SU1675773A1 - Способ определени ассоциированного с беременностью протеина-А - Google Patents
Способ определени ассоциированного с беременностью протеина-А Download PDFInfo
- Publication number
- SU1675773A1 SU1675773A1 SU894675094A SU4675094A SU1675773A1 SU 1675773 A1 SU1675773 A1 SU 1675773A1 SU 894675094 A SU894675094 A SU 894675094A SU 4675094 A SU4675094 A SU 4675094A SU 1675773 A1 SU1675773 A1 SU 1675773A1
- Authority
- SU
- USSR - Soviet Union
- Prior art keywords
- pregnancy
- wells
- protein
- incubated
- washed
- Prior art date
Links
Landscapes
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
Изобретение относитс к медицине, биологии , а именно к определению ассоциированного с беременностью белка протеина-/6 в различных биологических жидкост х и экстрактах ткани. Цель изобретени - повы- шекие чувствительности и сокращение времени анализа. 8 каждую лунку полистиролового планшета внос т по 0,2 мл раствора гепарина (15 мкг/мл), инкубируют в течение 1,5 ч при 37°С, отмывают. Затем внос т разведение исследуемого материала , инкубируют, отмывают. В дальнейшем инкубируют со специфическими антителами с последующим определением концентрации белка путем соотношени оптической плотности s опытной пробе с калибровочными В сравнении с прототипом увеличиваетс чувствительность способа в 20 раз, а длительность анализа сокращаетс в 10 раз.
Description
Изобретение относитс к медицине, биологии, а именно к биохимии и иммунологии , и может быть использовано в акушерстве , гинекологии, онкологии при определении концентрации ассоциированного с беременностью протеина-А в рэз- личных биологических жидкост х и экстрактах тканей.
Целью изобретени вл етс повышение чувствительности способа, а также сокращение времени анализа.
Способ осуществл ют следующим образом .
В каждую лунку полистиролового планшета внос т 0,2 мл раствора (15 мкг/мл) гепарина в забуференном фосфатами физиологическом растворе с рН 7,0 и инкубируют в течение 1,5 ч при 37°С. После сенсибилизации лунок и в дальнейшем планшеты промывают забуфвренным фосфатами
физиологическим раствором с рН 7,4, содержащим 0,1 %-ный твин-20, не менее трех раз. Дл предупреждени неспецифического св зывани в лунки внос т по 0,2 мл 1 %-ного раствора бычьего сывороточного альбумина в забуференном фосфатами физиологическом растворе (рН 7,4) и инкубируют 30 мин при 37°С. Затем лунки промывают.
Калибровочные разведени стандартной смеси сывороток крови беременных женщин с известной концентрацией ассоциированного с беременностью протеина-А внос т в лунки двух р дов с дублированием каждого разведени . Исследуемые образцы биологических жидкостей или экстрактов тканей помещают в остальные лунки планшета , Обьем антигенсодержащих растворов составл ет 0,2 мл. Инкубацию провод т в течение 1 ч при 37°С. После инкубации и
OV
VI
СЛ
VI
VI
00
отмывки планшета в лунки внос т по 0,2 мл раствора кроличьих моноспецифических аффинно очищенных антител против ассоциированного с беременностью протеина-А в забуферном фосфатами физиологическом растворе (рН 7,4) в концентрации 40 мкг/мл и инкубирут планшет в течение 2 ч при 37°С, затем планшет отмывают.
В лунки внос т по 0,2 мл козьих антител против иммуноглобулинов кролика, конъю- гированных с пероксидазой из хрена, в рабочем разведении 1:1000 в забуференном фосфатами физиологическом растворе, рН 7,4, и выдерживают в течение 1,5 ч при 37°С, после чего планшет промывают. Затем в лунки внос т 0,15 мл субстратного раствора рН 5,0(0,05 М лимонной кислоты, 0,1 М двухзамещенного фосфата натри , 0,04%-ного ортофенилендиамина и 0,012%-ной перекиси водорода). Ферментативное окисление субстрата при участии иммобилизованной пероксидазы из хрена провод т в течение 30 мин при 20°С с защищенном от света месте. Реакцию останавливают добавлением 0,05 мл 2 М серной кислоты. Относительную оптическую плотность содержимого каждой лунки определ ют спектрофотометрически при длине волны 492 нм по отношению к контрольным лункам, в которые вместо антигенсодержа- щих растворов внос т забуференный фосфатами физиологический раствор (рН 7,4).
