CN104251908B - 样品垫处理液、h7亚型禽流感病毒胶体金试纸条及其制备方法 - Google Patents

样品垫处理液、h7亚型禽流感病毒胶体金试纸条及其制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种样品垫处理液、H7亚型禽流感病毒胶体金试纸条及其制备方法，所述处理液为：PEG-2008-20g，PVP11-25g，BSA10-45g，屈立通X–1000.5-30ml，吐温-200.8-15ml，后用5mM-10mM磷酸盐缓冲液定容至1L，调节pH值9.5；试纸条由样品垫、玻璃纤维膜、硝酸纤维素膜和吸水纸顺次搭接粘贴在底板上构成，所述样品垫经上述处理液处理。所述处理液可增加样品垫亲水性，有助于其快速润湿，促进层析作用发生，大分子类溶于水形成的水溶液有悬浮分散作用，可保护样品中病毒抗原。所述试纸条操作安全、简便、特异性强、灵敏度高、交叉感染率低。

Description

样品垫处理液、H7亚型禽流感病毒胶体金试纸条及其制备方法
技术领域
本发明涉及医学检验领域，特别是涉及一种样品垫处理液、H7亚型禽流感胶体金试纸条及其制备方法。
背景技术
目前存在的试纸条，样品垫的处理液常见成分主要是封闭物质（如：牛血清白蛋白、酪蛋白）和表面活性剂（Tween-20、S-17、S-9、TritonX-10），其中，常用的蛋白质类（如：牛血清白蛋白），其具有流动封闭和保护金标抗体的作用；屈立通X–10、吐温-20表面活性剂可提高亲水性和润湿性，降低液体的表面张力，有利于检测样品中的抗原和试纸条中的金标抗体快速充分的反应，而湿润性效果取决于表面活性剂与其它聚合物基质的配伍性；然而，不同成分的配伍及其含量会直接影响样品垫的作用效果；再者，由于样品在酸性条件下变化较大，其在流动过程中捕捉抗体表面产生正电荷，这将引起与带有负电荷的金标粒子发生非特异性反应，如果样品中含有大量的酸性物质或者含有带有大量正电荷的蛋白质，它们在到达捕捉抗体区之前很可能与金标颗粒非特异性结合，从而使得试纸条检测的灵敏性降低，产生不良的交叉反应。
自2013年2月以来，我国上海市、安徽省、江苏省先后发生不明原因重症肺炎病例，并确诊为人感染H7N9亚型禽流感病毒引起的急性呼吸道传染病，截至2013年5月29日全国人感染H7N9禽流感确诊病例共计132例。H7亚型禽流感病毒属于禽流感病毒属，正粘病毒科，单股负链RNA病毒。禽流感病毒根据其膜蛋白血凝素（Hemagglutinin，HA）抗原性可分成不同的亚型，目前共有16种HA亚型（H1-H16），其中H7亚型禽流感病毒属于高致病力禽流感病毒之一。现今，发现可感染人的H7亚型禽流感包括H7N2、H7N3、H7N7和H7N9，因此，H7亚型禽流感对人类健康造成了重大威胁。
然而，目前针对禽流感病毒的检测，需要昂贵的仪器设备，检测成本较高，必须有专门的实验室以及专业的操作人员；因此受检测地点、检测仪器和专业人员操作条件限制，不适用于在机场、口岸、火车站、医院等人口密度大、人流量大的场所；也不适用于设备简易的基层社区、血站、边境检验检疫或家庭的现场即时检测；且操作较繁琐，检测周期长，仅检测反应就耗时120min，不能满足样品量多和即时检测的需求，直接影响疫情的防控速度;且并未有检测H7亚型禽流感病毒的试纸条，因此，建立简便快速检测H7亚型禽流感病毒的方法至关重要，有助于监控和预防其传播。
发明内容
基于此，本发明的目的在于提供一种样品垫处理液、H7亚型禽流感胶体金试纸条及其制备方法。
解决上述技术问题的具体技术方案如下：
一种样品垫处理液，所述处理液的配方为：聚乙二醇-2008-20g；聚乙烯吡咯烷酮11-25g；牛血清白蛋白10-45g；屈立通X–1000.5-30ml；吐温-200.8-15ml；最后用5mM-10mM磷酸盐缓冲液定容至1L，调节pH值9.5。
