CN104237512A - 一种免疫胶体金试纸条及制备方法及应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种免疫胶体金试纸及制备方法和应用，包括硬质聚氯乙烯背衬板、硝酸纤维膜、样品垫、胶体金结合垫吸水垫，硝酸纤维膜粘贴于在硬质聚氯乙烯背衬板上，在硝酸纤维膜的一端粘贴有胶体金结合垫，在胶体金结合垫上粘贴有样品垫，吸水垫置于硝酸纤维膜的另一端上；步骤：（1）用柠檬酸三钠与氯金酸反应制备胶体金；（2）将抗犬腺病毒Ⅱ型单克隆抗体标记在胶体金颗粒上；（3）将兔抗犬腺病毒Ⅱ型抗体包被在硝酸纤维膜上；（4）按顺序粘合一起得到胶体金试纸条。一种免疫胶体金试纸条在检测犬腺病毒Ⅱ型中的应用，该试纸操作简单、检测快速、灵敏、结果清晰易于判断。便于携带和使用，节约了疾病检测成本。

Description

一种免疫胶体金试纸条及制备方法及应用
技术领域
    本发明涉及一种犬疫病的检测技术领域，具体涉及一种免疫胶体金试纸条，同时还涉及一种免疫胶体金试纸条的制备方法，还涉及一种免疫胶体金试纸条在检测犬腺病毒Ⅱ型中的用途。
背景技术
犬腺病毒Ⅱ型（CAV-Ⅱ）能导致犬的呼吸道隐性或者轻微感染，可能会引起犬的传染性喉气管炎及肺炎症状。临床特征表现持续性高热、咳嗽、浆液性至粘液性鼻漏、扁桃体炎、喉气管炎和肺炎等呼吸道症状。常发生于半年以下的幼犬。在没断奶或刚断奶的幼犬可以造成全窝或全群咳嗽。CAV-Ⅱ可以通过口、鼻感染，病毒在无纤毛的细支气管上皮细胞，鼻粘膜、咽和扁桃体隐窝的表面细胞、支气管的粘膜及肺泡2型上皮细胞中进行复制，还能在咽后淋巴结和支气管淋巴结复制。感染在我国比较普遍。      目前CAV-Ⅱ的诊断方法有病毒分离、实验动物感染、包涵体检查、电镜观察、CAV-Ⅱ的中和试验、酶联免疫吸附试验（ELISA）、酶标SPA染色法、免疫荧光试验、链式聚合酶反应等方法。但是这些方法各有缺点，病毒分离鉴定及中和试验过程繁琐，耗时过长；电镜技术难以在基础普应用；分子生物学方法对对技术和设备要求高，这些检测方法难以在兽医临床现场应用。
免疫胶体金技术自问世以来得到了迅速的发展，在动物疫病检测领域应用广泛，特别是胶体金免疫技术具有操作简单、检测快速灵敏、结果清晰易于判断、无需仪器设备等优点，适合临床的快速诊断和基层流行病学调查大规模应用。将免疫胶体金技术应用于体外检测犬腺病毒Ⅱ型在国内还应用较少，本检测卡敏感性高，特异性好。
发明内容
本发明的目的是在于提供了一种免疫胶体金试纸条，该试纸操作简单、检测快速、灵敏、结果清晰易于判断。
本发明的另一个目的是在于提供了一种免疫胶体金试纸条的制备方法，试纸条制备过程简单，原辅料廉价易得，胶体金试纸条操作简单。
本发明的再一个目的是在于提供了一种免疫胶体金试纸条在检测犬腺病毒Ⅱ型中的应用，临床使用中不需要任何设备，便于携带和使用，检测快速敏感性高，大大节约了疾病检测成本。
     为了实现上述的目的，本发明采用以下技术措施：
一种能检测犬腺病毒Ⅱ型的免疫胶体金试纸条，所述的试纸条包括有硬质聚氯乙烯背衬板、硝酸纤维膜、胶体金结合垫、样品垫、吸水垫。其特征在于：硝酸纤维膜粘贴在硬质聚氯乙烯背衬板上面，在硝酸纤维膜的一端粘贴有胶体金结合垫，在胶体金结合垫上粘贴有样品垫，吸水垫置于硝酸纤维膜的另一端上面。
