CN114072678A - 用于确定人血浆样本中的β-淀粉样蛋白42/40比率的多重测定 - Google Patents

用于确定人血浆样本中的β-淀粉样蛋白42/40比率的多重测定 Download PDF

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Abstract

本发明技术涉及用于诊断患者的神经退行性障碍、监测神经退行性障碍的进展，评估治疗神经退行性障碍的功效或评估患上神经退行性障碍的风险的方法。这些方法基于使用同时检测Aβ42和Aβ40的改善的且高度灵敏的多重蛋白测定，确定从患有或被怀疑患有神经退行性障碍的患者收集的体液样品中的β‑淀粉样蛋白42(“Aβ42”)与β‑淀粉样蛋白40(“Aβ40”)的比率。

Description

用于确定人血浆样本中的β-淀粉样蛋白42/40比率的多重 测定
相关申请的交叉引用
本申请根据35U.S.C.§119(e)要求2019年5月10日提交的美国临时申请号62/846,565的优先权，将其通过引用以其整体特此并入。
技术领域
本发明技术涉及用于诊断患者的神经退行性障碍、监测神经退行性障碍的进展，评估治疗神经退行性障碍的功效或评估患上神经退行性障碍的风险的方法。这些方法基于使用同时检测Aβ42和Aβ40的改善的且高度灵敏的多重蛋白测定方法，确定从患有或被怀疑患有神经退行性障碍的患者收集的体液样品中的β-淀粉样蛋白42(“Aβ42”)与β-淀粉样蛋白40(“Aβ40”)的比率。
背景技术
下文提供对本发明技术的背景的说明只是为了帮助理解本发明技术，并且不承认所述说明描述或构成本发明技术的现有技术。
阿尔茨海默病
神经退行性障碍是世界范围内的重大公共健康问题。例如，截至2015年，估计痴呆影响了4600万人，并且预计到2050年这一数字将增加到1.315亿。阿尔茨海默病(AD)估计占所有痴呆病例的60％-70％。(参见例如，Fandos等人,8Alzheimer’s&Dementia:Diagnosis,Assessment&Disease Monitoring 179(2017))。阿尔茨海默病的特征在于这样一种痴呆，通常始于微妙且难以识别的记忆力衰退，逐渐变得更加严重并且最终丧失能力。其他常见症状包括意意识错乱、判断力差、语言障碍、躁动、退缩和幻觉。偶尔发生癫痫、帕金森症特征、肌张力增加、肌阵挛、尿失禁和缄默症。死亡通常是由于一般性营养不足、营养不良和肺炎引起的。所述疾病的典型的临床病程是8至10年，范围为从1至25年。所有AD中有大约25％是家族性的，其中大约95％是晚发型(年龄>60-65岁)，并且5％是早发型(年龄<65岁)。参见Thomas D.Bird,Alzheimer Disease Overview，在
Figure BDA0003457042970000011
(M.P Adam,H.H.Ardinger&R.A.Pagon等人编辑)(1998年10月23日，最后更新于2018年12月20日)，ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK1161/中。
由于AD带来了巨大的经济和社会负担，因此可以减缓、阻止或预防AD发展的成功治疗干预具有明显的益处。然而，目前还没有针对AD的有效疗法，部分是因为临床试验中靶向的个体通常被证明处于神经变性晚期。AD诊断目前依赖于临床神经病理学评估。β-淀粉样蛋白斑块和神经元内神经原纤维缠结的神经病理学发现仍然是诊断的金标准，尽管事实是其灵敏度在70.9％至87.3％的范围内，并且特异性为从44.3％至70.8％。(参见Beach等人,71J.Neuropathol.Exp.Neurol.266(2012)；Fandos等人,8Alzheimer’s&Dementia:Diagnosis,Assessment&Disease Monitoring 179,180(2017))。基于缓慢进行性痴呆的病征和神经影像学上严重大脑皮层萎缩的发现，这种对AD的临床诊断在大约80％-90％的病例中是正确的。然而，这些筛选方法对早期AD检测和干预是无用的，因为它们专注于表现出晚期神经变性症状的个体。
在另一方面，有效的AD治疗将可能依赖于对无症状(临床前)或前驱个体的早期检测和干预。因此，对于在不存在临床神经病理学症状的情况下有效检测AD发作的方法存在需要。
发明内容
在一方面，本公开文本涉及一种用于制备用于检测β-淀粉样蛋白42(“Aβ42”)至β-淀粉样蛋白40(“Aβ40”)中的至少一种的体液样品的方法，所述方法包括：获得来自受试者的体液样品；并且通过将所述体液样品在缓冲溶液中孵育使所述体液样品中的Aβ42和Aβ40中的至少一种与内源性蛋白解离，所述缓冲溶液包含：缓冲液；和蛋白质可相容的表面活性剂，其中将所述体液样品在所述缓冲溶液中孵育至少30分钟。
在一些实施方案中，所述缓冲溶液可以包含在0.005vol.-％与5.0vol.-％之间，或在0.05vol.-％与0.5vol.-％之间的蛋白质可相容的表面活性剂。在一些实施方案中，所述蛋白质可相容的表面活性剂可以包含聚山梨醇酯20、Triton X-100或其混合物。在一些实施方案中，可以将所述体液样品在所述缓冲溶液中稀释约4与约16之间的倍数、约8与约16之间的倍数或大约10的倍数。在一些实施方案中，可以将所述体液样品在所述缓冲溶液中孵育至少大约30分钟但是不多于大约4小时。
在一些实施方案中，所述体液可以选自血液、血浆、血清、淋巴液、脑脊液、滑液、尿液和唾液。在一些实施方案中，所述体液可以是血浆。
在一些实施方案中，根据本公开文本的方法可以进一步包括将所述体液样品在所述缓冲溶液中孵育后对所述体液样品进行免疫测定，以确定Aβ42和Aβ40中的至少一种的浓度。
在一些实施方案中，根据本公开文本的方法可以进一步包括确定Aβ42和Aβ40的浓度，并且计算在所述体液样品中Aβ42与Aβ40的比率。在一些实施方案中，计算Aβ42与Aβ40的比率可以包括：从至少第一可检测信号计算Aβ42的剂量(D)；从至少第二可检测信号计算Aβ40的剂量(D)；并且校正Aβ42和Aβ40的剂量(D)以确定Aβ42和Aβ40在所述体液中的浓度。在一些实施方案中，可以根据以下关系从所述剂量(D)确定Aβ42在所述体液中的浓度：
Figure BDA0003457042970000021
并且
可以根据以下关系从所述剂量(D)确定Aβ40在所述体液中的浓度：
Figure BDA0003457042970000022
其中C1、C2和C3是校正因子。在一些实施方案中，C1可以是大约2.4271，C2可以是大约0.9196，并且C3可以是大约0.35。
在根据本公开文本的一些实施方案中，所述免疫测定可以包括ELISA。在一些实施方案中，所述免疫测定可以是数字ELISA。
在根据本公开文本的一些实施方案中，所述受试者可以患有神经退行性障碍、可以被怀疑患有神经退行性障碍、可以正在经受神经退行性障碍的治疗、可以具有患上神经退行性障碍的风险、或可以被怀疑具有患上神经退行性障碍的风险。在一些实施方案中，所述神经退行性障碍可以选自痴呆、阿尔茨海默病和创伤性脑损伤。在一些实施方案中，所述神经退行性障碍可以是阿尔茨海默病。
在另一方面，本公开文本涉及一种用于确定在体液中Aβ42与Aβ40的比率的方法，所述方法包括：通过以下方式制备用于检测Aβ42和Aβ40中的至少一种的体液样品以产生游离肽：获得来自受试者的体液样品；并且通过将所述体液样品在缓冲溶液中孵育使所述体液样品中的Aβ42和Aβ40中的至少一种与内源性蛋白解离，所述缓冲溶液包含：缓冲液；和蛋白质可相容的表面活性剂，其中将所述体液样品在所述缓冲溶液中孵育至少30分钟；并且对所述体液样品进行免疫测定，其中从单一多重测定同时确定Aβ42和Aβ40在所述体液样品中的浓度。
在一些实施方案中，所述缓冲溶液可以包含在0.005vol.-％与5.0vol.-％之间，或在0.05vol.-％与0.5vol.-％之间的蛋白质可相容的表面活性剂。在一些实施方案中，所述蛋白质可相容的表面活性剂可以包含聚山梨醇酯20、Triton X-100或其混合物。在一些实施方案中，可以将所述体液样品在所述缓冲溶液中稀释约4与约16之间的倍数、约8与约16之间的倍数或大约10的倍数。在一些实施方案中，可以将所述体液样品在所述缓冲溶液中孵育至少大约30分钟但是不多于大约4小时。
