DE60311871T2

DE60311871T2 - Verfahren zur detektion von prp unter verwendung ein makrozyklischen ligand

Info

Publication number: DE60311871T2
Application number: DE60311871T
Authority: DE
Inventors: Aly Moussa; William Anthony COLEMAN; Patrick Shahgaldian; Eric Da Silva; Ambroise Martin; Adina Nicoleta Lazar; Edwige Leclere; Marilyne Dupin; Herve Perron
Original assignee: Biomerieux SA; Centre National de la Recherche Scientifique CNRS; Universite Claude Bernard Lyon 1 UCBL; Agence Francaise de Securite Sanitaire des Aliments (AFSSA)
Current assignee: Biomerieux SA; Centre National de la Recherche Scientifique CNRS; Universite Claude Bernard Lyon 1 UCBL; Agence Francaise de Securite Sanitaire des Aliments (AFSSA)
Priority date: 2002-12-20
Filing date: 2003-12-19
Publication date: 2007-10-31
Anticipated expiration: 2023-12-20
Also published as: DK1573337T3; DE60311871D1; JP2006510914A; PT1573337E; AU2003299390B2; AU2003299390A1; EP1573337B1; US20060019311A1; ES2282733T3; FR2849205A1; BR0317080A; FR2849205B1; AU2003299390A8; ATE354095T1; MXPA05006766A; WO2004059322A8; CN1729397A; US20070154885A1; EP1573337A1; CN100380125C

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zum Nachweisen der für übertragbare subakute spongiforme Enzephalopathien verantwortlichen pathogenen Formen des Prions.
Das native oder normale, mit PrP oder PrP^c für zelluläres Prionen-Protein bezeichnete Protein ist ein in den lymphoiden und neuronalen Zellen von Säugetieren weit exprimiertes Glykoprotein.
Konformationale Änderungen des Prp^c führen zum Auftreten und zur Verbreitung des pathogenen Proteins PrP^sc' das gegen die Proteinase K resistent ist. Dieses pathogene Protein kann gleichermaßen als PrP^sc oder PrP^res bezeichnet werden. Die Anhäufung von PrP^sc in den Organen von Tieren ist die Ursache zahlreicher Krankheiten und insbesondere der Traberkrankheit der Kleinwiederkäuer, der chronischen zehrenden Krankheit (oder Chronic Wasting Disease 'CWD') beim Elch und der Antilope, der bovinen spongiformen Enzephalopatie (BSE) und der Creutzfeld-Jakob-Krankheit (CJK) beim Menschen.
Das späte Auftreten nach einer Inkubationszeit von 2 bis 6 Jahren und die langsame Entwicklung der Symptome beim mit BSE infizierten Vieh hat die Entwicklung von epidemiologischen Modellen beträchtlich verlangsamt. BSE ist durch Aufnahme auf den Menschen übertragbar und hat zum Auftreten einer neuen Form der Creutzfeld-Jakob-Krankheit (CJKv) geführt.
Der Nachweis des pathogenen Proteins Prp^sc ist bei gesunden infizierten Tieren vor der Entwicklung der Krankheit und vor allem im Blut und im Urin bei kranken Tieren schwierig. Es steht inzwischen fest, dass das bei zur menschlichen Ernährung bestimmten Tieren vorhandene Prp^sc bei der Aufnahme der infizierten Gewebe auf den Menschen übertragen wird. Ein wichtiges Ziel für die Volksgesundheit ist daher die Vermeidung dieser Übertragung durch den Nachweis des Prp^sc:

– bei den zum menschlichen Verzehr bestimmten Tieren, um diese aus der Nahrungskette zu entfernen,
– bei zur Transfusion beim Menschen bestimmten Blutspenden und Blutderivaten. Wie nämlich ein Vorhandensein von pathogenem Protein PrPsc im Blut und den Lymphflüssigkeiten noch lange vor dem Erreichen des Gehirns und damit vor der Möglichkeit, neurologische, die klinische ausgebrochene Krankheit mit Prionen anzeigende Zeichen festzustellen aufzeigt, ist die Physiopathologie beim Menschen kaum bekannt, und da nicht wie beim Schaf experimentelle Infektionen realisiert werden können, erlaubt das Fehlen von Tests zum Nachweisen im Blut oder anderen Körperflüssigkeiten nicht die Studie und damit die Verhinderung einer Übertragung von Mensch zu Mensch zu Blutspenden oder die Behandlung von infizierten Personen, bevor die zerebralen Schäden eingetreten sind; und
– in den Tierherden vor dem neurologischen Stadium, was somit die frühzeitige Eliminierung der Tiere vor ihrem Eintreffen auf dem Schlachthof erlaubt.

Der Nachweis des Vorhandenseins von PrP^sc in biologischen Proben oder bei Tieren wird damit extrem wichtig, und mehrere For schungsteams entwickeln Verfahren zum immunologischen Nachweis (WO02/086511). Darüber hinaus sind Methoden zum Komplexieren von Peptiden, Molekülpeptiden oder Inhibitoren mit Prp^sc zur Behandlung von KJKv Gegenstand aktiver Forschungen. Allerdings stoßen die Methoden des Standes der Technik ohne Unterlass auf die Schwierigkeit, das Prp^sc auf zuverlässige Weise zu identifizieren, wenn es sich in geringer Menge in einer biologischen Probe befindet, und insbesondere in Körperflüssigkeiten.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist daher ein den Nachweis des Proteins PrP und insbesondere des Prp^sc in Verdünnungen zu erlauben, bei denen es mit den derzeitig verwendeten Methoden nicht mehr feststellbar ist, wobei diese Feststellung bei den von den Erfindern gestesteten 119 Proben eine Zuverlässigkeit von 100 % hat. Das erfindungsgemäße Verfahren erlaubt vorteilhaft die Verstärkung des Nachweises von Prp^sc um einen Faktor 4.
Genauer gesagt ist Gegenstand der vorliegenden Erfindung ein Verfahren zum Nachweis von PrP und insbesondere von Prp^sc, dadurch gekennzeichnet, dass man zu einer biologischen Probe, die PrP enthalten könnte, als Adjuvans einen makrozyklischen Liganden (AML) hinzufügt, der an einen Träger gebunden sein kann, man die daraus resultierende Suspension mit einem Anti-PrP Antikörper reagieren lässt und das Vorhandensein von PrP nachweist.
Die Bindung des makrozyklischen Liganden an den Träger kann auf dem Fachmann bekannte Weise umgesetzt werden, wie z. B. Adsorption oder kovalente Bindung, wobei die kovalente Bindung oder auch als Bindung durch Aufpfropfen bezeichnet, bevorzugt wird.
Wenn man Prp^sc nachweisen möchte, kann die vorliegende Erfindung ebenfalls eine zusätzliche Behandlungsphase der Probe mit der Proteinase K vor oder nach dem Kontakt mit dem AML umfassen.
Das Vorhandensein von PrP kann durch den Nachweis der Antiköper-Reaktion Anti-PrP/PrP, und zwar durch jedes dem Fachmann bekannte Mittel und insbesondere durch Sandwich-Methoden, wie z. B. ELISA, Immunoblotting, Immuno-Mikro-Cantilever-Nachweise, Massenspektrometrie oder durch optische und spektroskopische Analysen umgesetzt werden. Die Identifikation des Komplexes AML-PrP erfolgt mittels profilometrischer Rastertechniken, wie z. B. Raster-Reflexionsmikroskopie im nahen Bereich oder konfokale Rastermikroskopie.
Gemäß einem bevorzugten Realisierungsmodus der Erfindung stammt die biologische Probe von einem Tier, aber auch von einem Menschen. Diese Probe stammt bevorzugt aus dem Gehirn, dem Gewebe des Zentralnervensystems oder Organen, und insbesondere der Milz oder dem Darm. Gemäß einem bevorzugten Realisierungsmodus der Erfindung ist diese Probe eine Körperflüssigkeit, insbesondere die zerebrospinale Flüssigkeit oder das Serum.
Unter makrozyklischem Liganden wird eine Komponente verstanden, die in der Lage ist, sich an PrP zu binden, und insbesondere an PrPsc, und die aus einer Folge von einen Makrozyklus bildenden Zyklen gebildet wird. Die makrozyklischen Liganden sind dem Fachmann bekannt. Als nicht einschränkende Beispiele können Zyklophane, Metazyklophane, Zyklodextrine, Zyklo(Tetra-chromotropische Säuren) Sphäranden und Zyklo[n]Veratrylene genannt werden.
Der als Adjuvans verwendete makrozyklische Ligand ist vorteilhaft in der Lage, sich an andereinandergrenzenden oder räumlich nahe beieinander liegenden Stellen im Bereich der Bindungsstellen mit einem Antikörper zu verbinden und hat die Wirkung, die Bindung an den Antikörper-PrP^sc zu verstärken.
Der als Adjuvans verwendete makrozyklische Ligand wird vorteilhaft aus der Familie der Metazyklophane ausgewählt. Unter den Metazyklophanen sind die funktionalisierten Pa ra-Sulfonat-Calixarene auf der phenolischen Seite besonders vorteilhaft. Diese Komponenten können gemäß der von Da Silva et al., J. Supramol. Chem 1, (2001), 135-138 beschriebenen Methode erhalten werden.