П р и м е р 1. Проводили определени концентрации ассоциированного с беременностью протеина-А в сыворотке крови небеременной женщины М., 28 лет, донора со станции переливани крови. Предварительно в лунки планшета внос т 0,2 мл раствора (15 мкг/мл) гепарина в забуферном фосфатами физиологическом растворе (хлористый натрий 8 г, однозамещенный фосфат кали 0,2, двузамещенный фосфат натри 2,9, хлористый натрий 0,2, дистиллированна вода до 1000 мл) с рН 7,0 и инкубируют его 1,5 ч при 37°С. Дл промывки лунок используют забуференный фосфатами физиологический раствор с рН 7,4, содержащий 0,1%-ный твин-20, причем промывку производили на этом этапе и в дальнейшем троекратно.
Дл предупреждени неспецифического св зывани в лунки внос т 0,2 мл 1 %-но- го раствора бычьего сывороточного альбумина в забуференном фосфатами физиологическом растворе (рН 7,4) и инкубировали 30 мин при 37°С. Затем лунки промывают. Дл построени калибровочного графика в 9 лунок двух р дов внос т разведени стандартной смеси сывороток крови беременных женщин (II триместр беременности ) с исходной концентрацией ассоциированного с беременностью протеина-А 80 мкг/мл, измеренной с помощью методов количественного иммуноэлектрофореза .
Разведени смеси сывороток в забуфе- реннсм фосфатами физиологическом растворе (рН 7,4) были следующими, нг/мл: 2000; 1000:200; 100; 20; 10; 2; 1; 0,5. В лунки
0 их внос т в обьеме 0,2 мл. В две лунки этого же планшета внос т по 0,2 мл сыворотки донора М., а еще в две лунки внос т по 0,2 мл забуференного фосфатами физиологического раствора (рН 7,4) и используют по5 следние в качестве контрол . Инкубацию антигенсодержащих и контрольных растворов провод т в течение 1 ч при 37°С.
После инкубации и отмывки в рабочие лунки внос т по 0,2 мл раствора кроличьих
0 моноспецифических афинно очищенных антител против ассоциированного с беременностью протеина-А в забуференном фосфатами физиологическом растворе (рН 7,4) в концентрации 40 мкг/мл и оставл ют
5 планшет на 2 ч при 37°С, провод т отмывку планшета. Затем в рабочие лунки внос т по 0,2 мл козьих антител против иммуноглобулинов кролика, конъюгированных с пероксидазой из хрена в разведении 1:1000 в
0 забуференном фосфатами физиологическом растворе (рН 7,4) и выдерживают 1,5 ч при 37°С, после чего планшет промывают. Затем в рабочие лунки внос т по 0,15 мл субстратного раствора, рН 5,0 (0,05 М ли5 монной кислоты, 0,1 М двухзамещенного фосфата натри , 0,04%-ного ортофенилендиамина и 0,012%-ной перекиси водорода). Эту стадию ферментативного окислени субстрата при участии иммобилизованной
0 перрксидази из хрена1 провод т в течение 30 мин при 20°С в защищенном от света месте.
Оптическую плотность содержимого каждой лунки, в которую вносили калибро5 вочные разведени стандартной смеси сы- аороток и сыворотка крови исследуемого донора, определ ют при длине волны 492 нм по отношению к контрольным лункам, в которые вносилс забуференный фосфата0 ми физиологический раствор (рН 7,4). Получены следующие значени относительной оптической плотности (в единицах оптической плотности) дл калибровочных разведений: 2000 нг/мл - 0,728,0,722; 1000 нг/мл 5 0,677, 0,674; 200 нг/мл - 0,530, 0,533; 100 нг/мл - 0,479,0,480; 20 нг/мл - 0,382,0,383; 10 нг/мл - 0,338, 0,338; 2 нг/мл - 0,216, 0,215; 1 нг/мл - 0.174. 0,174; 0,5 w/мл - 0,050,0,051. На основании этих данных был построен калибровочный график, отражающий зависимость между относительной оптической плотностью содержимого лунок м соответствующей концентрацией в них ассоциированного с беременностью протеи- на-А. Относительна оптическа плотность содержимого лунок, в которые вносилась сыворотка крови женщины - донора, составила 0,404; 0,409, что соответствует на калибровочном графике концентрации ассоциированного с беременностью проте- ина-А 38,0 и 38,2 иг/мл, среднее значение результатов анализа 38,1 нг/мл. Продолжительность всего анализа равн лась 7 ч.