在一些实施方案中，所述体液可以选自血液、血浆、血清、淋巴液、脑脊液、滑液、尿液和唾液。在一些实施方案中，所述体液可以是血浆。
在一些实施方案中，进行免疫测定的步骤进一步包括：测量来自Aβ42免疫复合物的第一可检测信号；测量来自Aβ40免疫复合物的第二可检测信号；从至少第一可检测信号计算Aβ42的剂量(D)；从至少第二可检测信号计算Aβ40的剂量(D)；并且校正Aβ42和Aβ40的剂量(D)以确定Aβ42和Aβ40在所述体液中的浓度。
在一些实施方案中，进行免疫测定的步骤可以进一步包括：测量来自Aβ42免疫复合物的第一可检测信号；测量来自Aβ40免疫复合物的第二可检测信号；测量来自产物分子的第三可检测信号，其中所述产物分子包含来自底物分子与标记的Aβ42或Aβ40免疫复合物的反应的反应产物，其中所述标记的免疫复合物源自所述体液样品；从至少第一可检测信号和第三可检测信号计算Aβ42的剂量(D)；从至少第二可检测信号和第三可检测信号计算Aβ40的剂量(D)；并且校正Aβ42和Aβ40的剂量(D)以确定Aβ42和Aβ40在所述体液中的浓度。
在根据本公开文本的一些实施方案中，进行免疫测定的步骤可以进一步包括，在测量第一可检测信号之前和制备用于检测Aβ42和Aβ40中的至少一种的体液样品以产生游离肽分子之后：在具有检测试剂分子和捕获剂的溶液中孵育游离肽分子，所述捕获剂包含Aβ42捕获剂和Aβ40捕获剂，以产生Aβ42免疫复合物和Aβ40免疫复合物；洗涤所述捕获的肽以去除未结合或非特异性结合的Aβ42或Aβ40和未结合或非特异性结合的检测试剂分子；将所述免疫复合物与可检测标记分子一起孵育，其中所述可检测标记分子与所述免疫复合物上的检测试剂分子结合，以产生标记的Aβ42免疫复合物和标记的Aβ40免疫复合物；洗涤所述标记的免疫复合物以去除未结合或非特异性结合的可检测标记分子；在底物分子的存在下将所述标记的免疫复合物固定在测定盘上，其中所述底物分子与所述标记的Aβ42免疫复合物或标记的Aβ40免疫复合物反应以产生产物分子，并且其中所述产物分子发射第三可检测信号。
在一些实施方案中，可以根据以下关系从所述剂量(D)确定Aβ42在所述体液中的浓度：
Figure BDA0003457042970000031
并且
可以根据以下关系从所述剂量(D)确定Aβ40在所述体液中的浓度：
Figure BDA0003457042970000032
其中C1、C2和C3是校正因子。在一些实施方案中，C1可以是大约2.4271，C2可以是大约0.9196，并且C3可以是大约0.35。
在一些实施方案中，所述免疫测定可以包括ELISA。在一些实施方案中，所述免疫测定可以包括数字ELISA。
在一些实施方案中，所述第一可检测信号和第二可检测信号可以是荧光信号。在一些实施方案中，所述第三可检测信号可以是荧光信号。在一些实施方案中，所述第一可检测信号、第二可检测信号和第三可检测信号可以是荧光信号。
在根据本公开文本的一些实施方案中，所述Aβ42捕获剂或所述Aβ40捕获剂可以包含顺磁珠。在一些实施方案中，所述捕获剂可以包含与所述顺磁珠的表面附接的Aβ42特异性抗体或Aβ40特异性抗体或抗原结合片段。
在根据本公开文本的一些实施方案中，所述测定盘可以包含孔。在一些实施方案中，将标记的免疫复合物固定在测定盘上可以包括将所述标记的免疫复合物或裸捕获剂固定在所述孔中。在一些实施方案中，每个孔可以被配置为在其中含有不多于一种的标记的免疫复合物或一种裸捕获剂。
在一些实施方案中，将标记的免疫复合物固定在测定盘上可以进一步包括在所述底物分子的存在下将所述标记的免疫复合物封闭在所述孔内在油层下。
在另一方面，本公开文本涉及一种检测受试者的神经退行性障碍、监测神经退行性障碍的进展，评估治疗神经退行性障碍的功效或评估患上神经退行性障碍的风险的方法，所述方法包括任何以上公开的方法。在一些实施方案中，所述神经退行性障碍可以选自痴呆、阿尔茨海默病和创伤性脑损伤。在一些实施方案中，所述神经退行性障碍可以是阿尔茨海默病。
在一些实施方案中，所述受试者可以患有神经退行性障碍、可以被怀疑患有神经退行性障碍、可以正在经受神经退行性障碍的治疗、可以具有患上神经退行性障碍的风险、或可以被怀疑具有患上神经退行性障碍的风险。
在另一方面，本公开文本涉及一种用于确定体液中β-淀粉样蛋白42(“Aβ42”)与β-淀粉样蛋白40(“Aβ40”)的比率的方法，所述方法包括：(i)提供体液样品；(ii)将所述体液样品在包含蛋白质可相容的表面活性剂的缓冲溶液中孵育至少30分钟以产生游离肽；以及(iii)对所述体液样品进行免疫测定。在所述方法的一些实施方案中，可以从单一多重免疫测定同时确定Aβ42和Aβ40在所述体液样品中的浓度。
在所述方法的一些实施方案中，Aβ42与Aβ40的比率可以从选自血液、血浆、血清、淋巴液、脑脊液、滑液、尿液和唾液的体液中确定。在优选的实施方案中，所述体液可以是血浆。
在所述方法的一些实施方案中，可以将所述体液样品在包含蛋白质可相容的缓冲液的缓冲溶液中孵育。在优选的实施方案中，所述蛋白质可相容的表面活性剂可以选自聚山梨醇酯20、Triton X-100或其混合物。在特别优选的实施方案中，所述缓冲溶液可以包含在0.005vol.-％与5.0vol.-％之间的蛋白质可相容的表面活性剂，更优选在0.05vol.-％与0.5vol.-％之间的蛋白质可相容的表面活性剂。
在所述方法的一些实施方案中，将所述体液样品在缓冲溶液中孵育可以进一步包括将所述体液样品在所述缓冲溶液中稀释约4与约16之间的倍数，优选约8与约16之间的倍数，甚至更优选大约10的倍数。在所述方法中的一些实施方案中，可以将所述体液样品在所述缓冲溶液中孵育至少大约30分钟但是不多于大约4小时。
在所述方法的一些实施方案中，所述免疫测定可以包括ELISA。在优选的实施方案中，所述免疫测定可以包括数字ELISA。在所述方法的更优选的实施方案中，所述免疫测定可以使用Quanterix
Figure BDA0003457042970000041
HD-1分析仪进行。
在另一方面，本发明技术提供了一种用于确定体液中Aβ42与Aβ40的比率的方法，所述方法包括：(i)提供体液样品；(ii)将所述体液样品在包含蛋白质可相容的表面活性剂的缓冲溶液中孵育至少30分钟以产生游离肽；(iii)对所述体液样品进行免疫测定，其中进行免疫测定可以进一步包括：(iv)测量来自Aβ42免疫复合物的第一可检测信号；(v)测量来自Aβ40免疫复合物的第二可检测信号；(vi)从至少第一可检测信号计算Aβ42的剂量(D)；(vii)从至少第二可检测信号计算Aβ40的剂量(D)；以及(viii)校正Aβ42和Aβ40的剂量(D)以确定Aβ42和Aβ40在所述体液中的浓度。
在另一方面，本发明技术提供了一种用于确定体液中Aβ42与Aβ40的比率的方法，所述方法包括：(i)提供体液样品；(ii)将所述体液样品在包含蛋白质可相容的表面活性剂的缓冲溶液中孵育至少30分钟以产生游离肽；(iii)对所述体液样品进行免疫测定，其中进行免疫测定可以进一步包括：(iv)测量来自Aβ42免疫复合物的第一可检测信号；(v)测量来自Aβ40免疫复合物的第二可检测信号；(vi)测量来自产物分子的第三可检测信号，其中所述产物分子可以包含来自底物分子与标记的Aβ42或Aβ40免疫复合物的反应的反应产物，其中所述标记的免疫复合物可以源自所述体液样品；(vii)从至少第一可检测信号和第三可检测信号计算Aβ42的剂量(D)；(viii)从至少第二可检测信号和第三可检测信号计算Aβ40的剂量(D)；以及(ix)校正Aβ42和Aβ40的剂量(D)以确定Aβ42和Aβ40在所述体液中的浓度。
在所述方法的一些实施方案中，可以根据以下关系从所述剂量(D)确定Aβ42在所述体液中的浓度：
Figure BDA0003457042970000051
并且
可以根据以下关系从所述剂量(D)确定Aβ40在所述体液中的浓度：
Figure BDA0003457042970000052
其中C1、C2和C3是校正因子。在所述方法的优选的实施方案中，所述校正因子可以如下：C1可以是大约2.4271，C2可以是大约0.9196，并且C3可以是大约0.35。
在所述方法的一些实施方案中，所述第一可检测信号和第二可检测信号可以包含荧光信号。在其他实施方案中，所述第一可检测信号、第二可检测信号和第三可检测信号可以包含荧光信号。