所述的样品垫具体为缓冲液A处理过的吸水纸。缓冲液A配方为：0.05 mol/L的Tris-Cl，pH 9.0。
所述的吸水垫具体为裁切过的吸水纸。
所述的硝酸纤维膜为试纸条的检测膜，上面靠左侧的是检测线，质控线位于右侧，两条线的间隔距离是4～6mm。
所述的胶体金结合垫喷涂有抗犬腺病毒Ⅱ型单克隆抗体-胶体金标记物。
所述的硝酸纤维膜上分别喷涂有兔犬腺病毒Ⅱ型多克隆抗体检测线和兔抗鼠抗体的质控线。
     一种能检测犬腺病毒Ⅱ型的免疫胶体金试纸条的制备方法，其步骤是：
（1）用柠檬酸三钠与氯金酸反应制备胶体金：已硅化的瓶子中入100 mL注射用水，再加入1.2 mL 1 %（w/v）氯金酸，放在电炉上加热（电炉功率调至1500W，200～300℃）至完全沸腾；迅速一次加入1.8 mL的1.05%（w/v）柠檬酸三钠水溶液，继续加热（电炉功率调至1500W，200～300℃）至溶液变成稳定的酒红色，室温（20～25℃）下自然冷却至室温（20～25℃），即为胶体金溶液。
（2）胶体金的标记：将上述步骤（1）所得的胶体金用0.1 mol/L碳酸钾调节pH值到7.8～8.2；加入抗犬腺病毒Ⅱ型单克隆抗体（购于Santa公司），缓慢搅拌38～42 min得到抗犬腺病毒Ⅱ型单克隆抗体-胶体金标记物；在搅动下，加入10% BSA（w/v）溶液封闭38～42 min；将标记好的胶体金溶液8800 rpm离心28～32 min后重悬喷涂在胶体金结合垫上。
（3）将兔抗犬腺病毒Ⅱ型多克隆抗体（购于Santa公司）和兔抗鼠IgG抗体（购于武汉博士得生物工程有限公司）稀释后分别喷涂在硝酸纤维膜上构成检测线和质控线。
（4）将硝酸纤维膜、胶体金结合垫、样品垫、吸水垫按顺序粘合在硬质聚氯乙烯背衬板上在一起组成得到检测犬腺病毒Ⅱ型的免疫胶体金试纸条。
一种免疫胶体金试纸条在检测犬腺病毒Ⅱ型中的应用，其步骤是：
（1）将预处理过的样品（如犬鼻粘膜拭子、粪便或病死犬的脏器样品），取上清液约2～4滴（70～140 μL）在本发明试纸上，15 min后观察结果。
（2）结果判定：在质控线、检测线上均出现红色时，为犬腺病毒Ⅱ型阳性，即样本中含有犬腺病毒Ⅱ型，检测线不出现红色为犬腺病毒Ⅱ型阴性，即样本中不含有犬腺病毒Ⅱ型。若质控线未出现红色线，则试纸无效。
 本发明利用胶体金标记显色的免疫反应制备的免疫胶体金试纸条能较灵敏的检测出犬腺病毒Ⅱ型，结构合理，应用兔抗犬腺病毒Ⅱ型抗体作检测线，建立免疫层析法检测样本中是否含有犬腺病毒Ⅱ型。
与现有技术相比，本发明具有以下突出优点：
（1）适用于犬腺病毒Ⅱ型的快速检测，本试纸条检测结果特异性强，灵敏度高。本检测方法与临床酶联免疫吸附试验检测比较，120份被检测犬腺病毒Ⅱ型感染疑似病例犬的粪便、病死脏器的样本中，用酶联免疫吸附试验检测阳性为79份，阴性41份，用本发明的试纸条检测阳性为74份，阴性为46份，结果显示：犬腺病毒Ⅱ型用本发明试纸条检测阳性率为61.7%，酶联免疫吸附试验的检测阳性率65.8%，本发明试纸条与酶联免疫吸附试验的符合率为95.8%。
（2）本发明的试纸条不需要任何仪器设备，携带方便，检测成本低。
（3）本发明的试纸条操作简单易于掌握，无需专业人员操作。
