CN102033129A - 用抗原刺激的细胞免疫反应来检测病原微生物的方法及测试笔 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种用抗原刺激的细胞免疫反应来检测病原微生物的方法。本发明利用病原微生物的特异抗原或其功能片段刺激血液中已接触过该微生物的免疫细胞，使免疫细胞产生细胞因子，如伽玛干扰素(interferonγ，IFN-γ)，然后通过检测IFN-γ的量来判断动物体内是否有该病原微生物。本发明用胶体金标记免疫层析法来检测血液中的IFN-γ。此外，本发明还公开了一种检测病原微生物的胶体金免疫层析测试笔。本发明能够快速有效地检测出潜伏期或发病早期的病原微生物。

Description

用抗原刺激的细胞免疫反应来检测病原微生物的方法及测试笔
技术领域
本发明涉及分子生物学、免疫学和蛋白检测技术领域。更具体地，涉及一种用抗原刺激的细胞免疫反应来检测病原微生物的方法；此外，本发明还涉及一种检测病原微生物的胶体金免疫层析测试笔。
背景技术
由病原微生物感染引起的疾病很多，如肺结核、艾滋病(AIDS)、禽流感、严重急性呼吸综合征(severe acute respiratory syndrome，SARS)、肝炎、疟疾、炭疽病、肺炎、肝炎、疯牛病等，这些疾病由于能严重危害个人健康且具有很强的传染性，给人类的健康带来了很大的威胁。另外，由于很多时候这些病原微生物在体内能潜伏很长时间而不发病或发病较轻，给疾病的准确及时诊断带来了极大障碍，往往在病人病得很重、症状很明显时才能确诊，既延误了治疗时机，也容易传染他人。因此，尽早检测出动物或人体内是否有这些病原微生物十分重要。
目前常用的方法多是检测体液中病原微生物的抗体、抗原、DNA或RNA，但是由于初期病原微生物含量很少而不易检测出来，而取样品在培养扩增微生物又要花很长时间且过程复杂，不仅容易引入人为的错误而且往往贻误了最佳的治疗时间，因此有必要开发一种快速、简单、有效的检测方法来检测这类病原微生物引起的疾病。
众所周知，动物体内免疫系统的主要功能是清除动物体内的感染原，如病原微生物。在清除感染原的过程中，依赖于B淋巴细胞的体液免疫和依赖于T淋巴细胞的细胞免疫都必不可少。细胞内的病毒或细菌相对远离了体液免疫，但源自这些微生物的经处理和呈递的蛋白能促进T淋巴细胞的激活。相应的，对细胞内病原微生物(结核杆菌、HIV、流感病毒)的获得抗性依赖于T淋巴细胞和伽玛干扰素(interferonγ，IFN-γ)，IFN-γ和其他细胞因子的协同作用对于获得对细胞内病原微生物感染的抗性十分关键。因此，激活后T淋巴细胞的IFN-γ释放是针对胞内病原微生物抗原的细胞免疫反应的重要标志，可用于检测细胞免疫反应进而表明细胞内病原微生物的存在。
对于已经接触过病原微生物的免疫细胞，如T淋巴细胞，当再次受病原微生物的抗原刺激时，因细胞免疫反应会释放大量细胞因子，如IFN-γ、白介素(interleukin，IL)，转化生长因子(transforming growthfactorβ，TGF-β)等，因此可以通过检测刺激后血液中的细胞因子来反映动物体内是否有该病原微生物。
溶液中细胞因子的检测方法很多，都要用到细胞因子特异的抗体，具体方法可以是ELISA、化学发光、免疫荧光或抗体免疫层析等。
发明内容
本发明要解决的技术问题在于提供了一种用抗原刺激的细胞免疫反应来检测病原微生物的方法，该方法能够快速有效地检测出潜伏期或发病早期的病原微生物。为此，本发明还提供了一种检测病原微生物的胶体金免疫层析测试笔。
利用细胞免疫反应的原理，本发明提供了一种新的检测病原微生物的方法和测试笔。主要过程就是用病原微生物特异的抗原或抗原的功能片段与血液或血细胞保温至少6小时，然后用胶体金标记免疫层析法检测血液样品的IFN-γ、IL或TGF-β等细胞因子，从而判断动物是否感染了病原微生物，如结核杆菌、HIV、禽流感病毒、SARS冠状病毒、肝炎病毒、埃博拉病毒、朊蛋白等。