П р и м е р 2. Провод т измерение концентрации ассоциированного с беременностью протеина-А в мо -.е беременной Н., 28 лет, 30 недель беременности. Предварительно мочу центрифугируют и фильтруют. Все дальнейшие этапо анализа и их продол- жительность аналогичны примеру 1. Получены следующие значени относительной оптической плотности дл калибровочных разведений: 2000 нг/мл - 0,719, 0,728; 1000 нг/мл - 0,675, 0,679; 200 нг/мл - 0,529, 0,531; 100 нг/мл - 0,490, 0,490; 20 нг/мл - 0.384.0,379; 10 нг/мл -0,342, 0,346; 2 нг/мл - 0,210, 0,211; 1 нг/мл - 0,170, 0,170; 0,5 нг/мл - 0,048, 0,049. На основании этих данных был построен калибровочный график . Относительна оптическа плотность содержимого лунок, в которые вносилась моча беременной Н.. о.-ззалась 0,355 и 0,356, что соответствует концентрации ассоциированного с беременностью протеина-А 15.6 нг/мл.
П р и м е р 3. Приводили определение концентрации ассоциированного с беременностью протеина-А в экстракте ичниковой ткани, вз той у больной М., 31 г., оперированной по поводу поликистоза ичников . Предварительно кусочек ичниковой ткани массой 0,5 г гомогенизировали в присутствии 1,5 мл забуференного фосфатами физиологического раствора (рН 7,4), содержащего соевый ингибитор трипсина в концентрации 10 мкг/мл, затем гомогента поместили на 18 ч в холодильную камеру при 4°С, после этого его отцентрифугироза- ли, а супернатант профильтровали дл полного отделени от фрагментов ткани. Все
дальнейшие этапы анализа и их продолжительность соответствовали примеру 1. Получены следующие значение относительной оптической плотно ти (в единицах оптической плотнос м) дл калибровочных разведений: 2000 нг/мл - 0,718, 0,724; 1000 нг/мл - 0,680, 0,670; 200 чг/мл - 0,541, 0,538; 100 нг/мл - 0,482, 0,481; 20 нг/мл - 0,378, 0,380; 10 нг/мл - 0,342, 0,342; 2 нг/мл - 0,210,
0,212; 1 нг/мл - 0,179, 0,176; 0,5 нг/мл - Q.048, 0,050. На основании этих данных был построен калибровочный график. Относительна плотность содержимого лунок, в которые вноситс экстракт ичниковой ткани,
равн лась 0,244 и 0,250, что соответствует на калибровочном графике концентраци м ассоциированного с беременностью протеина-А 3,9 и 4,0 нг/мл. После усреднени результатов двух параллельных исследований находим, что концентраци ассоциированного с беременностью протеина-А в экстракте ичника ткани, вз той у больной М., равн етс 3,95 нг/мл.
Использование изобретени существенно расшир ет возможности применени иммуноферментного метода в широкой клинической и нэучно-исследовательской практике . Достигнуто значительное (в 20 раз) повышение чувствительности иммуноферментного способа определени концентрации ассоциированного с беременностью протеина-А в различных биологических жидкост х и экстрактах тканей. По известному способу чувствительность составл ет
10 нг/мл. а по предлагаемому 0,5 нг/мл. Это сочетаетс с дес тикратным сокращением времени проведени анализа (по известному длительность анализа составл ет 72 ч, а по предлагаемому способу 7 ч).
Claims (1)
- Формула изобретени. Способ определени ассоциированного с беременностью протеина-А путем иммуноферментного анализа с использованием сенсибилизированной твердой подложки иопределением концентрации протеина-А по величине оптической плотности, отличающийс тем, что, с целью повышени чувствительности способа и сокращени времени анализа, твердую подложку сенсибилизируют гепарином.