Der als Adjuvans verwendete makrozyklische Ligand hat die nachstehende allgemeine Formel,
in der
R₁ ein Wasserstoffatom, eine Hydroxylgruppe, eine Gruppe OR oder eine Gruppe OCOR ist und R der Definition unten entspricht,
R₂ ein Wasserstoffatom, eine Gruppe R, COR, Pol, CH₂Pol ist, in der Pol eine Phosphat-, Sulfat-, Amin- Ammonium-, Carbonsäure-Gruppe ist und R der Definition unten entspricht,
R₃ ein Wasserstoffatom, eine Hydroxylgruppe, eine Gruppe OR oder OCOR ist und R der Definition unten entspricht,
R₄ ein Wasserstoffatom, eine Hydroxylgruppe, eine Gruppe OR, OCH₂R oder OCOR ist, in der R der Definition unten entspricht, Y ein Kohlenstoff-, Stickstoff- oder Schwefelatom ist
R₅ und R₆, können jeweils einzeln betrachtet fehlen oder ein Wasserstoffatom, eine CH₂-Gruppe oder R gemäß der Definition unten sein, oder
R₅ und R₆ bilden zusammen ein Sauerstoff- oder Schwefelatom,
X ist eine CH₂ Gruppe oder ein Sauerstoff- oder Schwefelatom,
m ist eine ganze Zahl gleich 0 oder 1,
R ist ein Wasserstoffatom oder eine gesättigte oder ungesättigte, verzweigte oder unverzweigte, zyklische oder nicht zyklische Kohlenwasserstoffkette, die durch eine Halogengruppe ersetzt oder nicht ersetzt sein und Polfunktionen haben kann, n ist eine ganze Zahl zwischen 3 und 15,
die Substituenten R₁ bis R₅, R, X, Y und die ganze Zahl m können je nach Muster unterschiedlicher Art sein.
Somit stellen sch die Verbindungen der Formel (I) in Form einer Folge von n Mustern dar, gekennzeichnet durch das Vorhandensein eines benzenhaltigen Zyklus, und die Substituenten dieses Zyklus können unter der Einschränkung ihrer obigen Definitionen von einem Muster zum anderen unterschiedlich sein.
Die makrozyklischen Liganden können gemäß den dem Fachmann bekannten Techniken zubereitet werden, z. B. gemäß der Beschreibung in Comprehensive Supramolecular Chemistry, Pergamon, Oxford, 1996.
Die kohlenwasserstoffhaltige, gesättigten oder ungesättigten, verzweigten oder nicht verzweigten, zyklischen oder nicht zyklischen durch eine Halogengruppe substituierte oder nicht substituierte und Polfunktionen und Nicht-Polfunktionen tragenden Ketten sind dem Fachmann durchaus bekannt. Beispielhaft können Alkyle, Alkene, Aryle und gesättigte Zyklen genannt werden, wie z. B. Zyklohexan. Ein Beispiel einer nicht polaren Gruppe ist CF₃ und Beispiele für polare Gruppen sind Pol-Substituenten gemäß vorheriger Definition.
Gemäß einem besonderen Realisierungsmodus der Erfindung entspricht der als Adjuvans verwendete makrozyklische Ligand der obigen allgemeinen Formel (I) und ganz besonders der nachstehenden allgemeinen Formel (Ia)
in der
jede R₂-Gruppe einzeln betrachtet eine Sulfat- oder eine Phosphatgruppe ist, R₇ eine Gruppe (CH₂)_r-Z ist, in der Z eine Gruppe COOEt, COOH, CN oder NH₂ ist,
r eine ganze Zahl zwischen 1 und 20 ist,
p eine ganze Zahl zwischen 1 und 10 ist,
n eine ganze Zahl zwischen 2 und 10 ist.
Gemäß einem bevorzugten Realisierungsmodus der Erfindung ist der als Adjuvans verwendete makrozyklische Ligand das Calix[4]Aren-P-Sulfonat, das Calix[6]Aren-P-Sulfonat, das Calix[8]Aren-P-Sulfonat oder eines ihrer Derivate.
Gemäß einem zweiten Realisierungsmodus der Erfindung entspricht der als Adjuvans verwendete makrozyklische Ligand der obigen allgemeinen Formel (I) und ganz besonders der nachstehenden allgemeinen Formel (Ib)
in der n eine ganze Zahl zwischen 4 und 8 ist,
jede R₂-Gruppe einzeln betrachtet eine Sulfat- oder Phosphatgruppe ist, R₈ eine Gruppe (CH₂)_t-(CO)_s-(NH₂) oder eine Gruppe (CH₂)_t-COOH ist, in der t eine ganze Zahl zwischen 0 und 6 und s eine ganze Zahl zwischen 0 und 6 ist.
Vorteilhaft ist das Calixaren der Formel (Ib) derart, dass die beiden R₂-Gruppen jeweils eine Sulfatgruppe sind, n 4, 6 oder 8 ist und R₈ ein Wasserstoffatom, eine Gruppe CH₂COOH, eine Gruppe CH₂CONH₂ oder eine Gruppe CH₂CH₂NH₂ ist.
Das Calixaren der Formel (Ib) ist bevorzugt derart, dass die beiden R₂-Gruppen jeweils eine Sulfatgruppe sind, n eine ganze Zahl gleich 6 ist und R₈ eine Gruppe (CH₂)₂-NH₂ ist.
Gemäß einem besonderen Realisierungsmodus der Erfindung wird der Ligand erfindungsgemäß auf einen festen Träger aufgepfropft. Dieser Träger wird durch eine Funktion funktionalisiert, die eine Bindung mit einer vom Liganden getragenen Funktion bilden kann. Gemäß einem bevorzugten Realisierungsmodus wird der feste Träger durch eine Bindung NHS (N-Hydroxysuccinimid) oder durch eine Funktion NE₂ realisiert. Diese Funktion kann mit einer auf dem Liganden getragenen Funktion reagieren. In diesem Realisierungsmodus werden die eine Funktion tragenden Calixarene, die reagieren können, um eine Bindung mit der funktionalen Bindung des festen Trägers einzugehen, insbesondere eine Bindung NH₂ oder COOH tragende Calixarene, besonders bevorzugt.
Gegenstand der Erfindung ist ebenfalls ein als Adjuvans verwendeter, auf dem funktionalisierten Träger aufgepfropfter makrozyklischer Ligand, bei dem der Ligand der Formel (Ib) gemäß der obigen Definition entspricht, bei der n eine ganze Zahl zwischen 4 und 8 ist und der Träger vom Typ fester, bevorzugt durch eine Gruppe NHS oder eine Gruppe NH₂ funktionalisierter Träger und bevorzugt eine Magnetkugel oder eine Mikroplatte ist. Ein derartiges Aufpfropfen wahrt die spätere Interaktion zwischen dem Protein und dem Liganden, sowie die stereochemische Präsentation des Epitots für den Nachweis durch einen Antikörper Anti-PrP, wobei die durch das Aufpfropfen auf dem Träger identifizierten Stellen unterschiedlich von denen sind, die zur Interaktion mit dem PrP dienen.
Gemäß einem weiteren Ausführungsmodus der Erfindung wird der genannte als Adjuvans verwendete makrozyklotische Ligand in der Familie der Zykledextrine ausgewählt, und insbesondere der der allgemeinen Formel (II) entsprechenden Zylodextrine
in der
R₉ ein Wasserstoffatom oder eine Gruppe CH₂, OH, OR, OCOR, COR, CH₂Pol, OCH₂R, SR, NR, Pol ist und wobei R nachstehend definiert wird,
R₁₀ und R₁₁, jeweils unabhängig betrachtet, ein Wasserstoffatom oder eine Gruppe CH₂, OH, OR, OCOR, COR, CH₂Pol, OCH₂R, Pol ist und wobei R nachstehend definiert wird,
Pol eine Phosphat-, Sulfat-, Amin-, Ammonium- oder Carbonsäure ist
R eine kohlenwasserstoffhaltige, gesättigte oder nicht gesättigte, verzweigte oder nicht verzweigte, zyklische oder nicht zyklische, durch eine Halogengruppe substituierte oder nicht substituierte und polare oder nicht polare Funktionen tragende Kette ist,
n eine ganze Zahl zwischen 6 und 8 ist,
die Substituenten R₉ bis R₁₁ je nach den Mustern unterschiedlicher Art sein können. Damit stellt sich die Verbindung der Formel (II) in Form von einer Folge von n Mustern dar, gekennzeichnet durch das Vorhandensein eines Zyklus, und die Substituenten dieses Zyklus können von einem Muster zum anderen unter den Einschränkungen ihrer obigen Definitionen variabel sein.
Gemäß einer Realisierungsvariante der Erfindung wird der genannte als Adjuvans verwendete makrozyklische Ligand aus der Familie der chromotropischen Zyklon-Tetra-Säuren ausgewählt, und insbesondere den der allgemeinen Formel (III) entsprechenden chromotropischen Zyklon-Tetra-Säuren
in der
R₁₂ und R₁₃, jeweils unabhängig voneinander betrachtet, ein Wasserstoffatom oder eine Gruppe R oder Pol gemäß nachstehender Definition sind,
R₁₄ und R₁₅, jeweils unabhängig voneinander betrachtet, ein Wasserstoffatom, eine Gruppe CH₂ oder eine Gruppe R gemäß nachstehender Definition ist oder
R₁₄ und R₁₅ gemeinsam ein Sauerstoff- oder Schwefelatom sind,
R₁₆ und R₁₇, jeweils unabhängig voneinander betrachtet ein Wasserstoffatom oder eine Hydroxylgruppe oder eine Gruppe OR, OCH₂R, OCOR, SR, SCH₂R, SCHOR sind, wobei R nachstehender Definition entspricht,
M ein Wasserstoffatom oder ein aus Na, K, Li, Cs, Rb, Mg und Ca ausgewähltes Atom ist
Pol eine Phosphat-, Sulfat-, Amin-, Ammoniumgruppe oder Carbonsäure ist,
R eine kohlenwasserstoffhaltige, gesättigte oder nicht gesättigte, verzweigte oder nicht verzweigte, zyklische oder nicht zyklische, durch eine Halogengruppe substituierte oder nicht substituierte und polare oder nicht polare Funktionen tragende Kett ist,
n eine ganze Zahl zwischen 3 und 15 ist,
die Substituenten R₁₂ bis R₁₇, M, Pol und R je nach den Mustern unterschiedlicher Art sein können. Damit stellt sich die Verbindung der Formel (III) in Form einer Folge von n Mustern dar, gekennzeichnet durch das Vorhandensein eines Zyklus, und die Substituenten dieses Zyklus können unter den Einschränkungen ihrer obigen Definitionen von einem Muster zum anderen variabel sein.
