CN101967465A - 视黄醇结合蛋白单抗、其杂交瘤细胞及其制备方法和用途 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种新的RBP4单克隆抗体。本发明还公开了产生所述单克隆抗体的杂交瘤细胞系。本发明还公开了制备所述单克隆抗体的方法和该单克隆抗体的应用。本发明的单克隆抗体能够高特异性地结合RBP4抗原，具有很高的亲和力。

Description

视黄醇结合蛋白单抗、其杂交瘤细胞及其制备方法和用途

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别涉及一种视黄醇结合蛋白单克隆抗体、其杂交瘤细胞及其制备方法和用途。

背景技术

视黄醇结合蛋白(retinol-binding protein，RBP)为血中维生素A(VitA)的特异转运蛋白。RBP为低分子量蛋白，能自由滤过肾小球，近端肾小管几乎完全重吸收，其在血尿中变化与肾脏疾病密切相关。RBP以肝脏合成为主，血清、脑脊液、尿及其他体液为辅。目前已发现七种不同的RBP亚型，主要分布于血液循环系统(RBP4，简称RBP)、细胞(RBP1，RBP2，RBP5，RBP6，RBP7，简称RBPs)和视网膜光感受器间(RBP3，简称IRBP)。

RBP4(NM_006744)为一种单一肽链蛋白质，含有184个氨基酸残基和3个二硫键，有一个结合一分子全反式视黄醇的结合点。RBP4分子量为21000，沉降系数2.13～2.30，等电点为pH 4.4～4.8，半衰期约为3～12小时，合成率为每天每公斤体重5mg。RBP4在肝脏合成，受到全反式视黄醇刺激后分泌出来，释放入血液后与视黄醇(retinol，ROH)、甲状腺素运载蛋白(transthretin，TTR)以1∶1∶1的比例形成三元复合物。分泌入血的RBP4量受到视黄醇的严格调控。RBP受体在不同组织细胞的分布变化很大，其与RBP结合力也不一致。在肝、脾、肠分布的受体有特殊的结合力，在视网膜色素上皮细胞、胎盘、肾脏、骨髓其受体有高的结合力。不同组织RBP受体分布与VitA在不同组织的功能、代谢相一致。RBP与ROH结合，将ROH从肝储备区转运至肝外的靶组织。RBP与TTR结合增加ROH-RBP的稳定性，并防止小分子的RBP从肾脏滤过。RBP-VitA依赖细胞的表面受体协助VitA的摄入，当RBP-VitA结合到膜受体上后，RBP的构象改变与TTR及膜受体亲和力下降，促使视黄醇从RBP结合位点释放。

血浆中的视黄醇结合蛋白4(Retinol-binding protein 4；RBP4)与甲状腺素结合前白蛋白(Thyroxine-binding prealbumin；TBPA)结合形成复合物，并担负维生素A运载系统功能。RBP4最终由尿排出。同TBPA结合的RBP4其半寿期为12h，而游离的RBP4半衰期仅3.5h。该复合物能稳定特异地与ROH结合并进行细胞运转。而RBP4仅仅是血浆中ROH的携带者。多余的RBP4由肾小球滤过，再被近曲小管吸收(代谢降解)。肾小管疾病导致肾小管蛋白重吸收功能下降时，尿液中RBP4含量就会上升，在病情进行的初期约1-3mg/24h，严重时高于3mg/24h以上。(以正常人每天排尿量1.5升计算，约为0.67-2ug/ml，为正常人的10倍以上)，故尿液中RBP4增高具有早期诊断意义，是一种评价肾脏疾病特别是肾小管损伤疾病的良好指标。此外，肝胆系统疾病，如病毒性肝炎早期等、甲状旁腺功能亢进、营养不良均可引起血中RBP4降低，而慢性肾脏疾病时则升高。其检测方法在临床运用中显得尤为重要。目前检测血尿中的RBP4方法较多，常用的有免疫浊度、免疫电泳、酶联免疫和放射免疫分析等，但是酶联免疫具有高通量、可量化、精确度高、灵敏度高等优点。

