CN102650642A

CN102650642A - 一种用于检测人视黄醇结合蛋白4的抗体复合物及免疫层析检测卡和试剂盒

Info

Publication number: CN102650642A
Application number: CN2012101415972A
Authority: CN
Inventors: 邢国杰; 沈鹤柏
Original assignee: Shanghai Normal University
Current assignee: Shanghai Normal University; University of Shanghai for Science and Technology
Priority date: 2012-05-08
Filing date: 2012-05-08
Publication date: 2012-08-29

Abstract

本发明涉及生物医药领域，具体为检测人视黄醇结合蛋白4的抗体复合物及免疫层析检测卡，将人视黄醇结合蛋白4单克隆抗体1与胶体金颗粒连接，得到的抗体复合物用来制备人视黄醇结合蛋白4疫层析检测卡和试剂盒，具有灵敏度好，特异性强等优点。

Description

一种用于检测人视黄醇结合蛋白4的抗体复合物及免疫层析检测卡和试剂盒

技术领域

本发明涉及生物医药领域，具体为检测人视黄醇结合蛋白4的抗体复合物及免疫层析检测卡。

背景技术

视黄醇结合蛋白（Retinol Binding Protein,RBP）是一类在人体内负责从肝脏转运视黄醇至各组织细胞的运载蛋白，对视黄醇生理功能的发挥起着重要作用。RBP主要在肝脏中合成。肝脏中分泌的RBP-视黄醇聚合物与转铁蛋白（Transthyretin，TTR）形成稳定的蛋白复合物在血液系统中循环。RBP-视黄醇-TTR复合体在视黄醇释放后解体，RBP以游离形式存在于血液系统中，由肾小球滤过，再由近端小管上皮细胞重吸收、降解。因此正常人尿液中几乎不含有RBP（含量低于300ng/ml）。若肾小管病变，则重吸收功能下降，会导致尿液中的RBP大量上升。因此，在肾小管损伤病人尿液中RBP含量大于300ng/ml，一般可达到正常人的5倍以上，严重者其尿液中的RBP含量甚至可以达到10000ng/ml以上。故尿液中RBP增高具有早期诊断意义，被认为是肾小管损伤的一个良好的早期标志物，对RBP的检测已经被广泛应用于临床上对肾脏损伤的诊断中。

目前，医院常用的检测RBP的方法是基于免疫比浊法或酶联免疫吸附法（ELISA）。但上述方法步骤比较繁琐，测量时间较长，结果易受操作者技术水平等的影响，不确定性因素较多。而且要求操作者具有一定的操作技能，同时配备酶标仪，因此检测成本相对较高。为了达到简便、快速、高效和经济的检测尿RBP的要求，我们提出开发视黄醇结合蛋白4检测试剂盒（胶体金免疫层析法），意在建立一种肾小管损伤诊断的新技术。另外，通过专利检索，发现目前没有通过使用胶体金免疫层析法检测RBP4来诊断肾小管损伤的相关试剂盒专利。

发明内容

本发明旨在提供一种用于检测人视黄醇蛋白4的抗体复合物。

本发明还提供了人视黄醇结合蛋白4的免疫层析检测卡及试剂盒。

一种用于检测人视黄醇蛋白4的抗体复合物，其制备方法包括以下步骤：

将人视黄醇蛋白4（RBP4）单克隆抗体1标记于胶体金颗粒表面：将含有胶体金颗粒的溶液pH调节至8.2～8.7，加入人视黄醇蛋白4单克隆抗体1，震荡反应5～15分钟，用BSA封闭后离心，沉淀用硼酸缓冲液重悬后再次离心纯化；弃去上清取下层液体，即得到人视黄醇蛋白4的抗体复合物。

胶体金颗粒的粒径为10～30nm，优选20nm。

人视黄醇蛋白4（RBP4）单克隆抗体1与胶体金颗粒用量比为1～8μg：1mg，优选为5μg：1mg；胶体金颗粒溶液浓度为0.5～2mg/mL，优选为1mg/mL。

所得到的用于检测人视黄醇蛋白4的抗体复合物可用于制备检测视黄醇结合蛋白4的试剂及试剂盒。

所得到的用于检测人视黄醇蛋白4的抗体复合物进一步用来制备视黄醇结合蛋白4的免疫层析检测卡：

其结构包括结合垫、样品垫、分析膜和吸水纸，分析膜上包括检测线（T线）和质控线（C线）。

结合垫的制备方法为：用于检测人视黄醇蛋白4的抗体复合物与胶体金稀释液混合（用于检测人视黄醇蛋白4的抗体复合物与胶体金稀释液的混合体积比为1:15～30，优选为1:20）后喷在结合垫材料上，结合垫的材料选自玻璃纤维素膜；胶体金稀释液为0.03～0.08mol/L、pH=7.8～8.2的Tris-HCl缓冲液，含0.5%～1.0%BSA，0.3%～0.8%聚乙烯基吡咯烷酮PVP，0.2%～0.5%聚乙烯醇PEG，1.0%～3.0%蔗糖，0.1%～0.3%吐温-20；聚乙烯醇的分子量为10000～25000。