在另一方面，本发明技术提供了一种用于确定体液中Aβ42与Aβ40的比率的方法，所述方法包括：(i)提供体液样品；(ii)将所述体液样品在包含蛋白质可相容的表面活性剂的缓冲溶液中孵育至少30分钟以产生游离肽；(iii)对所述体液样品进行免疫测定，其中进行免疫测定可以进一步包括：(iv)在具有检测试剂分子和捕获剂的溶液中孵育游离肽分子，所述捕获剂包含Aβ42捕获剂和Aβ40捕获剂，以产生Aβ42免疫复合物和Aβ40免疫复合物；(v)洗涤所述捕获的肽以去除未结合或非特异性结合的Aβ42或Aβ40和未结合或非特异性结合的检测试剂分子；(vi)将所述免疫复合物与可检测标记分子一起孵育，其中所述可检测标记分子与在所述免疫复合物上的检测试剂分子结合，以产生标记的Aβ42免疫复合物和标记的Aβ40免疫复合物；(vii)洗涤所述标记的免疫复合物以去除未结合或非特异性结合的可检测标记分子；(viii)在底物分子的存在下将所述标记的免疫复合物固定在测定盘上，其中所述底物分子可以与所述标记的Aβ42免疫复合物或标记的Aβ40免疫复合物反应以产生产物分子，其中所述产物分子发射第三可检测信号；(ix)测量来自Aβ42免疫复合物的第一可检测信号；(x)测量来自Aβ40免疫复合物的第二可检测信号；(xi)测量来自产物分子的第三可检测信号，其中所述产物分子可以包含来自底物分子与标记的Aβ42或Aβ40免疫复合物的反应的反应产物，其中所述标记的免疫复合物可以源自所述体液样品；(xii)从至少第一可检测信号和第三可检测信号计算Aβ42的剂量(D)；(xiii)从至少第二可检测信号和第三可检测信号计算Aβ40的剂量(D)；以及(xiv)校正Aβ42和Aβ40的剂量(D)以确定Aβ42和Aβ40在所述体液中的浓度。
在所述方法的一些实施方案中，所述Aβ42捕获剂或所述Aβ40捕获剂可以包含顺磁珠。在所述方法的优选的实施方案中，所述捕获剂可以包含与顺磁珠的表面附接的Aβ42特异性抗体或Aβ40特异性抗体或抗原结合片段。在更优选的实施方案中，所述顺磁珠的直径可以是大约2.7μm。
在所述方法的一些实施方案中，所述测定盘可以包含孔，其中将标记的免疫复合物固定在测定盘上可以进一步包括将所述标记的免疫复合物或裸捕获剂固定在所述孔中。在优选的实施方案中，每个孔的尺寸可以被调整为在其中含有不多于一种的标记的免疫复合物或一种裸捕获剂。在更优选的实施方案中，每个孔可以具有大约4.50μm的直径和大约3.25μm的深度。在一些优选的实施方案中，将标记的免疫复合物固定在测定盘上可以进一步包括在所述底物分子的存在下将所述标记的免疫复合物封闭在所述孔内在油层下。
在所述方法的一些实施方案中，所述检测试剂可以包含生物素化检测抗体或生物素化抗原结合片段。在所述方法的一些实施方案中，所述可检测标记分子可以是酶，优选链霉亲和素-β-半乳糖苷酶。在优选的实施方案中，所述底物可以是试卤灵-β-d-吡喃半乳糖苷。
在另一方面，本发明技术提供了用于检测个体的神经退行性障碍、监测神经退行性障碍的进展，评估治疗神经退行性障碍的功效或评估患上神经退行性障碍的风险的方法，所述方法包括任何以上所述的方法。在优选的实施方案中，所述神经退行性障碍可以选自痴呆、阿尔茨海默病和创伤性脑损伤。
附图说明
图1是示出了在所述方法的一个实施方案中的过程步骤的流程图。
图2是根据本发明技术的免疫测定的一个实施方案的示意图。
图3示出了总结从表现出正常认知功能、早期MCI、晚期MCI和阿尔茨海默病的患者获得的血浆样本的免疫测定性能的箱线图。
图4示出了总结从阿尔茨海默病和晚期MCI患者获得的血浆样本与从早期MCI和正常患者获得的血浆样本的免疫测定性能的箱线图。
具体实施方式
定义
在本文中可互换使用的“体液(body fluid)”与“体液(bodily fluid)”是指来自人、动物或细胞培养物的流体样品。体液包括但不限于羊水、血液、脑脊液、腹膜液、血浆、胸膜液、唾液、精液、血清、痰、泪和尿液。在优选的实施方案中，所述体液(body fluid)或体液(bodily fluid)是人血浆。
在本文中可互换使用的“β-淀粉样肽”、“β-淀粉样蛋白”和“Aβ肽”是指β-淀粉样蛋白1-40(“Aβ40”)和β-淀粉样蛋白1-42(“Aβ42”)(分别为40和42个氨基酸的肽)。Aβ42和Aβ40是淀粉样前体蛋白(APP)的蛋白水解产物，所述Aβ42和Aβ40作为与AD发作、轻度认知损害、血管性痴呆和其他认知损害相关的生物标志物而受到关注。APP的β-分泌酶切割最初导致产生APP片段，所述APP片段在残基40-42处被γ-分泌酶进一步切割以产生两种主要形式的β-淀粉样蛋白，Aβ40和Aβ42。(参见例如，R.Vassar等人,29J.Neurosci.12787(2009))。
呈细胞外斑块形式的淀粉样蛋白的积累是AD的神经病理学的标志，并且据信在神经退行性过程中起核心作用。Aβ40是AD斑块中的主要的淀粉样蛋白组分，并且被认为是AD斑块形成的起始因子。在健康和疾病状态下，Aβ40是脑脊液(CSF)和血浆二者中最丰富的淀粉样肽形式(比Aβ42丰富10-20X)。最近的研究表明，Aβ42与Aβ40的比率的降低可能指示AD进展。参见例如，K.Yaffe等人,305JAMA 261(2011)。
现在已经围绕脑脊液(CSF)中Aβ42水平的疾病相关性进行了大量临床验证。参见例如，S.Janelidze等人,74JAMA Neurol.1492(2017)。与基于CSF的筛选方法相比，基于血液的Aβ42筛选将是一种侵入性更小、更具成本效益的技术，用于鉴定具有患上AD的风险的个体、用于监测神经退行性障碍的进展或用于监测神经退行性障碍的治疗。因此，测量Aβ42以及Aβ40的血液水平具有重要意义。然而，血液中Aβ42的浓度(通常在单一pg/ml范围内)比脑脊液中的浓度低100多倍，因此需要非常高的分析灵敏度才能进行可靠的测量。
如本文所用，“Aβ42/Aβ40比率”或“42/40比率”是指在流体样品(例如，体液样品，诸如血浆、CSF等)中Aβ42与Aβ40的比率。
如本文所用，“游离肽”意指如下β-淀粉样肽分子，其与内源性血浆蛋白完全解离、不与捕获剂结合，并且可以单独地或与表面活性剂分子缔合地在溶液中自由扩散。在本发明技术中，所述β-淀粉样肽可以是Aβ42或Aβ40。类似地，术语“游离肽溶液”意指包含此类Aβ42或Aβ40肽的溶液。
如本文所用，“蛋白质可相容的表面活性剂”意指不会在目的蛋白(例如，β-淀粉样肽)中引起不希望的反应或以其他方式使所述目的蛋白不可用于测定的表面活性剂。在一些情况下，“蛋白质可相容的表面活性剂”可以促进靶生物分子(例如，Aβ42或Aβ40肽)与内源性血浆蛋白的解离，使得它们可用于测定(例如，通过使用数字ELISA的免疫测定)。本领域中已知的蛋白质可相容的表面活性剂包括但不限于聚山梨醇酯20(即Tween-20)和Triton X-100。
如本文所用，“捕获剂”是指可以选择性或特异性结合游离β-淀粉样肽的固体支持物。所述固体支持物可以是与包含Aβ肽的溶液接触的任何固体表面(例如，聚合物珠、顺磁珠、微球或微珠、纳米颗粒、纳米线、平面表面等)。在优选的实施方案中，所述固体支持物可以在其一个或多个表面上展示免疫球蛋白相关组合物(例如，抗体或抗原结合片段)。在优选的实施方案中，所述免疫球蛋白相关组合物可以是Aβ42特异性抗体或Aβ40特异性抗体或抗原结合片段。在一些实施方案中，每种捕获剂可以具有与每个固体支持物表面附接的在一与一百万之间，优选在100,000与500,000之间的免疫球蛋白相关组合物(例如，抗体或抗原结合片段)。
如本文所用，“捕获的肽”分别意指与固体支持物结合的Aβ42或Aβ40肽分子，诸如Aβ42捕获剂或Aβ40捕获剂。在优选的实施方案中，所述捕获的Aβ42肽或捕获的Aβ40肽可以通过与Aβ42特异性或Aβ40特异性免疫球蛋白相关组合物(例如，抗体或抗原结合片段)的特异性结合相互作用与捕获剂偶联。
如本文所用，“裸捕获剂”意指未与游离肽分子结合的捕获剂。例如，“裸Aβ42捕获剂”是未捕获Aβ42肽的Aβ42捕获剂，并且“裸Aβ40捕获剂”是未捕获Aβ40肽的Aβ40捕获剂。因为裸捕获剂不包括捕获的肽，因此它们可能不会形成免疫复合物或标记的免疫复合物。
如本文所用，“检测试剂”意指可以与捕获的Aβ42或Aβ40肽特异性或选择性结合的选择性结合剂。所述检测试剂可以是免疫球蛋白相关组合物(例如，抗体或抗原结合片段)。这些结合剂可以与捕获的Aβ42或捕获的Aβ40选择性地或特异性地结合。这些结合剂可以是天然存在的或合成的。在优选的实施方案中，所述检测试剂可以是生物素化的抗体或生物素化的抗原结合片段。