在其中一些实施例中，所述处理液的配方中聚乙二醇-20017-19g；聚乙烯吡咯烷酮18-22g；牛血清白蛋白13-17g；屈立通X–1001.5-2.5mL；吐温-207-9mL。
在其中一些实施例中，所述处理液的配方中还包括叠氮钠0.1-1.1g。
一种H7亚型禽流感病毒胶体金试纸条，所述试纸条由样品垫、玻璃纤维膜、硝酸纤维素膜和吸水纸顺次搭接粘贴在底板构成，所述样品垫用上述处理液进行处理；所述玻璃纤维膜涂有胶体金颗粒标记的H7亚型禽流感病毒外膜血凝素抗原的单克隆抗体，所述硝酸纤维素膜包括检测区和质控区，所述检测区包被有H7亚型禽流感病毒外膜血凝素抗原的单克隆抗体，所述质控区包被有抗鼠IgG抗体。
在其中一些实施例中，所述胶体金颗粒标记的H7亚型禽流感病毒外膜血凝素抗原的单克隆抗体的浓度为25-30μg/ml，在所述玻璃纤维膜上的用量为25.5-45.5μg/cm2。
在其中一些实施例中，所述胶体金颗粒标记的H7亚型禽流感病毒外膜血凝素抗原的单克隆抗体的浓度为26-28μg/ml，在所述玻璃纤维膜上的用量为38-42μg/cm2。
在其中一些实施例中，所述H7亚型禽流感病毒外膜血凝素抗原的单克隆抗体在所述检测区的用量为0.244-0.390μg/mm；所述抗鼠IgG抗体在所述质控区的用量为0.122-0.55μg/mm。
在其中一些实施例中，所述H7亚型禽流感病毒外膜血凝素抗原的单克隆抗体在所述检测区的用量为0.3-0.34μg/mm；所述抗鼠IgG抗体在所述质控区的用量为0.4-0.5μg/mm。
一种H7亚型禽流感病毒胶体金试纸条的制备方法，包括以下步骤：
A、先将样品垫(1)浸泡于上述样品垫处理液中，取出干燥，再加入干燥剂封存备用；
B、制备抗H7亚型禽流感病毒外膜血凝素抗原的单克隆抗体和抗鼠IgG抗体；
C、将1mL胶体金液中加步骤B所得的H7亚型禽流感病毒外膜血凝素抗原的单克隆抗体，得胶体金颗粒标记的H7亚型禽流感病毒外膜血凝素抗原的单克隆抗体，按25.5-45.5μg/cm2的用量喷在玻璃纤维膜(2)上，并于温度20-40℃，湿度10-30％条件下，干燥，备用；
D、将步骤B所得的H7亚型禽流感外膜血凝素抗原的单克隆病毒抗体用包被缓冲液稀释至浓度为0.7-1.4mg/ml；按0.244-0.390μg/mm的用量喷在硝酸纤维素膜(3)的检测区(5)，干燥，备用；将步骤B所得的抗鼠IgG抗体用包被缓冲液稀释至浓度为1.0-2.0mg/ml，按0.122-0.55μg/mm的用量喷在硝酸纤维素膜(3)的质控区(6)，干燥，备用；
E、将样品垫(1)、玻璃纤维膜(2)、硝酸纤维素膜(3)和吸水纸(4)按序粘贴于底板(7)上，即得。
在其中一些实施例中，步骤A用处理液处理样品垫的方法为常规操作方法；优选地，先将样品垫(1)浸泡于样品垫处理液中20-60min，再取出于30-45℃干燥箱中干燥9-15h，加入干燥剂封存备。
本发明所述的一种样品垫处理液、H7亚型禽流感病毒胶体金试纸条及其制备方法的优点和有益效果：
（1）本发明样品垫的处理液配方不同于现有处理液，加入了大分子类物质聚乙二醇、聚乙烯吡咯烷酮，可增加样品垫亲水性，有助于样品垫的快速润湿，促进层析作用发生，另外大分子类溶于水形成的水溶液有悬浮分散作用，可用于保护检测样品中病毒抗原。
（2）本发明样品垫的处理液可显著降低由于样品在酸性条件流动过程中捕捉抗体表面产生正电荷，引起样品在到达捕捉抗体区之前与金标颗粒非特异性结合，从而降低试纸条的灵敏性，产生不良的交叉反应的缺点，即本发明所述处理液中聚乙二醇、聚乙烯吡咯烷酮其与其他物质相配伍，大大提高了试纸条的特异性、灵敏度，也降低了交叉感染。
（3）本发明所述试纸条能检测全部H7亚型的禽流感病毒，已解决现有技术中只能检测单一亚型的缺点。