（4）本发明的试纸条保存方便，稳定性好。常温保存12个月试纸条与4℃保存的检测结果一致。
附图说明
图1为一种检测犬腺病毒Ⅱ型的免疫胶体金试纸条的结构示意图。
其中：硬质聚氯乙烯背衬板1、硝酸纤维膜2、胶体金结合垫4、样品垫3、吸水垫5、检测线6，质控线7。
具体实施方式
实施例1：
下面结合附图和实施例对本发明作进一步说明。
一种检测犬腺病毒Ⅱ型的免疫胶体金试纸条，它由硬质聚氯乙烯背衬板1、硝酸纤维膜2、胶体金结合垫4、样品垫3、吸水垫5、检测线6，质控线7组成，其特征在于：硝酸纤维膜2粘贴在硬质聚氯乙烯背衬板1上面，在硝酸纤维膜2上面靠左侧由下而上依次粘贴有胶体金结合垫4、样品垫3，吸水垫5，设置在硝酸纤维膜2上面靠右侧的位置。所述的胶体金结合垫4由玻璃纤维制成，该胶体金结合垫4先用缓冲液浸泡30分钟，37℃烘干后，喷涂上胶体金标记的抗犬腺病毒Ⅱ型单克隆抗体。硝酸纤维膜2为试纸条的检测膜，上面靠左侧的是检测线6，质控线7位于右侧，两条线的间隔距离是4或5或6mm，检测线6和质控线7分别喷涂的是兔抗犬腺病毒Ⅱ型多克隆抗体和兔抗鼠抗体。当被检测样本中含有犬腺病毒Ⅱ型时，病毒可分别先与金标抗犬腺病毒Ⅱ型单克隆抗体结合，然后在层析作用下与相应检测线上的抗体结合而聚集后形成肉眼可见的色带，进而根据显色结果进行判定。
实施例2：
     一种检测犬腺病毒Ⅱ型的免疫胶体金试纸条的制备方法，其步骤是：
（1）用柠檬酸三钠与氯金酸反应制备胶体金：已硅化的瓶子中入100 mL注射用水，再加入1.2 mL 1 %（w/v）氯金酸，放在电炉上加热（电炉功率调至1500W，200～300℃）至完全沸腾；迅速一次加入1.8 mL的1.05%（w/v）柠檬酸三钠水溶液，继续加热（电炉功率调至1500W，200～300℃）至溶液变成酒红色，室温（20～25℃）下自然冷却室温（20～25℃，），即为胶体金溶液。制备的胶体金外观呈清亮透明的酒红色，通过分光光度计扫描在450～600 nm处光谱，最大吸收波长为520 nm，通过电镜观察颗粒大小均匀。
（2）犬腺病毒Ⅱ型单克隆抗体胶体金标记制备：
（a）确定最佳标记量和最佳标记pH值：将上述步骤（1）所得的胶体金用0.1 mol/L碳酸钾调节pH值分别为6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0；取各pH的胶体金溶液l mL于一系列PE管中混匀，在以上各pH条件下用胶体金标记抗犬腺病毒Ⅱ型单克隆抗体（购于Santa公司，浓度调整为1.0 mg/mL），蛋白标记量分别为1 μg、2 μg、5 μg、8 μg、10 μg、15 μg、20 μg，混匀后静置30 min；离心去除沉淀后测各个试管的OD520nm，以OD520nm值最大时的pH（8.0）为最佳pH值。当胶体金标记的最佳pH值为8.0，胶体金中单克隆抗体添加量为8 μg时，对应的吸收峰最大，在此基础上再加20%，即每1 mL胶体金溶液的最适当单克隆抗体的标记量为9.6 μg。