如本文所用，“免疫复合物”意指与捕获的肽结合的捕获剂，所述捕获的肽进而与检测试剂分子结合。在一些实施方案中，所述“免疫复合物”可以包含捕获的肽，所述免疫复合物可以包含通过与捕获剂的固体支持物的表面附接的免疫球蛋白相关组合物(例如，抗体或抗原结合片段)与Aβ42或Aβ40肽分子选择性或特异性结合的捕获剂。捕获的肽可以进而与检测试剂分子选择性地结合。在优选的实施方案中，所述检测试剂可以与所述捕获的肽选择性地或特异性地结合。更优选地，所述检测试剂可以是与所述捕获的肽选择性结合的免疫球蛋白相关组合物(例如，抗体或抗原结合片段)。
如本文所用，“可检测标记”意指与免疫复合物特异性或选择性结合的分子。在优选的实施方案中，可检测标记分子可以是与免疫复合物上结合的检测试剂部分缀合的任何分子，并且所述分子发射可检测信号，与发射可检测信号的底物分子复合，或与底物分子反应以产生发射可检测信号的产物分子。在优选的实施方案中，所述可检测标记分子可以包含与结合的检测试剂(例如，生物素)的互补部分选择性结合的接头部分(例如，亲和素、链霉亲和素或中性亲和素部分)。在优选的实施方案中，所述可检测标记分子可以是酶。在优选的实施方案中，所述可检测标记可以是链霉亲和素-β-半乳糖苷酶(SBG)。
如本文所用，“标记的免疫复合物”意指具有与检测试剂部分缀合的可检测标记分子的免疫复合物。例如，“标记的Aβ42免疫复合物”是其中所述结合的检测试剂可以与可检测标记分子缀合的Aβ42免疫复合物。同样，“标记的Aβ40免疫复合物”是其中所述结合的检测试剂可以与可检测标记分子缀合的Aβ40免疫复合物。在优选的实施方案中，所述结合的检测试剂可以通过链霉亲和素-生物素接头与可检测标记缀合。
如本文所用，“捕捉的免疫复合物”或“固定的免疫复合物”是指已经固定在测定盘上(例如，在底物分子的存在下捕捉在孔内在油层下)的标记的Aβ42免疫复合物或标记的Aβ40免疫复合物。“捕捉的免疫复合物”可以与捕捉在同一孔内的底物分子反应以产生发射可检测信号(例如荧光)的产物。
如本文所用，“底物”或“底物分子”是指可检测标记分子作用于其上的分子。作为一个例子，可检测标记分子可以是可以参与涉及底物分子的化学反应的酶。底物分子可以与酶活性位点结合，并且可以形成酶-底物复合物。底物可以转化为一种或多种产物，然后所述产物可以从活性位点释放，之后活性位点自由地接受另一个底物分子。在多种底物的情况下，底物可以以特定顺序结合活性位点，然后一起反应以产生产物。底物可以是可以与可检测标记复合的放射性同位素。如果底物在被可检测标记分子作用时产生荧光产物，则所述底物被称为“荧光的”。如果底物在被可检测标记分子作用时产生有色产物，则所述底物被称为“显色的”。底物分子也可以是可以与可检测标记分子复合的放射性同位素。
如本文所用，“特异性结合”或“选择性结合”是指与肽、检测试剂或可检测标记特异性或选择性结合的任何试剂、分子或化合物的活性。例如，Aβ42捕获剂或Aβ40捕获剂上的抗体可以分别与游离Aβ42或游离Aβ40肽分子或其特定部分特异性地和选择性地结合。例子包括但不限于抗体或抗体片段。这些结合剂可以是天然存在的或合成的。
如本文所用，“抗体”是指由基本上由免疫球蛋白基因或免疫球蛋白基因的片段编码的一种或多种多肽组成的蛋白质。公认的免疫球蛋白基因可以包括κ、λ、α、γ、δ、ε和μ恒定区基因，以及无数免疫球蛋白可变区基因。轻链分类为κ或λ。重链分类为γ、μ、α、δ或ε，它们进而分别定义了免疫球蛋白类别，IgG、IgM、IgA、IgD和IgE。
如本文所用，“酶联免疫吸附测定”或“ELISA”是指基于抗体的测定，其中经由产生可检测信号的酶促反应完成目的抗原的检测。ELISA可以以竞争形式或非竞争形式运行。ELISA还包括2位点或“夹心”测定，其中使用针对抗原的两种抗体，一种抗体用于捕获抗原，并且另一种用酶或其他可检测标记进行标记以检测捕获的抗体-抗原复合物。
在典型的2位点ELISA中，所述抗原具有至少一个表位是未标记的抗体和酶联抗体可以以高亲和力结合的。因此，抗原可以使用酶联抗体进行亲和捕获和检测。选择的典型酶包括碱性磷酸酶、辣根过氧化物酶或链霉亲和素-β-半乳糖苷酶(SBG)，所有这些酶都在消化适当的底物后产生可检测产物。
如本文所用，“单分子免疫测定”、
Figure BDA0003457042970000081
或“数字ELISA”是指允许使用与常规ELISA方法相同的试剂同时检测数千种单一蛋白质分子的测定技术。“数字ELISA”是一种有前景的用于检测pg/ml范围内的肽的平台。被描述为“单分子阵列”
Figure BDA0003457042970000082
技术，这种方法使用可以分离和检测单一蛋白质分子的毫微微升尺寸的反应室(孔)的阵列。孔容积比常规ELISA中小大约20亿倍，从而允许在存在酶标记的分析物蛋白时快速积聚荧光产物。由于孔容积极小防止荧光团产物扩散出孔，在每个反应室内存在高局部浓度的受限荧光底物分子。容易观察到这种高局部荧光团浓度，使得仅需要单一分子来达到检测限。参见例如，美国专利号8,846,415；Rissin等人,28Nat.Biotechnol.595(2010)。
如果特定的孔含有标记的免疫复合物(包含捕获的肽)，则受限底物分子可以通过可检测标记转化为产物(例如，“荧光团”)，并被限制在大约40毫微微升的体积，从而产生高局部产物浓度并且发射可检测信号(例如，荧光)。如果特定的孔含有裸捕获剂(没有捕获的肽)，则它将不含可检测标记。因此，所述孔将不会展现来自产物分子的可检测信号。因此，
Figure BDA0003457042970000083
允许以数字方式确定蛋白质浓度并且被称为“数字ELISA”。含有免疫复合物的孔的数量与含有裸捕获剂的孔的总数量的比率对应于样品分析物肽浓度。参见例如，美国专利号8,846,415；Rissin等人,28Nat.Biotechnol.595(2010)。
如本文所用，“检测(Detecting或detection)”是指确定样品中分子的存在和/或浓度。在优选的实施方案中，“检测”可以是确定体液样品中Aβ42或Aβ40的存在。检测不要求所述方法提供100％的灵敏度。
如本文所用，“可检测信号”意指对环境刺激的可量化反应，或者颗粒、光或能量的可量化发射。可检测信号可以是光学的(例如，发光、化学发光、荧光或比色)。可检测信号也可以是放射发射的(例如，来自放射性同位素)。
如本文所用，“荧光团”是指吸收特定波长(激发频率)的光，并且随后发射更长波长(发射频率)的光的分子。
如本文所用，“剂量”或“未校正的剂量”是指体液样品内Aβ42和/或Aβ40的计算浓度。在优选实施方案中，所述剂量可以经由以下方程使用
Figure BDA0003457042970000091
软件的4PL(4参数逻辑斯谛)回归，使用Quanterix
Figure BDA0003457042970000092
HD-1分析仪确定：
Figure BDA0003457042970000093
其中：
A＝可以获得的最小值(即在0剂量时的可检测信号)；
E＝可以获得的最大值(即在无限剂量时的可检测信号)；
C＝拐点(即在曲线上A与E中间的点)；
B＝曲线的希尔斜率(与曲线在C点的陡度相关)；
Y＝来自单独样本的可检测信号
D＝剂量(pg/ml)
如本文所用，“个体”、“患者”或“受试者”可以是单独的生物体、脊椎动物、哺乳动物或人。在优选的实施方案中，所述个体、患者或受试者是人。
如本文关于本发明技术的方法所用，“特异性”意指当在测定盘上的特定孔内固定裸捕获剂或没有固定捕获剂时测试结果将为阴性的概率。
如本文关于本发明技术的方法所用，“灵敏度”意指当在测定盘上的特定孔内固定标记的Aβ42免疫复合物或标记的Aβ40免疫复合物时测试结果将为阳性的概率。
除非上下文另外说明或另外明显，否则如本文关于数字所用，“约”或“大约”通常视为包括落在所述数字任一方向(大于或小于)的1％、5％或10％范围内的数字(这个数字低于可能值的0％或超过可能值的100％的情况除外)。
用于检测血浆中42/40比率的多重免疫测定
常规的淀粉样蛋白测定试剂盒(例如，Quanterix#101995，人神经病学3-Plex试剂盒，Quanterix Corp.，马萨诸塞州莱克星顿)回收率低，难以准确确定42/40比率。修改样本稀释度和孵育条件，以及基于测定性能应用分析校正因子提高了Aβ回收率，并且使得能够从单一多重测定快速准确地确定42/40比率。