Lucertini(Lucertini S，Valcavi P，Mutti A.ELISA of RBP in Serum and Urine[J].ClinChem，1984，30：149.)等建立了酶联免疫法(Enzyme-Linked Immunosorbnent Assay，ELISA)检测RBP4。ELISA的基础是抗原或抗体的固相化及抗原或抗体的酶标记。结合在固相载体表面的抗原或抗体仍保持其免疫学活性，酶标记的抗原或抗体既保留其免疫学活性，又保留酶的活性。在测定时，受检标本(测定其中的抗体或抗原)与固相载体表面的抗原或抗体起反应。用洗涤的方法使固相载体上形成的抗原抗体复合物与液体中的其他物质分开。再加入酶标记的抗原或抗体，也通过反应而结合在固相载体上。此时固相上的酶量与标本中受检物质的量呈一定的比例。加入酶反应的底物后，底物被酶催化成为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量直接相关，故可根据呈色的深浅进行定性或定量分析。由于酶的催化效率很高，间接地放大了免疫反应的结果，使测定方法达到很高的敏感度。

20世纪90年代，Wolff等偶然的发现了在小鼠肌肉中注射质粒DNA后其在肌肉组织中能进行表达之后，Williams和Tang等科学家进一步证实了给予加强剂量的质粒后可使免疫反应增强。以上的实验结果表明直接给动物接种编码抗原的基因可使该动物获得对该抗原的免疫力，一种崭新的免疫接种技术应运而生，同时标志着DNA疫苗的诞生。所谓DNA免疫，是通过基因重组技术，将编码某种蛋白抗原的外源基因(DNA或是RNA)直接导入动物体内，通过宿主细胞的转录系统合成抗原蛋白，诱导宿主细胞产生对该抗原蛋白的一系列特异性免疫应答。目前研究使用得最多的是DNA或cDNA，所以又称为DNA疫苗、核酸疫苗或基因疫苗。

DNA疫苗由病原抗原编码基因及质粒载体两部分组成。抗原基因可以是单个基因或完整的一组基因，也可以是编码抗原决定簇的一段核苷酸序列。DNA疫苗载体质粒一般以质粒为基本骨架。

DNA质粒被导入宿主细胞后，病原体抗原的基因片段在宿主细胞内得到表达并合成抗原，再经过加工、处理、修饰递呈给免疫系统，激发免疫应答。这一过程类似于病原微生物感染或减毒活疫苗接种，所以DNA疫苗能有效地激发体液免疫和细胞免疫，尤其是其具有激活杀伤性T淋巴细胞的作用。

DNA疫苗作为第3代疫苗，具有其自身的特点。DNA疫苗的优点：(1)易操作性和稳定性。不管其编码序列如何，都可用相同的方法纯化和处理，并且干燥的DNA质粒在室温下相对稳定。另外，DNA疫苗生产成本相对低廉，这就为DNA疫苗大规模使用提供了条件。(2)免疫效果好。DNA疫苗在宿主细胞内表达，其加工处理过程与病毒感染的自然过程相似，抗原递呈过程也相同，从而以自然的形式被加工后以天然构象递呈给宿主的免疫识别系统，激发较强的免疫应答。(3)重组质粒DNA在宿主体内存在时间长持续刺激机体产生广泛的体液免疫应答和细胞免疫应答，产生持久免疫。(4)DNA疫苗可用于变异频繁或血清型较多的病原免疫预防DNA疫苗在对变异频繁或血清型较多的病原免疫预防过程中，对于目前多价活毒疫苗防治的疾病预防和治疗有重要意义。(5)质粒DNA无免疫原性，可以反复使用这一特点对具有母源抗体的动物尤为重要。

DNA疫苗具有传统疫苗所没有的优越性，但是真正运用于人体还有许多问题有待解决。载体DNA整合到宿主基因组内，有导致不利转化的可能。免疫效果有待提高。实验动物越大，基因免疫效果越差。

DNA疫苗开创了免疫学和疫苗学的新领域。越来越多的试验研究发现，DNA疫苗在免疫防御方面有良好的效果，但DNA疫苗还面临着许多挑战，比如DNA疫苗接种的免疫学机理，有关核酸疫苗在理论上的安全性问题等方面，还需要进一步的试验加以阐明。现在普遍认为，DNA疫苗应先用在传统方法无法对付的病原体和疾病上。在另一个方面，DNA疫苗的优势是它的治疗作用。相信随着研究的深化，DNA疫苗将会逐一解决现有的问题，在更多的领域中发挥作用。