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
SU894675094A SU1675773A1 (ru) | 1989-04-06 | 1989-04-06 | Способ определени ассоциированного с беременностью протеина-А |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
SU894675094A SU1675773A1 (ru) | 1989-04-06 | 1989-04-06 | Способ определени ассоциированного с беременностью протеина-А |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
SU1675773A1 true SU1675773A1 (ru) | 1991-09-07 |
Family
ID=21440033
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
SU894675094A SU1675773A1 (ru) | 1989-04-06 | 1989-04-06 | Способ определени ассоциированного с беременностью протеина-А |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
SU (1) | SU1675773A1 (ru) |
Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO1998003874A1 (en) * | 1996-07-18 | 1998-01-29 | The Curators Of The University Of Missouri | A rapid and sensitive method for the detection of heparin-induced antibodies |
US6172198B1 (en) | 1993-03-19 | 2001-01-09 | Northern Sydney Area Health Service | PAPP-A, its immunodetection and uses |
-
1989
- 1989-04-06 SU SU894675094A patent/SU1675773A1/ru active
Non-Patent Citations (1)
Title |
---|
Berslnger N.A. Clln. Chem. Acta, 1983, 134, p.297-306. * |
Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US6172198B1 (en) | 1993-03-19 | 2001-01-09 | Northern Sydney Area Health Service | PAPP-A, its immunodetection and uses |
WO1998003874A1 (en) * | 1996-07-18 | 1998-01-29 | The Curators Of The University Of Missouri | A rapid and sensitive method for the detection of heparin-induced antibodies |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
USRE29169E (en) | Process for the demonstration and determination of reaction components having specific binding affinity for each other | |
JP3065667B2 (ja) | トロポニンiおよびtおよびこれらのコンプレックスの新規アッセイ法並びにイムノアッセイ用抗体の選択 | |
JPH0588421B2 (ru) | ||
JP2005503534A (ja) | ビタミンdアッセイ | |
US5712103A (en) | Diagnostic assay for the prediction of preeclampsia | |
EP0166623A2 (en) | Antibody lectin sandwich assay | |
GB2074727A (en) | Immunological diagnostic method | |
EP0070033B1 (en) | Quantitative determination of adenosine | |
US4729961A (en) | Process for the detection and assay by erythroadsorption | |
EP0008473A1 (en) | Method for the detection and/or determination of an antigen specific immunoglobulin, immuno-reagents to be used in said method and test kit for said determination | |
SU1675773A1 (ru) | Способ определени ассоциированного с беременностью протеина-А | |
US6383766B1 (en) | Reduced cortisol conjugates | |
US6352831B1 (en) | Glycolipid complexes and their uses | |
EP0398292B1 (en) | Diagnostic composition for rheumatoid arthritis | |
JP2508915B2 (ja) | 抗SSA/RoおよびSSB/La抗体測定用抗原、その製造法ならびに抗SSA/RoおよびSSB/La抗体の測定法 | |
JP3896303B2 (ja) | チトクロムc測定によるsirsにおける多臓器不全の検査試薬 | |
JPS61243363A (ja) | Crpの高感度定量法 | |
JP2000214163A (ja) | 測定試薬 | |
JP4422291B2 (ja) | ヒトメダラシンの免疫学的測定方法 | |
JPH02264864A (ja) | Gsa―2結合性蛋白質の免疫学的測定試薬及びそれを用いた免疫学測定用キット | |
Ollodart et al. | Antibodies to 1, 2-naphthoquinone | |
JP3444665B2 (ja) | グリココンジュゲートの測定方法および試薬 | |
RU2235329C1 (ru) | СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ФУНКЦИОНАЛЬНОЙ АКТИВНОСТИ СУБКОМПОНЕНТОВ Clr2s2 ПЕРВОГО КОМПОНЕНТА КОМПЛЕМЕНТА ЧЕЛОВЕКА | |
RU2093825C1 (ru) | Способ определения пирогенных свойств фармацевтических препаратов (пиротест) | |
JPS63269057A (ja) | フイブロネクチン測定試薬 |