Gemäß einem weiteren Realisierungsmodus der Erfindung wird der genannte als Adjuvans verwendete makrozyklische Ligand in der Familie der Zyklo[n]Veratrylene, ausgewählt, die der folgenden allgemeinen Formel (IV) entspricht
in der
R₁₈ ein Wasserstoffatom oder eine Gruppe CH₂, OH, OR, OCOR, COR, CH₂pol, OCH₂R, SR, NR, Pol ist und R nachstehend definiert wird,
R₁₉, R₂₀, R₂₁ und R₂₂, jeweils unabhängig voneinander betrachtet ein Wasserstoffatom oder eine Gruppe CH₂, OH, OR, OCOR, COR, CH₂Pol, OCH₂R, Pol sind und R nachstehend definiert wird,
Pol eine Phosphat-, Sulfat-, Amin-, Ammoniumgruppe oder Carbonsäure ist,
R eine kohlenwasserstoffhaltige, gesättigte oder nicht gesättigte, verzweigte oder nicht verzweigte, zyklische oder nicht zyklische, durch eine Halogengruppe substituierte oder nicht substituierte und polare oder nicht polare Funktionen tragende Kette ist,
n eine ganze Zahl zwischen 1 und 10 ist,
die Substituenten R₁₈ bis R₂₂, R, Pol und R je nach den Motiven unterschiedlicher Art sein können. Damit stellt sich die Verbindung der Formel (IV) in Form einer Folge von n Mustern dar, gekennzeichnet durch das Vorhandensein eines Zyklus, und die Substituenten dieses Zyklus können von einem Muster zum anderen unter der Einschränkung ihrer obigen Definitionen variabel sein.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung liegt in der Benutzung eines als Adjuvans verwendeten makrozyklischen Liganden (AML) für den Nachweis eines Prions PrP^SC in einer biologischen Probe und insbesondere eines Liganden mit der Formel (I), (Ia) oder (Ib) oben, frei oder an einen Träger gebunden.
Gegenstand der Erfindung ist ebenfalls ein Diagnoseset der Krankheiten, für die PrP^SC verantwortlich ist, vom Typ BSE, Traberkrankheit der Kleinwiederkäuer, Creutzfeld-Jakob, dadurch gekennzeichnet, dass es die Benutzung des als Adjuvans verwendeten makrozyklischen Liganden und insbesondere eines Liganden mit der obigen Formel (I), (Ia) oder (Ib) frei oder an einen Träger gebunden umfasst.
Gegenstand der Erfindung ist ebenfalls ein immunologisches Dosierungsset für Prp^sc' dadurch gekennzeichnet, dass es die Benutzung eines als Adjuvans verwendeten, makrozyklischen Liganden und insbesondere eines Liganden mit der obigen Formel (I), (Ia) oder (Ib), frei oder an einen Träger gebunden, umfasst.
Weitere Vorteile und Merkmale der Erfindung warden bei der Lektüre der nachfolgenden Beispiele bezüglich der Amplifikation des Nachweises von PrP^sc deutlich, wenn die biologische Probe mit einem als Adjuvans verwendeten, makrozyklischen, freien oder aufgepfropften Liganden zusammengebracht wird.
In diesen Beispielen wird auf die Zeichnungen im Anhang Bezug genommen, in denen:
Unter Bezugnahme auf Beispiel 1:
1 ein komparatives Beispiel des Nachweises durch Immunoblotting von Prp^sc einerseits in einem mit einem als Adjuvans verwendeten makrozyklischen Liganden (AML1), dessen Zubereitung nachstehend beschrieben wird, zusammengebrachten Probe ist und andererseits, in einer nicht mit AML1 zusammengebrachten Probe;
2 die optischen Dichtigkeitskurven des Nachweises von PrP^sc einerseits in einer mit AML1 zusammengebrachten Probe und andererseits in einer nicht mit AML1 zusammengebrachten Probe AML1 darstellt;
3 per Rastersondenmikroskopie (SPM) bei den getrockneten Filmen im kontaktlosen Modus aufgenommene Bilder des rekombinanten Prionenproteins (recPrP) allein (A), recPrP in Gegenwart von AML1 (B) und AML1 allein (C) zeigt;
4 per Rastersondenmikroskopie (SPM) bei den ge trockneten Filmen im kontaktlosen Modus aufgenommene Bilder des recPrP bei Vorhandensein von AML in unterschiedlichen Proportionen: 1/1000 AML1/recPrP, 1/100 AML1/recPrP, 1/10 AML1/recPrP zeigt.
5 eine graphische Darstellung ist, die die optischen Dichtigkeitswerte (DO) aufgibt, welche in Abhängigkeit von der Konzentration an Calixaren C6S erhalten werden, das nach der Inkubation einer rekombinanten PrP-Lösung vom Rind und der Entwicklung durch den mit Peroxydase gekennzeichneten Antikörper Anti-PrP AC23 aktiviert wird,
6 eine graphische Darstellung ist, die die optischen Dichtigkeitswerte (DO) aufgibt, welche in Abhängigkeit von der Konzentration an auf einer aktivierten Amin-Kugel aufgepfropften Calixaren C6S nach der Inkubation mit einer Lösung aus zu 0,25 g/ml dosiertem, rekombinanten PrP des Menschen durch direkte Entwicklung mit dem per Peroxydase markiertem Antikörper Anti-PrP 8D11G12 erhalten werden,
7 eine graphische Darstellung ist, die die optischen Dichtigkeitswerte (DO) angibt, die nach der Inkubation mit einer Lösungsserie menschlichen Serums in 0,05 %igem PBST erhalten werden, das mit auf einer aktivierten Aminkugel (NHS) aufgepfropften Calixaren C6S durch direktes Entwickeln mit dem mit Peroxydase markiertem Antikörper Anti-PrP 8D11G12 in Kontakt gebracht wird,
8 eine graphische Darstellung ist, die die optischen Dichtigkeitswerte (DO) aufgibt, die nach dem Verbringen des auf eine aktivierte Aminplatte (NHS) aufgepfropften Calixarens mit Proben positiver (LCR+) und negativer (LCR–) menschlicher Gehirn-Rückenmarks-Flüssigkeit für das MJC in Abhängigkeit von der Erhitzung, durch Entwicklung mit dem mit alkaliner Phosphatase markiertem Antikörper Anti-PrP AC23 erhalten werden,
9 eine graphische Darstellung ist, die die optischen Dichtigkeitswerte (DO) aufgibt, die nach dem Verbringen in Kontakt von auf einer aktivierten Aminplatte (NHS) aufgepfropftem Calixaren C6S mit dem aus den Gehirnen von von der Creutzfeld-Jacob-Krankheit betroffenen oder nicht betroffenen (CJK+/CJK–) Patienten extrahierten Prp^sc durch Entwickeln mit dem mit alkaliner Phosphatase markierten Antikörper Anti-PrP AC23 erhalten werden,
10 eine graphische Darstellung ist, die die optischen Dichtigkeitswerte (DO) aufgibt, die in Abhängigkeit von der Konzentration an auf eine aktivierte Aminplatte (NHS) aufgepfropftem Calixaren C6S nach dem Verbringen einer zu ½ oder zu 1/6 verdünnten LCR-Probe eines nicht von MJC betroffenen Patienten, in Kontakt und bei Fehlen der Verdauung durch die Proteinase K erreicht werden,
11 eine graphische Darstellung ist, die die optischen Dichtigkeitswerte (DO) aufgibt, die in Abhängigkeit von der Konzentration an auf einer aktivierten Aminplatte (NHS) aufgepfropftem Calixaren C6S nach dem Verbringen in Kontakt mit einer eventuell zu ½ (LCR+1/2 oder LCR–1/2) verdünnten LCR-Probe von nicht von CJK (LCR–) oder von dieser Krankheit (LCR+) betroffenen Patienten bei Fehlen der Verdauung durch die Proteinase K erreicht werden, und
12 eine graphische Darstellung ist, die die optischen Dichtigkeitswerte (DO) aufgibt, die in Abhängigkeit von der Konzentration an Proteinase K nach dem Verbringen in Kontakt des auf einer aktivierten Aminplatte (NHS) aufgepfropften Calixaren C6S mit einer LCR-Probe von nicht von CJK (LCR–) betroffenen oder von dieser Krankheit betroffenen (LCR+) Patienten erreicht werden,
Beispiel 1: Zubereitung der als Adjuvans verwendeten makrozyklischen Liganden
1.1 Zubereitung von Dup-Sulphonat-3,7-(2-Carboxy-Methyloxy)-Calix-[6]-Aren (bezeichnet als AML 1)
Dieser als Adjuvans verwendete makrozyklische Ligand AML1 besitzt die allgemeine Formel (V):
Dieser Ligand wird wie folgt synthetisiert: eine Calix[6]Aren-Suspension in Acetonitril bei Vorhandensein eines Basisäquivalents (K₂CO₃) wird unter Rückfluss geschüttelt. Nach 30 Minuten werden 0,5 Äquivalent Alkylantwirkstoff (Brom-Ethyl-Acetat) zu der Reaktionsmischung hinzugefügt, die 24 Stunden lang im Rückfluss und unter Schütteln gehalten wird. Nach dem Abkühlen der Suspension wird das Lösungsmittel unter reduziertem Druck verdampft, und der resultierende Feststoff wird in 200 ml CH₂Cl₂ aufgelöst und zwei Mal mit einer Lösung aus Salzsäure (1M) und ein Mal mit entmineralisiertem Wasser gewaschen. Nach dem Trocknen auf Magnesiumsulfat (MgSO₄) wird das organische Lösungsmittel unter reduziertem Druck verdampft und erlaubt den Erhalt eines weißen Pulvers. Dieses wird auf einer Silizium-Chromatographiesäule gereinigt (Elutionsmittel: CH₂Cl₂: Hexan; 4:1). Das gereinigte Produkt wird in RMN des ¹H, ¹³C und in der Massenspektrometrie Elektrospray analysiert. Die Verseifung des Carbonesters wird durch Kaliumhydroxyd in einer Lösung in einer Wassermischung realisiert: Ethanol (30:70) 24 Stunden lang unter Schütteln bei Raumtemperatur. Die gebildete Fällung wird gefiltert, anschließend mit 50 ml Salzsäure (1M) und 50 ml Wasser gewaschen, anschließend auf der Silizium-Chromatographiesäule gereinigt (Elutionsmittel Chloroform : Methanol : Essigsäure; 95 : 5 : 0.1%) und erlaubt nach dem Verdampfen des Lösungsmittels den Erhalt eines weißen und kristallinen Feststoffs. Dieses Produkt wird im RMN des ¹H, ¹³C und in der Massenspektrometrie Elektrospray analysiert. Die Sulfonierung wird 24 Stunden lang durch eine Behandlung mit Schwefelsäure bei 50°C realisiert. Das Produkt wird mit Ether gefällt und erlaubt den Erhalt des AML1 in Form eines weißen kristallinen Pulvers.