参考附图可以最好地理解本发明技术。参考图1，方法100的一些实施方案可以包括提供体液样品102。体液样品102可包含含有或怀疑含有Aβ42和/或Aβ40分子的任何体液(例如，血液、血浆、血清、淋巴液、脑脊液、滑液、尿液、唾液等)。在优选的实施方案中，体液样品102可以包含人体液样品。在优选的实施方案中，体液样品102可以包含血浆。
方法100的一些实施方案可以进一步包括测定前孵育106，其中将体液样品102在稀释缓冲溶液104中稀释以产生游离肽108。稀释缓冲溶液104可以包含任何合适的蛋白质可相容的缓冲溶液(例如，磷酸盐缓冲盐水)。在优选的实施方案中，稀释缓冲溶液104可以包含Quanterix 4-Plex稀释剂(Quanterix Corp.，马萨诸塞州莱克星顿)。
稀释缓冲溶液104可以另外地包含一种或多种表面活性剂，所述表面活性剂能够使Aβ肽(例如，Aβ42或Aβ40等)从基质血浆蛋白解吸，以使Aβ肽可用于测定。所述一种或多种表面活性剂可以包含任何合适的蛋白质可相容的表面活性剂(例如，聚山梨醇酯20(Tween-20)、Triton X-100或其混合物等)。在优选的实施方案中，所述表面活性剂包含Triton X-100和Tween-20的混合物。在一些实施方案中，所述表面活性剂可以以在.005vol.-％与5.0vol.-％之间、优选在.01vol.-％与1vol.-％之间、更优选在0.05vol.-％与0.5vol.-％之间的浓度存在。
在一些实施方案中，测定前孵育106可以包括将体液样品102在稀释缓冲溶液104中稀释1与20之间、优选4与16之间、甚至更优选8与12之间的倍数。在优选的实施方案中，可以将体液样品102在稀释缓冲溶液104中稀释大约10的倍数。
在一些实施方案中，在对所述体液样品进行免疫测定之前，可以在延长的时间中进行测定前孵育106以允许Aβ42和Aβ40与内源性血浆蛋白解离，从而增加Aβ42和Aβ40测定的可用性。在优选的实施方案中，测定前孵育106可以包括将所述体液样品102在稀释缓冲溶液104中孵育1min与480min之间，优选10min与360min之间，并且更优选30min与240min之间。在优选的实施方案中，测定前孵育106进行至少30min但是不多于4小时。
在一些实施方案中，方法100可以进一步包括，在测定前孵育106之后，进行免疫测定107，其中同时测定在所述稀释的体液样品中的Aβ42和Aβ40肽。同时测定Aβ42和Aβ40肽可以包括用于确定肽浓度的任何合适的测定方法(例如，ELISA、数字ELISA等)。在优选的实施方案中，所述测定方法可以包括数字ELISA。
现在参考图1和图2，在一个实施方案中，进行免疫测定107可以包括通过将游离肽108在捕获剂110和检测试剂分子111的存在下孵育以产生免疫复合物114来捕获112游离肽108。在优选的实施方案中，所述免疫复合物可以包含“夹心型”复合物，其中单一捕获剂可以在C末端处与一个或多个Aβ肽分子结合，并且检测试剂分子可以在其N末端处与每个捕获Aβ肽分子结合。
在方法100的一些实施方案中，所述捕获剂110可以包含固体支持物(例如珠、功能化孔、微粒、纳米颗粒等)。在优选的实施方案中，所述固体支持物可以包含2.7μm直径的顺磁珠。
在优选的实施方案中，所述捕获剂可以进一步包含可以与固体支持物结合的选择性结合剂(例如，Aβ42特异性结合剂或Aβ40特异性结合剂)。在优选的实施方案中，所述特异性结合剂可以包含免疫球蛋白相关组合物(例如，Aβ42特异性抗体或Aβ40特异性抗体)。在特别优选的实施方案中，所述支持物结合的Aβ42抗体或Aβ40抗体分别可以在C末端处与Aβ42肽或Aβ40肽选择性地和特异性地结合。
在优选的实施方案中，可以将每种捕获剂仅用一种类型的针对Aβ肽(例如，针对Aβ42或Aβ40)的选择性结合剂进行功能化。例如，每种Aβ42捕获剂可以用Aβ42特异性抗体(但不是Aβ40特异性抗体)功能化，而每种Aβ40捕获剂可以用Aβ40特异性抗体(但不是Aβ42特异性抗体)功能化。
此外，在优选的实施方案中，每种Aβ特异性捕获剂可以发射不同的可检测信号(例如，比色、发光、电致发光、放射发射、荧光等)。例如，每种Aβ42捕获剂可以发射第一波长的第一荧光信号，而每种Aβ40捕获剂可以发射第二波长的第二荧光信号。
在所述方法的优选的实施方案中，所述捕获剂110可以包含Quanterix
Figure BDA0003457042970000101
Aβ42染料编码的(488)珠浓缩物(1.4x 109个珠/ml)(Quanterix#102007，Quanterix Corp.，马萨诸塞州莱克星顿)和Quanterix
Figure BDA0003457042970000102
Aβ40染料编码的(700)珠浓缩物(1.4x 109个珠/ml)(Quanterix#102009，Quanterix Corp.，马萨诸塞州莱克星顿)。
在一些实施方案中，溶液中的捕获剂的总数可以超过游离Aβ42和Aβ40分子的总数10,000与1之间、更优选在100与1之间的倍数。在优选的实施方案中，捕获剂的总数可以超过游离Aβ42和游离Aβ40肽的总数，大约10比1。因此，所述捕获的肽溶液可以包含捕获的Aβ42、捕获的Aβ40和裸捕获剂。
参考图1和图2，在一些实施方案中，捕获112Aβ42和Aβ40肽可以进一步包括将游离肽108和捕获剂110在检测试剂分子111的存在下孵育。检测试剂分子可以与捕获的Aβ42或捕获的Aβ40选择性或特异性结合，以分别产生Aβ42免疫复合物或Aβ40免疫复合物。在优选的实施方案中，所述检测试剂分子可以通过它们共同的N末端序列与Aβ42或Aβ40结合，使得所述检测试剂分子不会相对于Aβ40优先结合Aβ42，或反之亦然。
检测试剂111分子可以是免疫球蛋白相关组合物(例如，抗体或抗原结合片段)。在优选的实施方案中，所述检测试剂可以包含与Aβ42或Aβ40的共同N末端选择性结合的免疫球蛋白相关组合物(例如，抗体或抗原结合片段)。在所述方法的优选的实施方案中，所述检测试剂可以包含生物素化抗体或生物素化抗原结合片段。在所述方法的优选的实施方案中，所述检测试剂可以包含Quanterix
Figure BDA0003457042970000111
Aβ40/42生物素化检测抗体(Quanterix#102010,Quanterix Corp.，马萨诸塞州莱克星顿)。
在一些实施方案中，进行免疫测定107可以进一步包括第一次洗涤116，其中将未结合或非特异性结合的肽118和未结合或非特异性结合的检测试剂分子119从所述测定溶液中去除。在优选的实施方案中，可以收集或保留免疫复合物114和裸捕获剂(未显示)用于随后的测定步骤。
仍然参考图1和图2，进行免疫测定107可以进一步包括通过将免疫复合物114在可检测标记分子120的存在下孵育来标记122它们。在一些实施方案中，一种或多种可检测标记分子通过连接(例如链霉亲和素-生物素)与每种免疫复合物缀合以产生标记的免疫复合物124。
在所述方法的优选的实施方案中，所述可检测标记122可以包含酶(例如，β-半乳糖苷酶、辣根过氧化物酶(HRP)或碱性磷酸酶)。在优选的实施方案中，所述可检测标记可以包含链霉亲和素-β-半乳糖苷酶(SBG)。在所述方法的特别优选的实施方案中，所述可检测标记可以包含源自Quanterix Bulk SBG试剂盒(Quanterix#101735，Quanterix Corp.，马萨诸塞州莱克星顿)的SBG。
仍然参考图1，在一些实施方案中，进行免疫测定107可以进一步包括第二次洗涤123，其中将未结合或非特异性结合的可检测标记分子125从所述测定溶液中去除。在优选的实施方案中，可以收集或保留标记的免疫复合物124和裸捕获剂(未显示)用于随后的测定步骤。
在所述方法100的一些实施方案中，进行免疫测定107可以进一步包括在底物分子126的存在下将标记的免疫复合物124和裸捕获剂(未显示)从溶液中固定128到测定盘127上以产生用于分析的捕捉的免疫复合物130。(固定128也可以捕捉裸捕获剂(未显示))。
参考图1和图2，在所述方法100的一些实施方案中，所述测定盘127可以包含一个或多个孔阵列。在优选的实施方案中，在测试基板中的孔的尺寸可以被调整为每孔容纳不多于一种标记的免疫复合物或裸捕获剂。在所述方法的特别优选的实施方案中，所述孔的尺寸可以是大约4.25μm宽和大约3.25μm深。
