CN115754288B - 一种样品垫处理液及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于医学检验技术领域，具体涉及一种样品垫处理液及其应用。该样品垫处理液，包含：封闭剂和反应增强剂中的至少一种；和缓冲液；所述封闭剂包含猪血清；所述反应增强剂包含CHAPS；其中，相对于每100mL的所述缓冲液，所述猪血清的添加量为0.5～20mL；和/或相对于每100mL的所述缓冲液，所述反应增强剂的添加量为0.1～20g。该样品垫处理液制备得到的试纸条的特异性和/或灵敏度得到显著提升。

Description

一种样品垫处理液及其应用

技术领域

本发明属于医学检验技术领域，具体涉及一种样品垫处理液及其应用。

背景技术

目前存在的胶体金试纸条，样品垫处理液常见成分主要是作为封闭剂的牛血清白蛋白、辅助病毒裂解以及加速液体流动辅助层析反应进行的表面活性剂、防腐剂以及氯化钠三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液体系。

影响胶体金试纸条的灵敏度和特异性的因素很多，其中与样品垫处理液相关的如下：①pH值的影响：胶体金与抗体通过静电吸附，容易被样品中的基质影响，过酸过碱过盐都会影响(常用的缓冲液包含 Tris-HCl缓冲液和PBS缓冲液)。②封闭剂的影响：呼吸道病毒抗原检测试剂容易受常见的微生物干扰，例如金黄色葡萄球菌，会分泌金黄色葡萄球菌A蛋白，该蛋白会与IgG抗体结合，造成假阳性结果，对试剂检测造成影响。使用不正确的封闭剂，不能有效抑制非特异性反应，而过量的封闭剂，亦会影响试剂的灵敏度，造成假阴性的现象。③水性流变助剂的影响：不同浓度的表面活性剂用于对水流速度的加速能力不同，会造成反应速率的不一致，影响胶体金标记抗体的溶解释放速度及膜面层析形态，对试剂反应造成影响。④反应增强剂的影响：由于胶体金试剂反应原理的影响，胶体金试剂灵敏度相对其它方法学较低，需要添加反应增强剂，增强试剂灵敏度。用量过大可能导致试剂假阳性现象的产生。

由于检测样本及项目的不同，使用现有的样品垫处理液应用于检测呼吸道病原体的试纸条时，均存在较大的问题，例如：胶体金试纸条的样品垫处理液对于病原体阴性和阳性样本均无法实现显色；对于阴性和阳性样本显色接近，阴阳样本区分度很差；样品垫处理后无法抑制非特异性反应，导致假阴性结果和假阳性结果等。因此，有必要开发一种用于呼吸道病原体检测试纸条的样品垫处理液。

发明内容

本发明第一方面的目的，在于提供一种样品垫处理液。

本发明第二方面的目的，在于提供一种样品垫。

本发明第三方面的目的，在于提供本发明第一方面的样品垫处理液和/或第二方面的样品垫在制备试纸条中的应用。

本发明第四方面的目的，在于提供一种试纸条。

本发明第五方面的目的，在于提供本发明第四方面的试纸条的制备方法。

本发明第六方面的目的，在于提供一种试剂盒。

本发明第七方面的目的，在于提供一种检测方法。

为了实现上述目的，本发明所采取的技术方案是：

本发明的第一个方面，提供一种样品垫处理液，包含：封闭剂和反应增强剂中的至少一种；和缓冲液；

所述封闭剂包含猪血清；

所述反应增强剂包含CHAPS；

其中，相对于每100mL的所述缓冲液，所述猪血清的添加量为0.5～20mL；和/或

相对于每100mL的所述缓冲液，所述反应增强剂的添加量为0.1～20g。

优选地，所述样品垫处理液包含封闭剂和缓冲液。

优选地，所述样品垫处理液包含反应增强剂和缓冲液。

优选地，所述样品垫处理液包含封闭剂、反应增强剂和缓冲液。

优选地，所述缓冲液包含Tris-HCL缓冲液、PBS缓冲液、硼酸盐缓冲液中的至少一种；进一步包含Tris-HCL 缓冲液。

优选地，所述缓冲液的浓度为0.001～1M；进一步为0.01～0.1M；更进一步为0.04～0.06M。

优选地，所述缓冲液的pH为7～10；进一步为7.5～8.5；更进一步为7.9～8.1。

优选地，所述封闭剂还包含牛血清白蛋白、酪蛋白、聚乙烯吡咯烷酮中的至少一种；进一步优选地，所述封闭剂还包含牛血清白蛋白、酪蛋白和聚乙烯吡咯烷酮。

优选地，所述聚乙烯吡咯烷酮包含PVP-K30、PVP-K40中的至少一种；进一步包含PVP-K40。

优选地，相对于每100mL的所述缓冲液，所述牛血清白蛋白的添加量为0.1～10g；进一步为0.5～2g；更进一步为0.8～1.2g。

优选地，相对于每100mL的所述缓冲液，所述酪蛋白的添加量为0.1～10g；进一步为0.1～1g；更进一步为0.4～0.6g。

优选地，相对于每100mL的所述缓冲液，所述聚乙烯吡咯烷酮的添加量为0.1～20g；进一步为5～15g；更进一步为9～11g。

优选地，相对于每100mL的所述缓冲液，所述猪血清的添加量为5～20mL；进一步为10～20mL。

猪血清的常规用途包括细胞培养、疫苗制备、构建疾病模型、免疫球蛋白提取分离。常规用途：猪血清可用于免疫球蛋白提取分离的原料。猪血清在染色体研究中表现非常出色，可用于淋巴细胞培养，疫苗生产 (生产支原体)，中和脂质体包裹的腺相关病毒(AAV)，用于诱导大鼠肝纤维化，作为酶联免疫吸附试验(ELISA)中的标准阴性参考。在生产中，猪血清常用于生产猪支原体肺炎灭活疫苗。因支原体对营养要求较高，常需在基础培养基中添加猪血清，以促进支原体的大量增殖。猪血清也是疫苗工业中支原体检查用培养基的添加成分。在科研中，猪血清常用于诱导大鼠肝纤维化，构建肝疾病模型。猪血清还可替代小牛血清，用于人外周血淋巴细胞的短期培养。发明人首次将猪血清作为封闭剂制备样品垫处理液，抑制非特异性反应，从而使采用该样品垫处理液的试纸条的特异性提升，并且不影响其灵敏度。

优选地，相对于每100mL的所述缓冲液，所述反应增强剂的添加量为0.6～20g；更进一步为15～20g。反应增强剂CHAPS(中文名：3-[3-(胆酰胺丙基)二甲氨基]丙磺酸内盐，CAS号：75621-03-3，分子式： C₃₂H₅₈N₂O₇S，分子量：614.8771)的常规用途为：非变性的两性离子型去垢剂、蛋白质裂解液，用于增溶膜蛋白和裂解蛋白-蛋白之间的相互作用。发明人首次将CHAPS作为反应增强剂剂制备样品垫处理液，从而使采用该样品垫处理液的试纸条的灵敏度性提升，并且不影响其特异性(不会造成假阳性的非特异性反应结果)。

优选地，所述样品垫处理液还包含水性流变助剂。

优选地，相对于每100mL的所述缓冲液，所述水性流变助剂的添加量为0.1～10mL；进一步为0.1～2mL；更进一步为0.8～1.2mL。

优选地，所述水性流变助剂包含曲拉通X-100、吐温20、表面活性剂s9、聚丙烯酸(PAA)、聚氧化乙烯 (PEO)、羟丙基甲基纤维素(HPMC)、溴甲酚绿乙醇中的至少一种；进一步包含吐温20。

优选地，所述样品垫处理液还包含防腐剂。

优选地，相对于每100mL的所述缓冲液，所述防腐剂的添加量为0.01～0.3mL；进一步为0.01～0.1mL；更进一步为0.02～0.04mL。

优选地，所述防腐剂包含Proclin 300、Proclin 900、叠氮钠(NaN₃)中的至少一种；进一步包含Proclin 300。

优选地，所述样品垫处理液用于提高试纸条的灵敏度和/或特异性。

优选地，所述试纸条用于检测呼吸道病原体；进一步用于检测人呼吸道病原体。

优选地，所述呼吸道病原体包含新型冠状病毒、甲型流感病毒、乙型流感病毒、呼吸道合胞病毒、呼吸道腺病毒中的至少一种；进一步包含甲型流感病毒、乙型流感病毒、呼吸道合胞病毒中的至少一种。

优选地，所述新型冠状病毒包含野生株、Alpha突变株、Beta突变株、Delta突变株、Omicron突变株中的至少一种。

优选地，所述甲型流感病毒包含H1N1、H3N2、H5N1、H7N9中的至少一种；进一步包含H1N1。

优选地，所述乙型流感病毒包含Victoria型、Yamagata型中的至少一种；进一步包含Yamagata型。

优选地，所述呼吸道合胞病毒包含RSV A型、RSV B型中的至少一种；进一步包含RSV B型。

优选地，所述呼吸道腺病毒包含ADV 1型、ADV 2型、ADV 3型、ADV 4型、ADV 5型、ADV 6型、ADV 7型、ADV 11型、ADV 14型、ADV 55型中的至少一种。