发明内容

本发明的目的就是提供一种新的RBP4杂交瘤细胞系。

本发明的又一目的是提供RBP4单克隆抗体及其用途。

本发明的第一方面，提供一种杂交瘤细胞系，所述杂交瘤细胞系的保藏号为CCTCC NO：-C200946。

本发明的第二方面，提供一种抗RBP4单克隆抗体，所述单克隆抗体是由保藏号为CCTCCNO：-C200946的杂交瘤细胞系产生。

本发明的第三方面，提供一种上述单克隆抗体的制备方法，包括如下步骤：

(a)扩增产生上述单克隆抗体的杂交瘤细胞株；

(b)从扩增产物中回收抗RBP4单克隆抗体。

本发明的第四方面，提供一种上述单克隆抗体的制备方法，包括如下步骤：

(a)扩增保藏号为CCTCC NO：-C200946的杂交瘤细胞株；

(b)腹腔注射动物；

(c)回收腹水并从腹水中分离抗RBP4单克隆抗体。

本发明的第五方面提供一种组合物，所述组合物包括上述单克隆抗体和药学上可接受的载体和/或赋形剂。

本发明的第六方面，提供一种试剂盒，所述试剂盒含有上述单克隆抗体。

本发明的第七方面，提供一种试剂盒，所述试剂盒包括上述单克隆抗体和保藏号为CCTCCNO：-C200951的杂交瘤细胞系所产生的单克隆抗体。

本发明的第八方面，提供一种试剂盒，所述试剂盒试剂盒包括上述单克隆抗体和抗RBP4多克隆抗体。

上述试剂盒还含有标记或显色剂。

上述标记选自；辣根过氧化物酶、碱性磷酸酯酶、β-D-半乳糖甘酶、葡萄糖氧化酶、脲酶、过氧化氢酶或葡萄糖淀粉酶。

上述标记为辣根过氧化物酶。

本方面的第九方面，提供上述单克隆抗体在制备检测RBP4蛋白的试剂盒中的应用。

本领域技术人员可以根据上述标记的不同来选择相应的显色剂。如用于辣根过氧化物酶的邻苯二胺(OPD)、四甲基联苯胺(TMB)、二氨基联苯胺(DAB)；用于碱性磷酸酯酶的对硝基苯磷酸酯(p-NPP)等。

上述试剂盒可以定性、半定量或定量检测RBP4蛋白。

HAT选择性培养基主要成分为次黄嘌呤(hypoxanthine，H)、氨甲蝶呤(aminopterin，

A)和胸腺嘧啶核苷(thymidine，T)，简称HAT培养基。

本发明的杂交瘤细胞系RBP4-1(即SA-64-11)，RBP4-2(即s-113-7)已分别于2009年7月9日和2009年7月22日提交位于武汉的中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC)保藏，保藏号分别为CCTCC-C200946和CCTCC-C200951。

本发明的主要优点在于：

首次采用pBudCE4.1-RBP4重组质粒免疫小鼠，用该DNA疫苗的方法可获得的抗RBP4鼠单克隆抗体。

本发明所制备的抗RBP4鼠单克隆抗体能灵敏的识别人体中天然的视黄醇结合蛋白4。

使用GE Healthcare AKTA纯化系统，从肾小管疾病病人尿液中提取了天然的视黄醇结合蛋白4，从而确立了纯化该蛋白的工艺流程。

本发明所制备的抗RBP4鼠单克隆抗体中有两株能配对，及识别天然视黄醇结合蛋白4的不同位点，灵敏度高，从而可用于对相关疾病的诊断或检测。

本发明的其他方面由于本文的公开内容，对本领域技术人员而言是显而易见的。

附图说明

图1是pBudCE4.1-RBP4重组质粒瞬时转染293T细胞后Western Blotting检测RBP4-His融合蛋白结果图；

泳道1：PBudCE4.1-RBP4

泳道2：pBudCE4.1

图2是肾小管损伤疾病病人尿液经离子交换层析处理结果图；

图3是肾小管损伤疾病病人尿液经疏水层析处理结果图；

图4是肾小管损伤疾病病人尿液经分子筛处理结果图；

图5是实施例3最终纯化产物天然提纯蛋白RBP4的SDS-PAGE电泳图。

泳道1是蛋白Marker；泳道2-5是第一批肾小管损伤病人尿液样品经过离子交换层析、疏水层析和分子筛后分管收集的蛋白样品；泳道6-9是第二批肾小管损伤病人尿液样品经过离子交换层析、疏水层析和分子筛后分管收集的蛋白样品。