（4）本发明所述试纸条可用于检测人体分泌物样品中的H7亚型禽流感病毒，适用于H7亚型的禽流感病毒感染的临床辅助诊断，有利于人类禽流感病毒疫情的防控。
（5）本发明所述的试纸条，其操作安全、无放射物污染、简便、一步即可完成、快速(15分钟左右即可有结果)，可实现对H7亚型禽流感病毒抗原现场即时检测。
附图说明
图1为本发明一种H7亚型禽流感病毒胶体金试纸条的结构示意图；
图2为实施例4检测H7亚型禽流感病毒抗原的结果示意图；
附图标记：
1.样品垫；2.玻璃纤维膜；3.硝酸纤维素膜；4.吸水纸；5.H7亚型禽流感病毒检测区(T)；6.质控区(C)；7.底板。
具体实施方式
本发明所述PEG为聚乙二醇，PVP为聚乙烯吡咯烷酮，BSA为牛血清白蛋白，Triton为屈立通，Tween为吐温。
所述包被缓冲液主要成分为0.01MpH7.2PBS、5％蔗糖、1％甲醇、3.6％甘氨酸、0.05％NaN3。
以下将结合具体实施例对本发明做进一步说明。
实施例1样品垫处理液
一种样品垫处理液，其配方为：聚乙二醇-200（PEG）：18g；聚乙烯吡咯烷酮（PVP）：20g；牛血清白蛋白（BSA）：15g；屈立通（Triton）X–100：1.8mL；吐温（Tween）-20：8.5mL；叠氮钠0.6g；最后用8mM磷酸盐缓冲液定容至1L，调节pH值为9.5。
实施例2样品垫处理液
一种样品垫处理液，其配方为：聚乙二醇-200（PEG）：8g；聚乙烯吡咯烷酮（PVP）：11g；牛血清白蛋白（BSA）：10g；屈立通（Triton）X–100：0.5mL；吐温（Tween）-20：0.8mL；叠氮钠0.1g；最后用5mM磷酸盐缓冲液定容至1L，调节pH值为9.5。
实施例3样品垫处理液
一种样品垫处理液，其配方为：聚乙二醇-200（PEG）：20g；聚乙烯吡咯烷酮（PVP）：25g；牛血清白蛋白（BSA）：45g；屈立通（Triton）X–100：30mL；吐温（Tween）-20：15mL；叠氮钠1.1g；最后用10mM磷酸盐缓冲液定容至1L，调节pH值为9.5。
实施例4H7亚型禽流感病毒胶体金试纸条
一种H7亚型禽流感病毒胶体金试纸条，所述试纸条由样品垫1、玻璃纤维膜2、硝酸纤维素膜3和吸水纸4顺次搭接粘贴在底板构成，所述玻璃纤维膜2涂有胶体金颗粒标记的H7亚型禽流感病毒外膜血凝素抗原的单克隆抗体，所述硝酸纤维素膜包括检测区5和质控区6，所述检测区5包被有H7亚型禽流感病毒外膜血凝素抗原的单克隆抗体，所述质控区6包被有抗鼠IgG抗体；所述胶体金颗粒标记的H7亚型禽流感病毒外膜血凝素抗原的单克隆抗体在所述玻璃纤维膜上的用量为40μg/cm2；所述H7亚型禽流感病毒外膜血凝素抗原的单克隆抗体在所述检测区5中的包被用量为0.32μg/mm；所述抗鼠IgG抗体在质控区6的包被用量为0.44μg/mm。
所述的检测H7亚型禽流感病毒抗原试纸条经过包装可以直接使用。
本实施例所述的H7亚型禽流感病毒胶体金试纸条的制备方法，包括以下步骤：
A、样品垫1预处理：将样品垫1浸泡于实施例1制得的样品垫处理液中30min，取出于37℃干燥箱中干燥12h，后加入干燥剂封存备。
B、制备抗H7亚型禽流感病毒外膜血凝素抗原的单克隆抗体和抗鼠IgG抗体
制备抗H7亚型禽流感病毒外膜血凝素抗原的单克隆抗体：利用常规方法用灭活的H7亚型禽流感病毒HA抗原免疫小鼠，H7亚型禽流感抗原免疫的小鼠与骨髓瘤细胞融合后，用ELISA方法鉴别，鉴别出来的杂交瘤在腹水中培养，筛选阳性克隆，分离纯化H7亚型禽流感病毒抗体。ELISA鉴定H7亚型禽流感病毒外膜血凝素抗原的单克隆抗体的活性和效价，纯化备用；
制备抗鼠IgG抗体：利用常规方法以纯化后小鼠IgG为免疫抗原，对兔进行免疫，两周后采集静脉血，用ELISA方法测定抗鼠IgG抗体的活性和效价，纯化备用。