样品垫的制备方法为：样品垫材料用处理液浸泡并干燥，样品垫材料选自玻璃纤维素膜；处理液为pH=7.2～7.4、0.01～0.02mol/L的磷酸缓冲液，含0.5%～1.0%BSA，0.3%～0.8%乙烯基吡咯烷酮，0.1%～0.3%吐温-20。

分析膜的制备方法为：在分析膜上喷点RBP4单克隆抗体2和羊抗鼠IgG抗体，羊抗鼠IgG抗体在上形成质控线（C线），RBP4单克隆抗体2在下形成检测线（T线），烘干；分析膜的材料为硝酸纤维素膜（NC膜）。

将上述样品垫、结合垫、分析膜和吸水纸依次粘贴在底板上，切成4mm宽的检测试纸条并装在塑料外壳中，得到人视黄醇结合蛋白4的免疫层析检测卡。

一种视黄醇结合蛋白4检测试剂盒，包括上述视人黄醇结合蛋白4的免疫层析检测卡、一次性塑料滴管和样品稀释液，样品稀释液为pH7.2～7.4、0.005～0.02mol/L的磷酸缓冲液，含有3%～6%BSA和0.3%～0.5%防腐剂。

本发明的视黄醇结合蛋白4检测试剂盒，利用胶体金免疫层析法，是一种快速、简便、无创的检测试剂：通过将抗原-抗体免疫学反应与层析技术相结合，并以干片法试纸的形式，达到对尿液中RBP4含量的定性及定量检测，是一种用于临床辅助诊断和体检筛查的检测方法。该免疫层析检测试剂盒灵敏度好，特异性强。

附图说明

图1为人黄醇结合蛋白4的免疫层析检测卡的结构示意图

其中1—样品垫，2—结合垫，3—分析膜，31—检测线（T线），32—质控线（C线），4—吸水纸，5—底板。

具体实施方式

试剂：RBP4单克隆抗体1和RBP4单克隆抗体2（上海柏纳生物技术有限公司）；胶体金，颗粒粒径20nm。

实施例1：胶体金-RBP抗体复合物的制备

用0.1mol/LK₂CO₃将1ml浓度为1mg/mL的胶体金（颗粒粒径20nm）溶液pH调至8.5，然后将5μg RBP4单克隆抗体1加入到胶体金溶液中，室温震荡反应10分钟，然后用10%BSA溶液封闭，低温离心，用浓度0.002mol/L、pH=9.0硼酸缓冲液重悬至原体积，再次离心纯化，弃去上清，取下层液体4℃保存。

实施例2：视黄醇结合蛋白4（RBP4）免疫层析检测卡的制备

2.1样品垫的制备：选用玻璃纤维素膜作为样品垫材料，将其放入处理液（pH=7.4、0.01M磷酸缓冲液PBS，含0.5%～1.0%BSA，0.3%~0.8%乙烯基吡咯烷酮PVP，0.1%～0.3%吐温-20）中浸泡10分钟后取出，37℃烘干备用。

2.2结合垫的制备：选用玻璃纤维素膜作为结合垫材料，将上述实施例1所制备的胶体金-RBP抗体复合物按1:20的体积比重新分散于胶体金稀释液（0.05mol/L、pH=8.0Tris-HCl缓冲液，含0.5%～1.0%BSA，0.3%～0.8%聚乙烯基吡咯烷酮，0.2%～0.5%聚乙烯醇2万，1.0%～3.0%蔗糖，0.1%～0.3%吐温-20，均为重量百分比）中，并喷于结合垫上，37℃烘干。

2.3硝酸纤维素膜（NC膜）的包被，制备分析膜：用点膜仪在NC膜的不同位置喷点RBP4单抗2及羊抗鼠IgG抗体，自下至上依次为质控线（羊抗鼠IgG抗体）、检测线（RBP4单抗2），37℃烘干，如图1所示。

2.4组装：将吸水纸、分析膜、结合垫、样品垫依次贴在带有粘合剂的底板上，如图1所示；并切成4cm宽的试纸条，装在塑料外壳中（即装卡）。

实施例3：样品稀释液的制备

配制一定浓度的磷酸缓冲液PBS（0.01mol/L，pH7.2～7.4），添加适量的保护蛋白BSA（终浓度5%），最后加入防腐剂Proclin 300（0.3%～0.5%）。将配好的样品稀释液按15mL的量分装到塑料试剂瓶中即得到RBP4样品稀释液。