图6是实施例5中RBP定量检测试剂盒标准曲线；

图7是用S-113-7对尿液中RBP4蛋白进行免疫印迹检测的结果；

1：纯化的天然RBP蛋白(约25μg/ml)

2：P1病人尿液样品        3：P2号病人尿液样品

4：1号正常人尿液样品     5：2号正常人尿液样品

6：3号正常人尿液样品     7：P3号病人尿液样品

图8是用SA-64-11对尿液中RBP4蛋白进行免疫印迹检测的结果；

1：纯化的天然RBP蛋白(约25μg/ml)

2：102号病人尿液样品     3：37号病人尿液样品

4：41号病人尿液样品      5：1号正常人尿液样品

6：2号正常人尿液样品     7：3号正常人尿液样品

具体实施方式

本发明单克隆抗体的应用领域不受特别限制，如能用于免疫测定，包括定量或半定量检测。本发明的单克隆抗体可以检测RBP4的表达异常，作为判断慢性肾脏疾病或甲状旁腺功能亢进或营养不良等会导致RBP4表达水平升高或降低的疾病的依据。

经免疫产生本发明的杂交瘤的动物不受特别限制，包括例如：小鼠、大鼠和大耳兔。在其中优选的是小鼠。

本发明中所述RBP除非特别说明，否则和RBP4可以互换使用，均为视黄醇结合蛋白4。

本发明的免疫测定法用至少一种本发明的单克隆抗体进行，方法可仅用一种抗体进行，也可与RBP4多克隆抗体结合进行，或同时使用两种以上单克隆抗体(如SA-64-11和s-113-7)。

作为本发明的免疫测定法，包括酶免疫测定(EIA)、酶联免疫吸附测定(ELISA)、放射免疫测定(RIA)、荧光免疫测定(FIA)、蛋白质印迹、免疫层析等技术。上述各种免疫测定法可用于以竞争法或夹心法，用标记物标记的抗原或抗体测定靶抗原或抗体。在上述各种免疫测定法中，ELISA和免疫层析技术是优选的。

上述夹心法包括例如：使RBP4夹在固定的一种本发明单克隆抗体(如RBP4-1)和用标记剂标记的另一本发明单克隆抗体或抗RBP4多克隆抗体之间，然后加入针对标记物(例如酶)的底物等，显示颜色，从而检测标本中的RBP4。通常考虑灵敏度高超的单克隆抗体作为优选的标记抗体，因为与特异性低而背景噪声高的多克隆抗体相比较，单克隆抗体的特异性高而背景噪声低，使检测更为准确。而且本发明获得的2株单克隆抗体可以识别不同位点，特异性高，实验结果稳定可靠。

上述竞争性方法基于例如：测试标本中RBP4和已知量的标记的RBP4与本发明的单克隆抗体定量竞争性结合反应。在上述特别提到的竞争性方法中，在含有RBP4的标本溶液中加入预定量的固定在载体上的抗体和预定量的用标记剂标记的RBP4。然后，测定保留在载体上的标记剂活性或未保留在载体上的标记剂活性。对此，优选几乎同时加入抗体和标记抗原。

对于上述标记剂，可使用放射性同位素或酶等，例如¹²⁵I、酶、酶底物、磷光物质、荧光物质、生物素和着色物质。在将这些标记剂与抗原或抗体结合中，可使用马来酰亚胺法(J.Biochem.(1976)，79，233)，活化生物素法(J.Am.Chem.SOC.(1978)，100，3585)或疏水键法。

对于上述提到的酶，包括例如过氧化物酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶和葡萄糖氧化酶。对于用于该场合的底物，可选择适合该场合所用的酶的底物，包括例如：ABTS、TMB、鲁米诺-H₂O₂、o-苯二胺一H₂O₂(针对过氧化物酶)、磷酸对硝基苯酯、磷酸甲基缴形酯、3-(2’一螺环金刚烷)-4-甲氧基-4-(3’-磷酰氧基)苯基-1，，2-二氧杂环丁烷(针对碱性磷酸酶)、对硝基苯基-BETA-D一半乳糖(针对β一半乳糖苷酶)。