C、将按1mL胶体金液加25-30μg步骤B制备的H7亚型禽流感病毒外膜血凝素抗原的单克隆抗体，形成胶体金标记的H7亚型禽流感病毒外膜血凝素抗原的单克隆抗体，按用量为40μg/cm2喷在玻璃纤维膜2上，并在温度20-40℃，湿度10％-30％，将玻璃纤维膜2干燥12h以上，备用。
D、用包被缓冲液稀释H7亚型禽流感病毒外膜血凝素抗原的单克隆抗体，使其浓度为0.7-1.4mg/mL，按抗体量0.32μg/mm，将其细致均匀的喷到硝酸纤维素膜3检测区5上，并在温度20-40℃，湿度10-30％条件下烘干处理12h以上，封袋，备用；用包被缓冲液稀释抗鼠IgG抗体，使其浓度为1.0-2.0mg/mL，按抗体量0.44μg/mm，将其细致均匀的喷到硝酸纤维素膜3质控区6上，并在温度20-40℃，湿度10％-30％条件下烘干处理12h以上，封袋，备用；
E、将样品垫1、玻璃纤维膜2、硝酸纤维素膜3、吸水纸4按序粘贴于底板7上，即得试纸条。
实施例5H7亚型禽流感病毒胶体金试纸条
一种H7亚型禽流感病毒胶体金试纸条，所述试纸条由样品垫1、玻璃纤维膜2、硝酸纤维素膜3和吸水纸4顺次搭接粘贴在底板构成，所述玻璃纤维膜2涂有胶体金颗粒标记的H7亚型禽流感病毒外膜血凝素抗原的单克隆抗体，所述硝酸纤维素膜包括检测区5和质控区6，所述检测区5包被有H7亚型禽流感病毒外膜血凝素抗原的单克隆抗体，所述质控区6包被有抗鼠IgG抗体；所述胶体金颗粒标记的H7亚型禽流感病毒外膜血凝素抗原的单克隆抗体在所述玻璃纤维膜上的用量为25.5μg/cm2；所述H7亚型禽流感病毒外膜血凝素抗原的单克隆抗体在所述检测区5中的包被用量为0.244μg/mm；所述抗鼠IgG抗体在质控区6的包被用量为0.122μg/mm。
本实施例所述的H7亚型禽流感病毒胶体金试纸条的制备方法，包括以下步骤：
A、样品垫1预处理：将样品垫1浸泡于实施例2所述的样品垫处理液中20min，取出于30℃干燥箱中干燥9h，后加入干燥剂封存备。
B、制备抗H7亚型禽流感病毒外膜血凝素抗原的单克隆抗体和抗鼠IgG抗体，参照实施例1。
C、将按1mL胶体金液加25-30μg步骤B制备的H7亚型禽流感病毒外膜血凝素抗原的单克隆抗体，形成胶体金标记的H7亚型禽流感病毒外膜血凝素抗原的单克隆抗体，按用量为25.5μg/cm2喷在玻璃纤维膜2上，并在温度20-40℃，湿度10％-30％，将玻璃纤维膜2干燥12h以上，备用。
D、用包被缓冲液稀释H7亚型禽流感病毒外膜血凝素抗原的单克隆抗体，使其浓度为0.7-1.4mg/mL，按抗体量0.244μg/mm，将其细致均匀的喷到硝酸纤维素膜3检测区5上，并在温度20-40℃，湿度10-30％条件下烘干处理12h以上，封袋，备用；用包被缓冲液稀释抗鼠IgG抗体，使其浓度为1.0-2.0mg/mL，按抗体量0.122μg/mm，将其细致均匀的喷到硝酸纤维素膜3质控区6上，并在温度20-40℃，湿度10％-30％条件下烘干处理12h以上，封袋，备用；
E、将样品垫1、玻璃纤维膜2、硝酸纤维素膜3、吸水纸4按序粘贴于底板7上，即得试纸条。
实施例6H7亚型禽流感病毒胶体金试纸条
一种H7亚型禽流感病毒胶体金试纸条，所述试纸条由样品垫1、玻璃纤维膜2、硝酸纤维素膜3和吸水纸4顺次搭接粘贴在底板构成，所述玻璃纤维膜2涂有胶体金颗粒标记的H7亚型禽流感病毒外膜血凝素抗原的单克隆抗体，所述硝酸纤维素膜包括检测区5和质控区6，所述检测区5包被有H7亚型禽流感病毒外膜血凝素抗原的单克隆抗体，所述质控区6包被有抗鼠IgG抗体；所述胶体金颗粒标记的H7亚型禽流感病毒外膜血凝素抗原的单克隆抗体在所述玻璃纤维膜上的用量为45.5μg/cm2；所述H7亚型禽流感病毒外膜血凝素抗原的单克隆抗体在所述检测区5中的包被用量为0.39μg/mm；所述抗鼠IgG抗体在质控区6的包被用量为0.55μg/mm。