1.2 Zubereitung des p-Sulphonat-3,7-(2-Mmino-Ethyloxy)-Calix-[6]-Aren (bezeichnet als C6S)
Dieser als Adjuvans verwendete makrozyklische Ligand C6S besitzt die allgemeine Formel (VI):
Dieser Ligand wird gemäß der in Eric Da Silva und Anthony W. Coleman, Synthesis and complexation properties towards amino acids of mono-substituted p-sulphonato-calix-[n]-arene, Tetrahedron 59 (2003) 7357-7364 beschriebenen Methode zubereitet.
1.3 Pfropfen des Liganden C6S auf Platten und Kugeln
Dieser Ligand ist mit einem eine aktivierte Fläche tragenden festen Träger (Kugel oder Platte) gekoppelt.
Pfropfen auf eine Platte:
Die „ NHS activated plates" Platten mit 96 Schälchen stammen von der Firma Covalab (Lyon, Frankreich). 100 ml einer Ligandenlösung werden in unterschiedlichen Konzentrationen in Phosphatpuffer 50 mM pH 8,2 aufgelöst. Die Schälchen werden nach zweistündiger Inkubation bei 37°C 3 Mal (3 × 200 ml) mit Wasser MilliQ gewaschen. Die Platten werden vor ihrer Benutzung bei Raumtemperatur getrocknet.
Aufpfropfschema:
Es wurden mehrere Platten in unterschiedlichen Konzentrationen des Liganden C6S hergestellt. Diese Platten werden im gesamten Text als „Platten C6S" bezeichnet.
Aufpfropfen auf Kugeln:
4 ml einer aktivierten Kugellösung NHS (2 × 10⁹ Kugeln/ml; Dynabeads^® M270Amine, Firma Dynals, Norwegen) werden in 1 ml Röhrchen restlos aufgeteilt. Die Kugeln werden zentrifugiert und per Magnetisierung gefällt. Der Überstand wird entfernt, und die Kugeln werden 3 Mal mit 1 ml Wasser gewaschen. Der Kugel-Rückstand wird mit unterschiedlichen Volumen an Cali xaren-Lösung in einem Phosphatpuffer 50 mM pH 8, 2 aufgenommen. Es werden 600 μL, 120 μL, 60 μL und 12 μL einer Ligandenlösung von 50 mg/ml (Phosphatpuffer 50mM, pH 8,2) hinzugefügt. Die Kugeln werden 24 Stunden lang bei Raumtemperatur geschüttelt. Die Kugeln werden 3 Mal mit Wassers MilliQ 1852 gewaschen, um den Liganden zu eliminieren, der nicht reagiert hat. Die Kugeln werden in 1 ml Wasser konserviert, um die ursprüngliche Konzentration von 2 × 10⁹ Kugeln/ml wieder aufzubauen. Die Kugellösung ist fertig zum Gebrauch. Diese Kugeln werden im gesamten Text als „Kugeln C6S" bezeichnet.
Aufpfropfschema des C6S auf den Kugeln:
1.4 Aufpfropfen des AML1 auf einer modifizierten mineralischen Fläche
Es wird 1 ml 3-Aminopropyltri-Methoxysilan (Firma ABCR) in einer Lösung aus 50 ml (95 % Ethanol und 5 % H₂O) 5 Min. lang in Lösung gebracht. Die Siliziumplatte wird 4 Min. lang unter Schütteln in diese Lösung getaucht. Die Siliziumplatte wird mit Ethanol gespült, und dann wird die Platte 15 Min. lang bei 130°C zum Trocknen gebracht. Es wurden 10 μL AML1 in Lösung 0, 1 M in DMSO auf einer modifizierten Siliziumplatte unter Verwendung eines Kopplungsmittels (DCC/HOBT) gekoppelt. Die Probe wurde 12 Stunden lang bei 23°C getrocknet.
Kopplungsschema:
Beispiel 2: Nachweis von PrP unter Verwendung von nicht auf einen festen Träger gekoppeltem AML1
2.1 Zubereitung der Proben
Die Proben, die zur Realisierung der Beispiele der 1 und 2 gedient haben, wurden wie folgt zubereitet:
Proben ohne AML: 0,5 g Gehirngewebe wird in 4,5 ml 5 %iger Gluskoselösung zermahlen, um eine 10 %ige Suspension zu erhalten (Gewicht/Volumen). Auf 100 μl 10 %iges Gehirnhomogenat in 5 %iger Glukose (Äquivalent von 10 μg Gehirn) wird 1 mg Proteinase K (Boehringer) in 10 μl hinzugefügt. Die Lösung wird einem Wirbel unterzogen und bei 37°C eine Stunde lang inkubiert. Nach dem Hinzufügen von 100 ml denaturierendem Puffer Laemmli wird 5 Minuten lang bei 100 °C erhitzt, 5 Minuten lang bei 12000 G zentrifugiert und der Überstand aufgefangen, um ihn auf SDS PAGE migrieren zu lassen.
Probe mit AML: 0,5 g Gehirngewebe wird in 4,5 ml 5 %iger Glukoselösung zermahlen, um eine 10 %ige Suspension (Gewicht/Volumen) zu erhalten. Auf 100 μl 10 %igem Gehirnhomogenat in 5 %iger Glukose (Äquivalent von 10 mg Gehirn), wird 1 μl AML 0,1 M hinzugefügt. Nach einer Stunde bei 37 ° C wird 1, 5 μg Proteinase K (Boehringer) in 10 μl hinzugefügt. Die Lösung wird einem Wirbel unterzogen und eine weitere Stunden lang bei 37°C inkubiert. Nach dem Hinzufügen von 100 μl denaturierendem Puffer Laemmli wird 5 Minuten lang bei 100 °C erhitzt, 5 Minuten lang bei 12000 G zentrifugiert und der Überstand aufgefangen, um ihn auf SDS PAGE migrieren zu lassen.
2.2 Verfahren zum Nachweis durch Immunoblotting
Nach der Migration auf einem eindimensionalen Elektrophoresegel mit 15 % Polyacrylamid bei Vorhandensein von Natrium-Dodecyl-Sulfat (SDS PAGE) wird von Laemmli, Nature 227 (1970), 680-685 beschrieben, werden die Proteinasen per Elektrophorese auf Nitrozellulose-Membranen übertragen und bei Raumtemperatur 60 Minuten lang mit einem monoklonalen Antikörper immunoblottiert, der einen aus Aminosäuren 126-160 gebildeten spezifischen Epitop erkennt. Der sekundäre Antikörper (1/5000) ist ein gegen die schweren und leichten Ketten der Mäuse-Immunoglobuline, die an der Raifort-Peroxydase (IgG H+L) konjugiert werden, gerichteter Ziegenantikörper.
Die Blots werden anschließend gewaschen, und die Signale werden durch Chemilumineszenz entweder mit einem Kit ECL (Amersham) auf Filmen (Biomex light, Kodak) oder mit einem Super Signal Ultra (Pierce) und Visualisierung Fluor S. Multimager (BioRad) detektiert.
1 ist ein vergleichendes Beispiel, das anzeigt, dass der Nachweis des Prions im Vergleich zum Nachweis desselben Prions bei Fehlen des AML1 wenigsten vier Mal verstärkt wird, wenn das Verfahren der Erfindung umgesetzt wird.
Bei Fehlen des AML1 wird bei den höheren Verdünnungen als 1/8 keinerlei Prp^sc detektiert. Bei Vorhandensein von AML ist der Nachweis des Prp^sc in derselben Probe bis zu einer Verdünnung von 1/32 möglich. Die Ergebnisse der 2 zeigen den Nachweis.