优选地，所述试纸条包含胶体金试纸条。

本发明的第二个方面，提供一种样品垫，包含本发明第一个方面的样品垫处理液，即所述样品垫采用第一个方面的样品垫处理液进行处理。

优选地，所述样品垫用于提高试纸条的灵敏度和/或特异性。

优选地，所述试纸条用于检测呼吸道病原体；进一步用于检测人呼吸道病原体。

优选地，所述呼吸道病原体包含新型冠状病毒、甲型流感病毒、乙型流感病毒、呼吸道合胞病毒、呼吸道腺病毒中的至少一种；进一步包含甲型流感病毒、乙型流感病毒、呼吸道合胞病毒中的至少一种。

优选地，所述新型冠状病毒包含野生株、Alpha突变株、Beta突变株、Delta突变株、Omicron突变株中的至少一种。

优选地，所述甲型流感病毒包含H1N1、H3N2、H5N1、H7N9中的至少一种；进一步包含H1N1。

优选地，所述乙型流感病毒包含Victoria型、Yamagata型中的至少一种；进一步包含Yamagata型。

优选地，所述呼吸道合胞病毒包含RSV A型、RSV B型中的至少一种；进一步包含RSV B型。

优选地，所述呼吸道腺病毒包含ADV 1型、ADV 2型、ADV 3型、ADV 4型、ADV 5型、ADV 6型、ADV 7型、ADV 11型、ADV 14型、ADV 55型中的至少一种。

优选地，所述试纸条包含胶体金试纸条。

本发明的第三个方面，提供提供本发明第一方面的样品垫处理液和/或第二方面的样品垫在制备试纸条中的应用。

优选地，所述试纸条用于检测呼吸道病原体；进一步用于检测人呼吸道病原体。

优选地，所述呼吸道病原体包含新型冠状病毒、甲型流感病毒、乙型流感病毒、呼吸道合胞病毒、呼吸道腺病毒中的至少一种；进一步包含甲型流感病毒、乙型流感病毒、呼吸道合胞病毒中的至少一种。

优选地，所述新型冠状病毒包含野生株、Alpha突变株、Beta突变株、Delta突变株、Omicron突变株中的至少一种。

优选地，所述甲型流感病毒包含H1N1、H3N2、H5N1、H7N9中的至少一种；进一步包含H1N1。

优选地，所述乙型流感病毒包含Victoria型、Yamagata型中的至少一种；进一步包含Yamagata型。

优选地，所述呼吸道合胞病毒包含RSV A型、RSV B型中的至少一种；进一步包含RSV B型。

优选地，所述呼吸道腺病毒包含ADV 1型、ADV 2型、ADV 3型、ADV 4型、ADV 5型、ADV 6型、ADV 7型、ADV 11型、ADV 14型、ADV 55型中的至少一种。

优选地，所述试纸条包含胶体金试纸条。

本发明的第四个方面，提供一种试纸条，包含本发明第一个方面的样品垫处理液和/或本发明第二个方面的样品垫。

优选地，一种试纸条，包含：底板、样品垫、结合垫、检测垫和吸水材料；

所述样品垫为本发明第二个方面的样品垫；或，所述样品垫包含本发明第一个方面的样品垫处理液；

所述结合垫包含金标蛋白；

所述检测垫包含检测线T和质控线C。

优选地，所述样品垫、结合垫、检测垫和吸水材料沿着样品流动方向依次相互叠加粘贴在底板上。

优选地，所述样品垫包含玻璃纤维素膜。

优选地，所述结合垫包含玻璃纤维素膜。

优选地，所述检测垫包含硝酸纤维素膜。

优选地，所述吸水材料包含吸水纸。

优选地，所述金标蛋白包含胶体金标记的抗体，所述抗体特异性结合待测抗原。

优选地，所述检测线T包含抗体，所述抗体特异性结合待测抗原。

优选地，所述质控线C包含IgG抗体。

优选地，所述试纸条用于检测呼吸道病原体；进一步用于检测人呼吸道病原体。

优选地，所述呼吸道病原体包含新型冠状病毒、甲型流感病毒、乙型流感病毒、呼吸道合胞病毒、呼吸道腺病毒中的至少一种；进一步包含甲型流感病毒、乙型流感病毒、呼吸道合胞病毒中的至少一种。

优选地，所述新型冠状病毒包含野生株、Alpha突变株、Beta突变株、Delta突变株、Omicron突变株中的至少一种。

优选地，所述甲型流感病毒包含H1N1、H3N2、H5N1、H7N9中的至少一种；进一步包含H1N1。

优选地，所述乙型流感病毒包含Victoria型、Yamagata型中的至少一种；进一步包含Yamagata型。

优选地，所述呼吸道合胞病毒包含RSV A型、RSV B型中的至少一种；进一步包含RSV B型。

优选地，所述呼吸道腺病毒包含ADV 1型、ADV 2型、ADV 3型、ADV 4型、ADV 5型、ADV 6型、ADV 7型、ADV 11型、ADV 14型、ADV 55型中的至少一种。

优选地，所述试纸条包含胶体金试纸条。

本发明的第五个方面，提供本发明第四个方面的试纸条的制备方法，包括如下步骤：

将本发明第一个方面的样品垫处理液涂布于样品垫上，得到包含样品垫处理液的样品垫；

将金标蛋白涂布于结合垫上，得到包含金标蛋白的结合垫；

分别将特异性结合待测抗原的抗体、IgG抗体包被于检测垫上，形成检测线T和质控线C，得到包含检测线T和质控线C的检测垫；

将包含样品垫处理液的样品垫、包含金标蛋白的结合垫、包含检测线T和质控线C的检测垫和吸水材料组装在底板上，得到试纸条。

本发明的第六个方面，提供一种试剂盒，包含：本发明第一个方面的样品垫处理液、本发明第二个方面的样品垫、本发明第四个方面的试纸条中的至少一种。

本发明的第七个方面，提供一种检测方法，包含采用本发明第六个方面的试剂盒的步骤。

本发明的有益效果是：

发明人首次发现将猪血清作为封闭剂制备样品垫处理液，可以抑制非特异性反应，从而使采用该样品垫处理液的试纸条的特异性提升，并且不影响其灵敏度；将CHAPS作为反应增强剂制备样品垫处理液，可以使采用该样品垫处理液的试纸条的灵敏度性提升，并且不影响其特异性(不会造成假阳性的非特异性反应结果)；基于此，本发明提供了一种样品垫处理液，包含：封闭剂和反应增强剂中的至少一种；和缓冲液；所述封闭剂包含猪血清；所述反应增强剂包含CHAPS；其中，相对于每100mL的所述缓冲液，所述猪血清的添加量为0.5～20mL；和/或相对于每100mL的所述缓冲液，所述反应增强剂的添加量为0.1～20g。该样品垫处理液制备得到的试纸条的特异性和/或灵敏度得到显著提升。

附图说明

图1是胶体金试纸的结构示意图。

图2是新冠抗原胶体金检测试纸条的反应前的示意图。

图3是新冠抗原胶体金检测试纸条的正常阴性反应示意图。

图4是新冠抗原胶体金检测试纸条的正常阳性反应示意图。

图5是新冠抗原胶体金检测试纸条的非特异性反应-假阳性示意图。

图6是新冠抗原胶体金检测试纸条的非特异性反应-假阴性示意图。

具体实施方式

术语解释：

胶体金：胶体金是由氯金酸(HAuCl₄)在还原剂如白磷、抗坏血酸、枸橼酸钠、鞣酸等作用下，可聚合成一定大小的金颗粒，并由于静电作用成为一种稳定的胶体状态，形成带负电的疏水胶溶液，由于静电作用而成为稳定的胶体状态，故称胶体金。胶体金在弱碱环境下带负电荷，可与蛋白质分子的正电荷基团形成牢固的结合，由于这种结合是静电结合，所以不影响蛋白质的生物特性。

胶体金免疫层析试纸：将特异性的抗原或抗体以条带状固定在膜上，胶体金标记试剂(抗体或单克隆抗体) 吸附在结合垫上，当待检样本加到试纸条一端的样本垫上后，通过毛细作用向前移动，溶解结合垫上的胶体金标记试剂后相互反应，再移动至固定的抗原或抗体的区域时，待检物与金标试剂的结合物又与之发生特异性结合而被截留，聚集在检测带上，可通过肉眼观察到显色结果。该法现已发展成为诊断试纸条，使用十分方便。

呼吸道病原体：流感病毒A(IA)，流感病毒B(IB)，呼吸道合胞病毒(RSV)和呼吸道腺病毒(ADV)、副流感 1,2,3、偏肺病毒、博卡病毒、冠状病毒、鼻病毒、肠道病毒、支原体、衣原体是引起呼吸道疾病的主要病原体。其中流感病毒A，流感病毒B，呼吸道合胞病毒和呼吸道腺病毒最为常见，约占呼吸道疾病的病毒性病原体的50％。为了更加快速和灵敏检测呼吸道病毒，合理使用各种抗生素，和治疗流感的新抗病毒药物的使用，早期检测和辨别感染病毒变得非常重要。

新型冠状病毒属于β属的冠状病毒，有包膜，颗粒呈圆形或椭圆形，常为多形性，直径60～140nm。其基因特征与SARSr-CoV和MERSr-CoV有明显区别。目前研究显示与蝙蝠SARS样冠状病毒(ba t-SL-CoVZC45)同源性达85％以上。体外分离培养时，2019-nCoV 96个小时左右即可在人呼吸道上皮细胞内发现，而在Vero E6和Huh-7细胞系中分离培养需约6天。根据对2019-nCoV和MERS-CoV的研究，冠状病毒对热敏感，保持56℃30分钟、乙醚、75％乙醇、含氯消毒剂、过氧乙酸和氯仿等脂溶剂均可有效灭活病毒。氯己定不能有效灭活病毒。

