定方法。
(8)前記可溶化工程で用いる前記可溶化溶液の前記界面活性剤が、陰イオン性界面活性剤を含有する、上記(6)または(7)に記載のタンパク質の測定方法。
(9)前記希釈工程において、非イオン性界面活性剤を含む希釈溶液を用いて前記可溶化試料溶液の希釈を行う、上記(6)〜(8)のいずれか1項に記載のタンパク質の測定方法。
(11)前記標準品タンパク質として、前記タンパク質の全長またはその一部を用いる、上記(10)に記載のタンパク質の測定方法。
(13)前記捕捉抗体を認識する固定化二次抗体を固定化する二次抗体固定化工程、及び前記固定化した固定化二次抗体と、前記捕捉抗体とを結合させることで、前記捕捉抗体を固定化する捕捉抗体結合工程とをさらに備える、上記(1)〜(12)のいずれか1項に記載のタンパク質の測定方法。
(14)前記固定化二次抗体が固相に固定化され、前記固相が、プレート、キュベット、チューブ、ビーズ、多孔質体、またはメンブレンである、上記(13)に記載のタンパク質の測定方法。
(15)前記タンパク質がジストロフィンタンパク質である上記(1)〜(14)のいずれか1項に記載のタンパク質の測定方法
(16)遺伝性疾患に関わるタンパク質を認識する捕捉抗体、及び前記タンパク質の前記捕捉抗体が認識する領域とは別の領域を認識し且つ発光性金属錯体が標識される検出抗体を備えることを特徴とする、ECL法用のタンパク質の測定キット。
(17)前記発光性金属錯体により標識され且つ前記検出抗体を認識する検出二次抗体をさらに備える、上記(16)に記載のECL法用のタンパク質の測定キット。
本測定方法において測定を行う試験材料は、測定を行う対象となる生体組織に由来する生体試料と、検量線を得るための測定対象となる標準品とに分けられる。まずはこれら試験材料について説明する。次いで、本測定方法に用いる、抗体及び試薬類について説明する。
本測定方法に用いられる生体試料は、ジストロフィンを発現する細胞、組織、または検体に由来する生体試料であれば、特に限定せず用いることができる。生体試料として例えば、人間、マウス、ラット、犬等の動物を検体として、これらの検体から採取した生体試料を用いることができる。具体的な生体試料として、これらの検体の筋肉、脳、血液、もしくは心臓に由来する細胞もしくは組織を用いることができるが、これらに特に限定されない。または、上記の筋肉、脳、血液、もしくは心臓に由来する細胞、または検体の皮膚もしくは毛髪などの末梢組織の細胞等の、生体の細胞に由来する幹細胞から誘導されるもしくは培養される細胞もしくは組織であって、ジストロフィンを発現するよう分化誘導されたものを用いることができる。幹細胞とは、例えば、胚性幹細胞(ES細胞)、体細胞由来ES細胞(ntES細胞)、人工多能性幹細胞(iPS細胞)などが挙げられるが、これらに特に限定されない。生体試料は、後述する可溶化工程によってジストロフィンを可溶化した状態で測定に供される。
標準品(標準品ジストロフィン)は、検量線作成工程において標準試料として用いられるタンパク質であって、分子量427kDaのジストロフィンの全長またはその一部を用いることができる。中でも、標準品ジストロフィンとして用いられるジストロフィンとしては、分子量427kDaの全長ジストロフィンをコードする遺伝子(Dp427)のcDNAが組み込まれた発現ベクターを、哺乳動物細胞に導入して発現させた、リコンビナント全長ジストロフィン(Recombinant full-length dystrophin;RFD)を用いることが好ましい。
捕捉抗体は、ジストロフィンを特異的に認識して、ジストロフィンとの抗原抗体反応を生じることで、ジストロフィンと結合する抗体である。
検出抗体は、ジストロフィンの捕捉抗体が認識する領域とは別の領域を特異的に認識して、ジストロフィンとの抗原抗体反応を生じることで、ジストロフィンと結合する抗体である。検出抗体のジストロフィン上の認識部位は特に限定されないが、捕捉抗体とは別の領域を認識して結合することが好ましい。検出抗体の認識部位と捕捉抗体の認識部位との関係は、上記の捕捉抗体についての説明を行った通りである。