可在4-40℃反应1分钟-18小时，然后测定结果显示的颜色或荧光、磷光或显色量，进行上述试验。另外，可使用所谓的速率试验，它在4-40℃范围内保温进行。

用市售的Bolton-Hunter试剂可方便的进行对上述抗原或抗体的放射性标记。例如，可通过将Bolton-Hunter试剂加到溶液中(该溶剂是通过将抗原或抗体溶于0.1M碳酸氢钠水溶液中制备的)，然后经过1-2小时，用G-25脱盐柱等除去未反应的Bolton-Hunter试剂部分。

另外，可使用氯亚明T法、碘原法等，方便的进行¹²⁵I放射性标记。

上述荧光物质，如荧光素和罗达明，可方便的使用活化酯法或异氰酸酯法(“酶免疫测定技术”，Igaku Shoin1987年出版)进行标记。对于上述着色物质，可使用着色乳胶颗粒和胶体金。

本发明的免疫测定法使用本发明的单克隆抗体，因此具有杰出的特性，仅识别存在于血液、组织或尿液中的RBP4，而不会由于交叉反应而错误检测其他物质和其他RBP，因此可进行特异性非常高的测定。

为了实施本发明的免疫测定法，可使用本发明的试剂盒。本发明的试剂盒含有至少一种本发明的单克隆抗体，并可只含一种单克隆抗体。在本发明的试剂盒中，本发明的单克隆抗体可预先固定在固相上，本发明的单克隆抗体还可以用上述标记剂标记。

本发明的试剂盒可用免疫学方法检测含RBP4的标本，如血液，组织或尿液，因此可以判断RBP4的存在与否以及表达量的变化。

用于本发明的试剂盒的固相不受特别限制，但包括例如聚合物，如聚苯乙烯、玻璃珠、磁性颗粒、微量滴定板、免疫层析用滤纸、玻璃滤器或其他不溶性载体。

本发明的试剂盒还可含有其他组件，如标记或显色剂。上述标记或显色剂可以是标记用的酶、放射性同位素、磷光物质、荧光物质或着色物质。本发明试剂盒的其他组件不受特别限制，还可以包括洗涤液、终止液、增敏稀释液等。

本发明的试剂盒可以是用于实施上述竞争性方法或上述夹心法的试剂盒。然而优选的是使用夹心法的试剂盒。上述夹心法具有优点，即灵敏度高，需要的反应时间短，准确率高，操作方便。用上述免疫层析技术，可以制备一种试剂盒，它使得测试方法方便而简单，而且用它可以简单的通过肉眼观察判断结果。当以ELISA技术并使用上述夹心法时，酶反应产物的形成由试验目标物质的量决定，因此可建立一种系统，可方便的通过显色等，以肉眼观察确定RBP4的存在与否，也可用仪器测试其OD值，进行定量和半定量的检测。

本发明试剂盒所用的标本不受特别限制，但包括例如：血液、尿液或组织，优选尿液。

本发明的诊断试剂盒使用单克隆抗体，具有高水平的检测灵敏度，不产生假阴性或假阳性问题，在批与批之间没有任何差异。如标记的抗体优选使用与固相载体上单抗不同的单克隆抗体，则更便于控制产品质量，和制定统一的标准。

本发明RBP4多克隆抗体可通过常规的方法来制备，如用RBP4重组蛋白或天然蛋白免疫动物获得抗RBP4多克隆抗体。所述动物选自兔、羊、牛等，优选采用兔来制备。在本发明中可以按照专利200610117198.7的方法制备该多克隆抗体，与本发明单克隆抗体配对制备ELISA检测试剂盒。

RBP4检测试剂盒检测原理，用抗RBP4的单克隆抗体和抗RBP4的多克隆抗体或另一抗RBP4单克隆抗体作为固相化抗体和酶标抗体，如果待测样品中存在RBP4，则形成抗体-抗原-酶标抗体复合物，加入底物，如四甲基联苯胺(TMB)产生显色反应，反之则无显色反应。双抗体夹心ELISA法是一种非常灵敏的检测技术，并且ELISA敏感性高、操作简便，配套仪器设备的发展使操作程序规范化和自动化，从而进一步提高了稳定性。