样品垫：样品垫是检测试纸条的一个重要组成部分，样品垫在使用前需要通过样品垫处理液进行处理。

胶体金试纸常规构造：试纸包括内部试纸条和适配的外部卡壳(图1)。试纸条组成：PVC底板以及依次搭接在PVC底板上的样品垫、金标垫(结合垫)、NC膜(检测垫、硝酸纤维素膜)、吸水纸(吸水材料)，其中，金标垫(结合垫)上附着有胶体金偶联的蛋白抗体/抗原，PVC底板上附着有抗体/抗原。外部卡壳包含塑料卡壳上盖和塑料卡壳底壳。

新冠抗原胶体金检测试纸条反应原理

本试剂采用免疫层析技术，采用双抗体夹心法检测新型冠状病毒(2019-nCoV)抗原。检测时，将处理后的待测样本滴加至测试卡的加样孔后，当待测样本中含有新型冠状病毒(2019-nCoV)抗原且抗原浓度高于最低检出限时，病毒抗原先和标记抗体形成反应复合物，在层析作用下，反应复合物沿着硝酸纤维素膜向前移动，被硝酸纤维素膜上检测区(T)预先包被的新型冠状病毒(2019-nCoV)核蛋白单克隆抗体捕获，在检测区上最终形成一条粉红色/紫红色反应线，此时结果为阳性；相反，当待测样本中不含病毒抗原或者抗原浓度低于最低检出限时，则检测区无粉红色/紫红色反应线出现，此时结果为阴性。无论样本是否含有病毒抗原，质控区(C)都会形成一条粉红色/紫红色反应线，质控区(C)内所显现的粉红色/紫红色反应线是判定层析过程是否正常的标准。

反应前示意图如图2所示；正常阴性反应示意图(样本中不含病原体，T线不显示)如图3所示；正常阳性反应示意图(样本中含病原体，T线显色)如图4所示；非特异性反应-假阳性示意图(样本中不含病原体，含有其他干扰物质，T线显色，假阳性)如图5所示；非特异性反应-假阴性示意图(样本中含病原体，含有其他干扰物质，T线不显示，假阴性)如图6所示。

胶体金试纸制备方法：①胶体金溶液的制备：以氯金酸溶液和柠檬酸三钠水溶液为原料，制备含有粒径为 10～30nm的胶体金颗粒的胶体金溶液；②胶体金溶液标记待测病原体单抗：将步骤①中的胶体金溶液离心后弃上清液，沉淀用pH为8.0～8.5的碳酸钾溶液重新悬浮；将待测病原体单克隆抗体0.04～0.1mg加入到胶体金溶液中，搅拌均匀后静置；逐滴加入质量浓度为8～12％的无菌牛血清白蛋白，搅拌后室温静置得标记后的胶体金溶液；将标记后的胶体金溶液再次离心，弃上清液，沉淀用4～6ml重悬液复溶，得到胶体金标记的待测病原体单克隆抗体溶液；③：金标垫制备：将胶体金标记后的待测病原体单抗用专用处理液稀释，涂布于玻璃纤维素膜上，烘干，制备金标垫；④：底板制备：将硝酸纤维素膜黏贴到PVC 底板的固定位置上，将吸水纸黏贴到PVC底板固定位置上，然后在硝酸纤维素膜上包被C线与T线抗体，烘干，制备底板；⑤样品垫制备：配制样品垫处理液，使用浸纸压垫机对玻璃纤维素膜进行样品垫处理液涂布，涂布浓度为35ml/张样品垫(20*30cm规格)，烘干处理制得样品垫；⑥胶体金免疫试纸条的组装：将金标垫、样品垫搭接到底板上；⑦胶体金免疫测试卡组装：将试纸条嵌入塑料卡壳内。

以下通过具体的实施例对本发明的内容作进一步详细的说明。

应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。

下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。本实施例中所使用的材料、试剂等，如无特别说明，为从商业途径得到的试剂和材料。

实施例1一种样品垫处理液

一种样品垫处理液，包含：pH为8、0.05M的Tris-HCl缓冲液、牛血清白蛋白、Proclin 300、3-[(3- 胆酰胺丙基)二甲氨基]丙磺酸内盐(CHAPS)、吐温20、聚乙烯吡咯烷酮K40(PVP-K40)、酪蛋白和猪血清；

其中，相对于每100mL Tris-HCl缓冲液，添加牛血清白蛋白1g，Proclin 3000.03mL，CHAPS 0.6g，吐温20 1mL，PVP-K40 10g，酪蛋白0.5g，猪血清10mL。

实施例2一种样品垫处理液

一种样品垫处理液，包含：pH为8、0.05M的Tris-HCl缓冲液、牛血清白蛋白、Proclin 300、3-[(3- 胆酰胺丙基)二甲氨基]丙磺酸内盐(CHAPS)、吐温20、聚乙烯吡咯烷酮K40(PVP-K40)、酪蛋白和猪血清；

其中，相对于每100mLTris-HCl缓冲液，添加牛血清白蛋白1g，Proclin 3000.03mL，CHAPS 0.1g，吐温20 1mL，PVP-K40 10g，酪蛋白0.5g，猪血清0.5mL。

实施例3一种样品垫处理液

一种样品垫处理液，包含：pH为8、0.05M的Tris-HCl缓冲液、牛血清白蛋白、Proclin 300、3-[(3- 胆酰胺丙基)二甲氨基]丙磺酸内盐(CHAPS)、吐温20、聚乙烯吡咯烷酮K40(PVP-K40)、酪蛋白和猪血清；

其中，相对于每100mL Tris-HCl缓冲液，添加牛血清白蛋白1g，Proclin 3000.03mL，CHAPS 20g，吐温20 1mL，PVP-K40 10g，酪蛋白0.5g，猪血清20mL。

实施例4一种样品垫处理液

实施例4的样品垫处理液与实施例1相同，区别仅在于：不包含CHAPS；相对于每100mL Tris-HCl 缓冲液，添加猪血清0.5mL。

实施例5一种样品垫处理液

实施例5的样品垫处理液与实施例1相同，区别仅在于：不包含CHAPS。

实施例6一种样品垫处理液

实施例6的样品垫处理液与实施例1相同，区别仅在于：不包含CHAPS；相对于每100mL Tris-HCl 缓冲液，添加猪血清20mL。

实施例7一种样品垫处理液

实施例7的样品垫处理液与实施例1相同，区别仅在于：不包含猪血清；相对于每100mL Tris-HCl 缓冲液，添加CHAPS 0.1g。

实施例8一种样品垫处理液

实施例8的样品垫处理液与实施例1相同，区别仅在于：不包含猪血清。

实施例9一种样品垫处理液

实施例9的样品垫处理液与实施例1相同，区别仅在于：不包含猪血清；相对于每100mL Tris-HCl 缓冲液，添加CHAPS 20g。

实施例10一种样品垫处理液

实施例10的样品垫处理液与实施例2相同，区别仅在于：猪血清替换为兔血清。

实施例11一种样品垫处理液

实施例11的样品垫处理液与实施例3相同，区别仅在于：猪血清替换为兔血清。

实施例12一种样品垫处理液

实施例12的样品垫处理液与实施例1相同，区别仅在于：猪血清替换为兔血清。

实施例13一种样品垫处理液

实施例13的样品垫处理液与实施例1相同，区别仅在于：将CHAPS替换为曲拉通X-100；相对于每 100mL Tris-HCl缓冲液，添加猪血清0.5mL。

实施例14一种样品垫处理液

实施例14的样品垫处理液与实施例1相同，区别仅在于：将CHAPS替换为曲拉通X-100。

实施例15一种样品垫处理液

实施例15的样品垫处理液与实施例1相同，区别仅在于：将CHAPS替换为曲拉通X-100；相对于每 100mL Tris-HCl缓冲液，添加猪血清20mL。

对比例1一种样品垫处理液

对比例1的样品垫处理液与实施例1相同，区别仅在于：不包含CHAPS和猪血清。

对比例2一种样品垫处理液

对比例2的样品垫处理液与实施例4相同，区别仅在于：将猪血清替换为兔血清。

对比例3一种样品垫处理液

对比例3的样品垫处理液与实施例5相同，区别仅在于：将猪血清替换为兔血清。

对比例4一种样品垫处理液

对比例4的样品垫处理液与实施例6相同，区别仅在于：将猪血清替换为兔血清。

对比例5一种样品垫处理液

对比例5的样品垫处理液与实施例7相同，区别仅在于：将CHAPS替换为曲拉通X-100。

对比例6一种样品垫处理液

对比例6的样品垫处理液与实施例8相同，区别仅在于：将CHAPS替换为曲拉通X-100。

对比例7一种样品垫处理液

对比例7的样品垫处理液与实施例9相同，区别仅在于：将CHAPS替换为曲拉通X-100。

效果实施例1

1.本效果实施例中的实验用材料：

1)交叉病原体样本：由我司培养或合作单位提供(表4)。

2)正常人样本：来源于我司健康员工采集的鼻拭子共20例(表3)，经达安基因的新冠PCR试剂(注册证编号：国械注准20203400063)检测为阴性。

3)试验弱阳性样本：将来源于援鄂支援服务队采集的湖北新冠患者的鼻拭子2份(表1)合并成为1 份并稀释至弱阳性浓度(CT30)后作为阳性样本，将交叉病原体与阳性样本1:1(v/v)混合成为试验弱阳性样本。