固定化二次抗体は、捕捉抗体を特異的に認識して、捕捉抗体との抗原抗体反応を生じることで、捕捉抗体と結合する抗体である。また、固定化二次抗体は、固定化されうる。固定化二次抗体を、固相に対して固定化する場合には、上記の捕捉抗体の固相に対する固定化と同様に行うことができる。
検出二次抗体は、検出抗体を特異的に認識して、検出抗体との抗原抗体反応を生じることで結合する抗体である。検出二次抗体は、上記の検出抗体において説明した、ECL法による検出に用いられる発光性金属錯体によって標識される。これにより、検出二次抗体は、ECL法による電気化学発光を生じる。
本測定方法では、上記の通り捕捉抗体を固相に固定化してもよく、この固相にジストロフィンを含む試料溶液を適用することで、固定化された捕捉抗体とジストロフィンとの抗原抗体反応を生じさせてもよい。この場合、試料溶液に含まれるジストロフィンを、捕捉抗体に結合することができるとともに、試料溶液に含まれる捕捉抗体に結合しない成分を分離することができる。よって、生体試料に含まれるジストロフィンの特異的な検出が可能となる。なお、試料溶液を適用するとは、固相に対して試料溶液を分注、注入、または滴下等を行うことにより、試料溶液に含まれるジストロフィンと捕捉抗体とを接触させることをいう。
可溶化溶液は、生体試料に含まれるジストロフィンの可溶化に用いられる、少なくとも界面活性剤を含有する水溶液である。ジストロフィンは疎水性の巨大分子であって水には溶けにくい性質を有する。また、ジストロフィンは、細胞膜の内側に存在して、細胞骨格のアクチンと結合している。このため、ジストロフィンの測定を行うにあたっては、界面活性剤を含む可溶化溶液を用いることによりジストロフィンの可溶化を行って、可溶化試料溶液を得ることが好ましい。
希釈溶液は、可溶化試料溶液の希釈に用いられる、少なくとも非イオン性界面活性剤を含有する水溶液である。可溶化試料溶液には界面活性剤が含まれるため、この可溶化試料溶液をそのまま測定に供した場合には、抗原抗体反応に影響を及ぼして、測定の感度を低下させるおそれがある。一方で、単純に可溶化試料溶液を希釈した場合には、界面活性剤の濃度が低下することで、ジストロフィンが凝集する場合がある。このため、ジストロフィンの測定を行うにあたっては、非イオン性界面活性剤を含有する希釈溶液を用いることにより可溶化試料溶液の希釈を行って、希釈試料溶液を得ることが好ましい。非イオン性界面活性剤は界面活性剤の中でもマイルドな性質を有することから、可溶化に用いられた界面活性剤の濃度を下げて測定への影響を抑えるとともに、ジストロフィンの可溶化を維持することができる。
本測定方法は、操作の順序に従って、抗原結合工程、検出抗体結合工程、及び測定工程を備えて構成される。さらに、本測定方法は、可溶化工程、希釈工程、二次抗体固定化工程、ブロッキング工程、捕捉抗体結合工程、検出二次抗体結合工程、検量線作成工程、算出工程を備えることが好ましい。以下に、図1を参照して、これらの工程を順に説明する。なお、本測定方法は、公知のECL法による電気化学発光量の測定方法を利用して行うことができる。
まず、検体から採取した生体試料に対して、可溶化溶液を用いて生体試料の可溶化を行い、ジストロフィンを可溶化した可溶化試料溶液を得る(ステップS11:可溶化工程)。このとき、通常、生体試料に含まれる他のタンパク質と共に、ジストロフィンが可溶化される。生体試料の可溶化の手法は、特に限定されないが、例えば、生体試料に可溶化溶液を加えて冷却しながら、ホモジナイザー、ガラスビーズ、または超音波処理などを用いて細胞を破砕する処理を行い、生体試料の細胞破砕液(ホモジネート)を調製することにより行うことができる。さらに、このホモジネートに遠心分離を行い、上清を回収することで、可溶化試料溶液を得ることが好ましい。
次に、可溶化試料溶液と希釈溶液とを混合して、可溶化試料溶液の希釈を行い、希釈化試料溶液を得る(ステップS12:希釈工程)。このとき、希釈を行った状態の希釈化試料溶液において、可溶化試料溶液に含まれていた界面活性剤の濃度が、希釈化試料溶液の総量に対して、通常1w/v%以下、好ましくは0.5w/v%以下、より好ましくは0.2w/v%以下となるよう希釈を行うことが好ましい。