在本发明的一方面，提供一种用抗原刺激的细胞免疫反应来检测病原微生物的方法，该方法采用病原微生物特异的一个或多个抗原或抗原的功能片段与动物或人的全血或血细胞混合并在37℃保温至少6小时，再用特异的抗体来检测血细胞释放的细胞因子，检测到较无抗原刺激时更高浓度的细胞因子表明有病原微生物。
本发明中“病原微生物”也叫传染病原，指可通过呼吸道、消化道、皮肤、血液传播、传染的能够引起动物疾病的微生物，包括原核生物、细菌、病毒、真菌、朊蛋白等。更具体的，前述原核生物包括疟原虫，细菌包括导致肺结核的结核杆菌、引起炭疽病的炭疽杆菌、引起肺炎的链球菌或假单胞菌、引起梅毒的苍白螺旋体等，病毒包括HIV、各种流感病毒、SARS冠状病毒、肝炎病毒、埃博拉病毒等，真菌包括酵母等。朊蛋白则能引起疯牛病、羊瘙痒症。
本发明中“抗原”指病原微生物特异的抗原，主要是病原微生物表面特异的蛋白、糖或脂，特异的抗原是一种病原微生物专有的，可以通过这些抗原特异的抗体鉴别一种病原微生物而把它与不同的病原微生物区分开来。不同病原微生物特异的抗原也能被动物的免疫系统区分开来并且被记住，以后当这些抗原再次进入动物体内时就会引发免疫系统的免疫反应。
本发明中“抗原的功能片段”指含有病原微生物抗原的全部或部分抗原决定簇的抗原组分或片段。在病原微生物进入动物体内被动物的免疫系统识别并记住后，当其抗原的功能片段进入动物体内时也会引发动物免疫系统的免疫反应。
优选地，所述病原微生物为结核杆菌，所述抗原为结核杆菌特异的抗原ESAT6、CFP10或P4。
优选地，所述病原微生物为HIV，所述抗原为HIV特异的抗原GP120、GP41、GP36或P24。
优选地，所述病原微生物为禽流感病毒，所述抗原为禽流感病毒特异的抗原血凝素(hemagglutinin，HA)、神经氨酸酶(neuraminidase，NA)或质子通道M2。
优选地，所述病原微生物为SARS冠状病毒，所述抗原为SARS冠状病毒特异的抗原刺突糖蛋白(spike glycoprotein)、红细胞凝集素乙酰酯酶糖蛋白(hemagglutinin-acetylesterase glycoprotein)或M蛋白。
所述血细胞释放的细胞因子为伽玛干扰素IFN-γ、白介素IL或转化生长因子TGF-β。
优选地，所述特异的抗体是IFN-γ的单克隆抗体。
所述检测的方法可采用ELISA(酶联免疫吸附剂测定法)、化学发光、免疫荧光或胶体金标记的抗体免疫层析法。
优选地，所述用特异的抗体来检测血细胞释放的细胞因子采用胶体金标记的IFN-γ单克隆抗体免疫层析测试笔。
在本发明的另一方面，提供一种检测病原微生物的测试笔，包括滤血纸、胶体金垫、硝酸纤维素膜、吸水滤纸和PVC底板；所述胶体金垫上面包被有小鼠抗人INF-γ的单克隆抗体——胶体金的复合物，所述硝酸纤维素膜上有测试线和控制线，该测试线上包被有IFN-γ，该控制线上包被有羊抗小鼠IgG多克隆抗体。
图1所示检测IFN-γ的测试笔包括塑料件帽子1，吸水棒2，滤血纸3，胶体金垫4，测试线(T线)5，硝酸纤维素膜(NC膜)6，控制线(C线)7，吸水滤纸8，塑料件下盖9，干燥剂10，塑料件上盖11，观察窗口12，PVC底板13。而图2所示检测IFN-γ的测试条包括滤血纸3、胶体金垫4、T线5、NC膜6、C线7、吸水滤纸8、PVC底板13。其中胶体金垫4上面包被有小鼠抗人INF-γ的单克隆抗体——胶体金的复合物，NC膜6上包被有T线5(含IFN-γ)和C线7(含羊抗小鼠IgG多克隆抗体)。该测试笔的测试原理为：样品滴加到吸水棒后，样品中的IFN-γ随溶液移动到胶体金垫上并与其中的金标IFN-γ单克隆抗体结合形成抗原抗体复合物，若样品中的IFN-γ不够多从而使金标IFN-γ单克隆抗体还能再结合抗原IFN-γ，那么这些单克隆抗体随溶液移动到T线时可与T线处的IFN-γ结合而使T线呈红色；反之，若样品中的IFN-γ过量而使金标IFN-γ单克隆抗体不能再结合抗原IFN-γ，这些单克隆抗体随溶液移动到T线时则不能与T线处的IFN-γ结合，T线将无颜色出现。