2.3 Mikroskopische Ergebnisse
Die Proben, die zu den Experimenten mit der Raster-Sondenmikroskopie gedient haben und die in den 3 und 4 wiedergegeben wurden, wurden wie folgt zubereitet:
Ausschließlich als Adjuvans verwendeten makrozyklischen Liganden enthaltende Proben: Es werden als Adjuvans verwendete makrozyklische Liganden enthaltende Proben (50 mM) durch Aufbringen von frisch aus 10 μl AML-Lösung bzw. 10 μl Wasser abgespaltenem Mica enthaltende Proben zubereitet und 24 Stunden lang bei 37°C getrocknet.
Ausschließlich das rekombinante Protein (recPrP) enthaltende Proben: recPrP (50 mM) enthaltende Proben werden per Aufbringen auf frisch mit 10 μl Lösung aus jeweils 1/10 (v/v) AML1/recPrP, 1/100 (v/v) AML1/recPrP und 1/1000 (v/v) AML1/recPrP und 10 μl Wasser versetztem Mica zubereitet und 24 Stunden lang bei 37°C getrocknet.
Gleichzeitig als Adjuvans verwendete makrozyklische Liganden und recPrP umfassende Proben: 1) Es werden gleichzeitig als Adjuvans verwendete makrozyklische Liganden und recPrP ent haltende Proben durch Aufbringen auf frisch von jeweils 1 μl AML-Lösung und 1000 μl recPrP abgespaltenem Mica zubereitet und 24 Stunden lang bei 37°C getrocknet; 2) es werden gleichzeitig als Adjuvans verwendeter makrozyklischer Ligand (AML1) und recPrP enthaltende Proben durch Aufbringen auf frisch jeweils mit 1 μl AML-Lösung und 100 μl recPrP versetztem Mica zubereitet und 24 Stunden lang bei 37°C getrocknet; 3) Es werden gleichzeitig als Adjuvans verwendeter makrozyklischer Ligand und recPrP enthaltende Proben durch Aufbringen auf frisch mit jeweils 1 ml AML-Lösung und 10 μl recPrP versetztem Mica zubereitet und 24 Stunden lang bei 37°C getrocknet.
Es wird eine Analyse durch Bildgebungstechnik mittels eines mit einem dreifüßigen Scanner 100 μm ausgerüsteten Thermomikroscop Explorer AFM im Modus ohne Kontakt unter Verwendung von hohen Resonanzfrequenzen (F₀ = 320 kHz) des pyramidalen Cantilevers mit Silikonsonden mit einer Rasterfrequenz von 1 Hz durchgeführt. Die Verarbeitung der Bilder wird mit der Software SPMlab 5.1 realisiert und nicht gefiltert präsentiert.
Aus den 3 und 4 geht hervor, dass die recPr-Filme allein eine charakteristische Struktur in kreisförmigen Aggregaten zeigen. Bei Vorhandensein von AML werden die beim recPrP beobachteten Strukturen sequentiell modifiziert, sind eine steigende Funktion der Menge an AML und zeigen abgerundete und eventuell orthogonale Kristallit-Muster. Die Bilder des als Adjuvans verwendeten makrozyklischen Liganden (AML1) allein zeigen ähnliche, jedoch kleinere Strukturen als die Muster der Filme recPrP-AML.
Weitere Experimente wurden per Mikroskopie mit Atomkraft realisiert.
Eine spätere Analyse per Oberflächenanalyse der Rauheit wird in Tabelle 1 aufgeführt. Der Einsatz dieser Rauheitsmessungen kann auf profilometrische Analysetechniken ausgeweitet werden.
TABELLE 1
Die berechneten Rauheitswerte werden durch die Software des Thermomikroskops SPML 5.01 erhalten. Die durchschnittliche Rauheit Ra wird als das arithmetische Mittel der Höhenabweichungen (Formel A), die durchschnittliche Wurzel der Rauheit zum Quadrat (root mean square roughness RMS) wird als die Wurzel zum Quadrat des durchschnittlichen Wertes der Entfernungen der Punkte zum durchschnittlichen Bildwert (Formel B) und die durchschnittliche Höhe der Probe (Formel C) definiert.
Beispiel 3: Nachweis von rekombinantem PrP durch Verwendung von auf einen festen Träger aufgepfropftem C6S
3.1 Nachweis von rekombinantem PrP vom Rind auf Platten
a) Protokoll
Das in diesem Experiment verwendete Protokoll ist genau dem in einem klassischen ELISA realisierten Protokoll nachempfunden.
Gemäß Beispiel 1 wird das Aufpfropfen der aktivierten Aminplatten (NHS) 6 Stunden lang mit einer Reihe von in einer Lösung aus PBS 50 mM (salzigem Phosphatpuffer) gelöstem sulfoniertem Calix-6-Aen (C6S) realisiert. Die Platten werden anschließend mit destilliertem Wasser gespült, bevor sie durch eine Lösung aus PBST (PBS Tween) (0,05 % 5 %iger Milch 1 Stunde lang bei Raumtemperatur gesättigt werden. Nach dem Spülen wird eine rekombinante, bei einer Konzentration von 0,25 μg/ml in 0,05 %iger PBST gelöster Prionenproteinlösung (PrP) vom Rind aufgebracht. Sie wird eine Stunde lang bei Raumtemperatur inkubiert. Die Platte wird erneut drei Mal gespült. Dann wird sie eine Stunde lang bei Raumtemperatur mit einer mit 0, 5 μg/ml in 0,05 %igem PBST gelöster Peroxydase markierter Anti-PrP Antikörperlösung inkubiert. Der verwendete Antikörper erkennt die von den Aminosäuren 145-154 des PrP vom Menschen definierte Region und die entsprechenden Regionen des PrP von Tieren (AC23). Nach einem neuen Spülzyklus wird schließlich der Entwickler, eine OPD-Lösung (Ortho-Phenylendiamin), hinzugefügt, die 10 Minuten lang bei Raumtemperatur vor Licht geschützt inkubiert wird. Die Reaktion wird mithilfe einer Lösung aus H₂SO₄ gestoppt. Das Auslesen des erhaltenen Signals erfolgt mithilfe eines Spektrophotometers bei 495 nm.
b) Ergebnisse
Die Ergebnisse sind auf der 5 identisch, die aufzeigt, dass die in der Ordinate gemessene optische Dichte (DO) die Menge des von den C6S eingefangenen und nach dem Waschen hängen gebliebenen PrP reflektiert. Das bei den unterschiedlichen Aufpfropfungen erhaltene Signal zeigt, dass das rekombinante PrP vom Rind von den C6S eingefangen wurde. Das rekombinante PrP vom Rind fixiert sich an den auf den Platten aufgepfropften C6S.
3.2 Nachweis des rekombinanten PrP vom Menschen auf Kugeln
a) Versuchsbedingungen:
Gemäß Beispiel 1 werden die Kugeln NHS zunächst mit einer in destilliertem Wasser verdünnten Lösung aus C6S zum Aufpfropfen des C6S auf den Kugeln in Kontakt gebracht. Nach dieser Periode werden die Kugeln mit destilliertem Wasser und dann mit 0,05 %igem PBST gewaschen. Eine Lösung aus zu 0,25 μg/ml in 0,05 %igem PBST dosiertem rekombinantem PrP vom Menschen wird parallel dazu zubereitet. Anschließend wird eine Kugelreihe C6S jeweils durch Hinzufügen realisiert von: 0; 0,1; 1; 5 und 10 μl der Kugellösung auf 100 μl der Lösung aus PrP realisiert. Die Inkubation dauert 1 Stunde bei 37 °C, dann werden die Kugeln durch Magnetisierung vom Überstand getrennt. Das auf den Kugeln fixierte PrP wird direkt mithilfe eines gemäß einer der Methode ELISA nahen Sandwich-Methode markierten Antikörpers dosiert.
Der mit der Peroxydase markierte Entwicklungsantikörper wird nach dem Spülen der Kugeln mit einer 0, 05 %igen PBST-Lösung eine Stunde lang bei 37°C inkubiert. Die Kugeln werden vom Überstand per Magnetisierung getrennt, bevor sie erneut gewaschen werden und dann durch eine 10 Minuten lang inkubierte OPD-Lösung gewaschen. Die Reaktion wird mithilfe einer Lösung aus H₂SO₄ gestoppt. Der verwendete Entwicklungs-Antikörper ist der 8D11G12 (bioMérieux, Frankreich).
Das Auslesen des erhaltenen Signals erfolgt mithilfe eines Spektrometers bei 495 nm.
b) Ergebnisse
Die Entwicklungsergebnisse auf den Kugeln sind identisch mit der 6 und zeigen, dass die C6S ohne Funktionsverlust auf den Trägern NHS ordnungsgemäß aufgepfropft sind, behalten aber vor allem ihre Einfangeigenschaft des rekombinanten PrP unterschiedlicher Spezies und verstärken sogar das mit den spezifischen Antikörpern dieses Proteins erhaltene Signal auf reproduzierbare Weise.
Beispiel 4: Nachweis des physiologischen PrP unter Verwendung des auf einen festen Träger aufgepfropften C6S
4.1 Serum vom Menschen auf Kugeln
a) Protokoll:
Gemäß Beispiel 1 werden die Kugeln NHS zunächst mit einer in destilliertem Wasser verdünnten Lösung aus C6S zum Aufpfropfen in Kontakt gebracht. Nach dieser Periode werden die Kugeln mit destilliertem Wasser und dann mit 0,05 %igem PBST gewaschen.
Es wird parallel eine Serumreihe durch Verdünnung in PBS zubereitet. Eine zu 0,25 μg/ml dosierte Lösung aus rekombinantem PrP vom Menschen wird in PBS zubereitet sowie eine Lösung aus 0, 05 %iger PBST und 5%iger Milch, die jeweils als positive und negative Kontrolle dienen.
