CN109946458A - 一种快速检测猪流行性腹泻病毒的荧光试纸及制备和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开一种快速检测猪流行性腹泻病毒的荧光试纸，包括硬质聚氯乙烯底板、硝酸纤维素膜、样品垫、荧光标记物垫、吸水纸，荧光标记物垫上喷涂有抗PEDV的单克隆抗体Ⅰ－量子点荧光标记物，硝酸纤维素膜上喷涂有抗PEDV的单克隆抗体Ⅱ检测线和山羊抗鼠IgG的质控线；抗PEDV的单克隆抗体Ⅰ由杂交瘤细胞10F10分泌产生，抗PEDV的单克隆抗体Ⅱ由杂交瘤细胞4A11分泌产生。本发明还提供了上述试纸的制备方法和应用方法，制备的试纸操作简单、检测快速、灵敏、特异性强、结果清晰易于判断，仅需要一个简易的激发设备，无需专业人员操作，适用于现场诊断。

Description

一种快速检测猪流行性腹泻病毒的荧光试纸及制备和应用

技术领域

本发明属于病毒检测技术领域，特别是一种快速检测猪流行性腹泻病毒的荧光试纸及制备和应用。

背景技术

猪流行性腹泻(porcine epidemic diarrhea，PED)是由冠状病毒科猪流行性腹泻病毒(PEDV)引起的一种主要侵害猪肠道的高接触性传染病。该病的主要特征是感染猪发生呕吐、腹泻和脱水。各年龄猪均易感，对1周龄内的新生仔猪危害最大，新生仔猪的发病率可达70％-100％，死亡率接近100％。鉴于PED的严重危害，建立一种灵敏快速高效的PEDV 诊断方法迫在眉睫；同时对该病早发现早防治，也是降低经济损失的最佳途径。

目前常用的检测PEDV的方法有病毒分离鉴定、RT-PCR、酶联免疫吸附试验法(ELISA)、免疫荧光法(IF)和胶体金。其中，病毒分离鉴定、RT-PCR、ELISA法、免疫荧光法(IF) 须接受过专业培训的人员在一期设备齐全的实验室中进行，操作繁复、费时费力，因此仅限于实验室检测并不适合于大规模诊断和临床诊断。胶体金操作简单，不需要特定仪器，是常用的现场检测和基层兽医工作者的检测方法，但该方法敏感性较低，易出现漏检现象。

荧光免疫层析分析技术是基于抗原抗体特异性免疫反应的新型膜检测技术，待测物在流动相作用下先与荧光标记物结合，当到达检测线时在于包被物抗体结合形成抗体夹心的“三明治”。该技术操作简单、反应迅速，仅需要一个简易的激发设备，操作人员也不需专业的技术培训，可以满足临床诊断的需求。。

现有技术中，例如专利号为201510152757.7的发明“一种快速定量检测猪流行性腹泻病毒的免疫荧光试纸及其制备方法”中，提供了一种免疫荧光试纸，通过含有荧光微球标记的抗PEDV单域抗体(氨基酸序列为如SEQ ID NO：6)的结合垫，包被有抗PEDV的多克隆抗体的检测线，以及包被有能与荧光微球标记的抗PEDV单域抗体结合的蛋白的质控线，实现PEDV的快速检测。

发明内容

相比于现有技术，本发明提供了一种快速检测猪流行性腹泻病毒的荧光试纸，以及其制备方法和应用方法，具体通过以下技术实现。

一种快速检测猪流行性腹泻病毒的荧光试纸，包括硬质聚氯乙烯底板、硝酸纤维素膜、样品垫、荧光标记物垫、吸水纸，所述硝酸纤维素膜粘贴在硬质聚氯乙烯底板上，在硝酸纤维膜的一端粘贴有荧光标记物垫，在荧光标记物垫上粘贴有样品垫，吸水纸置于硝酸纤维素膜的另一端，所述荧光标记物垫上喷涂有抗PEDV的单克隆抗体Ⅰ－量子点荧光标记物，所述硝酸纤维素膜上喷涂有抗PEDV的单克隆抗体Ⅱ的检测线和山羊抗鼠IgG的质控线。

优选地，所述抗PEDV的单克隆抗体Ⅰ由杂交瘤细胞10F10分泌产生，分泌抗猪流行性腹泻病毒单克隆抗体的杂交瘤细胞10F10于2019年1月14日保藏在位于中国.武汉.武汉大学的中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，其菌种保藏编号为CCTCC NO:C201905。