ECL法によるジストロフィンの測定に先立って、固定化二次抗体を固相に固定化する(ステップS13:二次抗体固定化工程)。固定化二次抗体の固定化は、固定化二次抗体を含有する固定化二次抗体溶液をウェルに加えて、振とうさせつつ一定温度でインキュベーションすることにより行う。これにより、固定化二次抗体が固相に接触して結合することで、固相に固定化される。
次に、固定化二次抗体を固定化した固相にブロッキングを行う(ステップS14:ブロッキング工程)。ブロッキングは、二次抗体、捕捉抗体、検出抗体、及び検出二次抗体のいずれとも結合しない、BSA、スキムミルク、カゼイン等のブロッキング剤を含む溶液をウェルに加えて静置することにより行う。これにより、ブロッキング剤が固相に接触して吸着することで、固相表面がブロッキングされる。ブロッキングを行うことにより、抗体及びジストロフィンが固相に非特異的に吸着することを防ぐ。
ブロッキングを行った固相に、捕捉抗体を結合させる(ステップS15:捕捉抗体結合工程)。捕捉抗体の結合は、捕捉抗体を含む捕捉抗体溶液をウェルに加えて、振とうさせつつ一定温度でインキュベーションすることにより行う。これにより、捕捉抗体と固定化二次抗体とが抗原抗体反応を生じて結合することで、捕捉抗体が固相に固定化される。
続いて、固相に固定化された捕捉抗体に、ジストロフィンを結合させる(ステップS16:抗原結合工程)。ジストロフィンの結合は、ステップS12で得られた希釈化試料溶液を測定試料としてウェルに加えて、振とうさせつつ一定温度でインキュベーションすることにより行う。これにより、捕捉抗体がジストロフィンのN末領域を認識して、抗原抗体反応を生じて結合する。
さらに、捕捉抗体に結合したジストロフィンに、検出抗体を結合させる(ステップS17:検出抗体結合工程)。検出抗体の結合は、検出抗体を含む検出抗体溶液をウェルに加えて、振とうさせつつ一定温度でインキュベーションすることにより行う。これにより、検出抗体がジストロフィンのC末領域を認識して、抗原抗体反応を生じて結合する。
またさらに、ジストロフィンに結合した検出抗体に、検出二次抗体を結合させる(ステップS18:検出二次抗体結合工程)。検出二次抗体の結合は、検出二次抗体を含む検出二次抗体溶液をウェルに加えて、振とうさせつつ一定温度でインキュベーションすることにより行う。これにより、検出二次抗体が検出抗体を認識して、抗原抗体反応を生じて結合する。このとき、固相上には、固定化二次抗体、捕捉抗体、ジストロフィン、検出抗体、及び検出二次抗体がこの順で結合した複合体が形成される。
上記の複合体の形成後、電気化学発光リーダーを用いて、ECL法により生じる電気化学発光量を測定する(ステップS19:測定工程)。電気化学発光量の測定は、まず、ECL反応における電子供与物質を含む溶液をウェルに加える。さらに、ウェルに備えられた電極を介して、ウェル内の溶液に電圧を印加することによって、検出二次抗体に標識された発光性金属錯体と電子供与物質との酸化還元反応により、発光性金属錯体から電気化学発光が誘導される。この電気化学発光を、電気化学発光リーダーが備える光電子増倍管によって検出することで、電気化学発光量を測定する。電子供与物質としては、例えば、トリプロピルアミン(Tripropylamine;TPA)等の第三級アルキルアミンが用いられるが、これに特に限定されない。
上記の生体試料を用いた生体試料に含まれる前記ジストロフィンにおける電気化学発光量の測定(ステップS13〜S19)と同様にして、標準品ジストロフィンを用いて電気化学発光量の測定を行う。このとき、標準品ジストロフィンの濃度が異なる複数の標準試料溶液を調製して、それぞれの電気化学発光量の測定を行うことで、標準品ジストロフィンの濃度と電気化学発光量との検量線を作成する(ステップS20:検量線作成工程)。なお、本明細書において検量線という場合、ジストロフィンの濃度と各濃度における電気化学発光量との関係をプロットして得られるグラフと、ジストロフィンの濃度と各濃度における電気化学発光量との関係から算出される回帰式とを含むものとする。