Die Kugeln werden in einer Menge von 5 μl in einer Lösung von 2.10^e9 Kugeln/ml auf 250 μl Probe hinzugefügt. Die Inkubation dauert 1 Stunde bei 37°C unter Schütteln. Anschließend werden die Kugeln vom Überstand durch Magnetisierung getrennt. Das auf den Kugeln fixierte PrP wird direkt mithilfe eines markierten Antikörpers dosiert.
Die Entwicklung auf Kugeln verwendet ein ELISA ähnliches Protokoll. Der mit Peroxydase markierte Entwicklungsantikörper wird eine Stunde lang bei 37°C unter leichtem Schütteln nach dem Spülen der Kugeln durch eine 0,05%ige PBST-Lösung inkubiert. Die Kugeln werden vom Überstand durch Magnetisierung getrennt, bevor sie erneut gewaschen und dann durch eine 10 Minuten lang inkubierte OPD-Lösung entwickelt werden. Die Reaktion wird mithilfe einer Lösung aus H₂SO₄ gestoppt. Der verwendete Entwicklungsantikörper ist das 8D11G12.
Das Auslesen des erhaltenen Signals erfolgt mithilfe eines Spektrometers bei 495 nm.
b) Ergebnisse
Ergebnisse werden in 7 angezeigt, die Folgendes aufzeigt:

– Der negative Vergleich in der Milch erlaubt die Bewertung des Hintergrundgeräuschs, während der positive Vergleich in einer Lösung aus 0,25 μg/ml PrP die Überprüfung erlaubt, dass das Experiment funktioniert hat und auswertbar ist.
– Die auf den Kugeln NHS aufgepfropften C6S fangen das im Serum vom Menschen vorhandene physiologische PrP ein. Darüber hinaus ist das Einfangen besser, wenn die Verdünnung des Serums mit einer bei den Verdünnungen zu 1/5 und 1/10 erreichten Sättigungsplatte erhöht wird.

c) Schlussfolgerung
Auf überraschende Weise fangen diese auf den Kugeln NHS aufgepfropften C6S das im Serum des Menschen vorhandene physiologische PrP ein. Die Verdünnungen des Serums erlauben die Erhöhung des auf den Kugeln erhaltenen Signals.
4.2 Gehirn-Rückenmarks-Flüssigkeit (LCR) vom Menschen auf Platten
a) Versuchsbedingungen:
Die LCR-Proben werden zunächst in Röhrchen mit äquivalenten Volumen verteilt. Zwei Verdünnungspunkte: rein und zu 1/12 werden für jede Probe realisiert. Dann werden diese drei Arten von Hitzebehandlung unterzogen: 30 Minuten bei 56°C, 15 Minuten bei à 75°C oder 5 Minuten bei 95°C. Bei den reinen Proben wird parallel ein Vergleich ohne Erhitzen realisiert.
Gemäß Beispiel 1 werden die Platten NHS parallel 6 Stunden lang mit einer Lösung aus in einer Lösung aus PBS 50 mM verdünntem C6S zum Aufpfropfen in Kontakt gebracht.
Die Platten werden anschließend mit destilliertem Wasser und dann mit 0,05 %igem PBST gespült.
Dann werden die Proben eine Nacht lang bei 2-8°C abgelegt und inkubiert. Anschließend wird die Platte sechs Mal gespült. Dann wird sie mit einer Anti-PrP, mit zu 0, 5 μg/ml in 0, 05 %igem PBST verdünntem Biotin markierten Antikörperlösung eine Stunde bei Raumtemperatur inkubiert. Der verwendete Antikörper ist AC23.
Nach einem neuen Spülzyklus wird eine Lösung aus Streptavidin-PAL (Phosphatase Alcaline) hinzugefügt, die 20 Minuten lang bei Raumtemperatur inkubiert wird. Die Platte wird ein letztes Mal gespült, und die Entwicklungslösung aus PNPP wird abgelegt und 30 Minuten lang bei 37°C inkubiert. Die Reaktion wird mithilfe einer Lösung aus NaOH 0,4N gestoppt.
Das Auslesen des erhaltenen Signals wird mithilfe eines Spektrometers bei 405 nm gegen einen Filter von 490 nm durchgeführt.
b) Ergebnisse:
Die Ergebnisse werden in 8 angegeben, die aufzeigt, dass das physiologische PrP im LCR dosiert werden kann.
Beispiel 5: Nachweis von PrP^sc im Gehirn unter Verwendung des auf einen festen Träger aufgepfropften C6S
5.1 Nachweis auf der Platte
a) Versuchsbedingungen:
Die erste Phase besteht in dem Erhalt des durch Extraktion ausgehend von Gehirnen von von der Creutzfeld-Jacob-Krankheit (CJK) betroffenen oder nicht betroffenen Patienten gereinigtem PrP^sc. Es wird eine Probe von 260 mg jedes Gehirns entnommen und dann zermahlen, um ein 10 %iges Homogenat in 5 %iger Glukose zu erhalten. Das zermahlene Gehirn wird anschließend mithilfe einer Nadel gefiltert. Darauf folgt eine Verdauungsstufe durch die Proteinase K. Sie wird in einer Konzentration von 20 μg auf 100 mg Gewebe bei 37°C 1 Stunde lang eingesetzt. Anschließend werden 650 μl einer Lösung aus 30 %igem Sarkosyl hinzugefügt. Parallel dazu wird ein Saccharosekissen von 400 μl auf dem Boden eines Röhrchens zum Ultrazentrifugieren hinzugefügt. Die Probe wird anschließend auf diesem Kissen aufgebracht. Die Röhrchen werden vor dem Versiegeln vervollständigt und dann 2 Stunden bei 20°C bei 100 000 U/Min. ultrazentrifugiert. Die Überstände werden eliminiert, und die Wände der Röhrchen werden grob mit saugfähigem Papier getrocknet. Die Rückstände werden anschließend in Tris-Maleat übernommen. Dann werden die Proben 5 Minuten lang bei 95°C erhitzt und anschließend 15 Minuten lang bei 12.000 U/Min. bei 20°C zentrifugiert. Diese Proben werden bei –80°C bis zur nächsten Verwendung aufbewahrt. Der Erfolg dieser ersten Stufe wurde per Western Blot bestätigt.
b) Test auf Calix-6-Sulphonat-Platten
Gemäß Beispiel 1 wird das Aufpfropfen der Platten NHS 6 Stunden lang mit einer Serie von in einer Lösung aus PBS 50 mM verdünntem C6S realisiert. Sie werden zunächst durch eine Lösung aus 0, 05 %igem PBST und 5 % Milch 6 Stunden lang bei Raumtemperatur gesättigt. Anschließend werden sie drei Mal mit einer Lösung aus 0,05 %igem PBST gewaschen. Die zuvor in Tris-Maleat gelöste Probe wird auf der Platte aufgebracht und eine Nacht lang bei 2-8°C inkubiert. Anschließend wird die Platte 6 Mal mit 0,05 %igem PBST gewaschen. Die Lösung aus Entwicklungs-Antikörper wird 1 Stunde lang bei Raumtemperatur inkubiert. Nach einer neuen Waschserie wird das Streptavi din-PAL 20 Minuten lang inkubiert. Die Platte wird ein letztes Mal vor dem Aufbringen von PNPP (Para-Nitrophenylphosphat) gewaschen, das 30 Minuten lang bei 37°C inkubiert wird. Dann wird die Entwicklungsreaktion durch Hinzufügen von Natron gestoppt.
Das Auslesen der DO wird bei 405 nm gegen einen Filter bei 490 nm mithilfe eines Spektrophotometers durchgeführt.
c) Ergebnisse
Die Ergebnisse werden in 9 angezeigt, die auf überraschende Weise aufzeigt, dass das PrP^sc der aus von der Creutzfeld-Jacob-Krankheit betroffenen Patienten stammenden Proben durch das erfindungsgemäße Verfahren unter Verwendung eines Einfangens durch die auf Platten NHS aufgepfropfte C6S und den Nachweis durch einen speziell gegen das Protein PrP gerichtete Antikörper feststellbar ist, wobei dieses durch die positiven Vergleiche rekombinanter PrP vom Menschen und negativen Vergleiche 0,05 %igen PBSTs bestätigt wird.
Beispiel 6: Nachweis von PrP^sc in der LCR unter Verwendung von auf einen festen Träger aufgepfropftem C6S
6.1 Zubereitung der Proben
Die Proben werden aus entnommener, bevorzugt nicht hämolysierter Gehirn-Rückenmarksflüssigkeit (LCR) ohne Zellbruchstücke gebildet. Diese Entnahmen sind anonym und werden bei –(80°C) in Röhrchen mit für die Proteine(„Pre-lubricated micro centrifuge tube 1,7 ml", Marsh Biomedical Products, Ref. T6050G) schwach adsorbierenden Wänden aufbewahrt.
Sie werden in zwei Kategorien unterteilt:
Einerseits die für die CJK positiven Proben.
Es handelt sich um LCR post mortem, die bei der Autopsie per Punktion in den Hohlräumen aufgefangen wurden und deren Suche nach PrP^SC im zerebralen Gewebe per Western Blot die Bestätigung der Diagnose der CJK (sichere Fälle) erlaubt hat. Bei der Autopsie wird die entnommene LCR ohne vorheriges Zentrifugieren sofort in die zuvor beschriebenen Röhrchen verteilt (hiervon ausgenommen sind die in einer erheblichen Menge zelluläre Bruchstücke aufweisenden Proben) und die restlos aufgeteilten Mengen werden bei –80°C tiefgefroren.