本实施例所述的H7亚型禽流感病毒胶体金试纸条的制备方法，包括以下步骤：
A、样品垫1预处理：将样品垫1浸泡于实施例3所述的样品垫处理液中60min，取出于45℃干燥箱中干燥15h，后加入干燥剂封存备。
B、制备抗H7亚型禽流感病毒外膜血凝素抗原的单克隆抗体和抗鼠IgG抗体，参照实施例1。
C、将按1mL胶体金液加25-30μg步骤B制备的H7亚型禽流感病毒外膜血凝素抗原的单克隆抗体，形成胶体金标记的H7亚型禽流感病毒外膜血凝素抗原的单克隆抗体，按用量为45.5μg/cm2喷在玻璃纤维膜2上，并在温度20-40℃，湿度10％-30％，将玻璃纤维膜2干燥12h以上，备用。
D、用包被缓冲液稀释H7亚型禽流感病毒外膜血凝素抗原的单克隆抗体，使其浓度为0.7-1.4mg/mL，按抗体量0.39μg/mm，将其细致均匀的喷到硝酸纤维素膜3检测区5上，并在温度20-40℃，湿度10-30％条件下烘干处理12h以上，封袋，备用；用包被缓冲液稀释抗鼠IgG抗体，使其浓度为1.0-2.0mg/mL，按抗体量0.55μg/mm，将其细致均匀的喷到硝酸纤维素膜3质控区6上，并在温度20-40℃，湿度10％-30％条件下烘干处理12h以上，封袋，备用；
E、将样品垫1、玻璃纤维膜2、硝酸纤维素膜3、吸水纸4按序粘贴于底板7上，即得试纸条。
实施例7检测H7亚型禽流感病毒抗原
本实施例利用实施例1制得的试纸条对人的痰液、鼻腔分泌物和咽喉分泌物等样品中的H7亚型禽流感病毒抗原进行检测。
具体步骤如下：
（1）采集样本：使用无菌PP（聚丙烯）杆的聚酯海绵拭子采集样本。
痰液采集：用医用吸痰器吸取病人痰液，或患者清水漱口后，深呼吸数次，将痰液从肺部咳出，痰液需用专门的洁净容器密闭保存。
鼻腔分泌物采集：收集鼻腔分泌物时，将拭子插入鼻腔中分泌物最多处，轻轻转动并向鼻腔内部推动拭子，直至鼻甲（离鼻孔约2.0cm～2.5cm）受阻处，贴鼻腔壁旋转拭子三次，取出拭子。
咽喉分泌物采集：将拭子从口腔完全插入咽喉中，以咽喉壁、上颚扁桃的发红部位为中心，适度用力擦拭双侧咽扁桃体及咽后壁，取出拭子，应注意避免触及舌部。
（2）样本采集后应尽快用本试剂提供的稀释液（0.85%生理盐水，pH值7.0±0.2）进行处理（2小时内），如不能立即处理，应立即置于已消毒的干燥、密封的塑料管内储存，于2℃～8℃下可保存8小时，更长时间贮存则应置于-20℃或更低温度。
（3）样本提取：用本试剂提供的稀释液进行处理。
痰液样品/鼻咽分泌物样品/咽喉样品提取：将拭子浸入痰液中，旋转搅拌约10次，至拭子的签头完全浸透；向样本提取管中垂直加入400μL（约10滴）稀释液；将浸透的拭子插入样本提取管内溶液中，紧靠管内壁旋转约10次，同时沿管内壁适当挤压拭子的签头，使样本尽可能溶解在溶液中；取出并弃去拭子。
（4）将铝箔袋沿切口部位撕开，取出检测条平放，并做好标记。将检测条垂直插入样本提取管内的提取液中，液面勿超过MAX线，待液体爬至观察窗口时，取出检测条平放；15分钟内观察显示的结果，30分钟后显示的结果无效。
（5）检测结果(参见图2)，若硝酸纤维素膜3的检测区5出现一条肉眼可见的深色线(T线)，即表明样品中含有大量H7亚型禽流感病毒抗原，即说明受检验者的机体已经被H7亚型禽流感病毒感染(参考图2中的阳性)；若硝酸纤维素膜3的检测区5未出现一条肉眼可见的深色线，即表明样品中未含有大量的H7亚型禽流感病毒抗原，说明受检验者未被病毒感染(参考图图2中的阴性)；当样品通过硝酸纤维素膜3的检测区5移动至控制区6时，无论样品中有没有H7亚型禽流感病毒抗原，控制区6都会有一条深色线(C线)；若控制区6无色线出现，说明试纸条已经过期或操作有误(参考图2中的无效)。
（6）测试结束后，将使用后的试纸条、样本提取管和口腔取样器按生物医疗废弃物进行处理。