さらに、ステップS20で得られた検量線と、ステップS19で得られた生体試料に含まれるジストロフィンにおける電気化学発光量とに基づいて、生体試料に含まれる前記ジストロフィンの量を算出する(ステップS21:算出工程)。
本実施形態のタンパク質の測定キット(以降、単に「本測定キット」とも称する。)は、上記の本測定方法のために用いられるキットであって、上記測定方法を行うために必要な要素を提供する。すなわち本測定キットは、ECL法用のタンパク質の測定キットである。より具体的には、遺伝性疾患に関わるタンパク質の測定キットである。
本測定方法は、捕捉抗体に結合したタンパク質と検出抗体とを結合させて、この検出抗体を、電気化学的刺激によって生じる電気化学発光量を測定することによって検出することで、タンパク質の測定を行う。本測定方法によれば、ECL法を利用することによって、感度、真度、及び精度に優れるタンパク質の測定方法を提供することができる。また、捕捉抗体、タンパク質、及び検出抗体がこの順序でサンドイッチされた複合体を形成することで、タンパク質に対して特異性の高い測定を行うことができる。これにより、本測定方法は、遺伝性疾患に関わるタンパク質の発現回復の確認を行う際に、微量なタンパク質であっても測定を行うことが可能である。
<抗体>
表1に、実施例及び参照例において使用した抗体を示す。
表2に、実施例及び参照例において使用した試薬類を示す。また、表3に、実施例及び参照例において使用した機器及び器具を示す。
<PBSの調製例>
10×D−PBS(−)10ml、及び水90mlを混合した。これにより、PBS(1×)を得た。
少量の水に塩化ナトリウム5.8gを加え溶解し、水で全量を100mlとした。これにより、1mol/l塩化ナトリウム水溶液を得た。
1mol/l Tris−HCl(pH6.8)0.22ml、20%SDS5ml、グリセロール 2ml、及び2−メルカプトエタノールに水を加えて全量を50mlとした。これにより、可溶化溶液(4.4mmol/lTris、2% SDS、4% グリセロール、0.25% 2−ME)を得た。
1mol/l Tris−HClBuffer Solution(pH8.0)2ml、1mol/l 塩化ナトリウム水溶液15ml、NP−40(10%in H2O)0.5ml、10% BSA 10ml、及び0.5mol/l−EDTA Solution(pH8.0) 0.1mlを混合した。0.1mol/l塩酸を加え、pH7.5に調整した後に、水で全量100mlとした。これにより、希釈溶液(20mmol/lTris、150mmol/l 塩化ナトリウム、0.05%NP−40、1% BSA、0.5mmol/lEDTA、pH7.5)を得た。
20× TBS−Twith Tween 20(以降、「20×TBST」と称する。)50ml、及び水950mlを混合した。これにより、これにより、洗浄液(1×TBST)を得た。
10% BSADiluent/Blocking Solution(以降、「10%BSA」と称する。)50ml、20×TBST 5ml、及び水45mlを混合した。これにより、TBST−BSA水溶液(以降、「TBST−BSA」と称する。)を得た。
MSD Readbuffer T(4×)with surfactant 5ml、及び水15mlを混合した。これにより、Read buffer(1×)を得た。
<固定化二次抗体溶液>
2nd Ab1(1.2mg/ml)21μl、及びPBS 2499μlを混合した。これにより、固定化二次抗体溶液(10μg/ml)を得た。
<捕捉抗体溶液>
mAb3(36μg/ml) 75μl、及びTBST−BSA 2625μlを混合した。これにより、捕捉抗体溶液(1μg/ml)を得た。
pAb1(500μg/ml) 6μl、及びTBST−BSA 2994μlを混合した。これにより、検出抗体溶液(1μg/ml)を得た。
SULFO−TAG Ab(500μg/ml) 6μl、及びTBST−BSA 2994μlを混合した。これにより、検出二次抗体溶液(1μg/ml)を得た。
<標準品ジストロフィンの調製例(RFD))>