优选地，所述抗PEDV的单克隆抗体Ⅱ由杂交瘤细胞4A11分泌产生，分泌抗猪流行性腹泻病毒单克隆抗体的杂交瘤细胞4A11于2019年1月14日保藏在位于中国.武汉.武汉大学的中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，其菌种保藏编号为CCTCC NO:C201904。

本发明还提供了上述快速检测猪流行性腹泻病毒的荧光试纸的制备方法，包括以下步骤：

S1、标记抗PEDV单克隆抗体Ⅰ胶体金的步骤为：

S11、配置试剂：分别取1g EDC和NHS各自溶于100ML纯水，配置成10mg/mL的EDC 和NHS的工作母液，4℃下保存；

S12、活化量子点荧光：取500μL量子点荧光用纯水稀释至1㎎/ml，将EDC和NHS 的工作母液稀释为1mg/mL的EDC和NHS的工作液，分别加入87.5μL的EDC工作液和53.3 μL的NHS工作也，避光常温混匀30min，得活化量子点荧光；

S13、取pH值为8.7且浓度为0.02mol/L的PBS缓冲液，以及体积百分浓度分别为20％的海藻糖、20％的蔗糖、0.5％的吐温-20、0.5％的BSA，搅匀过滤后取得复溶液；

S14、取1mL活化的量子点荧光加入66μL浓度为1㎎/mL的抗PEDV的单克隆抗体，避光常温混匀1h；再加入100μL体积百分比浓度为10％的BSA，避光常温混匀2h， 13000rpm/min下离心30min，去上清后加入1mL复溶液溶解，4℃保存，得标记的抗PEDV 单克隆抗体Ⅰ胶体金；

S2、制备抗PEDV的单克隆抗体Ⅰ－量子点荧光标记物垫的步骤为：

S21、配制包被液Ⅰ：取浓度为0.015mol/L的PBS缓冲液，以及体积百分浓度为0.5％的BSA、2.0％的海藻糖、2％的吐温-20，搅匀过滤得包被液Ⅰ；

S22、制备荧光标记物垫：将玻璃纤维素膜浸泡在上述包被液Ⅰ中30min，37℃下烘干；将标记的抗PEDV单克隆抗体Ⅰ胶体金稀释8倍后喷涂于处理过的玻璃纤维素膜上，喷量为10μL/cm，37℃下烘干2h，裁切成宽0.5cm条状的荧光标记物垫；

S3、喷涂检测线和质控线的步骤为：

S31、配制包被液Ⅱ：取pH值为7.2且浓度为0.02mol/L的PBS缓冲液，以及体积百分数浓度为1.0％的海藻糖、1.0％的山梨醇、0.3％的吐温-20、搅匀后用0.22μm的滤膜过滤，得包被液Ⅱ；

S32、将硝酸纤维素膜非点样面粘贴于聚氯乙烯底板上，将抗PEDV的单克隆抗体Ⅱ用包被液Ⅱ稀释至浓度为0.5mg/mL，然后喷涂于硝酸纤维素膜上作为检测线，喷量为0.8μL/cm；

将浓度为1.5mg/mL的羊抗鼠IgG喷涂在硝酸纤维素膜上作为质控线，喷量为0.8μL/cm；37℃下烘干2h备用；

S4、处理样品垫，将吸水纸浸泡在由浓度为0.015mol/L的PBS以及体积百分浓度为2.5％蔗糖和2％BSA组成的PBS缓冲液中30min，37℃下烘干，裁切成宽为1.8cm条状备用，得样品垫；

S5、试纸的组装、切割和包装，在硬质聚氯乙烯底板上依次粘贴有样品垫、荧光标记物垫、硝酸纤维素膜和吸水纸，样品垫部分覆盖在荧光标记物垫上，荧光标记物垫部分覆盖在硝酸纤维素膜上，吸水纸部分覆盖在硝酸纤维素膜上；荧光标记物垫与硝酸纤维素膜上的检测线相邻，吸水纸与硝酸纤维素膜上的质控线相邻；切成3.6mm宽得试纸成品。