对比例1H7亚型禽流感病毒胶体金试纸条及其制备方法
一种H7亚型禽流感病毒胶体金试纸条与实施例4基本相同，区别在于制备方法步骤A中按常规步骤（不经过任何处理液预处理或者使用磷酸盐缓冲液处理）处理样品垫；利用本对比例1制得的试纸条检测H7亚型禽流感病毒抗原的方法参见实施例7。
对比例2试纸条的临床应用有效性
一、检测目的
本对比例2采用实施例7和检测H7亚型禽流感病毒抗原试剂对实验室确诊方法确认和核酸检测的样本进行盲法对比检测，来评价本实施例4和对比例1的临床应用有效性。
二、检测样品
本对比例2中检测样品为广东省第二人民医院（广东省应急医院）承担的临床样本经过实验室确诊方法确认为H7亚型流感病毒阴性样本208例。
三、检测结果
（1）实施例4所制得的试纸条对临床样品的检测结果，如表1：
表1实施例4试纸条对临床样品的检测结果
（2）实施例4制得的试纸条对临床交叉干扰样品的检测结果，如表2：
表2实施例4试纸条对临床交叉干扰样品的检测结果
样品类型 实验室确诊结果 实施例4结果 备注
咽拭子 - - 肺炎支原体弱阳
咽拭子 - - 肺炎支原体阳性
痰液拭子 - - 肺炎支原体阳性
由表1可知：实施例4所制得的试纸条，其检测结果与实验室确诊方法的阴性符合率为100%，即该试纸条特异性良好；
由表2可知：实施例4所制得的试纸条对肺炎支原体阳性样品无交叉干扰。
（3）对比例1制得的试纸条对临床样品的检测结果，如表3：
表3对比例1试纸条对临床样品的检测结果
（4）对比例1制得的试纸条对临床交叉干扰样品的检测结果，如表4：
表4对比例1试纸条对临床交叉干扰样品的检测结果
样品类型 实验室确诊结果 对比例1结果 备注
咽拭子 - - 肺炎支原体弱阳
咽拭子 - + 肺炎支原体阳性
痰液拭子 - + 肺炎支原体阳性
从表3可知：对比例1的检测结果与实验室确诊方法的阴性符合率为88%见表1，特异性良好；
从表4可知：对比例1制得的试纸条对肺炎支原体阳性样品出现交叉干扰，三个实验室确诊为肺炎支原体阳性的样品，对比例1制得的试纸条结果出现两个阳性。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (9)

1.一种样品垫处理液，其特征在于，所述处理液的配方为：聚乙二醇-200
8-20g，聚乙烯吡咯烷酮11-25g，牛血清白蛋白10-45g，屈立通X–100
0.5-30ml，吐温-200.8-15ml，叠氮钠0.1-1.1g，5mM-10mM磷酸盐缓冲液定容至1L，调节pH值9.5。
2.根据权利要求1所述的样品垫处理液，其特征在于，所述处理液的配方中聚乙二醇-20017-19g，聚乙烯吡咯烷酮18-22g，牛血清白蛋白13-17g，屈立通X–1001.5-2.5ml，吐温-207-9ml。
3.一种H7亚型禽流感病毒胶体金试纸条，其特征在于，所述试纸条由样品垫(1)、玻璃纤维膜(2)、硝酸纤维素膜(3)和吸水纸(4)顺次搭接粘贴在底板(7)上构成，所述样品垫是经权利要求1-2任一项所述的处理液进行处理的；所述玻璃纤维膜(2)涂有胶体金颗粒标记的H7亚型禽流感病毒外膜血凝素抗原的单克隆抗体，所述硝酸纤维素膜(3)包括检测区(5)和质控区(6)，所述检测区(5)包被有H7亚型禽流感病毒外膜血凝素抗原的单克隆抗体，所述质控区(6)包被有抗鼠IgG抗体。
4.根据权利要求3所述的H7亚型禽流感病毒胶体金试纸条，其特征在于，所述胶体金颗粒标记的H7亚型禽流感病毒外膜血凝素抗原的单克隆抗体的浓度为25-30μg/ml，在所述玻璃纤维膜上的用量为25.5-45.5μg/cm2。
5.根据权利要求4所述的H7亚型禽流感病毒胶体金试纸条，其特征在于，所述胶体金颗粒标记的H7亚型禽流感病毒外膜血凝素抗原的单克隆抗体的浓度为26-28μg/ml，在所述玻璃纤维膜上的用量为38-42μg/cm2。