国立研究開発法人産業技術総合研究所より提供されたリコンビナント全長ジストロフィン(RFD)溶液(10fmol/μl)を、希釈溶液で段階的に希釈して、表4に示すように、RFD濃度が0.00001〜0.04fmol/μlの15段階となるようにして、15種類の標準試料溶液A1〜A15を得た。
正常人由来筋組織に可溶化溶液100μlを加え、ジルコニアビーズ及びビーズ式細胞破砕装置を用いて細胞を破砕してヒト筋組織ホモジネートを調製した。このホモジネートを遠心分離(4℃、100000×g、10分間)して、上清を回収することにより、ジストロフィンを含むタンパク質を可溶化した可溶化試料溶液を得た。この可溶化試料溶液のタンパク質濃度を、タンパク質定量キット(GEヘルスケア・ジャパン株式会社製、商品名:2DQuant Kit)を用いて測定した。可溶化試料溶液のタンパク質濃度は、630μg/mlであった。続いて、この可溶化試料溶液を希釈溶液で段階的に希釈して、表5に示すように、タンパク質濃度が0.4〜28.8μg/mlの5段階となるようにして、5種類の希釈試料溶液(生体試料溶液a1〜a5)を得た。
RFD溶液(10fmol/μl)を、希釈溶液で段階的に希釈して、表6に示すように、RFD濃度が0.00150〜0.0100fmol/μlの7段階となるようにして、7種類の標準試料溶液B1〜B7を得た。
RFD溶液(10fmol/μl)を、希釈溶液で段階的に希釈して、表7に示すように、RFD濃度が0.00150〜0.0100fmol/μlの7段階となるようにして、7種類の再現性確認試料溶液C1〜C7を得た。
タンパク質濃度が5mg/mlの小脳ライセートを、希釈溶液で希釈して、タンパク質濃度が0.006fmol/μlの生体試料溶液bを得た。
タンパク質濃度が19.5μg/mlのDMD患者筋組織ホモジネートを、希釈溶液で希釈して、タンパク質濃度が0.006fmol/μlの生体試料溶液cを得た。
<電気化学発光量の測定>
以下の手順によって、電気化学発光量の測定を行った。なお、測定は標準試料溶液A1〜A15、及び生体試料溶液a1〜a5について、それぞれ3点実施して、3点の電気化学発光量(ECLシグナル)の平均値を、各試料の電気化学発光量の測定値とした。
〔4〕プログラム低温恒温器(設定値4℃、保存庫管理温度範囲:2.0〜8.0℃)にて、8時間以上静置した。これにより、プレートがBSAによりブロッキングされた。
〔5〕プレート内の溶液を除去し、充分に水分を取り除いた。
標準試料溶液A1〜A15の測定で得られたECLシグナルの測定値をY、RFD濃度(fmol/μl)をXとし、4−パラメーターロジスティックモデル(重み付け:1/Y2)を用いた回帰式を算出することで、検量線(A1〜A15)を作成した。検量線の作製には、コンピュータシステム(Molecular Devices Inc.製、商品名:SoftMax Pro(Ver. 5.4))を用いて行った。さらに、この検量線(A1〜A15)に基づいて、各標準試料溶液の逆算値と、逆算値の真度を算出し、検量線を評価した。評価結果を表4に示す(検量線(A1〜A15))。真度(%)は、「逆算値/添加濃度×100」によって算出した。なお、表4において、標準試料溶液A13の逆算値が算出されなかったのは、逆算値が負の値になるためであると推測される。
生体試料溶液a1〜a5を測定して得られたECLシグナルを、標準試料溶液A1〜A9から算出された回帰式に代入して、ジストロフィンの定量値を算出した。結果を表5に示す。
<電気化学発光量の測定:1回目>
測定試料として、標準試料溶液A1〜A15及び生体試料溶液a1〜a5に代えて、標準試料溶液B1〜B7を用いて、それぞれ1点測定を実施する以外は実施例1と同様にして、電気化学発光量の測定を行った。標準試料溶液B1〜B7の1点の電気化学発光量を、各試料の測定値とした。この測定値を、検量線(1回目)のデータとして用いた。
実施例2の1回目の電気化学発光量の測定と同一の環境(実施者、装置)で、異なる実施日に同一の試料(標準試料溶液B1〜B7)の電気化学発光量の測定を2回行い、それぞれについて測定値を得た。この測定値を、検量線(2,3回目)のデータとして用いた。