未与T线结合的金标IFN-γ单克隆抗体继续随溶液移动到C线，和C线处的羊抗小鼠多克隆抗体结合而使C线呈红色，提示小鼠抗人IFN-γ单克隆抗体能被羊抗小鼠多克隆抗体识别。综上所述，当C线呈红色时，T线若也呈红色说明样品溶液中的IFN-γ浓度较低，受检病人体内无病原微生物；C线呈红色而T线无颜色出现则说明样品溶液中的IFN-γ浓度较高，受检病人体内含病原微生物。
该方法利用接触过病原微生物的动物或人的血细胞据有记忆功能，再次接触该病原微生物的蛋白组分时能被刺激而释放出细胞因子，如IFN-γ、IL、TGF-β等，从而通过检测这些细胞因子就能判断该动物体内是否有该病原微生物。该方法可以通过选择特异的蛋白组分(抗原或其功能片段)而提高特异性。因为不需要检测病原微生物的抗原或体内产生的抗体，只需检测血细胞反应，所以可以在病原微生物的潜伏期或发病的早期就检测出体内病原微生物的存在，缩短诊断时间，便于病人及时治疗，早日康复。
本发明通过检测细胞免疫反应的方法来检测结核杆菌、HIV、禽流感病毒、SARS冠状病毒等传染性较强的病原微生物，可以在微生物潜伏期或发病早期检测出微生物，不像现有的主要直接检测抗原或抗体的血清学方法需等到有大量的病原微生物或较强的体液免疫反应后才能检测，因此可尽早地检测出病原微生物，为病人的早日治疗赢得了时间。而且检测时间很短只需20小时左右，方法也很简单，大大减少了人力物力，节省了成本。另外本发明通过利用各种病原微生物特异的抗原或其功能片段，也显著提高了检测方法的特异性和灵敏度。
附图说明
图1是本发明中胶体金标记的IFN-γ单克隆抗体免疫层析法检测IFN-γ的测试笔的结构示意图；
图2是本发明中胶体金标记的IFN-γ单克隆抗体免疫层析法检测IFN-γ的测试条的结构示意图。
在图1和图2中，附图标记1-13说明：1-塑料件帽子；2-吸水棒；3-滤血纸；4-胶体金垫；5-测试线(T线)；6-硝酸纤维素膜(NC膜)；7-控制线(C线)；8-吸水滤纸；9-塑料件下盖；10-干燥剂；11-塑料件上盖；12-观察窗口；13-PVC底板。
具体实施方式
以下通过实施例和对比试验对本发明作进一步的阐述：
实施例1，检测IFN-γ的胶体金免疫层析测试笔的制备
图1所示测试笔的制备方法如下：
1.胶体金的制备：采用柠檬酸三钠还原法(HAuCl4、柠檬酸三钠购自Sigma公司)制备胶体金，胶体金颗粒大小在40nm左右。
2.抗IFN-γ抗体胶体金垫的制备
以1mg抗体/1500D胶体金的比例在pH8.4的条件下，用胶体金标记抗IFN-γ单克隆抗体(Abcam公司)，30分钟后，在pH7.4的条件下加入适量BSA，离心浓缩后即得到IFN-γ抗体金探针。
该金探针以胶体金膜稀释液(0.1M TAPS缓冲液，20％蔗糖，3.75％BSA，pH8.0)稀释至OD2.0后备用。
将玻璃纤维(Millipore公司)在OD2.0的IFN-γ胶体金膜溶液中充分浸泡后，取出并挤去多余液体，平铺于专用网架上；于相对湿度≤20％的环境中室温干燥过夜得IFN-γ抗体胶体金垫，备用。
3.IFN-γ硝酸纤维素膜(NC膜)的制备
以pH7.4的10mM PBS溶液将IFN-γ(Abcam)稀释至0.12mg/ml，0.22μm过滤。
以pH7.4的10mM PBS溶液将羊抗小鼠IgG多克隆抗体(厦门波生生物技术有限公司)稀释至2.0mg/ml，0.22μm过滤。
用IFN-γ溶液在NC膜(Millipore公司)T线(测试线)喷点的同时用羊抗小鼠IgG多克隆抗体溶液在NC膜C线(控制线)喷点以在膜上形成测试线和控制线，并将喷点完成的硝酸纤维素膜于相对湿度≤20％的环境中室温干燥过夜，备用。
4.粘膜大卡的制备：