6.根据权利要求3所述的H7亚型禽流感病毒胶体金试纸条，其特征在于，所述H7亚型禽流感病毒外膜血凝素抗原的单克隆抗体在所述检测区的用量为0.244-0.390μg/mm；所述抗鼠IgG抗体在所述质控区的用量为0.122-0.55μg/mm。
7.根据权利要求6所述的H7亚型禽流感病毒胶体金试纸条，其特征在于，所述H7亚型禽流感病毒外膜血凝素抗原的单克隆抗体在所述检测区的用量为0.3-0.34μg/mm；所述抗鼠IgG抗体在所述质控区的用量为0.4-0.5μg/mm。
8.一种如权利要求3-7任一项所述的H7亚型禽流感病毒胶体金试纸条的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
A、先将样品垫(1)浸泡于权利要求1-2任一项所述的样品垫处理液中，取出干燥，再加入干燥剂封存备用；
B、制备抗H7亚型禽流感病毒外膜血凝素抗原的单克隆抗体和抗鼠IgG抗体；
C、将1mL胶体金液中加步骤B所得的H7亚型禽流感病毒外膜血凝素抗原的单克隆抗体，得胶体金颗粒标记的H7亚型禽流感病毒外膜血凝素抗原的单克隆抗体，按25.5-45.5μg/cm2的用量喷在玻璃纤维膜(2)上，并于温度20-40℃，湿度10-30％条件下，干燥，备用；
D、将步骤B所得的H7亚型禽流感外膜血凝素抗原的单克隆病毒抗体用包被缓冲液稀释至浓度为0.7-1.4mg/ml；按0.244-0.390μg/mm的用量喷在硝酸纤维素膜(3)的检测区(5)，干燥，备用；将步骤B所得的抗鼠IgG抗体用包被缓冲液稀释至浓度为1.0-2.0mg/ml，按0.122-0.55μg/mm的用量喷在硝酸纤维素膜(3)的质控区(6)，干燥，备用；
E、将样品垫(1)、玻璃纤维膜(2)、硝酸纤维素膜(3)和吸水纸(4)按序粘贴于底板(7)上，即得。
9.根据权利要求8所述的H7亚型禽流感病毒胶体金试纸条的制备方法，其特征在于，所述步骤A为先将样品垫(1)浸泡于样品垫处理液中20-60min，取出于30-45℃干燥箱中干燥9-15h，后加入干燥剂封存备用。
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Families Citing this family (15)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104678098A (zh) * 2015-03-13 2015-06-03 苏州万木春生物技术有限公司 心肌肌钙蛋白i和心型脂肪酸结合蛋白联检试纸制备方法
CN105486859B (zh) * 2015-11-20 2019-03-15 润和生物医药科技(汕头)有限公司 一种新型改进免疫层析试纸条及其制备和应用
CN105891468A (zh) * 2016-04-08 2016-08-24 四川新健康成生物股份有限公司 一种样品释放垫处理液
CN106198970A (zh) * 2016-07-06 2016-12-07 聊城大学 一种快速检测h9n2亚型禽流感病毒的试剂盒
CN107389929A (zh) * 2017-09-06 2017-11-24 深圳市检验检疫科学研究院 一种h7亚型禽流感病毒荧光微球检测卡及其应用
CN107966561A (zh) * 2017-11-24 2018-04-27 德诺杰亿（北京）生物科技有限公司 一种检测hiv抗体的试纸条和试剂盒
CN110940806B (zh) * 2019-11-18 2021-05-11 广东医科大学附属医院 腺病毒和轮状病毒量子点联检试纸条及制备方法和应用
CN110954695B (zh) * 2019-11-18 2021-05-11 广东医科大学附属医院 诺如病毒gi和gii型量子点联检试纸条及其制备方法和应用