（b）犬腺病毒Ⅱ型单克隆抗体胶体金标记：于广口瓶中加入100 mL的胶体金，0.1 mol/L碳酸钾调节pH为8.0后，边磁力搅拌边滴加犬腺病毒Ⅱ型单克隆抗体（购于Santa公司），搅拌38或39或40或41或42min；加入10 %（w/v）牛血清白蛋白（BSA）至终浓度为1 %，继续搅拌38或39或40或41或42min；分装于50 mL离心管中，8800 r/min离心28或29或30或31或32min，弃去上清，加入重悬液15 mL。
（3）胶体金结合垫制备：
（a）配制包被液：0.05 mol/L pH 9.0 Tris缓冲液、0.5%（w/v）聚乙烯吡咯烷酮K40（PVP K40）、1.0%（w/v）蔗糖、0.8%（w/v）吐温20搅拌均匀后滤纸过滤。
（b）制备胶体金结合垫：将玻璃纤维素膜浸泡在上述包被液中28或29或30或31或32分钟，37℃烘箱中烘干；上述步骤（2）制备的胶体金标记的抗犬腺病毒Ⅱ型单克隆抗体喷涂于处理过胶体金结合垫上，喷量为10 μL/cm，于37℃烘箱中烘干2小时，裁切成宽0.5cm条状备用。
（4）检测线和质控线制备：
（a）配制包被液：0.02 mol/L pH 7.2磷酸盐缓冲液（PBS）、1.0%（w/v）海藻糖、1.0%（w/v）山梨醇、0.3%（w/v）吐温20、搅拌均匀后0.22 μm滤膜过滤。
（b）将兔抗犬腺病毒Ⅱ型多抗（购于Santa公司）用上述包被液稀释后，喷涂于硝酸纤维膜（Millipore HF135）上作为检测线，兔抗犬腺病毒Ⅱ型多抗浓度为1.0 mg/ mL，喷量为0.8 μL/cm；喷涂在硝酸纤维膜上质控线上兔抗鼠抗体（购于武汉博士得生物工程有限公司）浓度为1.5 mg/ mL，喷量为0.8 μL/cm，检测线和质控线的距离是5 mm，于37℃烘箱中烘干2小时备用。
（5）处理样品垫：将吸水纸浸泡在缓冲液中30 min，37℃烘箱中烘干，裁切成宽为1.5 cm条状备用。上述的缓冲液配方为：0.05 mol/L的Tris-Cl，pH 9.0。
 （6）试纸的组装：将处理好的样品垫、喷有抗犬腺病毒Ⅱ型单克隆抗体-胶体金标记物的胶体金结合垫、喷有兔抗犬腺病毒Ⅱ型抗体的检测线的硝酸纤维膜、吸水垫按顺序依次粘贴在硬质聚氯乙烯上组成试纸条。
实施例3：
一种免疫胶体金试纸条在检测犬腺病毒Ⅱ型中的应用，其步骤是：
（1）样品的预处理：将收集到的样品如犬鼻粘膜拭子、粪便或病死犬的脏器样品，各有阴性样本作对照。将样本每份取约0.5 g（mL）左右，加生理盐水约0.5 mL，制成混悬液（粪便样本充分混匀后静置5 min，或者离心）。
（2）检测：分别取上清液2～4滴（70～140 μL）滴在本发明试纸上，15 min后观察结果。
（3）结果判定：在质控线、检测线上均出现红色时，为犬腺病毒Ⅱ型阳性，即样本中含有犬腺病毒Ⅱ型，检测线不出现红色为犬腺病毒Ⅱ型阴性，即样本中不含有犬腺病毒Ⅱ型。若质控线未出现红色线，则试纸无效。
      本发明应用效果举例：
（1）特异性试验：用生理盐水对犬腺病毒Ⅱ型（TCID50为10-5.2/0.1ml）犬细小病毒细胞培养液（TCID50为10-5.0/0.1ml）、犬腺病毒Ⅰ型（TCID50为10-5.5/0.1ml）、犬细小病毒（TCID50为10-5.9/0.1ml）、犬瘟热（TCID50为10-6.3/0.1ml）、犬副流感病毒（TCID50为10-4.8/0.1ml）培养液倍比稀释至1:128，分别取120 μL滴加在样品垫上，另外设生理盐水做阴性对照。除犬腺病毒Ⅱ型细胞培养液呈阳性反应外，其他的样本皆为阴性反应，重复3次后结果相同，说明该方法有较高的特异性。