粘膜时车间工作环境相对湿度要求低于30％。
如图1和图2所示，取60mm×300mm胶板(底衬)一块，在中心位置上粘贴包被后的NC膜6，NC膜的T线5位置朝下；在NC膜T线5的一侧下部粘贴一条胶体金垫4并部分覆盖NC膜6的下缘，保证两者有1～2mm的重叠；在胶体金垫4下侧粘贴一条滤血纸3(Ahlstrom Filtration公司)并部分覆盖胶体金垫4下缘；在PVC底板13(millipore公司)未贴滤血纸3的一端粘贴吸水滤纸8(Ahlstrom Filtration公司)一条，并保证部分覆盖NC膜6上缘；将粘贴后的大卡装入塑料袋，在相对湿度低于20％的低湿储存间保存。
5.测试芯片的切割、装配及包装
切割、装配时的车间工作环境相对湿度要求低于30％。
如图1所示，将大卡用Matrix2501切割机切割成6mm宽度的生物测试芯片试纸条，将6mm试纸条、吸水棒2(Filtrona Fibertec公司)和干燥剂10(Sud-Chemie公司)按测试笔装配步骤按序装入塑料件(包括塑料件帽子1、塑料件下盖9和塑料件上盖11)装配成测试笔，将测试笔用铝箔包装密封。
实施例2，通过检测人血液中的IFN-γ来检测结核杆菌
第一步，收集血液样品。抽取病人1ml血液，加入含肝素(香港先进技术工业有限公司)的无菌试管中作阴性对照管；然后抽取病人1ml血液，加入含肝素、结核杆菌抗原(ESAT6和CFP10，香港先进技术工业有限公司)的无菌试管中作测量管；再抽取病人1ml血液，加入含肝素、细胞分裂原(如植物凝集素，phytohemagglutinin，香港先进技术工业有限公司)作阳性对照管。将3管血液分别充分震荡。12小时内开始检测试验。第二步，样品保温。收集血液样品后，在12小时内将3个试管于37℃保温6-24小时。第三步，样品检测。取100μl样品滴加到图1所示检测IFN-γ的胶体金免疫层析测试笔(盒中含图2示检测IFN-γ的胶体金免疫层析测试条)的吸水棒2，10分钟后如果控制线7位置出现红线，测试线5位置也出现红线，表明样品中IFN-γ浓度较低；反之若控制线7位置出现红线，测试线5位置不出现红线，表明样品中IFN-γ浓度较高。第四步，结果判读。对于该检测人体内结核杆菌的方法，当阴性对照中IFN-γ浓度较低(测试线位置出现红线)且阳性对照中IFN-γ浓度较高(测试线位置不出现红线)时，若测量管中IFN-γ浓度较低(测试线位置出现红线)，提示病人体内没有结核杆菌；反之，若测量管中IFN-γ浓度较高(测试线位置不出现红线)，提示病人体内有结核杆菌。如果阴性对照中IFN-γ浓度较高(测试线位置不出现红线)或者阳性对照中IFN-γ浓度较低(测试线位置出现红线)，提示血液样品本身IFN-γ基线太高或者血液中血细胞出现问题而对细胞分裂原没反应，发生这两种情况时表明检测失败，要重新检测。
用10例病人的血样检测后结果显示7例含结核杆菌，3例不含结核杆菌，与临床诊断结果一致。
样品中的IFN-γ也可用ELISA(enzyme 1inked immunosorbent assay)测量。测量方法为将酶标板的孔用IFN-γ的单克隆抗体(abcam公司)包被，再加入样品溶液，室温保温2小时后洗板，再加入辣根过氧化物酶HRP偶联的IFN-γ的单克隆抗体(abcam)，室温保温2小时后洗板，加入HRP的底物(abcam)反应后将酶标板置于Bio-Rad酶标仪中于450nm读数，根据IFN-γ的标准曲线分析IFN-γ的浓度。
本领域的技术人员知道还可以采取化学发光、免疫荧光等方法来用抗体检测IFN-γ等细胞因子。
该方法不仅能够检测出结核病人体内的结核杆菌，还能够检测出未发病的人体内潜伏的结核杆菌。该方法克服了现有的噬菌体快速扩增法不够快，血清学诊断方法中灵敏度和特异性不高的缺陷，将诊断过程缩减到20个小时左右，并且提高了灵敏度和特异性，以满足快速确诊肺结核的需要，便于对患者及时用药治疗。
实施例3，通过检测人血液中的IFN-γ来检测HIV