標準試料溶液B1〜B7の測定で得られたECLシグナルの測定値をY、RFD濃度(fmol/μl)をXとし、4−パラメーターロジスティックモデル(重み付け:1/Y2)を用いた回帰式を算出することで、1〜3回目の電気化学発光量の測定それぞれについて検量線を作成した。さらに、これらの検量線の相関係数を算出した。また、これらの検量線に基づいて、各標準試料溶液の逆算値と、逆算値の真度を算出し、検量線を評価した。結果を表6に示す(検量線(1〜3回目))。
<電気化学発光量の測定:1回目>
測定試料として、標準試料溶液A1〜A15及び生体試料溶液a1〜a5に代えて、標準試料溶液B1〜B7及び再現性確認試料溶液C1〜C7を用いて、それぞれ5点測定を実施する以外は実施例1と同様にして、電気化学発光量の測定を行った。5点の電気化学発光量の平均値を、各試料の電気化学発光量の測定値とした。この測定値を、日内再現性のデータ、また日間再現性1回目のデータとして用いた。
実施例3の1回目の電気化学発光量の測定と同一の環境(実施者、装置)で、同一の試料(標準試料溶液B1〜B7及び再現性確認試料溶液C1〜C7)の電気化学発光量の測定を、異なる実施日で2回行い、それぞれについて測定値を得た。この測定値を、日間再現性2回目のデータ、及び日間再現性3回目のデータとして用いた。
標準試料溶液B1〜B7の測定で得られたECLシグナルの測定値をY、RFD濃度(fmol/μl)をXとし、4−パラメーターロジスティックモデル(重み付け:1/Y2)を用いた回帰式を算出することで、1〜3回目の電気化学発光量の測定それぞれについて検量線を作成した。さらに、再現性確認試料溶液C1〜C7を測定して得られた1〜3回目のECLシグナルを、標準試料溶液B1〜B7から算出された1〜3回目の各回帰式に代入して、ジストロフィンの定量値を算出した。1〜3回目の電気化学発光量の測定値から算出された結果を表7に示す(再現性1〜3回目)。
1〜3回目の電気化学発光量の測定それぞれについて、再現性確認試料溶液C1〜C7の定量値の平均値、精度(CV)、真度、及びトータルエラーを算出した。なお、精度(%)は、「定量値の標準偏差/定量値の平均値×100」によって算出した。また、トータルエラー(%)は、「{(真度−100.0)の絶対値}+CV」によって算出した。
表7に示すように、日間再現性(全体)において、C1(0.000150fmol/μl)及びC7(0.0100fmol/μl)の精度25.7及び4.3%、真度は103.8及び101.2%であった。他の標準試料溶液の精度は3.2〜10.5%、真度は100.2〜112.5%であった。通常、ウェスタンブロット法では、日間再現性の精度が6.3〜20.4%であることに鑑みると、本測定方法は、日間再現性の精度に優れたジストロフィンの測定法であることが分かる。
上記の実施例1〜3の評価結果を総合的に考慮すると、本測定方法は、感度、真度、及び精度に優れたジストロフィンの測定方法であるといえる。
<電気化学発光量の測定>
測定試料として、生体試料溶液a1〜a5に代えて、生体試料溶液b及び生体試料溶液cを用いた以外は実施例1と同様にして、電気化学発光量の測定を行った。このとき、測定試料として、生体試料溶液b(小脳ライセート)を用いたものが実施例4にあたり、生体試料溶液c(DMD患者筋組織ホモジネート)を用いたものが参照例にあたる。
実施例1と同様にして、標準試料溶液A1〜A9の測定で得られたECLシグナルから回帰式を算出することで、検量線を作成した。
生体試料溶液b及び生体試料溶液cを測定して得られたECLシグナルを、標準試料溶液A1〜A9から算出された回帰式に代入して、ジストロフィンの定量値を算出した。結果を表8に示す。
一方、生体試料としてのDMD患者筋組織ホモジネートを用いた参照例では、測定限界未満となりジストロフィンの測定を行うことができなかった。これは、DMD患者筋組織に発現するジストロフィンは全長のジストロフィンではなく、C末端を欠くため、検出抗体pAb1による結合ができなかったためであると推測される。
このように、本測定方法によれば、ジストロフィンの測定を特異的に行うことが可能である。
Claims (15)