Andererseits die für die CJK negativen Proben. Sie sind von 2 Arten:
Bei der Autopsie post mortem aufgefangene LCR, deren Suche nach Prp^sc im zerebralen Gewebe durch Western Blot die Ausschaltung der Diagnose CJK (negative Vergleiche für CJK) erlaubt hat LCR von nicht von CJK betroffenen Patienten, die aus externen ventrikularen Derivationen (EVD) stammt. Die Lagerungsbedingungen dieser Entnahmen sind identisch mit den zuvor beschriebenen Bedingungen.
6.2 ELISA-Ansatz
a) Analytisches Prinzip
Die Proben werden einfach bei hoher Temperatur eine bestimmte Zeit lang inkubiert und dann nach dem Abkühlen zu ½ oder 1/5 in einem mit einer immunometrischen Analyse (ELISE) kompatiblem Puffer verdünnt (Puffer Tris-Maleat, pH 8). Wenn die Verdauung durch die Proteinase K vor der Ablagerung auf der Platte C6S erfolgt, werden die Proben durch die Proteinase K 15 Minuten lang verdaut und dann somit auf der Platte C6S ohne vorherige Inhibition aufgebracht.
Der Begriff ELISA wird verwendet, obwohl das Einfangen nicht immunologisch ist, denn es handelt sich um eine Reaktion vom Typ Ligand/Affiniermittel mit immunologischer Entwicklung.
Die ELISA-Techniken sind immuno-enzymologische, quantitative Techniken, die die Dosierung des gesuchten Antigens durch die Umwandlung eines Substrats in ein in der Probe vorhandenes zur Antigenmenge proportionales lösliches, messbares Produkt erlauben. Die hier verwendete Technik umfasst dieselben Phasen wie ein nicht kompetitives klassisches ELISA-Sandwich, mit Ausnahme der Sensibilisierung der Schälchen. Der eingefangene Antiprionen-Antikörper wird durch die sulfonierten, auf den Gruppen NHS der Mikroplatten durch ihre Aminfunktion aufgepfropften Calix-6-Arenen ersetzt.
Nach der Immobilisierung der C6S auf dem Boden der Schälchen einer Mikroplatte und Sättigung der nicht spezifischen Fixierungsstellen des Antigens wird die Probe aufgebracht und die Platte inkubiert, um die Verbindung des Antigens mit dem C6S zu erlauben. Dann, nach mehreren Waschungen, wird der für das Prionenprotein spezifische und markierte Entwicklungsantikörper hinzugefügt. Die gebildeten Komplexe werden nach dem Hinzufügen des Substrats des Enzyms, das sich in eingefärbtes Produkt umwandelt, dessen Extinktion mithilfe eines Mikroplatten-Lesegeräts (automatisierter Spektrometer) bestimmt wird, per kolorimetrischer Methode angezeigt.
b) Vorgehensweise
Es wird ein LCR-Volumen 15 Minuten lang bei 75°C im trockenen Laborbad inkubiert. Nach dem Abkühlen wird die Probe 5 Mal im Puffer Tris-Maleat 0, 2 M, pH 8 (Hinzufügen von 4 Puffervolumen) verdünnt und wird entweder direkt auf einer zuvor durch C6S sensibilisierten Mikroplatte aufgebracht oder durch die Proteinase K 15 Minuten lang bei 37°C verdaut und dann auf der Mikroplatte aufgebracht.
Die sukzessiven Phasen der immunometrischen Analyse werden nachstehend in der chronologischen Reihenfolge aufgezählt:

1 – Das Aufpfropfen der sulfonierten Calix-6-Arenen C6S auf den aktivierten (NHS) Aminplatten wird gemäß der oben genannten Methode 6 Stunden lang bei Raumtemperatur gemäß einer Konzentrationsauswahl oder gemäß einer bestimmten Konzentration verdünnt in einer Lösung aus PBS 50 mM realisiert.
2 – Die Platten werden anschließend 3 Mal in 0,05 %igem PBST gewaschen und dann in 0,05 %igem PBST – 5 %iger Milch 1 Stunde lang bei 37°C gesättigt.
3 – Nach dem Waschen werden per Schälchen μL gemäß dem oben beschriebenen analytischen Prinzip zubereitetem aufgebracht; die Platten werden 1 ½ Stunden lang bei 37°C inkubiert.
4 – Nach dem Waschen werden per Schälchen 100 μL des Entwicklungsantikörpers aufgebracht (AC23-HRP, HPR für Raifort-Peroxydase, zu 0,5 μg/ml oder AC23-Biotin zu 0,5 μg/ml). Die Platten werden 1 Stunde lang bei Raumtemperatur inkubiert.
5 – Nach dem Waschen werden die gebildeten Komplexe entwickelt:
5.1 – Wenn der Entwicklungsantikörper mit Biotin gekoppelt wird, werden 100 μL einer Lösung aus zu 1/20.000 verdünntem SA-PAL in 0,05 %igem Puffer in Schälchen aufgebracht. Anschließend werden die Platten 20 Minuten lang bei Raumtemperatur inkubiert. Nach dem Waschen werden 100 μL PNPP pro Schälchen aufgebracht. Die Platten werden 10 bis 30 Minuten lang bei 37°C inkubiert. Nach Abschluss der Inkubation wird die kolorimetrische Reaktion durch das Hinzufügen von 50 μL NaOH zu 0, 4 N in jedem Schälchen gestoppt. Die optische Dichte wird anschließend mit dem Spektrometer bei 405 nm gegen einen Filter von 450 nm gemessen.
5.2 – Wenn der Entwicklungsantikörper mit der Peroxydase gekoppelt wird, werden 100 μL OPD pro Schälchen aufgebracht. Die Platten werden 10 Minuten lang in der Dunkelheit und bei Raumtemperatur inkubiert.

Bei Abschluss der Inkubation wird die kolorimetrische Reaktion durch Hinzufügen von 50 μL H₂SO₄ bei 1,8 N in jedem Schälchen gestoppt. Die optische Dichte wird anschließend mit dem Spektrophotometer bei 495 nm gemessen.
b) Ergebnisse
1 – Überprüfung der Verbindung der auf Mikroplatten aufgepfropften sulfonierten, mono-aminen Calix-6-Arenen (C6S) mit dem Prionenprotein der Gehirn-Rückenmarksflüssigkeit (LCR):
Eine Gehirn-Rückenmarksflüssigkeit eines nicht von der Creutzfeld-Jacob-Krankheit betroffenen Patienten wird 15 Minuten lang bei. 75°C erhitzt und anschließend zu ½ oder zu 1/6 in einem mit einer immunologischen Entwicklung nach ELISA kompatiblem Puffer verdünnt. Die Proben werden nicht durch die Proteinase K verdaut und werden damit auf einer mit den C6S aufgepfropften Platte gemäß einer zwischen 1,8 und 18 μg/ml inbegriffenen Konzentration aufgebracht. Nach der Inkubation wird die immunologische Entwicklung des auf den C6S eingefangenen Antigens durch den mit der Peroxydase gekoppelten, zu 0,5 μg/ml verwendeten Antikörper AC23 gesichert. Die Ergebnisse werden in 10 vorgestellt.
Diese Ergebnisse zeigen, dass die C6S sich effektiv mit einer Form von Prionenproteinen in der LCR verbinden, da bereits bei der ersten Konzentration von am Boden der Schälchen immobilisierten C6S ein Signal festgestellt wird.
2 – Überprüfung der Verbindung der C6S mit dem pathologischen Prionenprotein in heterogener Phase ohne Verwendung von Proteinase K:
Eine LCR eines nicht von CJK betroffenen Patienten (LCR–) und eine LCR eines an CJK verstorbenen Patienten (MJC+), die zu ½ verdünnt oder nicht verdünnt sind, werden unterschiedlichen Arten von Hitzebehandlungen unterzogen. Sie werden anschließend auf der Platte aufgebracht, auf die die C6S zu 7,2 μg/ml aufgepfropft wurden. Nach dem Waschen wird die immunologische Entwicklung durch den mit Biotin gekoppelten Antikörper Antiprion AC23 gesichert.
Die Ergebnisse werden graphisch in 11 dargestellt.
Die Ergebnisse zeigen eine Adsorption des Prionenproteins auf den auf der Platte aufgepfropften C6S bei Fehlen der Behandlung durch die Proteinase K, die bei der positiven Probe wirkungsvoller ist als bei der negativen Probe. Die unterschiedlichen Hitzebehandlungen beeinflussen die Adsorptions-Wirksamkeit des Prionenproteins auf den C6S bei fehlender Verdünnung leicht und in stärkerem Maße, wenn die Probe verdünnt ist. Damit scheinen die die Adsorption des Prionenproteins auf den C6S MN in der heterogenen Phase begünstigenden Versuchsbedingungen eine Verdünnung der Proben und eine 5-minütige Behandlung bei 95°C zu sein.
3 – Überprüfung der Verbindung der C6S mit dem pathologischen Prionenprotein in der heterogenen Phase mit der Verwendung der Proteinase K:
Es wurde eine 15-minütige Verdauungsphase durch die Proteinase K bei 37°C in der vor-analytischen Behandlung, vor dem Einfangen der 1-stündigen Verdauungsmischung auf der Platte 6CS bei 37°C eingesetzt. Die Elimination der restlichen Proteinase K wird durch sukzessive Waschungen in 0,05 %igem Puffer PBS-Tween gewährleistet.
Die Ergebnisse werden in 12 angegeben.