4)试验阴性基质样本：由采集的健康员工鼻拭子样本多份(表2)经达安基因的新冠PCR试剂(注册证编号：国械注准20203400063)检测为阴性后合并成一份作为阴性样本，将交叉病原体与阴性样本1:1 混合成为试验阴性样本。

5)不同型别灭活毒株样本：来源于合作单位提供(表5)。

表1新冠阳性临床样本来源及信息

表2阴性基质样本来源及信息

表3交叉反应健康人阴性样本确认结果

表4交叉反应病原体来源及浓度

/>

/>

/>

表5不同型别毒株来源及浓度

2.分别采用实施例和对比例的样品垫处理液制备新型冠状病毒(2019-nCoV)抗原胶体金检测试纸，具体如下：

①胶体金溶液的制备：将所需用到的圆底烧瓶、量筒用洗洁精洗涮干净，清洗至玻璃器皿无水珠挂壁现象，再用纯水冲涮至少三次。取已按要求清洗干净的圆底烧瓶，倒入适量2/3烧瓶容量的纯水，同时放入搅拌子，将烧瓶置于控温磁力搅拌器上加热，加热至水沸腾约3min后停止加热，将烧瓶里的沸水倒掉，搅拌子留于瓶内，烧瓶再用适量的超纯水润洗3次，倒干净瓶内的水，煮瓶完成。用已清洗干净的量筒量取100mL超纯水加入到烧瓶中，再加入1(w/v)％氯金酸4mL，开启控温磁力搅拌器，将搅拌转速调至2r/s, 温度调至300℃，加热待沸腾。待烧瓶溶液开始产生上升气泡时开始计时，约40s后水开始沸腾，此时加入预热至37℃的2(w/v)％柠檬酸钠溶液2mL，适当加大转速，继续搅拌加热3min。关闭控温磁力搅拌器停止加热，取出烧瓶，将所烧制的金溶胶放置于室温冷却，冷却后转移至干净的试剂瓶中。金溶胶色泽应为酒红色纯净液体；

②胶体金溶液标记鼠抗新型冠状病毒抗原单克隆抗体：将步骤①中的胶体金溶液离心后弃上清液，沉淀用pH为8.0～8.5的碳酸钾溶液重新悬浮，悬浮后胶体金浓度为0.04g/100mL；将待测病原体单克隆抗体 (来源于广州锐达生物科技有限公司的鼠抗新型冠状病毒抗原单克隆抗体M0171)0.06mg加入到胶体金溶液中，搅拌均匀后静置；逐滴加入质量浓度为10％的无菌牛血清白蛋白，搅拌后室温静置得标记后的胶体金溶液；将标记后的胶体金溶液再次离心，弃上清液，沉淀用5mL重悬液(pH8.0硼酸缓冲液，含2. 5(w/v)％蔗糖，1(w/v)％酪蛋白和5(v/v)％曲拉通)复溶，得到胶体金标记的鼠抗新型冠状病毒抗原单克隆抗体溶液；

③金标垫制备：将胶体金标记后的鼠抗新型冠状病毒抗原单克隆抗体用专用处理液(pH8.0硼酸缓冲液，含2.5(w/v)％蔗糖，1(w/v)％酪蛋白和5(v/v)％曲拉通)稀释4倍，涂布于玻璃纤维素膜上，烘干，制备金标垫；

④底板制备：将硝酸纤维素膜黏贴到PVC底板的固定位置上，将吸水纸黏贴到PVC底板固定位置上，然后在硝酸纤维素膜上包被C线(来源于广州锐达生物科技有限公司的羊抗鼠IgG多克隆抗体GZ003)与 T线抗体(来源于广州锐达生物科技有限公司的鼠抗新型冠状病毒抗原单克隆抗体M0172)(C线抗体用量：底板长度30cm，宽度为8cm，划线量0.7μL/cm，划线浓度1mg/mL，合计21μg/张底板；T线抗体用量：底板长度30cm，宽度为8cm，划线量0.7μL/cm，划线浓度1mg/mL，合计21μg/张底板)，烘干，制备底板；

⑤样品垫制备：分别取实施例和对比例的样品垫处理液，使用浸纸压垫机对玻璃纤维素膜进行样品垫处理液涂布，涂布浓度为35mL/张样品垫(20*30cm规格)，烘干处理制得样品垫；

⑥胶体金免疫试纸条的组装：将金标垫、样品垫搭接到底板上；

⑦胶体金免疫测试卡组装：将试纸条嵌入塑料卡壳内。

3.实施例和对比例的样品垫处理液制备的新型冠状病毒(2019-nCoV)抗原胶体金检测试纸检测结果

(1)实施例7～12和对比例1～4的样品垫处理液制备的新型冠状病毒(2019-nCoV)抗原胶体金检测试纸检测结果

1)特异性

采用实施例7～12和对比例1～4的样品垫处理液制备的新型冠状病毒(2019-nCoV)抗原胶体金检测试纸检测试验弱阳性样本以及试验阴性样本(交叉病原体如表6、7所示)，具体如下：样本处理液(0.05 M Tris-HCl缓冲液+1％质量体积比的TritonX-100+1％质量体积比的氯化钠)和试验用样本通过体积比1:1 进行混合。检测试纸平放在水平桌面上，将混合后的样本加入到待测试纸的加样孔内，每孔加样80μl体积的样本。等待15分钟后观察结果。

表6对比例1～4、实施例7的样品垫处理液制备的新型冠状病毒(2019-nCoV)抗原胶体金检测试纸的特异性检测结果

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注：“+”表示阳性结果；“-”表示阴性结果；“/”表示不进行检测。

表7实施例8～12的样品垫处理液制备的新型冠状病毒(2019-nCoV)抗原胶体金检测试纸的特异性检测结果

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/>

注：“+”表示阳性结果；“-”表示阴性结果。

2)灵敏度

采用实施例7～12和对比例1～4的样品垫处理液制备的新型冠状病毒(2019-nCoV)抗原胶体金检测试纸检测不同型别灭活毒株样本。

表8对比例1～4、实施例7～12的样品垫处理液制备新型冠状病毒(2019-nCoV)抗原胶体金检测试纸的灵敏度检测结果

/>

备注：结果判读根据下列标准，“+”表示阳性结果，数量表示阳性强度；“-”表示阴性结果；“±”表示弱阳性结果。

特异性结果如表6、7所示，灵敏度结果如表8所示：未添加兔血清的样品垫处理液(对比例1)，检测结果出现许多假阳性结果(高达4个)，而添加兔血清的样品垫处理液(对比例2～4、实施例7～12) 依旧出现假阳性(高达4个)，表明兔血清对检测试纸的非特异性反应无抑制作用；与未添加CHAPS的样品垫处理液(对比例1～4)，添加CHAPS的样品垫处理液(实施例7～12)的灵敏度显著增加，其中，C HAPS浓度为20g/mL时，灵敏度最强，检测限低至1.25×10²TCID₅₀/mL，表明CHAPS可提高灵敏度。

(2)实施例4～6、13～15、对比例1、5～7的样品垫处理液制备的新型冠状病毒(2019-nCoV)抗原胶体金检测试纸检测结果

1)特异性

采用实施例4～6、13～15、对比例1、5～7的样品垫处理液制备的新型冠状病毒(2019-nCoV)抗原胶体金检测试纸检测试验弱阳性样本以及试验阴性样本(交叉病原体如表9、10所示)。

表9对比例1、实施例4～6、对比例5的样品垫处理液制备的新型冠状病毒(2019-nCoV)抗原胶体金检测试纸的特异性检测结果

/>

/>

注：“+”表示阳性结果；“-”表示阴性结果。

表10对比例6～7、实施例13～15的样品垫处理液制备的新型冠状病毒(2019-nCoV)抗原胶体金检测试纸的特异性检测结果

/>

注：“+”表示阳性结果；“-”表示阴性结果。

2)灵敏度

采用实施例4～6、13～15、对比例1、5～7的样品垫处理液制备的新型冠状病毒(2019-nCoV)抗原胶体金检测试纸检测不同型别灭活毒株样本。

表11对比例4～6、13～15、对比例1、5～7的样品垫处理液制备的新型冠状病毒(2019-nCoV)抗原胶体金检测试纸的灵敏度检测结果

/>

备注：结果判读根据下列标准，“+”表示阳性结果，数量表示阳性强度；“-”表示阴性结果；“±”表示弱阳性结果。

特异性结果如表9、10所示，灵敏度结果如表11所示：未添加猪血清的样品垫处理液(对比例1、5～ 7)，检测结果出现许多假阳性结果(高达4个)，而添加猪血清的样品垫处理液(实施例4～6、13～15) 假阳性显著减少(甚至不出现假阳性)，表明猪血清对检测试纸的非特异性反应有抑制作用；与未添加曲拉通X-100的样品垫处理液(对比例1、实施例4～6)，添加曲拉通X-100的样品垫处理液(对比例5～7、实施例13～15)的灵敏度基本无变化，表明曲拉通X-100无法提高灵敏度。