权利要求1～3任一项所述的快速检测猪流行性腹泻病毒的荧光试纸的制备，其特征在于，步骤S32中，检测线和质控线的距离是5mm。

上述快速检测猪流行性腹泻病毒的荧光试纸的应用方法，包括以下步骤：

P1、样品的预处理：取少量待测样本加至pH值为7.4，浓度为1mL的0.01mol/LPBS缓冲液中，搅匀后静置或离心，取上清液；

P2、检测：取75μL上清液滴在荧光试纸上，15min后放入便携检测仪中观察结果；

P3、结果判定：质控线、检测线上均出现橙色荧光时为阳性，即待测样本中含有猪流行性腹泻病毒；质控线出现橙色荧光、检测线不出现橙色荧光为阴性结果，即样本中不含有猪流行性腹泻病毒；质控线未出现橙色荧光，则试纸无效。

与现有技术相比，本发明的有益之处在于：该试纸操作简单、检测快速、灵敏、特异性强、结果清晰易于判断，仅需要一个简易的激发设备，无需专业人员操作，适用于现场诊断。

附图说明

图1为实施1的试纸的结构示意图。图中标号如下：

1、硬质聚氯乙烯底板；2、硝酸纤维素膜；3、样品垫；4、荧光标记物垫；5、吸水纸；6、检测线；7、质控线。

图2为采用实施例1制备的试纸判断待测样品是否感染猪流行性腹泻病毒的显色示意图，其中A为阳性结果示意图，B为阴性结果示意图，C为无效结果示意图。

图3为实施例1制备的试纸判断待测样品是否感染猪流行性腹泻病毒的显色的实物图。

图4为实施例1制备的试纸敏感性判断结果。

图5为实施例1制备的试纸特异性的判断结果。

具体实施方式

下面将对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动条件下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1

本实施例提供的快速检测猪流行性腹泻病毒的荧光试纸，包括硬质聚氯乙烯底板、硝酸纤维素膜、样品垫、荧光标记物垫、吸水纸，硝酸纤维素膜粘贴在硬质聚氯乙烯底板上，在硝酸纤维膜的一端粘贴有荧光标记物垫，在荧光标记物垫上粘贴有样品垫，吸水纸置于硝酸纤维素膜的另一端，荧光标记物垫上喷涂有抗PEDV的单克隆抗体Ⅰ－量子点荧光标记物，抗PEDV的单克隆抗体Ⅰ由杂交瘤细胞10F10分泌产生，杂交瘤细胞10F10保藏在中国典型培养物保藏中心CCTCC，其菌种保藏编号为CCTCC NO:C201905；硝酸纤维素膜上喷涂有抗PEDV的单克隆抗体Ⅱ的检测线和山羊抗鼠IgG的质控线，抗PEDV的单克隆抗体Ⅱ由杂交瘤细胞4A11分泌产生，所述的杂交瘤细胞4A11保藏在中国典型培养物保藏中心 CCTCC，其菌种保藏编号为CCTCC NO:C201904。

上述试纸的制备方法为：

S1、标记抗PEDV单克隆抗体Ⅰ胶体金的步骤为：

S11、配置试剂：分别取1g EDC和NHS各自溶于100ML纯水，配置成10mg/mL的EDC 和NHS的工作母液，4℃下保存；

S12、活化量子点荧光：取500μL量子点荧光用纯水稀释至1㎎/ml，将EDC和NHS 的工作母液稀释为1mg/mL的EDC和NHS的工作液，分别加入87.5μL的EDC工作液和53.3 μL的NHS工作也，避光常温混匀30min，得活化量子点荧光；

S13、取pH值为8.7且浓度为0.02mol/L的PBS缓冲液，以及体积百分浓度分别为20％的海藻糖、20％的蔗糖、0.5％的吐温-20、0.5％的BSA，搅匀过滤后取得复溶液；

S14、取1mL活化的量子点荧光加入66μL浓度为1㎎/mL的抗PEDV的单克隆抗体Ⅰ，避光常温混匀1h；再加入100μL体积百分比浓度为10％的BSA，避光常温混匀2h， 13000rpm/min下离心30min，去上清后加入1mL复溶液溶解，4℃保存，得标记的抗PEDV 单克隆抗体胶体金；

S2、制备抗PEDV的单克隆抗体Ⅰ－量子点荧光标记物垫的步骤为：

S21、配制包被液Ⅰ：取浓度为0.015mol/L的PBS缓冲液，以及体积百分浓度为0.5％的BSA、2.0％的海藻糖、2％的吐温-20，搅匀过滤得包被液Ⅰ；

S22、制备荧光标记物垫：将玻璃纤维素膜浸泡在上述包被液Ⅰ中30min，37℃下烘干；将标记的抗PEDV的单克隆抗体Ⅰ胶体金稀释8倍后喷涂于处理过的玻璃纤维素膜上，喷量为10μL/cm，37℃下烘干2h，裁切成宽0.5cm条状的荧光标记物垫；