Diese Ergebnisse zeigen eine unterschiedliche optische Dichte zugunsten der für CJK positiven Probe nach der Verdauung durch die Proteinase K. Dieses Differential ist bereits bei der ersten getesteten Proteinase-Konzentration K (0,5 μg/ml) sichtbar.
d) Schlussfolgerung
Der Nachweis des Pionenproteins in der LCR wird gemäß dem Verfahren der Erfindung ermöglicht. Bei fehlender Verdauung durch die Proteinase K wird der Nachweis des totalen (zelllulären und pathologischen) PrP bei Vorhandensein von sulfonierten Calix-6-Arenen auf unerwartete Weise nämlich verstärkt, das PrP^sc wird bevorzugt nachgewiesen. Die Verwendung dieser C6S beim Einfangen nach dem Verdauen der Proben durch die Proteinase K erlaubt den Nachweis der Prp^sc der LCR durch Liefern eines erheblich unterschiedlichen Signals zwischen den von nicht von CJK betroffenen Patienten stammenden LCR und den von CJK betroffenen Patienten stammenden LCR.

Claims

Verfahren zum Nachweis von PrP, und insbesondere PrP^sc, dadurch gekennzeichnet, dass man zu einer biologischen Probe, die PrP^sc enthalten könnte, als Adjuvans einen makrozyklischen Liganden (AML) hinzufügt, der an einen Träger gebunden sein kann, man die daraus resultierende Suspension mit einem anti-PrP^Sc Antikörper reagieren lässt, und das Vorhandensein von PrP nachweist.
Verfahren zum Nachweis von PrP und insbesondere von PrP^Sc gemäß Patentanspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass es eine zusätzliche Phase umfasst, die aus der Behandlung der Probe mit Proteinase K vor oder nach dem Kontakt mit dem AML besteht.
Verfahren zum Nachweis von PrP und insbesondere von PrP^Sc gemäß Patentanspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass besagte biologische Probe von einem Tier, aber auch von einem Menschen stammen kann.
Verfahren zum Nachweis von PrP und insbesondere von PrP^Sc gemäß Patentanspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass besagte Probe ein Gewebe oder eine Körperflüssigkeit ist, insbesondere eine zerebrospinale Flüssigkeit oder ein Serum.
Verfahren zum Nachweis von PrP und insbesondere von PrP^Sc gemäß einem der Patentansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass besagter fester Träger vorzugsweise durch eine Gruppe NHS oder eine Gruppe NH₂ funktionalisiert wird und vorzugsweise eine Magnetkugel oder eine Mikroplatte ist.
Verfahren zum Nachweis von PrP und insbesondere von PrP^Sc gemäß einem der Patentansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass sich der als Adjuvans verwendete besagte makrolytische Ligand an aneinandergrenzenden oder räumlich nahe beieinander lie genden Stellen im Bereich der Bindungsstellen von PrP^Sc an einen Antikörper bindet.
Verfahren zum Nachweis von PrP und insbesondere von PrP^Sc gemäß einem der Patentansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass der als Adjuvans verwendete makrolytische Ligand aus der Familie der Metazyklophane und insbesondere aus der Familie der Calixarene ausgewählt wird.
Verfahren zum Nachweis von PrP und insbesondere von PrP^Sc gemäß Patentanspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass die bevorzugten Calixarene Para-Sulfonat-Calixarene sind, die auf der Phenolseite, vorzugsweise von Calix[4]aren-p-Sulfonat, Calix[6]aren-p-sulfonat, Calix[8]aren-p-sulfonat oder einem ihrer Derivate funktionalisiert wird.
Verfahren zum Nachweis von PrP und insbesondere von PrP^Sc gemäß einem der Patentansprüche 7 oder 8, dadurch gekennzeichnet, dass der als Adjuvans verwendete makrozyklische Ligand nachstehende allgemeine Formel hat (I):
in der Klein Wasserstoffatom, eine Hydroxylgruppe, eine Gruppe OR oder eine Gruppe OCOR ist, und R der Definition unten entspricht, R₂ ein Wasserstoffatom, eine Gruppe R, COR, Pol, CH₂Pol ist, in der Pol eine Phosphat-, Sulfat-, Amin-, Ammonium-, Carbonsäure-Gruppe ist und R der Definition unten entspricht, R₃ ein Wasserstoffatom, eine Hydroxylgruppe, eine Gruppe OR oder OCOR ist, und R der Definition unten entspricht, R₄ ein Wasserstoffatom, eine Hydroxylgruppe, eine Gruppe OR, OCH₂R oder OCOR ist, in der R der Definition unten entspricht, Y ein Kohlenstoff-, Stickstoff- oder Schwefelatom ist. R₅ und R₆ können jeweils einzeln betrachtet fehlen, oder ein Wasserstoffatom, eine CH₂-Gruppe oder R gemäß der Definition unten sein, oder R₅ und R₆ bilden zusammen ein Sauerstoff- oder Schwefelatom, m ist eine ganze Zahl gleich 0 oder 1, R ist ein Wasserstoffatom oder eine gesättigte oder ungesättigte, verzweigte oder unverzweigte, zyklische oder nicht zyklische Kohlenwasserstoffkette, die durch eine Halogengruppe ersetzt werden und Polfunktionen haben kann, n ist eine ganze Zahl zwischen 3 und 15, die Substituenten R₁ bis R₅, R, X, Y und die ganze Zahl m können je nach Muster unterschiedlicher Art sein.
Verfahren zum Nachweis von PrP und insbesondere von PrP^Sc gemäß Patentanspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass besagter als Adjuvans verwendeter makrozyklischer Ligand nachstehende allgemeine Formel (Ia) hat:
in der jede R₂-Gruppe einzeln betrachtet eine Sulfat- oder eine Phosphatgruppe ist, R₇ eine Gruppe (CH₂)r-Z ist, in der Z eine Gruppe COOEt, COOH, CN oder NH₂ ist, r eine ganze Zahl zwischen 1 und 20 ist, p eine ganze Zahl zwischen 1 und 10 ist, n eine ganze Zahl zwischen 2 und 10 ist.
Verfahren gemäß Patentanspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass besagter Ligand nachstehende Formel (Ib) hat:
in der n eine ganze Zahl zwischen 4 und 8 ist, jede R₂-Gruppe einzeln betrachtet eine Sulfat- oder Phosphatgruppe ist, R₈ eine Gruppe (CH₂)t-(CO)3-(NH₂) oder eine Gruppe (CH₂)t-COOH ist, in der t eine ganze Zahl zwischen 0 und 6 und s eine ganze Zahl zwischen 0 und 6 ist.
Verfahren nach Patentanspruch 11, dadurch gekennzeichnet, dass besagter Ligand ein Calixaren mit der Formel (Ib) ist, in dem die beiden R₂-Gruppen jeweils eine Sulfatgruppe sind, wobei n gleich 4, 6 oder 8 ist und R₈ ein Wasserstoffatom, eine Gruppe CH₂COOH, eine Gruppe CH₂CONH₂ oder eine Gruppe CH₂CH₂NH₂ ist.
Verfahren nach Patentanspruch 11, dadurch gekennzeichnet, dass besagter Ligand dergestalt ist, dass die beiden R₂-Gruppen jeweils eine Sulfatgruppe sind, wobei n eine ganze Zahl gleich 6, und R₉ eine Gruppe (CH₂)₂-NH₂ ist.
Verfahren zum Nachweis von PrP und insbesondere von PrP^sc gemäß einem der Patentansprüche 7 bis 12, dadurch gekennzeichnet, dass besagtes Calixaren an einen Träger gebunden ist, der insbesondere durch eine Funktion NHS oder NH₂ funktionalisiert ist.
Als Adjuvans verwendeter makrozyklischer Ligand, der auf einen funktionalisierten Träger gepfropft wird, in dem der Ligand folgende Formel (Ib) hat:
n eine ganze Zahl zwischen 4 und 8 ist, jede R₂-Gruppe einzeln betrachtet eine Sulfat- oder eine Phosphatgruppe ist, R₈ eine Gruppe (CH₂)_t-(CO)_s-(NH₂) oder eine Gruppe (CH₂)t-COOH ist, in der t eine ganze Zahl zwischen 0 und 6 und s eine ganze Zahl zwischen 0 und 6 ist, und der Träger ein fester Träger ist, der vorzugsweise durch eine NHS- oder eine NH₂-Gruppe funktionalisiert ist und vorzugsweise ein Magnetkugel oder eine Mikroplatte ist.
Benutzung eines makrozyklischen Liganden als Adjuvans zum Nachweis von PrP, rekombinantem, physiologischem oder pathologischem PrP, vom Rind, vom Menschen oder anderen Spezies, und PrP^sc, in einer biologischen Probe, insbesondere einer Körperflüssigkeit, und insbesondere eines Liganden mit der Formel (I), (Ia) oder (Ib) gemäß der Definition in den Patentansprüchen 9, 10 und 15, der an einen Träger gebunden sein kann.
Benutzung eines Sets, das einen makrozyklischen Liganden als Adjuvans und insbesondere einen Liganden mit der Formel (I), (Ia) oder (Ib) gemäß der Definition in den Patentansprüchen 9, 10 und 15 umfasst, welcher an einen Träger gebunden sein kann, zur Diagnose von Krankheiten, für die PrP^Sc verantwortlich ist, wie z.B. Krankheiten vom Typ BSE, die Traberkrankheit der Kleinwiederkäuer oder die Creutzfeld-Jakob-Krankheit.
Benutzung eines Sets mit einem makrozyklischen Liganden als Adjuvans und insbesondere einem Liganden mit der Formel (I), (Ia) oder (Ib) gemäß der Definition in den Patentansprüchen 9, 10 und 15, der an einen Träger gebunden sein kann, zur immunologischen Dosierung von PrP^Sc.