(3)实施例1～9、对比例1的样品垫处理液制备的新型冠状病毒(2019-nCoV)抗原胶体金检测试纸检测结果

1)特异性

采用实施例1～9、对比例1的样品垫处理液制备的新型冠状病毒(2019-nCoV)抗原胶体金检测试纸检测试验弱阳性样本以及试验阴性样本(交叉病原体如表12、13所示)。

表12实施例4～7、对比例1的样品垫处理液制备的新型冠状病毒(2019-nCoV)抗原胶体金检测试纸的特异性检测结果

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/>

注：“+”表示阳性结果；“-”表示阴性结果。

表13实施例1～3、8～9的样品垫处理液制备的新型冠状病毒(2019-nCoV)抗原胶体金检测试纸的特异性检测结果

/>

/>

注：“+”表示阳性结果；“-”表示阴性结果。

2)灵敏度

采用实施例1～9、对比例1的样品垫处理液制备的新型冠状病毒(2019-nCoV)抗原胶体金检测试纸检测不同型别灭活毒株样本。

表14实施例1～9、对比例1的样品垫处理液制备的新型冠状病毒(2019-nCoV)抗原胶体金检测试纸的灵敏度检测结果

/>

备注：结果判读根据下列标准，“+”表示阳性结果，数量表示阳性强度；“-”表示阴性结果；“±”表示弱阳性结果。

特异性结果如表12、13所示，灵敏度结果如表14所示：未添加猪血清的样品垫处理液(对比例1、实施例7～9)，检测结果出现许多假阳性结果(高达4个)，而添加猪血清的样品垫处理液(实施例1～6) 假阳性显著减少(甚至不出现假阳性)，表明猪血清对检测试纸的非特异性反应有抑制作用；与未添加CH APS的样品垫处理液(对比例1、实施例4～6)，添加CHAPS的样品垫处理液(实施例1～3、实施例7～ 9)的灵敏度显著增加，其中，CHAPS浓度为20g/mL时，灵敏度最强，检测限低至1.25×10²TCID₅₀/mL，表明CHAPS可提高灵敏度。

效果实施例2

1.本效果实施例中的实验用材料：

1)交叉病原体样本：由我司培养或合作单位提供(表4，去除甲流病毒，加上新冠病毒)。

2)正常人样本：来源于我司健康员工采集的口咽拭子共20例(表16)，经圣湘生物科技股份有限公司的六项呼吸道病原体PCR检测试剂盒(注册证编号：国械注准20213400256)检测为阴性。

3)试验弱阳性样本：甲型流感病毒培养物(表17)添加到阴性样本(步骤4)中的试验阴性基质样本，甲型流感病毒稀释至1×10⁵TCID₅₀/mL)，中制备试验弱阳性样本。

4)试验阴性基质样本：由采集的健康员工口咽拭子样本多份(表15)经圣湘生物科技股份有限公司的六项呼吸道病原体PCR检测试剂盒(注册证编号：国械注准20213400256)检测为阴性后合并成一份作为阴性样本，将交叉病原体与阴性样本1:1混合成为试验阴性样本。

5)不同型别灭活毒株样本：由我司培养或合作单位提供(表17)。

表15阴性基质样本来源及信息

表16交叉反应健康人阴性样本确认结果

/>

表17病毒培养物

2.分别采用实施例和对比例的样品垫处理液制备甲型流感病毒抗原胶体金检测试纸，具体如下：

①胶体金溶液的制备：将所需用到的圆底烧瓶、量筒用洗洁精洗涮干净，清洗至玻璃器皿无水珠挂壁现象，再用纯水冲涮至少三次。取已按要求清洗干净的圆底烧瓶，倒入适量2/3烧瓶容量的纯水，同时放入搅拌子，将烧瓶置于控温磁力搅拌器上加热，加热至水沸腾约3min后停止加热，将烧瓶里的沸水倒掉，搅拌子留于瓶内，烧瓶再用适量的超纯水润洗3次，倒干净瓶内的水，煮瓶完成。用已清洗干净的量筒量取100ml超纯水加入到烧瓶中，再加入1w/v％(每100ml含1g)氯金酸4mL，开启控温磁力搅拌器，将搅拌转速调至2r/s,温度调至300℃，加热待沸腾。待烧瓶溶液开始产生上升气泡时开始计时，约40s后水开始沸腾，此时加入预热至37℃的2w/v％(2g/100mL)柠檬酸钠溶液2mL，适当加大转速，继续搅拌加热3min。关闭控温磁力搅拌器停止加热，取出烧瓶，将所烧制的金溶胶放置于室温冷却，冷却后转移至干净的试剂瓶中。金溶胶色泽应为酒红色纯净液体。

②胶体金溶液标记鼠抗甲型流感病毒NP蛋白单克隆抗体：将步骤①中的胶体金溶液离心后弃上清液，沉淀用pH为8.0～8.5的碳酸钾溶液重新悬浮，悬浮后胶体金浓度为0.04g/100mL；将待测病原体单克隆抗体(来源于广州锐达生物科技有限公司的鼠抗甲型流感病毒NP蛋白单克隆抗体M0001-6)0.06mg加入到胶体金溶液中，搅拌均匀后静置；逐滴加入质量浓度为10％的无菌牛血清白蛋白，搅拌后室温静置得标记后的胶体金溶液；将标记后的胶体金溶液再次离心，弃上清液，沉淀用5mL重悬液(pH8.0硼酸缓冲液，含2.5(w/v)％蔗糖，1(w/v)％酪蛋白和5(v/v)％曲拉通)复溶，得到胶体金标记的鼠抗甲型流感病毒NP蛋白单克隆抗体溶液；

③胶体金溶液标记兔IgG多克隆抗体：将步骤①中的胶体金溶液离心后弃上清液，沉淀用pH为8.0～ 8.5的碳酸钾溶液重新悬浮，悬浮后胶体金浓度为0.04g/100mL；将质控抗体(来源于广州锐达生物科技有限公司的兔IgG多克隆抗体M0145-1)0.06mg加入到胶体金溶液中，搅拌均匀后静置；逐滴加入质量浓度为10％的无菌牛血清白蛋白，搅拌后室温静置得标记后的胶体金溶液；将标记后的胶体金溶液再次离心，弃上清液，沉淀用5mL重悬液(pH8.0硼酸缓冲液，含2.5(w/v)％蔗糖，1(w/v)％酪蛋白和5(v/v)％曲拉通) 复溶，得到胶体金标记的兔IgG多克隆抗体溶液；

④金标垫制备：将胶体金标记后的鼠抗甲型流感病毒NP蛋白单克隆抗体和胶体金标记的兔IgG多克隆抗体用专用处理液(pH8.0硼酸缓冲液，含2.5％蔗糖，1％酪蛋白和5％曲拉通)稀释4倍，涂布于玻璃纤维素膜上，烘干，制备金标垫；

⑤底板制备：将硝酸纤维素膜黏贴到PVC底板的固定位置上，将吸水纸黏贴到PVC底板固定位置上，然后在硝酸纤维素膜上包被C线(来源于广州锐达生物科技有限公司的羊抗兔IgG多克隆抗体M0145-2) 与T线抗体(来源于广州锐达生物科技有限公司的鼠抗甲型流感病毒NP蛋白单克隆抗体M0001)(C线抗体用量：底板长度30cm，宽度为8cm，划线量0.7μL/cm，划线浓度1mg/mL，合计21μg/张底板；T线抗体用量：底板长度30cm，宽度为8cm，划线量0.7μL/cm，划线浓度1mg/mL，合计21μg/张底板)，烘干，制备底板；

⑥样品垫制备：配制样品垫处理液，使用浸纸压垫机对玻璃纤维素膜进行样品垫处理液涂布，涂布浓度为35mL/张样品垫(20*30cm规格)，烘干处理制得样品垫；

⑦胶体金免疫试纸条的组装：将金标垫、样品垫搭接到底板上；

⑧胶体金免疫测试卡组装：将试纸条嵌入塑料卡壳内。

3.实施例和对比例的样品垫处理液制备的甲型流感病毒抗原胶体金检测试纸检测结果

(1)实施例1～9、对比例1的样品垫处理液制备的甲型流感病毒抗原胶体金检测试纸检测结果

1)特异性

采用实施例1～9、对比例1的样品垫处理液制备的甲型流感病毒抗原胶体金检测试纸检测试验弱阳性样本以及试验阴性样本(交叉病原体如表18、19所示)，具体如下：样本处理液和试验用样本通过体积比 1:1进行混合。检测试纸平放在水平桌面上，将混合后的样本加入到待测试纸的加样孔内，每孔加样80μl 体积的样本。等待15分钟后观察结果。