（2）敏感性试验：用生理盐水对TCID50为10-5.2/0.1ml的犬腺病毒Ⅱ型作倍比稀释至1:128，分别取120 μL滴加在样品垫上，试纸仍呈阳性反应，重复3次后结果相同，本发明试纸敏感性强。
（3）稳定性试验：将本发明的3批试纸条分别放置在在37℃恒温培养箱、常温、4℃，每隔1个月取出同时检测10份犬腺病毒Ⅱ型样本、10份阴性犬腺病毒Ⅱ型阴性样本，结果显示：37℃作用6个月对本发明的试纸条无破坏作用，证明该试纸条在高温下较为稳定；本发明的试纸条常温放置12个月仍较为稳定。
（4）与酶联免疫吸附试验比较：120份被检测犬腺病毒Ⅱ型感染疑似病例犬的粪便、病死脏器的样本中，用酶联免疫吸附试验检测阳性为79份，阴性41份，用本发明的试纸条检测阳性为74份，阴性为46份，结果显示：犬腺病毒Ⅱ型用本发明试纸条检测阳性率为61.7%，酶联免疫吸附试验的检测阳性率65.8%，本发明试纸条与酶联免疫吸附试验的符合率为95.8%。

Claims (4)

1.一种免疫胶体金试纸条，包括硬质聚氯乙烯背衬板（1）、硝酸纤维膜（2）、样品垫（3）、胶体金结合垫（4）吸水垫（5），其特征在于：硝酸纤维膜（2）粘贴于在硬质聚氯乙烯背衬板（1）上，在硝酸纤维膜（2）的一端粘贴有胶体金结合垫（4），在胶体金结合垫（4）上粘贴有样品垫（3），吸水垫（5）置于硝酸纤维膜（2）的另一端上；
所述的胶体金结合垫（4）喷涂有抗犬腺病毒Ⅱ型单克隆抗体-胶体金标记物；
所述的硝酸纤维膜（2）上分别喷涂有兔抗犬腺病毒Ⅱ型抗体多克隆抗体检测线（6）和兔抗鼠抗体的质控线（7）。
2.根据权利要求1所述的一种免疫胶体金试纸条，其特征在于：所述的硝酸纤维膜（2）为试纸条的检测膜，上面靠左侧的是检测线（6），质控线（7）位于右侧，两条线的间隔距离是4～6 mm。
3.权利要求1所述的一种免疫胶体金试纸条的制备方法，其步骤是：
（1）用柠檬酸三钠与氯金酸反应制备胶体金：已硅化的瓶子中入100 mL注射用水，再加入1.2 mL 1 % w/v氯金酸，放在电炉上加热至完全沸腾；加入1.8 mL的1.05%柠檬酸三钠水溶液，继续加热至溶液变成稳定的酒红色，室温下自然冷却，为胶体金溶液；
（2）胶体金的标记：将步骤（1）所得的胶体金用0.1 mol/L碳酸钾调节pH值到8.0；加入单抗，搅拌40 min；在搅动下，加入稳定剂10% BSA溶液封闭38～42 min得到稳定的犬腺病毒Ⅱ型单克隆抗体-胶体金标记物；将标记好的胶体金溶液8800 rpm离心28～32 min后重悬喷涂在胶体金结合垫上；
（3）将兔抗犬腺病毒Ⅱ型多克隆抗体和兔抗鼠IgG抗体稀释后分别喷涂在硝酸纤维膜上构成检测线和质控线；
（4）将硬质聚氯乙烯背衬板（1）、硝酸纤维膜（2）、胶体金结合垫（4）、样品垫（3）、吸水垫（5）按顺序粘合在一起组成得到检测犬腺病毒Ⅱ型的免疫胶体金试纸条。
4.权利要求1所述的一种免疫胶体金试纸条在检测犬腺病毒Ⅱ型中的应用。
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