CN111856019A (zh) * 2020-02-04 2020-10-30 潍坊市康华生物技术有限公司 一种检测新型冠状病毒（2019-nCoV）抗原的试纸条、试剂盒及检测方法
CN111189821B (zh) * 2020-02-06 2021-01-29 江南大学 一种负载金纳米粒子的铜离子比色检测试纸
CN111443204A (zh) * 2020-02-25 2020-07-24 古镜科技(深圳)有限公司 一种毛发中毒品荧光三联检试纸条及其制备方法
CN111551744A (zh) * 2020-05-15 2020-08-18 安徽中起生物科技有限公司 新城疫病毒N蛋白IgY抗体胶体碳检测试纸及其应用
CN114264820A (zh) * 2021-12-22 2022-04-01 广东医科大学附属医院 一种流感病毒a型和b型量子点联检试纸条及其制备方法和应用
CN115754288B (zh) * 2022-11-15 2023-08-29 广东和信健康科技有限公司 一种样品垫处理液及其应用
CN115856326A (zh) * 2023-03-01 2023-03-28 山东康华生物医疗科技股份有限公司 一种25羟基维生素d检测试剂盒

Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1254844A (zh) * 1998-11-23 2000-05-31 普莱克斯生物系统股份有限公司 改进的侧流分析
CN101243321A (zh) * 2005-06-21 2008-08-13 美国政府健康及人类服务部，疾病控制和预防中心 用于检测抗-类脂抗体的方法、免疫测定法和装置
CN101556282A (zh) * 2008-04-09 2009-10-14 河南农业大学 烟草复合病毒田间快速检测试纸条及其制备方法
CN101893627A (zh) * 2010-07-08 2010-11-24 崔亚丽 金磁微粒标记免疫层析快速检测方法
CN102650642A (zh) * 2012-05-08 2012-08-29 上海师范大学 一种用于检测人视黄醇结合蛋白4的抗体复合物及免疫层析检测卡和试剂盒
CN102680695A (zh) * 2012-05-29 2012-09-19 西安金磁纳米生物技术有限公司 用于黄曲霉毒素检测的金磁微粒标记层析试纸条

Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1254844A (zh) * 1998-11-23 2000-05-31 普莱克斯生物系统股份有限公司 改进的侧流分析
CN101243321A (zh) * 2005-06-21 2008-08-13 美国政府健康及人类服务部，疾病控制和预防中心 用于检测抗-类脂抗体的方法、免疫测定法和装置
CN101556282A (zh) * 2008-04-09 2009-10-14 河南农业大学 烟草复合病毒田间快速检测试纸条及其制备方法
CN101893627A (zh) * 2010-07-08 2010-11-24 崔亚丽 金磁微粒标记免疫层析快速检测方法
CN102650642A (zh) * 2012-05-08 2012-08-29 上海师范大学 一种用于检测人视黄醇结合蛋白4的抗体复合物及免疫层析检测卡和试剂盒
CN102680695A (zh) * 2012-05-29 2012-09-19 西安金磁纳米生物技术有限公司 用于黄曲霉毒素检测的金磁微粒标记层析试纸条

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