- 遺伝性疾患に関わるジストロフィンタンパク質と、前記ジストロフィンタンパク質を認識する捕捉抗体とを結合させる抗原結合工程、
前記捕捉抗体に結合した前記ジストロフィンタンパク質と、前記ジストロフィンタンパク質の前記捕捉抗体が認識する領域とは別の領域を認識し且つ発光性金属錯体が標識される検出抗体とを結合させる検出抗体結合工程、
及び
前記ジストロフィンタンパク質に結合し且つ前記発光性金属錯体が標識された前記検出抗体を、電気化学的刺激によって生じる電気化学発光量を測定することによって検出する測定工程
を備えることを特徴とする、タンパク質の測定方法。 - 前記捕捉抗体がモノクローナル抗体であり、前記検出抗体がポリクローナル抗体である、
請求項1に記載のタンパク質の測定方法。 - 前記捕捉抗体がポリクローナル抗体であり、前記検出抗体がモノクローナル抗体である、
請求項1に記載のタンパク質の測定方法。 - 前記捕捉抗体が前記ジストロフィンタンパク質のC末端領域を認識する抗体であり、前記検出抗体が前記ジストロフィンタンパク質のN末端領域を認識する抗体である、
請求項1〜3のいずれか1項に記載のタンパク質の測定方法。 - 前記捕捉抗体が前記ジストロフィンタンパク質のN末端領域を認識する抗体であり、前記検出抗体が前記ジストロフィンタンパク質のC末端領域を認識する抗体である、
請求項1〜3のいずれか1項に記載のタンパク質の測定方法。 - 界面活性剤及び還元剤を含有する可溶化溶液を用いて、生体試料から前記ジストロフィンタンパク質を可溶化する可溶化工程、及び
前記可溶化工程で得られた可溶化試料溶液を希釈して、前記ジストロフィンタンパク質を含む希釈試料溶液を得る希釈工程をさらに備え、
前記抗原結合工程では、前記希釈試料溶液に含まれる前記ジストロフィンタンパク質と前記捕捉抗体とを結合させる、
請求項1〜5のいずれか1項に記載のタンパク質の測定方法。 - 前記可溶化工程において、前記生体試料として、筋肉、脳、血液、もしくは心臓に由来する細胞もしくは組織、または生体の細胞に由来する幹細胞から誘導されるもしくは培養される細胞もしくは組織を用いる、
請求項6に記載のタンパク質の測定方法。 - 前記可溶化工程で用いる前記可溶化溶液の前記界面活性剤が、陰イオン性界面活性剤を含有する、
請求項6または7に記載のタンパク質の測定方法。 - 前記希釈工程において、非イオン性界面活性剤を含む希釈溶液を用いて前記可溶化試料溶液の希釈を行う、
請求項6〜8のいずれか1項に記載のタンパク質の測定方法。 - 標準品ジストロフィンタンパク質の濃度と電気化学発光量との検量線と、前記生体試料に含まれる前記ジストロフィンタンパク質における電気化学発光量とに基づいて、前記生体試料に含まれる前記ジストロフィンタンパク質の量を算出する算出工程をさらに備える、
請求項6〜9のいずれか1項に記載のタンパク質の測定方法。 - 前記標準品ジストロフィンタンパク質として、前記ジストロフィンタンパク質の全長またはその一部を用いる、
請求項10に記載のタンパク質の測定方法。 - 前記発光性金属錯体が、前記発光性金属錯体により標識され且つ前記検出抗体を認識する検出二次抗体により、前記検出抗体に導入される、
請求項1〜11のいずれか1項に記載のタンパク質の測定方法。 - 前記捕捉抗体を認識する固定化二次抗体を固定化する二次抗体固定化工程、及び
前記固定化した固定化二次抗体と、前記捕捉抗体とを結合させることで、前記捕捉抗体を固定化する捕捉抗体結合工程とをさらに備える、
請求項1〜12のいずれか1項に記載のタンパク質の測定方法。 - 遺伝性疾患に関わるジストロフィンタンパク質を認識する捕捉抗体、及び
前記ジストロフィンタンパク質の前記捕捉抗体が認識する領域とは別の領域を認識し且つ発光性金属錯体が標識される検出抗体
を備えることを特徴とする、ECL法用のタンパク質の測定キット。 - 前記発光性金属錯体により標識され且つ前記検出抗体を認識し、前記検出抗体に前記発光性金属錯体を導入する検出二次抗体をさらに備える、
請求項14に記載のECL法用のタンパク質の測定キット。
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