第一步，收集血液样品。抽取病人1ml血液，加入含肝素(香港先进技术工业有限公司)的无菌试管中作阴性对照管；然后抽取病人1ml血液，加入含肝素、HIV抗原(GP120、GP41、GP36和P24，香港先进技术工业有限公司)的无菌试管中作测量管；再抽取病人1ml血液，加入含肝素、细胞分裂原(如植物凝集素，phytohemagglutinin，香港先进技术工业有限公司)作阳性对照管。将3管血液分别充分震荡。12小时内开始检测试验。第二步，样品保温。收集血液样品后，在12小时内将3个试管于37℃保温6-24小时。第三步，样品检测。取100μl样品滴加到图1所示检测IFN-γ的测试笔(盒中含图2示检测IFN-γ的胶体金免疫层析测试条)的吸水棒2，10分钟后如果控制线7位置出现红线，测试线5位置也出现红线，表明样品中IFN-γ浓度较低；反之若控制线7位置出现红线，测试线5位置不出现红线，表明样品中IFN-γ浓度较高。第四步，结果判读。对于该检测人体内HIV的方法，当阴性对照中IFN-γ浓度较低(测试线位置出现红线)且阳性对照中IFN-γ浓度较高(测试线位置不出现红线)时，若测量管中IFN-γ浓度较低(测试线位置出现红线)，提示病人体内没有HIV；反之，若测量管中IFN-γ浓度较高(测试线位置不出现红线)，提示病人体内有HIV。如果阴性对照中IFN-γ浓度较高(测试线位置不出现红线)或者阳性对照中IFN-γ浓度较低(测试线位置出现红线)，提示血液样品本身IFN-γ基线太高或者血液中血细胞出现问题而对细胞分裂原没反应，发生这两种情况时表明检测失败，要重新检测。
用10例病人的血样检测后结果显示4例含HIV，6例不含HIV，与临床诊断结果一致。
实施例4通过检测人血液中的IFN-γ来检测禽流感病毒
第一步，收集血液样品。抽取病人1ml血液，加入含肝素(香港先进技术工业有限公司)的无菌试管中作阴性对照管；然后抽取病人1ml血液，加入含肝素、禽流感病毒抗原(血凝素HA和神经氨酸酶NA，香港先进技术工业有限公司)的无菌试管中作测量管；再抽取病人1ml血液，加入含肝素、细胞分裂原(如植物凝集素，phytohemagglutinin，香港先进技术工业有限公司)作阳性对照管。将3管血液分别充分震荡。12小时内开始检测试验。第二步，样品保温。收集血液样品后，在12小时内将3个试管于37℃保温6-24小时。第三步，样品检测。取100μl样品滴加到图1所示检测IFN-γ的测试笔(盒中含图2示检测IFN-γ的胶体金免疫层析测试条)的吸水棒2，10分钟后如果控制线7位置出现红线，测试线5位置也出现红线，表明样品中IFN-γ浓度较低；反之若控制线7位置出现红线，测试线5位置不出现红线，表明样品中IFN-γ浓度较高。第四步，结果判读。对于该检测人体内禽流感病毒的方法，当阴性对照中IFN-γ浓度较低(测试线位置出现红线)且阳性对照中IFN-γ浓度较高(测试线位置不出现红线)时，若测量管中IFN-γ浓度较低(测试线位置出现红线)，提示病人体内没有禽流感病毒；反之，若测量管中IFN-γ浓度较高(测试线位置不出现红线)，提示病人体内有禽流感病毒。如果阴性对照中IFN-γ浓度较高(测试线位置不出现红线)或者阳性对照中IFN-γ浓度较低(测试线位置出现红线)，提示血液样品本身IFN-γ基线太高或者血液中血细胞出现问题而对细胞分裂原没反应，发生这两种情况时表明检测失败，要重新检测。
用10例病人的血样检测后结果显示3例含禽流感病毒，7例不含禽流感病毒，与临床诊断结果一致。
实施例5通过检测人血液中的IFN-γ来检测SARS冠状病毒