表18实施例4～7、对比例1的样品垫处理液制备的甲型流感病毒抗原胶体金检测试纸的特异性检测结果

/>

注：“+”表示阳性结果；“-”表示阴性结果。

表19实施例1～3、8～9的样品垫处理液制备的甲型流感病毒抗原胶体金检测试纸的特异性

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/>

注：“+”表示阳性结果；“-”表示阴性结果。

2)灵敏度

采用实施例1～9、对比例1的样品垫处理液制备的甲型流感病毒抗原胶体金检测试纸检测不同型别灭活毒株样本。

表20实施例1～9、对比例1的样品垫处理液制备的甲型流感病毒抗原胶体金检测试纸的灵敏度检测结果

/>

备注：结果判读根据下列标准，“+”表示阳性结果，数量表示阳性强度；“-”表示阴性结果；“±”表示弱阳性结果。

特异性结果如表18、19所示，灵敏度结果如表20所示：未添加猪血清的样品垫处理液(对比例1、实施例7～9)，检测结果出现许多假阳性结果(高达5个)，而添加猪血清的样品垫处理液(实施例1～6) 假阳性显著减少(甚至不出现假阳性)，表明猪血清对检测试纸的非特异性反应有抑制作用；与未添加CH APS的样品垫处理液(对比例1、实施例4～6)，添加CHAPS的样品垫处理液(实施例1～3、实施例7～ 9)的灵敏度显著增加，其中，CHAPS浓度为20g/mL时，灵敏度最强，表明CHAPS可提高灵敏度。

效果实施例3

1.本效果实施例中的实验用材料：

1)交叉病原体样本：由我司培养或合作单位提供(表4，去除乙流病毒，加上新冠病毒)。

2)正常人样本：来源于我司健康员工采集的口咽拭子共20例(表16)，经圣湘生物科技股份有限公司的六项呼吸道病原体PCR检测试剂盒(注册证编号：国械注准20213400256)检测为阴性。

3)试验弱阳性样本：乙型流感病毒培养物(表21)添加到阴性样本(步骤4)中的试验阴性基质样本，乙型流感病毒稀释至1×10⁵TCID₅₀/mL)中制备弱阳性样本。

4)试验阴性基质样本：由采集的健康员工口咽拭子样本多份(表15)经圣湘生物科技股份有限公司的六项呼吸道病原体PCR检测试剂盒(注册证编号：国械注准20213400256)检测为阴性后合并成一份作为阴性样本，将交叉病原体与阴性样本1:1混合成为试验阴性样本。

5)不同型别灭活毒株样本：由我司培养或合作单位提供(表21)。

表21病毒培养物

2.分别采用实施例和对比例的样品垫处理液制备乙型流感病毒抗原胶体金检测试纸，具体如下：

①胶体金溶液的制备：将所需用到的圆底烧瓶、量筒用洗洁精洗涮干净，清洗至玻璃器皿无水珠挂壁现象，再用纯水冲涮至少三次。取已按要求清洗干净的圆底烧瓶，倒入适量2/3烧瓶容量的纯水，同时放入搅拌子，将烧瓶置于控温磁力搅拌器上加热，加热至水沸腾约3min后停止加热，将烧瓶里的沸水倒掉，搅拌子留于瓶内，烧瓶再用适量的超纯水润洗3次，倒干净瓶内的水，煮瓶完成。用已清洗干净的量筒量取100ml超纯水加入到烧瓶中，再加入1w/v％氯金酸4mL，开启控温磁力搅拌器，将搅拌转速调至2r/s, 温度调至300℃，加热待沸腾。待烧瓶溶液开始产生上升气泡时开始计时，约40s后水开始沸腾，此时加入预热至37℃的2w/v％柠檬酸钠溶液2mL，适当加大转速，继续搅拌加热3min。关闭控温磁力搅拌器停止加热，取出烧瓶，将所烧制的金溶胶放置于室温冷却，冷却后转移至干净的试剂瓶中。金溶胶色泽应为酒红色纯净液体。

②胶体金溶液标记鼠抗乙型流感病毒NP蛋白单克隆抗体：将步骤①中的胶体金溶液离心后弃上清液，沉淀用pH为8.0～8.5的碳酸钾溶液重新悬浮，悬浮后胶体金浓度为0.04g/100mL；将待测病原体单克隆抗体(来源于广州锐达生物科技有限公司的鼠抗乙型流感病毒NP蛋白单克隆抗体M0004-6)0.06mg加入到胶体金溶液中，搅拌均匀后静置；逐滴加入质量浓度为10％的无菌牛血清白蛋白，搅拌后室温静置得标记后的胶体金溶液；将标记后的胶体金溶液再次离心，弃上清液，沉淀用5mL重悬液(pH8.0硼酸缓冲液，含2.5(w/v)％蔗糖，1(w/v)％酪蛋白和5(v/v)％曲拉通)复溶，得到胶体金标记的鼠抗乙型流感病毒NP蛋白单克隆抗体溶液；

③胶体金溶液标记兔IgG多克隆抗体：将步骤①中的胶体金溶液离心后弃上清液，沉淀用pH为8.0～ 8.5的碳酸钾溶液重新悬浮，悬浮后胶体金浓度为0.04g/100mL；将质控抗体(来源于广州锐达生物科技有限公司的兔IgG多克隆抗体M0145-1)0.06mg加入到胶体金溶液中，搅拌均匀后静置；逐滴加入质量浓度为10％的无菌牛血清白蛋白，搅拌后室温静置得标记后的胶体金溶液；将标记后的胶体金溶液再次离心，弃上清液，沉淀用5mL重悬液(pH8.0硼酸缓冲液，含2.5(w/v)％蔗糖，1(w/v)％酪蛋白和5(v/v)％曲拉通) 复溶，得到胶体金标记的兔IgG多克隆抗体溶液；

④金标垫制备：将胶体金标记后的鼠抗乙型流感病毒NP蛋白单克隆抗体和胶体金标记的兔IgG多克隆抗体用专用处理液(pH8.0硼酸缓冲液，含2.5％蔗糖，1％酪蛋白和5％曲拉通)稀释4倍，涂布于玻璃纤维素膜上，烘干，制备金标垫；

⑤底板制备：将硝酸纤维素膜黏贴到PVC底板的固定位置上，将吸水纸黏贴到PVC底板固定位置上，然后在硝酸纤维素膜上包被C线(来源于广州锐达生物科技有限公司的羊抗兔IgG多克隆抗体M0145-2) 与T线抗体(来源于广州锐达生物科技有限公司的鼠抗乙型流感病毒NP蛋白单克隆抗体M0004A)(C线抗体用量：底板长度30cm，宽度为8cm，划线量0.7μL/cm，划线浓度1mg/mL，合计21μg/张底板；T线抗体用量：底板长度30cm，宽度为8cm，划线量0.7μL/cm，划线浓度1mg/mL，合计21μg/张底板)，烘干，制备底板；

⑥样品垫制备：配制样品垫处理液，使用浸纸压垫机对玻璃纤维素膜进行样品垫处理液涂布，涂布浓度为35mL/张样品垫(20*30cm规格)，烘干处理制得样品垫；

⑦胶体金免疫试纸条的组装：将金标垫、样品垫搭接到底板上；

⑧胶体金免疫测试卡组装：将试纸条嵌入塑料卡壳内。

3.实施例和对比例的样品垫处理液制备的乙型流感病毒抗原胶体金检测试纸检测结果

(1)实施例1～9、对比例1的样品垫处理液制备的乙型流感病毒抗原胶体金检测试纸检测结果

1)特异性

采用实施例1～9、对比例1的样品垫处理液制备的乙型流感病毒抗原胶体金检测试纸检测试验弱阳性样本以及试验阴性样本(交叉病原体如表22、23所示)，具体如下：样本处理液(0.05M Tris-HCl缓冲液 +1％质量体积比的TritonX-100+1％质量体积比的氯化钠)和试验用样本通过体积比1:1进行混合。检测试纸平放在水平桌面上，将混合后的样本加入到待测试纸的加样孔内，每孔加样80μl体积的样本。等待15 分钟后观察结果。

表22实施例4～7、对比例1的样品垫处理液制备的乙型流感病毒抗原胶体金检测试纸的特异性检测结果

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注：“+”表示阳性结果；“-”表示阴性结果。

表23实施例1～3、8～9的样品垫处理液制备的乙型流感病毒抗原胶体金检测试纸的特异性

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注：“+”表示阳性结果；“-”表示阴性结果。

2)灵敏度

采用实施例1～9、对比例1的样品垫处理液制备的乙型流感病毒抗原胶体金检测试纸检测不同型别灭活毒株样本。

表24实施例1～9、对比例1的样品垫处理液制备的乙型流感病毒抗原胶体金检测试纸的特异性检测结果

备注：结果判读根据下列标准，“+”表示阳性结果，数量表示阳性强度；“-”表示阴性结果；“±”表示弱阳性结果。

特异性结果如表22、23所示，灵敏度结果如表24所示：未添加猪血清的样品垫处理液(对比例1、实施例7～9)，检测结果出现许多假阳性结果(高达5个)，而添加猪血清的样品垫处理液(实施例1～6) 假阳性显著减少(甚至不出现假阳性)，表明猪血清对检测试纸的非特异性反应有抑制作用；与未添加 CHAPS的样品垫处理液(对比例1、实施例4～6)，添加CHAPS的样品垫处理液(实施例1～3、实施例 7～9)的灵敏度显著增加，其中，CHAPS浓度为20g/mL时，灵敏度最强，表明CHAPS可提高灵敏度。

效果实施例4

1.本效果实施例中的实验用材料：

1)交叉病原体样本：由我司培养或合作单位提供(表4，去除呼吸道合胞病毒，加上新冠病毒)。

2)正常人样本：来源于我司健康员工采集的口咽拭子共20例(表16)，经圣湘生物科技股份有限公司的六项呼吸道病原体PCR检测试剂盒(注册证编号：国械注准20213400256)检测为阴性。