在一些实施方案中，可以在底物分子126的存在下将标记的免疫复合物124固定在测定盘127上。在优选的实施方案中，所述底物可以包含任何合适的底物分子126，所述底物分子可以与可检测标记分子反应以产生发射第三可检测信号(例如荧光)的产物分子132。
在优选的实施方案中，所述底物126可以包含试卤灵-β-d-吡喃半乳糖苷(RGP)。在特别优选的实施方案中，所述底物分子可以源自Quanterix’s Bulk RGP试剂盒(Quanterix#101736，Quanterix Corp.，马萨诸塞州莱克星顿)的等分试样。
在一些实施方案中，将标记的免疫复合物124固定128在测定盘127上可以包括将标记的免疫复合物和裸捕获剂封闭在测定盘的孔内。在优选的实施方案中，将标记的免疫复合物固定在测定盘上可以进一步包括横跨测定盘铺展油(例如，Dupont
Figure BDA0003457042970000112
性能润滑剂)，从而在底物分子的存在下将免疫复合物和裸捕获剂封闭在孔中。在所述方法的优选的实施方案中，密封油可以是Quanterix
Figure BDA0003457042970000113
密封油(Quanterix#100206，QuanterixCorp.，马萨诸塞州莱克星顿)。
在一些实施方案中，进行免疫测定107可以进一步包括测量可检测信号以确定Aβ42和Aβ40在体液样品中的浓度。例如，在一些实施方案中，所述Aβ42捕获剂可以发射第一可检测信号(例如，荧光)，使得可以由测量第一可检测信号来确定测定盘上的标记的Aβ42免疫复合物和裸Aβ42捕获剂的数量。此外，在一些实施方案中，所述Aβ40捕获剂可以发射第二可检测信号(例如，荧光)，使得可以由测量第二可检测信号来确定测定盘上的标记的Aβ40免疫复合物和裸Aβ40捕获剂的数量。第一可检测信号和第二可检测信号可以通过合适的分析仪测量。在优选的实施方案中，所述第一可检测信号和第二可检测信号可以通过数字荧光分析仪(例如，Quanterix
Figure BDA0003457042970000121
HD-1分析仪)测量。
此外，因为可以在底物分子126的存在下将标记的免疫复合物130捕捉在测定盘127上，所以底物分子可以与标记的免疫复合物130上的可检测标记部分反应以产生可以发射第三可检测信号(例如，荧光)的产物分子132。由于孔可能是密封的，所以产物分子可能无法扩散出孔，所述孔可能含有毫微微升数量级的容积。因此，可以在含有标记的免疫复合物的每个孔内积聚高浓度的产物分子，使得第三可检测信号(例如，荧光信号)易于观察。第三可检测信号可以通过任何合适的分析仪(例如，数字荧光分析仪、模拟荧光分析仪、组合数字模拟荧光分析仪等)测量。在优选的实施方案中，第三可检测信号可以通过数字荧光分析仪(例如，Quanterix
Figure BDA0003457042970000122
HD-1分析仪)测量。
在一些实施方案中，可以比较第一、第二和第三可检测信号以确定Aβ42和Aβ40在样品中的浓度。测定盘127上标记的免疫复合物130与裸捕获剂(未显示)的比率可以指示Aβ42和/或Aβ40在体液样品中的浓度。
在优选的实施方案中，进行免疫测定可以进一步包括测量来自测定盘中的产物分子的可检测信号(例如，放射发射、荧光、发光或化学发光，或比色信号)。在优选的实施方案中，可检测信号可以是数字荧光信号。在优选的实施方案中，所述荧光信号可以使用可商购的分析仪测量。最优选地，所述可商购的分析仪可以是Quanterix
Figure BDA0003457042970000123
HD-1分析仪(Quanterix Corp.，马萨诸塞州莱克星顿)。
在所述方法的一个实施方案中，进行免疫测定107可以进一步包括基于第一、第二与第三可检测信号之间的关系计算Aβ42和Aβ40的剂量(D)(分析物的浓度)。在优选的实施方案中，可以使用拟合校准曲线计算剂量(D)。在优选的实施方案中，可以经由以下方程使用4参数逻辑斯谛(“4PL”)拟合校准曲线计算剂量(D)：
Figure BDA0003457042970000124
其中：
A＝可以获得的最小值(即在0剂量时的可检测信号)；
E＝可以获得的最大值(即在无限剂量时的可检测信号)；
C＝拐点(即在曲线上A与E中间的点)；
B＝曲线的希尔斜率(与曲线在C点的陡度相关)；
Y＝来自单独样本的可检测信号
D＝剂量(pg/ml)
在优选的实施方案中，进行免疫测定127可以进一步包括校正136剂量(D)值以确定分析物肽(例如，Aβ42和Aβ40)的浓度。在优选的实施方案中，在体液样品中Aβ42和Aβ40的浓度可以使用校正因子从剂量(D)计算。在优选的实施方案中，在体液样品中Aβ42和Aβ40的浓度(和42/40比率)可以根据以下方程，使用校正因子C1、C2和C3，通过校正剂量来计算：
Figure BDA0003457042970000125
Figure BDA0003457042970000126
Figure BDA0003457042970000131
在特别优选的实施方案中，C1可以是大约2.4271，C2可以是大约0.9196，并且C3可以是大约0.35。
本公开文本还涉及用于检测个体的神经退行性障碍、监测神经退行性障碍的进展，评估治疗神经退行性障碍的功效或评估患上神经退行性障碍的风险的方法。在一些实施方案中，所述神经退行性障碍可以选自痴呆、阿尔茨海默病和创伤性脑损伤。在所述方法的优选的实施方案中，所述神经退行性障碍可以是阿尔茨海默病。
在一个实施方案中，所述方法可以包括根据以上公开的方法确定体液样品中的42/40比率，然后将42/40比率与参考值进行比较，使得大于或等于参考值的42/40比率在正常范围内，并且小于参考值的42/40比率在正常范围外。在所述方法的一个实施方案中，所述参考值可以是大约0.080，使得大于或等于大约0.080的42/40比率在正常范围内，而小于大约0.080的42/40比率在正常范围外。
实施例
实施例1
将患者血浆样品手动稀释在稀释缓冲溶液中，以将Aβ42和Aβ40与内源性血浆蛋白解离。首先将每个患者样品解冻，然后充分涡旋。为了实现1:10的稀释，将30μl的每个患者样品移液到1.5ml的卡扣式(snap-top)管中，所述管含有270μl的Quanterix 4-Plex稀释剂(Quanterix Corp.，马萨诸塞州莱克星顿)。允许将稀释的患者样品在室温下平衡至少30分钟但是不多于4小时，然后进行进一步处理。
β淀粉样肽对照由Aβ42(例如，β-淀粉样蛋白(Aβ)[1-42](人)，Invitrogen#03-112)和Aβ40(例如，淀粉样β蛋白1-40，Sigma Aldrich#A1075-1MG)的储备溶液制备。从这些储备溶液中，对于Aβ42(分别为100pg/ml、20pg/ml和10pg ml)和Aβ40(分别为700pg/ml、150pg/ml和70pg/ml)制备“类似物”和高、中、低浓度对照。将每种对照溶液按1:10稀释(将60μl移液到540μl的稀释缓冲溶液(例如，Quanterix 4-Plex稀释剂)中)。
从Aβ42/Aβ40(100/200pg/ml)校准品储备溶液制备一系列校准品，所述储备溶液是通过将Aβ42校准品浓缩液(例如，Aβ42校准品浓缩液，Quanterix Corp.，马萨诸塞州莱克星顿)和Aβ40校准品浓缩液(例如，Aβ40校准品浓缩液，Quanterix Corp.，马萨诸塞州莱克星顿)在稀释缓冲溶液(例如，Quanterix 4-Plex稀释剂)中稀释制备的并且在-15℃至-25℃下储存。为了制备校准品，将稀释缓冲溶液(Quanterix 4-Plex稀释剂)移液到一系列1.5ml卡扣式管中(每管333.3μl)。将校准品储备溶液解冻，然后充分涡旋。然后通过将校准品储备溶液在稀释缓冲液中连续稀释以实现200/100pg/ml、66.7/33.3pg/ml、22.2/11.1pg/ml、7.41/3.70pg/ml、2.47/1.23pg/ml、0.82/0.41pg/ml、0.27/0.14pg/ml和0/0pg/ml的Aβ40/Aβ42浓度，来制备校准品样品。将250ul的每种校准品溶液移液到测定盘中的预定位置。
将稀释的对照和患者样品(各250μl)移液到测定盘中的预定位置。一式两份制备并运行每种校准品、对照和患者样品(即体液样品)。然后将板用X-Pierce密封膜密封。