本发明提供特异产生抗RBP4单克隆抗体的杂交瘤细胞系，由这些细胞系可以产生抗人RBP4单克隆抗体，用该抗体可以制备试剂盒等。

本发明的单克隆抗体可通过扩增本发明的杂交瘤细胞系来产生，如可以从体外培养本发明的杂交瘤的培养液中获得的。本发明的杂交瘤产生识别RBP4的单克隆抗体，并可通过经RBP4蛋白免疫的动物的脾细胞或淋巴结细胞与骨髓瘤细胞融合获得。

本发明的杂交瘤可以用本领域已知的细胞融合技术产生。

因此，用RBP4重组质粒免疫除了人以外的动物，将该动物的脾细胞或淋巴结细胞与骨髓瘤细胞融合，产生杂交瘤，从其中选出产生识别RBP4的单克隆抗体的杂交瘤，从而获得了本发明的杂交瘤。

本发明提供一种新的杂交瘤细胞的制备方法，包括如下步骤：

(a)采用含有目的蛋白的多核苷酸的重组表达载体免疫动物；

(b)将该动物的脾细胞或淋巴结细胞与骨髓瘤细胞融合；

(c)筛选获得产生目的蛋白的单克隆抗体的杂交瘤细胞系。

所述目的蛋白可以是任意蛋白，包括但不限于人RBP4蛋白。

本发明RBP4杂交瘤细胞系的制备方法，包括步骤：

(a)采用含有RBP4蛋白的多核苷酸的重组表达载体免疫动物；

(b)将该动物的脾细胞或淋巴结细胞与骨髓瘤细胞融合；

(c)筛选获得RBP4杂交瘤细胞系。

上述RBP4杂交瘤细胞的制备方法，包括步骤：

(a)将含有人RBP4蛋白的多核苷酸的重组表达载体与佐剂按照质量比3∶1到1∶1的比例混合后免疫小鼠；

(b)对该小鼠使用天然人RBP4蛋白做回忆刺激后3天，将该小鼠的脾细胞与骨髓瘤细胞融合；

(c)筛选获得RBP4杂交瘤细胞系。

上述重组表达载体优选pBudCE4.1。

上述动物优选小鼠、山羊、大鼠等。优选的，步骤(a)重复2-3次。

上述RBP4重组表达载体与佐剂混合后进行动物免疫。上述RBP4重组质粒与佐剂的质量比为3∶1到1∶1；优选质量比为3∶1到2∶1。优选将上述混合物以肌肉注射方式注射到动物肌肉处。在具体实施例中，肌肉注射后采用在注射部位做电穿孔。

上述佐剂选自弗氏佐剂或佐剂CpG。优选佐剂为全硫代的CpG ODN 1826。

较佳的，在实施步骤(b)前进行回忆刺激。具体的，在融合前3天取纯化的天然RBP4蛋白进行皮下多点注射，作为回忆刺激。

在具体实施例中，取免疫后小鼠的脾脏细胞和鼠骨髓瘤细胞SP2/0融合。融合采用聚乙二醇(PEG)常规融合法。

步骤(c)中加HAT选择性培养基，筛选采用ELISA法，所用筛选用抗原为纯化好的天然的RBP4蛋白。

本发明的杂交瘤细胞系RBP4-1(即SA-64-11)已于2009年7月9日提交位于武汉的中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC)保藏，保藏号分别为CCTCC-C200946。本发明的杂交瘤细胞系RBP4-2(即s-113-7)已于2009年7月22日提交位于武汉的中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC)保藏，保藏号分别为CCTCC-C200951。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。本发明中未特别说明的试剂、仪器等为市售的常规产品。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook、Russell等人，分子克隆：实验室手册III(New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press，2001)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1DNA疫苗的构建