S3、喷涂检测线和质控线的步骤为：

S31、配制包被液Ⅱ：取pH值为7.2且浓度为0.02mol/L的PBS缓冲液，以及体积百分数浓度为1.0％的海藻糖、1.0％的山梨醇、0.3％的吐温-20、搅匀后用0.22μm的滤膜过滤，得包被液Ⅱ；

S32、将硝酸纤维素膜非点样面粘贴于聚氯乙烯底板上，将抗PEDV的单克隆抗体Ⅱ用包被液Ⅱ稀释至浓度为0.5mg/mL，然后喷涂于硝酸纤维素膜上作为检测线，喷量为0.8μL/cm；

将浓度为1.5mg/mL的羊抗鼠IgG喷涂在硝酸纤维素膜上作为质控线，喷量为0.8μL/cm；检测线和质控线的距离是5mm，37℃下烘干2h备用；

S4、处理样品垫，将吸水纸浸泡在由浓度为0.015mol/L的PBS以及体积百分浓度为2.5％蔗糖和2％BSA组成的PBS缓冲液中30min，37℃下烘干，裁切成宽为1.8cm条状备用，得样品垫；

S5、试纸的组装、切割和包装，在硬质聚氯乙烯底板上依次粘贴有样品垫、荧光标记物垫、硝酸纤维素膜和吸水纸，样品垫部分覆盖在荧光标记物垫上，荧光标记物垫部分覆盖在硝酸纤维素膜上，吸水纸部分覆盖在硝酸纤维素膜上；荧光标记物垫与硝酸纤维素膜上的检测线相邻，吸水纸与硝酸纤维素膜上的质控线相邻；切成3.6mm宽得试纸成品。

应用例：检测实施例1制备的试纸条的敏感性和特异性

1、敏感性：将TCID₅₀/0.1ml为10^6.5的猪流行性腹泻病毒液用pH值为7.4，浓度为0.01mol/L的PBS缓冲液稀释10倍、100倍、1000倍、2000倍、3000倍后，各取约75μL 滴在试纸上，15min后观察结果，稀释至2000倍时，检测结果为阳性，稀释至3000倍时，检测结果为阴性，如图4所示。

2、特异性：将猪蓝耳病病毒液、猪圆环病毒液(2型)、猪瘟病毒液、猪传染性胃肠炎病毒液、猪轮状病毒液、细胞培养物、pH值为7.4且浓度为0.01mol/L的PBS缓冲液、阴性猪粪便混悬液(猪粪便取少量加入到1mL的pH值为7.4且浓度为0.01mol/L磷酸盐缓冲液中，制成混悬液，充分混匀后静置5min或者离心取上清)，取约75μL滴在试纸上，15min后观察结果，均为阴性。如示例图5。

Claims (6)

1.一种快速检测猪流行性腹泻病毒的荧光试纸，包括硬质聚氯乙烯底板、硝酸纤维素膜、样品垫、荧光标记物垫、吸水纸，所述硝酸纤维素膜粘贴在硬质聚氯乙烯底板上，在硝酸纤维膜的一端粘贴有荧光标记物垫，在荧光标记物垫上粘贴有样品垫，吸水纸置于硝酸纤维素膜的另一端，其特征在于，所述荧光标记物垫上喷涂有抗PEDV的单克隆抗体Ⅰ－量子点荧光标记物，所述硝酸纤维素膜上喷涂有抗PEDV的单克隆抗体Ⅱ的检测线和山羊抗鼠IgG的质控线。

2.根据权利要求1所述的快速检测猪流行性腹泻病毒的荧光试纸，其特征在于，所述抗PEDV的单克隆抗体Ⅰ由杂交瘤细胞10F10分泌产生，所述的杂交瘤细胞10F10保藏在中国典型培养物保藏中心CCTCC，其菌种保藏编号为CCTCC NO:C201905。

3.根据权利要求1所述的快速检测猪流行性腹泻病毒的荧光试纸，其特征在于，所述抗PEDV的单克隆抗体Ⅱ由杂交瘤细胞4A11分泌产生，所述的杂交瘤细胞4A11保藏在中国典型培养物保藏中心CCTCC，其菌种保藏编号为CCTCC NO:C201904。