然后使用Quanterix
Figure BDA0003457042970000132
HD-1分析仪使用标准两步式“自制”方案运行免疫测定。根据以下方程，使用四参数逻辑斯谛校准曲线计算初始浓度：
Figure BDA0003457042970000133
其中：
A＝可以获得的最小值(即在0剂量时的可检测信号)；
E＝可以获得的最大值(即在无限剂量时的可检测信号)；
C＝拐点(即在曲线上A与E中间的点)；
B＝曲线的希尔斜率(与曲线在C点的陡度相关)；并且
Y＝来自单独样本的可检测信号。
D＝剂量(pg/ml)
然后根据以下方程校正原始浓度值并将其用于计算42/40比率：
Figure BDA0003457042970000141
Figure BDA0003457042970000142
Figure BDA0003457042970000143
其中C1＝2.4271，C2＝0.9196并且C3＝0.35。
图3示出了总结从表现出正常认知功能、早期MCI、晚期MCI和阿尔茨海默病的患者获得的血浆样本的免疫测定性能的箱线图。针对AD和晚期MCI患者测量的平均血浆42/40比率明显低于针对AD和晚期MCI患者测量的所述比率。
图4示出了将与晚期MCI患者配对的AD患者与与正常患者配对的早期MCI患者的免疫测定性能进行比较的第二箱线图。针对AD/晚期MCI患者观察到的平均血浆42/40比率高于针对正常/早期MCI患者观察到的所述比率。
本文所述的多重方法以最佳回收率同时测定了Aβ42和Aβ40，所述最佳回收率使得能够计算来自血浆的42/40比率，所述多重方法经证实的临床灵敏度为76％并且临床特异性为71％，以及阳性预测值为66％并且阴性预测值为81％。当采用针对每个分析物的基线回收率的校正因子时，概率统计(从单尾T检验中获得)从没有另外校正的p＝0.011提高到应用校正因子后的p＝0.004。这代表在分析特异性和灵敏度方面提高了大约36％。
等效物
本发明技术并不受限于本申请中描述的具体实施方案，所述具体实施方案旨在作为本发明技术的单独方面的单一说明。如对于本领域技术人员将清楚的，可以在不背离本发明技术的精神和范围的情况下，对本发明技术进行多种修饰和变更。本领域技术人员根据前述描述将清楚，除了本文列举的方法和装置外，在本发明技术范围内的功能上等效的方法和装置。此类修饰和变更旨在落于本发明技术的范围内。应理解，本发明技术不限于具体方法、试剂、化合物、组合物或生物系统，当然它们可以改变。还应理解，本文中所用术语仅用于描述特定实施方案的目的，并且不旨在具有限制性。
另外，当本公开文本的特征或方面以马库什组(Markush group)描述时，本领域技术人员将意识到本公开文本还由此以马库什组的任何单独的成员或成员子组描述。
如本领域技术人员将理解的，出于任何和所有目的，特别是就提供书面描述而言，本文公开的所有范围还涵盖任何和所有可能的子范围及其子范围的组合。任何所列范围都可容易地识别为充分描述相同范围并且使得相同范围能分解为至少相等的二分之一、三分之一、四分之一、五分之一、十分之一等。作为非限制性例子，本文中论述的每个范围可容易地分解为下三分之一、中三分之一和上三分之一等。同样如本领域技术人员可理解，所有诸如“高达”、“至少”、“大于”、“小于”等言辞都包括所述数字并且涉及随后可分解为如上所述的子范围的范围。最后，如本领域技术人员应理解，范围包括每个单独的成员。因此，例如，具有1-3个单元的组是指具有1、2或3个单元的组。类似地，具有1-5个单元的组是指具有1、2、3、4或5个单元的组，等等。
本文提到或引用的所有专利、专利申请、临时申请和出版物都通过引用以其整体并入，包括所有图形和表格，并入程度使其与本说明书的明确教示一致。

Claims (50)

1.一种用于制备用于检测β-淀粉样蛋白42(“Aβ42”)至β-淀粉样蛋白40(“Aβ40”)中的至少一种的体液样品的方法，所述方法包括：
获得来自受试者的体液样品；以及
通过将所述体液样品在缓冲溶液中孵育使所述体液样品中的Aβ42和Aβ40中的至少一种与内源性蛋白解离，所述缓冲溶液包含：
缓冲液；和
蛋白质可相容的表面活性剂，
其中将所述体液样品在所述缓冲溶液中孵育至少30分钟。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述缓冲溶液包含在0.005vol.-％与5.0vol.-％之间的所述蛋白质可相容的表面活性剂。
3.根据权利要求1或权利要求2所述的方法，其中将所述体液样品在所述缓冲溶液中稀释约4与约16之间的倍数。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的方法，其中所述蛋白质可相容的表面活性剂包含聚山梨醇酯20、Triton X-100或其混合物。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的方法，其中所述体液选自血液、血浆、血清、淋巴液、脑脊液、滑液、尿液和唾液。
6.根据权利要求1-5中任一项所述的方法，其中将所述体液样品在所述缓冲溶液中孵育至少大约30分钟但是不多于大约4小时。
7.根据权利要求1-6中任一项所述的方法，所述方法进一步包括将所述体液样品在所述缓冲溶液中孵育后对所述体液样品进行免疫测定，以确定Aβ42和Aβ40中的至少一种的浓度。
8.根据权利要求7所述的方法，所述方法进一步包括：确定Aβ42和Aβ40的浓度，并且计算在所述体液样品中Aβ42与Aβ40的比率。
9.根据权利要求8所述的方法，其中计算Aβ42与Aβ40的比率包括：
从至少所述第一可检测信号计算Aβ42的剂量(D)；
从至少所述第二可检测信号计算Aβ40的剂量(D)；以及
校正Aβ42和Aβ40的剂量(D)以确定Aβ42和Aβ40在所述体液中的浓度。
10.根据权利要求8或权利要求9所述的方法，其中根据以下关系从所述剂量(D)确定Aβ42在所述体液中的浓度：
Figure FDA0003457042960000011
并且
其中根据以下关系从所述剂量(D)确定Aβ40在所述体液中的浓度：
Figure FDA0003457042960000012
其中C1、C2和C3是校正因子。
11.根据权利要求10所述的方法，其中C1是大约2.4271，C2是大约0.9196，并且C3是大约0.35。
12.根据权利要求7-11中任一项所述的方法，其中所述免疫测定包括ELISA。
13.根据权利要求1-12中任一项所述的方法，其中所述受试者患有神经退行性障碍、被怀疑患有神经退行性障碍、正在经受神经退行性障碍的治疗、具有患上神经退行性障碍的风险、或被怀疑具有患上神经退行性障碍的风险。
14.一种用于确定在体液中Aβ42与Aβ40的比率的方法，所述方法包括：
根据权利要求1-6中任一项所述的方法制备用于检测Aβ42和Aβ40中的至少一种的体液样品以产生游离肽分子；以及
对所述体液样品进行免疫测定，
其中从单一多重测定同时确定Aβ42和Aβ40在所述体液样品中的浓度。
15.根据权利要求14所述的方法，其中进行免疫测定的步骤进一步包括：
测量来自Aβ42免疫复合物的第一可检测信号；
测量来自Aβ40免疫复合物的第二可检测信号；
从至少所述第一可检测信号计算Aβ42的剂量(D)；
从至少所述第二可检测信号计算Aβ40的剂量(D)；以及
校正Aβ42和Aβ40的剂量(D)以确定Aβ42和Aβ40在所述体液中的浓度。
16.根据权利要求14所述的方法，其中进行免疫测定的步骤进一步包括：
测量来自Aβ42免疫复合物的第一可检测信号；
测量来自Aβ40免疫复合物的第二可检测信号；
测量来自产物分子的第三可检测信号，其中所述产物分子包含来自底物分子与标记的Aβ42或Aβ40免疫复合物的反应的反应产物，其中所述标记的免疫复合物源自所述体液样品；
从至少所述第一可检测信号和所述第三可检测信号计算Aβ42的剂量(D)；
从至少所述第二可检测信号和所述第三可检测信号计算Aβ40的剂量(D)；以及
校正Aβ42和Aβ40的剂量(D)以确定Aβ42和Aβ40在所述体液中的浓度。
17.根据权利要求14-16中任一项所述的方法，其中进行免疫测定进一步包括，在测量第一可检测信号之前和制备用于检测Aβ42和Aβ40中的至少一种的体液样品以产生游离肽分子之后：