第一步，收集血液样品。抽取病人1ml血液，加入含肝素(香港先进技术工业有限公司)的无菌试管中作阴性对照管；然后抽取病人1ml血液，加入含肝素、SARS冠状病毒抗原(刺突糖蛋白和红细胞凝集素乙酰酯酶糖蛋白，香港先进技术工业有限公司)的无菌试管中作测量管；再抽取病人1ml血液，加入含肝素、细胞分裂原(如植物凝集素，phytohemagglutinin，香港先进技术工业有限公司)作阳性对照管。将3管血液分别充分震荡。12小时内开始检测试验。第二步，样品保温。收集血液样品后，在12小时内将3个试管于37℃保温6-24小时。第三步，样品检测。取100μl样品滴加到图1所示检测IFN-γ的测试笔(盒中含图2示检测IFN-γ的胶体金免疫层析测试条)的吸水棒2，10分钟后如果控制线7位置出现红线，测试线5位置也出现红线，表明样品中IFN-γ浓度较低；反之若控制线7位置出现红线，测试线5位置不出现红线，表明样品中IFN-γ浓度较高。第四步，结果判读。对于该检测人体内SARS冠状病毒的方法，当阴性对照中IFN-γ浓度较低(测试线位置出现红线)且阳性对照中IFN-γ浓度较高(测试线位置不出现红线)时，若测量管中IFN-γ浓度较低(测试线位置出现红线)，提示病人体内没有SARS冠状病毒；反之，若测量管中IFN-γ浓度较高(测试线位置不出现红线)，提示病人体内有SARS冠状病毒。如果阴性对照中IFN-γ浓度较高(测试线位置不出现红线)或者阳性对照中IFN-γ浓度较低(测试线位置出现红线)，提示血液样品本身IFN-γ基线太高或者血液中血细胞出现问题而对细胞分裂原没反应，发生这两种情况时表明检测失败，要重新检测。
用10例病人的血样检测后结果显示2例含SARS冠状病毒，8例不含SARS冠状病毒，与临床诊断结果一致。

Claims (10)

1.一种用抗原刺激的细胞免疫反应来检测病原微生物的方法，其特征在于，该方法采用病原微生物特异的一个或多个抗原或抗原的功能片段与动物或人的全血或血细胞混合并在37℃保温至少6小时，再用特异的抗体来检测血细胞释放的细胞因子，检测到较无抗原刺激时更高浓度的细胞因子表明有病原微生物。
2.如权利要求1所述的用抗原刺激的细胞免疫反应来检测病原微生物的方法，其特征在于，所述病原微生物为结核杆菌，所述抗原为结核杆菌特异的抗原ESAT6、CFP10或P4。
3.如权利要求1所述的用抗原刺激的细胞免疫反应来检测病原微生物的方法，其特征在于，所述病原微生物为HIV，所述抗原为HIV特异的抗原GP120、GP41、GP36或P24。
4.如权利要求1所述的用抗原刺激的细胞免疫反应来检测病原微生物的方法，其特征在于，所述病原微生物为禽流感病毒，所述抗原为禽流感病毒特异的抗原血凝素HA、神经氨酸酶NA或质子通道M2。
5.如权利要求1所述的用抗原刺激的细胞免疫反应来检测病原微生物的方法，其特征在于，所述病原微生物为SARS冠状病毒，所述抗原为SARS冠状病毒特异的抗原刺突糖蛋白、红细胞凝集素乙酰酯酶糖蛋白或M蛋白。
6.如权利要求1所述的用抗原刺激的细胞免疫反应来检测病原微生物的方法，其特征在于，所述血细胞释放的细胞因子为伽玛干扰素IFN-γ、白介素IL或转化生长因子TGF-β。
7.如权利要求1-5任一项所述的用抗原刺激的细胞免疫反应来检测病原微生物的方法，其特征在于，所述特异的抗体是IFN-γ的单克隆抗体。
8.如权利要求1所述的用抗原刺激的细胞免疫反应来检测病原微生物的方法，其特征在于，所述检测的方法采用ELISA、化学发光、免疫荧光或抗体免疫层析法。
9.如权利要求1所述的用抗原刺激的细胞免疫反应来检测病原微生物的方法，其特征在于，所述用特异的抗体来检测血细胞释放的细胞因子采用胶体金标记的IFN-γ单克隆抗体免疫层析测试笔。
10.一种检测病原微生物的胶体金免疫层析测试笔，其特征在于，包括滤血纸、胶体金垫、硝酸纤维素膜、吸水滤纸和PVC底板；所述胶体金垫上面包被有小鼠抗人INF-γ的单克隆抗体——胶体金的复合物，所述硝酸纤维素膜上面含有测试线和控制线，该测试线上包被有IFN-γ，该控制线上包被有羊抗小鼠IgG多克隆抗体。
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