实施例4：胶体金免疫层析法视黄醇结合蛋白4（RBP4）检测试剂盒的制备

4.1将实施例2制备的人视黄醇结合蛋白4（RBP4）免疫层析检测卡、一次性塑料滴管和干燥剂一起装入铝箔袋中，封口机封口，得到1人份的检测试剂。

4.2将20人份检测试剂、1瓶样品稀释液以及1份说明书装在包装盒中。

实施例5：RBP标准溶液的检测

5.1将RBP4标准品用PBS作为稀释液配置成系列标准液：250ng/mL、300ng/mL，500ng/mL。

5.2将上述标准液分别准确稀释60倍，用一次性塑料滴管分别吸取2滴标准液滴加到检测卡的加样孔中，10分钟后观测结果。结果为阳性则质控线和检测线均显红色；结果为阴性则质控线显色，检测线不显色。

实施例6：性能测试

6.1灵敏度

对同一批试剂盒用标准溶液进行检测，实验结果为250ng/mL时为阴性，300ng/mL时为弱阳性，500ng/mL时为阳性，即灵敏度为300ng/mL。

6.2特异性

取同一批试剂盒，对5例阴性质控品进行检测，阴性质控品分别为尿微量白蛋白（20000ng/ml）、转铁蛋白（2×10⁶ng/ml）、纤维连接蛋白（300ng/ml）、β2-微球蛋白（200ng/ml）、溶菌酶（2000ng/ml），检测结果100%为阴性。

6.3.重复性

6.3.1批内差异

取同一批号试剂盒，分别检测300ng/mL和500ng/mL阳性质控品各5次，检测结果100%为阳性，反应结果应一致，显色应均一；质控线显色，检测线显色为红色。

6.3.2批间差异

取3个批号的试剂盒检测500ng/ml阳性样本各5次，检测结果100%为阳性，反应结果应一致，显色应均一；质控线显色，检测线显色为红色。

6.4.稳定性

试剂盒在37℃条件放置20d后，灵敏度和重复性结果依然符合6.1-6.3。

Claims

1.一种用于检测人视黄醇蛋白4的抗体复合物，其特征在于，制备方法为将人视黄醇蛋白4单克隆抗体1标记于胶体金颗粒表面，包括以下步骤：

将含有胶体金颗粒的溶液pH调节至8.2～8.7，加入人视黄醇蛋白4单克隆抗体1，震荡反应5～15分钟，封闭后离心、沉淀重悬后再次离心纯化。

2.权利要求1所述用于检测人视黄醇蛋白4的抗体复合物，其特征在于，所述胶体金颗粒的粒径为10～30nm，含有胶体金颗粒的溶液浓度为0.5～2mg/mL。

3.权利要求1所述用于检测人视黄醇蛋白4的抗体复合物，其特征在于，人视黄醇蛋白4单克隆抗体1与胶体金颗粒用量比为1～8μg：1mg。

4.权利要求1所述用于检测人视黄醇蛋白4的抗体复合物，其特征在于，用pH=8.5～9.5、浓度为0.001～0.005mol/L的硼酸缓冲液重悬沉淀。

5.人视黄醇结合蛋白4的免疫层析检测卡，其特征在于，结构包括结合垫、样品垫、分析膜和吸水纸，分析膜上包括检测线和质控线；

所述的结合垫上含有权利要求1～4任一项所述的用于检测人视黄醇蛋白4的抗体复合物；

所述的检测线上含有人视黄醇蛋白4单克隆抗体2。

6.权利要求5所述人视黄醇结合蛋白4的免疫层析检测卡，其特征在于，所述质控线上含有羊抗鼠IgG抗体。

7.权利要求5所述人视黄醇结合蛋白4的免疫层析检测卡，其特征在于，所述结合垫的制备方法为：用于检测人视黄醇蛋白4的抗体复合物与胶体金稀释液混合按1:15～30的体积比混合后喷在结合垫材料上；

样品垫的制备方法为：样品垫材料用处理液浸泡并干燥。

8.权利要求7所述人视黄醇结合蛋白4的免疫层析检测卡，其特征在于，样品垫材料选自玻璃纤维素膜；结合垫材料选自玻璃纤维素膜；处理液为pH=7.2～7.5、0.005～0.02mol/L的磷酸缓冲液，含0.5%～1.0%BSA，0.3%～0.8%聚乙烯基吡咯烷酮，0.1%～0.3%吐温-20；

胶体金稀释液为0.03～0.08mol/L、pH=7.8～8.2的Tris-HCl缓冲液，含0.5%～1.0%BSA，0.3%～0.8%聚乙烯基吡咯烷酮，0.2%～0.5%聚乙烯醇，1.0%～3.0%蔗糖，0.1%～0.3%吐温-20，聚乙烯醇的分子量为10000～25000。

9.一种检测人视黄醇结合蛋白4的试剂盒，其特征在于，包括权利要求5～8任一项所述的人视黄醇结合蛋白4的免疫层析检测卡和样品稀释液，所述样品稀释液为pH7.2～7.4、0.005～0.02mol/L的磷酸缓冲液，含有3%～6%BSA和0.3%～0.5%防腐剂。

10.权利要求1～4任一项所述的用于检测人视黄醇蛋白4的抗体复合物在制备检测人视黄醇蛋白4的试剂方面的应用。