3)试验弱阳性样本：呼吸道合胞病毒培养物(表25)添加到阴性样本((步骤4)中的试验阴性基质样本，呼吸道合胞病毒稀释至1×10⁵TCID₅₀/mL))中制备弱阳性样本。

4)试验阴性基质样本：由采集的健康员工口咽拭子样本多份(表15)经圣湘生物科技股份有限公司的六项呼吸道病原体PCR检测试剂盒(注册证编号：国械注准20213400256)检测为阴性后合并成一份作为阴性样本，将交叉病原体与阴性样本1:1混合成为试验阴性样本。

5)不同型别灭活毒株样本：由我司培养或合作单位提供(表25)。

表25病毒培养物

2.分别采用实施例和对比例的样品垫处理液制备的呼吸道合胞病毒抗原胶体金检测试纸，具体如下：

①胶体金溶液的制备：将所需用到的圆底烧瓶、量筒用洗洁精洗涮干净，清洗至玻璃器皿无水珠挂壁现象，再用纯水冲涮至少三次。取已按要求清洗干净的圆底烧瓶，倒入适量2/3烧瓶容量的纯水，同时放入搅拌子，将烧瓶置于控温磁力搅拌器上加热，加热至水沸腾约3min后停止加热，将烧瓶里的沸水倒掉，搅拌子留于瓶内，烧瓶再用适量的超纯水润洗3次，倒干净瓶内的水，煮瓶完成。用已清洗干净的量筒量取100ml超纯水加入到烧瓶中，再加入1w/v％氯金酸4mL，开启控温磁力搅拌器，将搅拌转速调至2r/s, 温度调至300℃，加热待沸腾。待烧瓶溶液开始产生上升气泡时开始计时，约40s后水开始沸腾，此时加入预热至37℃的2w/v％柠檬酸钠溶液2mL，适当加大转速，继续搅拌加热3min。关闭控温磁力搅拌器停止加热，取出烧瓶，将所烧制的金溶胶放置于室温冷却，冷却后转移至干净的试剂瓶中。金溶胶色泽应为酒红色纯净液体。

②胶体金溶液标记鼠抗呼吸道合胞病毒NP蛋白单克隆抗体：将步骤①中的胶体金溶液离心后弃上清液，沉淀用pH为8.0～8.5的碳酸钾溶液重新悬浮，悬浮后胶体金浓度为0.04g/100mL；将待测病原体单克隆抗体(来源于广州锐达生物科技有限公司的鼠抗呼吸道合胞病毒NP蛋白单克隆抗体M0016-1)0.06mg 加入到胶体金溶液中，搅拌均匀后静置；逐滴加入质量浓度为10％的无菌牛血清白蛋白，搅拌后室温静置得标记后的胶体金溶液；将标记后的胶体金溶液再次离心，弃上清液，沉淀用5mL重悬液(pH8.0硼酸缓冲液，含2.5(w/v)％蔗糖，1(w/v)％酪蛋白和5(v/v)％曲拉通)复溶，得到胶体金标记的鼠抗乙型流感病毒NP蛋白单克隆抗体溶液；

③胶体金溶液标记兔IgG多克隆抗体：将步骤①中的胶体金溶液离心后弃上清液，沉淀用pH为8.0～ 8.5的碳酸钾溶液重新悬浮，悬浮后胶体金浓度为0.04g/100mL；将质控抗体(来源于广州锐达生物科技有限公司的兔IgG多克隆抗体M0145-1)0.06mg加入到胶体金溶液中，搅拌均匀后静置；逐滴加入质量浓度为10％的无菌牛血清白蛋白，搅拌后室温静置得标记后的胶体金溶液；将标记后的胶体金溶液再次离心，弃上清液，沉淀用5mL重悬液(pH8.0硼酸缓冲液，含2.5(w/v)％蔗糖，1(w/v)％酪蛋白和5(v/v)％曲拉通) 复溶，得到胶体金标记的兔IgG多克隆抗体溶液；

④金标垫制备：将胶体金标记后的鼠抗乙型流感病毒NP蛋白单克隆抗体和胶体金标记的兔IgG多克隆抗体用专用处理液(pH8.0硼酸缓冲液，含2.5(w/v)％蔗糖，1(w/v)％酪蛋白和5(v/v)％曲拉通)稀释4倍，涂布于玻璃纤维素膜上，烘干，制备金标垫；

⑤底板制备：将硝酸纤维素膜黏贴到PVC底板的固定位置上，将吸水纸黏贴到PVC底板固定位置上，然后在硝酸纤维素膜上包被C线(来源于广州锐达生物科技有限公司的羊抗兔IgG多克隆抗体M0145-2) 与T线抗体(来源于广州锐达生物科技有限公司的鼠抗呼吸道合胞病毒NP蛋白单克隆抗体M0016A)(C 线抗体用量：底板长度30cm，宽度为8cm，划线量0.7μL/cm，划线浓度1mg/mL，合计21μg/张底板；T 线抗体用量：底板长度30cm，宽度为8cm，划线量0.7μL/cm，划线浓度1mg/mL，合计21μg/张底板)，烘干，制备底板；

⑥样品垫制备：配制样品垫处理液，使用浸纸压垫机对玻璃纤维素膜进行样品垫处理液涂布，涂布浓度为35ml/张样品垫(20*30cm规格)，烘干处理制得样品垫；

⑦胶体金免疫试纸条的组装：将金标垫、样品垫搭接到底板上；

⑧胶体金免疫测试卡组装：将试纸条嵌入塑料卡壳内。

3.实施例和对比例的样品垫处理液制备的呼吸道合胞病毒抗原胶体金检测试纸检测结果

(1)实施例1～9、对比例1的样品垫处理液制备的呼吸道合胞病毒抗原胶体金检测试纸检测结果

1)特异性

采用实施例1～9、对比例1的样品垫处理液制备的呼吸道合胞病毒抗原胶体金检测试纸检测试验弱阳性样本以及试验阴性样本(交叉病原体如表26、27所示)，具体如下：样本处理液(0.05M Tris-HCl缓冲液+1％质量体积比的TritonX-100+1％质量体积比的氯化钠)和试验用样本通过体积比1:1进行混合。检测试纸平放在水平桌面上，将混合后的样本加入到待测试纸的加样孔内，每孔加样80μl体积的样本。等待 15分钟后观察结果。

表26实施例4～7、对比例1的样品垫处理液制备的呼吸道合胞病毒抗原胶体金检测试纸的特异性检测结果

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注：“+”表示阳性结果；“-”表示阴性结果。

表27实施例1～3、8～9的样品垫处理液制备的乙型流感病毒抗原胶体金检测试纸的特异性

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注：“+”表示阳性结果；“-”表示阴性结果。

2)灵敏度

采用实施例1～9、对比例1的样品垫处理液制备的呼吸道合胞病毒抗原胶体金检测试纸检测不同型别灭活毒株样本。

表28实施例1～9、对比例1的样品垫处理液制备的呼吸道合胞病毒抗原胶体金检测试纸的灵敏度检测结果

/>

备注：结果判读根据下列标准，“+”表示阳性结果，数量表示阳性强度；“-”表示阴性结果；“±”表示弱阳性结果。

特异性结果如表26、27所示，灵敏度结果如表28所示：未添加猪血清的样品垫处理液(对比例1、实施例7～9)，检测结果出现许多假阳性结果(高达5个)，而添加猪血清的样品垫处理液(实施例1～6) 假阳性显著减少(甚至不出现假阳性)，表明猪血清对检测试纸的非特异性反应有抑制作用；与未添加 CHAPS的样品垫处理液(对比例1、实施例4～6)，添加CHAPS的样品垫处理液(实施例1～3、实施例 7～9)的灵敏度显著增加，其中，CHAPS浓度为20g/mL时，灵敏度最强，表明CHAPS可提高灵敏度。

效果实施例5

1.本效果实施例中的实验用材料：

1)交叉病原体样本：由我司培养或合作单位提供(表4，去除呼吸道腺病毒，加上新冠病毒)。

2)正常人样本：来源于我司健康员工采集的口咽拭子共20例(表16)，经圣湘生物科技股份有限公司的六项呼吸道病原体PCR检测试剂盒(注册证编号：国械注准20213400256)检测为阴性。

3)试验弱阳性样本：呼吸道腺病毒培养物(表29)添加到阴性样本((步骤4)中的试验阴性基质样本，呼吸道腺病毒稀释至1×10⁵TCID₅₀/mL))中制备弱阳性样本。

4)试验阴性基质样本：由采集的健康员工口咽拭子样本多份(表15)经圣湘生物科技股份有限公司的六项呼吸道病原体PCR检测试剂盒(注册证编号：国械注准20213400256)检测为阴性后合并成一份作为阴性样本，将交叉病原体与阴性样本1:1混合成为试验阴性样本。