4.权利要求1～3任一项所述的快速检测猪流行性腹泻病毒的荧光试纸的制备，其特征在于，包括以下步骤：

S1、标记抗PEDV单克隆抗体Ⅰ胶体金的步骤为：

S11、配置试剂：分别取1g EDC和NHS各自溶于100ML纯水，配置成10mg/mL的EDC和NHS的工作母液，4℃下保存；

S12、活化量子点荧光：取500μL量子点荧光用纯水稀释至1㎎/ml，将EDC和NHS的工作母液稀释为1mg/mL的EDC和NHS的工作液，分别加入87.5μL的EDC工作液和53.3μL的NHS工作也，避光常温混匀30min，得活化量子点荧光；

S13、取pH值为8.7且浓度为0.02mol/L的PBS缓冲液，以及体积百分浓度分别为20％的海藻糖、20％的蔗糖、0.5％的吐温-20、0.5％的BSA，搅匀过滤后取得复溶液；

S14、取1mL活化的量子点荧光加入66μL浓度为1㎎/mL的抗PEDV的单克隆抗体Ⅰ，避光常温混匀1h；再加入100μL体积百分比浓度为10％的BSA，避光常温混匀2h，13000rpm/min下离心30min，去上清后加入1mL复溶液溶解，4℃保存，得标记的抗PEDV单克隆抗体Ⅰ胶体金；

S2、制备抗PEDV的单克隆抗体Ⅰ－量子点荧光标记物垫的步骤为：

S21、配制包被液Ⅰ：取浓度为0.015mol/L的PBS缓冲液，以及体积百分浓度为0.5％的BSA、2.0％的海藻糖、2％的吐温-20，搅匀过滤得包被液Ⅰ；

S22、制备荧光标记物垫：将玻璃纤维素膜浸泡在上述包被液Ⅰ中30min，37℃下烘干；将标记的抗PEDV单克隆抗体Ⅰ胶体金稀释8倍后喷涂于处理过的玻璃纤维素膜上，喷量为10μL/cm，37℃下烘干2h，裁切成宽0.5cm条状的荧光标记物垫；

S3、喷涂检测线和质控线的步骤为：

S31、配制包被液Ⅱ：取pH值为7.2且浓度为0.02mol/L的PBS缓冲液，以及体积百分数浓度为1.0％的海藻糖、1.0％的山梨醇、0.3％的吐温-20、搅匀后用0.22μm的滤膜过滤，得包被液Ⅱ；

S32、将硝酸纤维素膜非点样面粘贴于聚氯乙烯底板上，将抗PEDV的单克隆抗体Ⅱ用包被液Ⅱ稀释至浓度为0.5mg/mL，然后喷涂于硝酸纤维素膜上作为检测线，喷量为0.8μL/cm；

将浓度为1.5mg/mL的羊抗鼠IgG喷涂在硝酸纤维素膜上作为质控线，喷量为0.8μL/cm；37℃下烘干2h备用；

S4、处理样品垫，将吸水纸浸泡在由浓度为0.015mol/L的PBS以及体积百分浓度为2.5％蔗糖和2％BSA组成的PBS缓冲液中30min，37℃下烘干，裁切成宽为1.8cm条状备用，得样品垫；

S5、试纸的组装、切割和包装，在硬质聚氯乙烯底板上依次粘贴有样品垫、荧光标记物垫、硝酸纤维素膜和吸水纸，样品垫部分覆盖在荧光标记物垫上，荧光标记物垫部分覆盖在硝酸纤维素膜上，吸水纸部分覆盖在硝酸纤维素膜上；荧光标记物垫与硝酸纤维素膜上的检测线相邻，吸水纸与硝酸纤维素膜上的质控线相邻；切成3.6mm宽得试纸成品。

5.权利要求1～3任一项所述的快速检测猪流行性腹泻病毒的荧光试纸的制备，其特征在于，步骤S32中，检测线和质控线的距离是5mm。

6.权利要求1～3任一项所述的快速检测猪流行性腹泻病毒的荧光试纸的应用，其特征在于，包括以下步骤：

P1、样品的预处理：取少量待测样本加至pH值为7.4，浓度为1mL的0.01mol/LPBS缓冲液中，搅匀后静置或离心，取上清液；

P2、检测：取75μL上清液滴在荧光试纸上，15min后放入便携检测仪中观察结果；

P3、结果判定：质控线、检测线上均出现橙色荧光时为阳性，即待测样本中含有猪流行性腹泻病毒；质控线出现橙色荧光、检测线不出现橙色荧光为阴性结果，即样本中不含有猪流行性腹泻病毒；质控线未出现橙色荧光，则试纸无效。