在具有检测试剂分子和捕获剂的溶液中孵育游离肽分子，所述捕获剂包含Aβ42捕获剂和Aβ40捕获剂，以产生Aβ42免疫复合物和Aβ40免疫复合物；
洗涤所述捕获的肽以去除未结合或非特异性结合的Aβ42或Aβ40和未结合或非特异性结合的检测试剂分子；
将所述免疫复合物与可检测标记分子一起孵育，其中所述可检测标记分子与所述免疫复合物上的检测试剂分子结合，以产生标记的Aβ42免疫复合物和标记的Aβ40免疫复合物；
洗涤所述标记的免疫复合物以去除未结合或非特异性结合的可检测标记分子；
在底物分子的存在下将所述标记的免疫复合物固定在测定盘上，
其中所述底物分子与所述标记的Aβ42免疫复合物或标记的Aβ40免疫复合物反应以产生产物分子，并且
其中所述产物分子发射第三可检测信号。
18.根据权利要求14-17中任一项所述的方法，其中根据以下关系从所述剂量(D)确定Aβ42在所述体液中的浓度：
Figure FDA0003457042960000021
并且
其中根据以下关系从所述剂量(D)确定Aβ40在所述体液中的浓度：
Figure FDA0003457042960000022
其中C1、C2和C3是校正因子。
19.根据权利要求18所述的方法，其中C1是大约2.4271，C2是大约0.9196，并且C3是大约0.35。
20.根据权利要求14-19中任一项所述的方法，其中所述免疫测定包括ELISA。
21.根据权利要求14-19中任一项所述的方法，其中所述第一可检测信号和第二可检测信号是荧光信号。
22.根据权利要求14-20中任一项所述的方法，其中所述第三可检测信号是荧光信号。
23.根据权利要求14-21中任一项所述的方法，其中所述Aβ42捕获剂或所述Aβ40捕获剂包含顺磁珠。
24.根据权利要求14-22中任一项所述的方法，其中所述捕获剂包含与所述顺磁珠的表面附接的Aβ42特异性抗体或Aβ40特异性抗体或抗原结合片段。
25.根据权利要求17-24中任一项所述的方法，其中：
所述测定盘包含孔；
将标记的免疫复合物固定在测定盘上包括将所述标记的免疫复合物或裸捕获剂固定在所述孔中；并且
每个孔被配置为在其中含有不多于一种的标记的免疫复合物或一种裸捕获剂。
26.根据权利要求17-25中任一项所述的方法，其中将标记的免疫复合物固定在测定盘上进一步包括在所述底物分子的存在下将所述标记的免疫复合物封闭在所述孔内在油层下。
27.一种检测受试者的神经退行性障碍、监测神经退行性障碍的进展，评估治疗神经退行性障碍的功效或评估患上神经退行性障碍的风险的方法，所述方法包括根据权利要求14-26中任一项所述的方法。
28.根据权利要求27所述的方法，其中所述神经退行性障碍选自痴呆、阿尔茨海默病和创伤性脑损伤。
29.根据权利要求27或权利要求28中任一项所述的方法，其中所述受试者患有神经退行性障碍、被怀疑患有神经退行性障碍、正在经受神经退行性障碍的治疗、具有患上神经退行性障碍的风险、或被怀疑具有患上神经退行性障碍的风险。
30.一种用于确定在体液中Aβ42与Aβ40的比率的方法，所述方法包括：
获得来自受试者的体液样品；
将所述体液样品在包含蛋白质可相容的表面活性剂的缓冲溶液中孵育至少30分钟以产生游离肽；以及
对所述体液样品进行免疫测定，
其中从单一多重测定同时确定Aβ42和Aβ40在所述体液样品中的浓度。
31.根据权利要求30所述的方法，其中进行免疫测定的步骤进一步包括：
测量来自Aβ42免疫复合物的第一可检测信号；
测量来自Aβ40免疫复合物的第二可检测信号；
从至少所述第一可检测信号计算Aβ42的剂量(D)；
从至少所述第二可检测信号计算Aβ40的剂量(D)；以及
校正Aβ42和Aβ40的剂量(D)以确定Aβ42和Aβ40在所述体液中的浓度。
32.根据权利要求30所述的方法，其中进行免疫测定的步骤进一步包括：
测量来自Aβ42免疫复合物的第一可检测信号；
测量来自Aβ40免疫复合物的第二可检测信号；
测量来自产物分子的第三可检测信号，其中所述产物分子包含来自底物分子与标记的Aβ42或Aβ40免疫复合物的反应的反应产物，其中所述标记的免疫复合物源自所述体液样品；
从至少所述第一可检测信号和所述第三可检测信号计算Aβ42的剂量(D)；
从至少所述第二可检测信号和所述第三可检测信号计算Aβ40的剂量(D)；以及
校正Aβ42和Aβ40的剂量(D)以确定Aβ42和Aβ40在所述体液中的浓度。
33.根据权利要求31或权利要求32所述的方法，其中进行免疫测定进一步包括，在测量第一可检测信号之前和将所述体液样品在缓冲溶液中孵育之后：
在具有检测试剂分子和捕获剂的溶液中孵育游离肽分子，所述捕获剂包含Aβ42捕获剂和Aβ40捕获剂，以产生Aβ42免疫复合物和Aβ40免疫复合物；
洗涤所述捕获的肽以去除未结合或非特异性结合的Aβ42或Aβ40和未结合或非特异性结合的检测试剂分子；
将所述免疫复合物与可检测标记分子一起孵育，其中所述可检测标记分子与所述免疫复合物上的检测试剂分子结合，以产生标记的Aβ42免疫复合物和标记的Aβ40免疫复合物；
洗涤所述标记的免疫复合物以去除未结合或非特异性结合的可检测标记分子；
在底物分子的存在下将所述标记的免疫复合物固定在测定盘上，
其中所述底物分子与所述标记的Aβ42免疫复合物或标记的Aβ40免疫复合物反应以产生产物分子，并且
其中所述产物分子发射第三可检测信号。
34.根据权利要求31-33中任一项所述的方法，
其中根据以下关系从所述剂量(D)确定Aβ42在所述体液中的浓度：
Figure FDA0003457042960000041
并且
其中根据以下关系从所述剂量(D)确定Aβ40在所述体液中的浓度：
Figure FDA0003457042960000042
其中C1、C2和C3是校正因子。
35.根据权利要求34所述的方法，其中C1是大约2.4271，C2是大约0.9196，并且C3是大约0.35。
36.根据权利要求30-35中任一项所述的方法，其中所述体液选自血液、血浆、血清、淋巴液、脑脊液、滑液、尿液和唾液，并且优选是血浆。
37.根据权利要求30-36中任一项所述的方法，其中所述蛋白质可相容的表面活性剂包含聚山梨醇酯20、Triton X-100或其混合物。
38.根据权利要求30-37中任一项所述的方法，其中所述缓冲溶液包含在0.005vol.-％与5.0vol.-％之间，优选在0.05vol.-％与0.5vol.-％之间的所述蛋白质可相容的表面活性剂。
39.根据权利要求30-38中任一项所述的方法，其中将所述体液样品在所述缓冲溶液中稀释约4与约16之间的倍数，优选约8与约16之间的倍数，更优选大约10的倍数。
40.根据权利要求30-39中任一项所述的方法，其中将所述体液样品在所述缓冲溶液中孵育至少大约30分钟但是不多于大约4小时。
41.根据权利要求30-40中任一项所述的方法，其中所述免疫测定包括ELISA，优选数字ELISA。
42.根据权利要求31-41中任一项所述的方法，其中所述第一可检测信号和第二可检测信号是荧光信号。
43.根据权利要求32-42中任一项所述的方法，其中所述第三可检测信号是荧光信号。
44.根据权利要求33-43中任一项所述的方法，其中所述Aβ42捕获剂或所述Aβ40捕获剂包含顺磁珠。
45.根据权利要求33-44中任一项所述的方法，其中所述捕获剂包含与所述顺磁珠的表面附接的Aβ42特异性抗体或Aβ40特异性抗体或抗原结合片段。
46.根据权利要求33-45中任一项所述的方法，其中：
所述测定盘包含孔；
将标记的免疫复合物固定在测定盘上包括将所述标记的免疫复合物或裸捕获剂固定在所述孔中；并且
每个孔被配置为在其中含有不多于一种的标记的免疫复合物或一种裸捕获剂。
47.根据权利要求30-46中任一项所述的方法，其中将标记的免疫复合物固定在测定盘上进一步包括在所述底物分子的存在下将所述标记的免疫复合物封闭在所述孔内在油层下。
48.一种检测受试者的神经退行性障碍、监测神经退行性障碍的进展，评估治疗神经退行性障碍的功效或评估患上神经退行性障碍的风险的方法，所述方法包括根据权利要求30-47中任一项所述的方法。
49.根据权利要求48所述的方法，其中所述神经退行性障碍选自痴呆、阿尔茨海默病和创伤性脑损伤。
50.根据权利要求48或权利要求49所述的方法，其中所述受试者患有神经退行性障碍、被怀疑患有神经退行性障碍、或被怀疑具有患上神经退行性障碍的风险。
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