5)不同型别灭活毒株样本：由我司培养或合作单位提供(表29)。

表29病毒培养物

2.分别采用实施例和对比例的样品垫处理液制备的呼吸道腺病毒抗原胶体金检测试纸，具体如下：

①胶体金溶液的制备：将所需用到的圆底烧瓶、量筒用洗洁精洗涮干净，清洗至玻璃器皿无水珠挂壁现象，再用纯水冲涮至少三次。取已按要求清洗干净的圆底烧瓶，倒入适量2/3烧瓶容量的纯水，同时放入搅拌子，将烧瓶置于控温磁力搅拌器上加热，加热至水沸腾约3min后停止加热，将烧瓶里的沸水倒掉，搅拌子留于瓶内，烧瓶再用适量的超纯水润洗3次，倒干净瓶内的水，煮瓶完成。用已清洗干净的量筒量取100ml超纯水加入到烧瓶中，再加入1w/v％氯金酸4mL，开启控温磁力搅拌器，将搅拌转速调至2r/s, 温度调至300℃，加热待沸腾。待烧瓶溶液开始产生上升气泡时开始计时，约40s后水开始沸腾，此时加入预热至37℃的2w/v％柠檬酸钠溶液2mL，适当加大转速，继续搅拌加热3min。关闭控温磁力搅拌器停止加热，取出烧瓶，将所烧制的金溶胶放置于室温冷却，冷却后转移至干净的试剂瓶中。金溶胶色泽应为酒红色纯净液体。

②胶体金溶液标记鼠抗呼吸道腺病毒六邻体蛋白单克隆抗体：将步骤①中的胶体金溶液离心后弃上清液，沉淀用pH为8.0～8.5的碳酸钾溶液重新悬浮，悬浮后胶体金浓度为0.04g/100mL；将待测病原体单克隆抗体(来源于广州锐达生物科技有限公司的鼠抗呼吸道腺病毒六邻体蛋白单克隆抗体M0018-6)0.06mg 加入到胶体金溶液中，搅拌均匀后静置；逐滴加入质量浓度为10％的无菌牛血清白蛋白，搅拌后室温静置得标记后的胶体金溶液；将标记后的胶体金溶液再次离心，弃上清液，沉淀用5mL重悬液(pH8.0硼酸缓冲液，含2.5(w/v)％蔗糖，1(w/v)％酪蛋白和5(v/v)％曲拉通)复溶，得到胶体金标记的鼠抗呼吸道腺病毒六邻体蛋白单克隆抗体溶液；

③胶体金溶液标记兔IgG多克隆抗体：将步骤①中的胶体金溶液离心后弃上清液，沉淀用pH为8.0～ 8.5的碳酸钾溶液重新悬浮，悬浮后胶体金浓度为0.04g/100mL；将质控抗体(来源于广州锐达生物科技有限公司的兔IgG多克隆抗体M0145-1)0.06mg加入到胶体金溶液中，搅拌均匀后静置；逐滴加入质量浓度 10％的无菌牛血清白蛋白，搅拌后室温静置得标记后的胶体金溶液；将标记后的胶体金溶液再次离心，弃上清液，沉淀用5mL重悬液(pH8.0硼酸缓冲液，含2.5(w/v)％蔗糖，1(w/v)％酪蛋白和5(v/v)％曲拉通) 复溶，得到胶体金标记的兔IgG多克隆抗体溶液；

④金标垫制备：将胶体金标记后的鼠抗乙型流感病毒NP蛋白单克隆抗体和胶体金标记的兔IgG多克隆抗体用专用处理液(pH8.0硼酸缓冲液，含2.5(w/v)％蔗糖，1(w/v)％酪蛋白和5(v/v)％曲拉通)稀释4倍，涂布于玻璃纤维素膜上，烘干，制备金标垫；

⑤底板制备：将硝酸纤维素膜黏贴到PVC底板的固定位置上，将吸水纸黏贴到PVC底板固定位置上，然后在硝酸纤维素膜上包被C线(来源于广州锐达生物科技有限公司的羊抗兔IgG多克隆抗体M0145-2) 与T线抗体(来源于广州锐达生物科技有限公司的鼠抗呼吸道腺病毒六邻体蛋白单克隆抗体M0018A)(C 线抗体用量：底板长度30cm，宽度为8cm，划线量0.7μL/cm，划线浓度1mg/mL，合计21μg/张底板；T 线抗体用量：底板长度30cm，宽度为8cm，划线量0.7μL/cm，划线浓度1mg/mL，合计21μg/张底板)，烘干，制备底板；

⑥样品垫制备：配制样品垫处理液，使用浸纸压垫机对玻璃纤维素膜进行样品垫处理液涂布，涂布浓度为35ml/张样品垫(20*30cm规格)，烘干处理制得样品垫；

⑦胶体金免疫试纸条的组装：将金标垫、样品垫搭接到底板上；

⑧胶体金免疫测试卡组装：将试纸条嵌入塑料卡壳内。

3.实施例和对比例的样品垫处理液制备的呼吸道腺病毒抗原胶体金检测试纸检测结果

(1)采用实施例1～9、对比例1的样品垫处理液制备的呼吸道腺病毒抗原胶体金检测试纸检测结果

1)特异性

采用实施例1～9、对比例1的样品垫处理液制备的新型冠状病毒(2019-nCoV)抗原胶体金检测试纸检测试验弱阳性样本以及试验阴性样本(交叉病原体如表30、31所示)，具体如下：样本处理液(0.05M Tris-HCl缓冲液+1％质量体积比的TritonX-100+1％质量体积比的氯化钠)和试验用样本通过体积比1:1进行混合。检测试纸平放在水平桌面上，将混合后的样本加入到待测试纸的加样孔内，每孔加样80μl体积的样本。等待15分钟后观察结果。

表30实施例4～7、对比例1的样品垫处理液制备的呼吸道腺病毒抗原胶体金检测试纸的特异性检测结果

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注：“+”表示阳性结果；“-”表示阴性结果。

表31实施例1～3、8～9的样品垫处理液制备的呼吸道腺病毒抗原胶体金检测试纸的特异性

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/>

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注：“+”表示阳性结果；“-”表示阴性结果。

2)灵敏度

采用实施例1～9、对比例1的样品垫处理液制备的呼吸道腺病毒抗原胶体金检测试纸检测不同型别灭活毒株样本。

表32实施例1～9、对比例1的样品垫处理液制备的呼吸道腺病毒抗原胶体金检测试纸的灵敏度检测结果

/>

/>

备注：结果判读根据下列标准，“+”表示阳性结果，数量表示阳性强度；“-”表示阴性结果；“±”表示弱阳性结果。

特异性结果如表30、31所示，灵敏度结果如表32所示：未添加猪血清的样品垫处理液(对比例1、实施例7～9)，检测结果出现许多假阳性结果(高达6个)，而添加猪血清的样品垫处理液(实施例1～6) 假阳性显著减少(甚至不出现假阳性)，表明猪血清对检测试纸的非特异性反应有抑制作用；与未添加CH APS的样品垫处理液(对比例1、实施例4～6)，添加CHAPS的样品垫处理液(实施例1～3、实施例7～ 9)的灵敏度显著增加，其中，CHAPS浓度为20g/mL时，灵敏度最强，表明CHAPS可提高灵敏度。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (12)

1.一种样品垫处理液，包含：封闭剂、反应增强剂、水性流变助剂和缓冲液；

所述封闭剂包含猪血清、牛血清白蛋白、酪蛋白和聚乙烯吡咯烷酮；

所述反应增强剂包含CHAPS；

所述水性流变助剂包含吐温20；

其中，相对于每100mL的所述缓冲液，所述猪血清的添加量为0.5～20mL；

相对于每100mL的所述缓冲液，所述反应增强剂的添加量为15～20g；

相对于每100mL的所述缓冲液，所述牛血清白蛋白的添加量为0.8～1.2g；

相对于每100mL的所述缓冲液，所述酪蛋白的添加量为0.4～0.6g；

相对于每100mL的所述缓冲液，所述聚乙烯吡咯烷酮的添加量为9～11g；

相对于每100mL的所述缓冲液，所述水性流变助剂的添加量为0.8～1.2mL；

所述缓冲液的pH为7.5～8.5。

2.根据权利要求1所述的样品垫处理液，其特征在于：

相对于每100mL的所述缓冲液，所述猪血清的添加量为5～20mL。

3.根据权利要求2所述的样品垫处理液，其特征在于：

相对于每100mL的所述缓冲液，所述猪血清的添加量为10～20mL。

4.根据权利要求1～3任一项所述的样品垫处理液，其特征在于：

所述样品垫处理液还包含防腐剂。

5.根据权利要求4所述的样品垫处理液，其特征在于：相对于每100mL的所述缓冲液，所述防腐剂的添加量为0.01～0.3mL。

6.根据权利要求5所述的样品垫处理液，其特征在于：所述防腐剂包含Proclin 300、Proclin 900、叠氮钠中的至少一种。

7.根据权利要求1所述的样品垫处理液，其特征在于：

所述缓冲液包含Tris-HCL缓冲液、PBS缓冲液、硼酸盐缓冲液中的至少一种。

8.根据权利要求7所述的样品垫处理液，其特征在于：

所述缓冲液的浓度为0.001～1M。

9.一种样品垫，包含权利要求1～8任一项所述的样品垫处理液。

10.一种试纸条，包含权利要求1～8任一项所述的样品垫处理液和/或权利要求9所述的样品垫。

11.根据权利要求10所述的试纸条，其特征在于：

所述试纸条包含：底板、样品垫、结合垫、检测垫和吸水材料；

所述样品垫为权利要求9所述的样品垫；或，所述样品垫包含权利要求1～8任一项所述的样品垫处理液；

所述结合垫包含金标蛋白；

所述检测垫包含检测线T和质控线C。

12.一种试剂盒，包含：权利要求1～8任一项所述的样品垫处理液、权利要求9述的样品垫、权利要求10～11任一项所述的试纸条中的至少一种。