以之前构建好的pET28a-RBP4(详见专利200610117198.7)的重组质粒为模板，以两端添加Kpn I和Xho I酶切位点的引物正向引物RBP-Sp(SEQ ID NO：1)：CGGGGTACCATGATGAAGTGGGTGTGGGCGCT和反向引物RBP-AS(SEQ ID NO：2)：CCGCTCGAGTCGCTACAAAAGGTTTCTTTCTGATC，PCR扩增获得视黄醇结合蛋白4的编码序列，将获得的视黄醇结合蛋白4的编码序列定向连接到pBudCE4.1载体(Invitrogen公司)的Kpn I和Xho I位点中，获得pBudCE4.1-RBP4重组质粒，此重组质粒即为DNA疫苗。克隆出的基因经测序(上海英俊生物技术公司)验证不含有义突变。

实施例2pBudCE4.1-RBP4重组质粒转染293T细胞，RBP4-His融合蛋白检测

将构建好的pBudCE4.1-RBP4重组质粒通过lipofectamine 2000(Invitrogen)瞬时转染入293T细胞中，Western Blotting检测RBP4-His融合蛋白的表达(结果见图1)。

一抗：anti-his tag(1∶2000)(天根)

二抗：goat-anti-mouse HRP(1∶1000)(中科英沐)

图1显示，泳道1有RBP4-His融合蛋白的表达。

实施例3天然视黄醇结合蛋白4的提取

视黄醇结合蛋白4在肾小管损伤疾病病人的尿液中含量较之正常人尿样中含量高出10倍以上。故从肾小管损伤疾病病人的尿液中可以提取天然视黄醇结合蛋白4。纯化采用亲和层析的方法，使用的是GE Healthcare AKTA纯化系统，采用的纯化柱也是购自GE公司。

3.1尿样的预处理

由于尿液成分比较复杂，过层析柱前需用0.45μm滤膜进行过滤。过滤后，对尿液样品进行盐浓度测定，然后将样品中的盐浓度调整到5％左右。

3.2离子交换层析

3.2.1平衡离子交换柱

采用的是Q-FF填料，装柱量20ml，将A管道进样端放入buffer A(1.409g NaH₂PO₄·2H₂O，4.372g Na₂HPO₄·7H₂O溶于1L H₂O，pH8.0)中，选择A泵，设置最大耐压为0.3MPa，流速为5ml/min，运行平衡柱子，当cond、UV、pH等稳定后，设置UV吸收值anto zero。

3.2.2上样及冲洗

将A管道进样端放入样品中，选择A泵，设置流速为5ml/min，进行上样。当UV吸收值逐渐上升，在大于0.05AU时，开始收集穿透。上样完后，暂停，将A管道进样端取出用蒸馏水冲洗，放入buffer A中。用buffer A冲洗柱子，洗掉结合不紧密的杂质，流速5ml/min，运行至cond、UV、pH等值降下来时停止收集穿透，当cond、UV、pH稳定后，停止运行，开始准备洗脱蛋白。

3.2.3目的蛋白的洗脱

将A管道进样端放入buffer A中，B管道进样端放入buffer B中，设置洗脱梯度为：0-8％buffer B，80ml达到，流速为5ml/min。运行至UV吸收值上升至0.05时，马上开始用10ml的EP管收集洗脱。当达到8％，cond开始稳定后，马上设置为100％buffer B(1.409g NaH₂PO₄·2H₂O，4.372g Na₂HPO₄·7H₂O，溶于1L H₂O，1mM Nacl)，pH8.0，0ml达到(参见图2)。当洗脱的颜色很浓，呈深黄色时当停止收集，直接将出样管放入废液烧杯中。

3.2.4柱子的清洗

首先用100％buffer B进行清洗，稳定后，用0.5M的NaOH溶液进行清洗，再次稳定后用100％buffer B进行冲洗，稳定后最后用buffer A平衡。平衡好后，用20％的乙醇冲洗，待cond值降至0.005以下时将柱子取下，上下接口用配套的螺丝帽拧死，保存于4℃冰箱中。用20％的乙醇清洗机器。

3.3疏水层析

3.3.1平衡疏水柱

根据RBP蛋白的特性，选择了Butyle-FF 1ml层析柱。将A管道进样端放入HIC bufferA中，B管道进样端放入HIC buffer B中，设置最大耐压0.3MPa，用HIC buffer A清洗平衡疏水层析柱，流速为1ml/min。当cond、UV、pH等稳定后，设置UV吸收值auto zero。

3.3.2上样

将A管道进样端放入样品中，开始1ml/min流速上样，收集穿透峰，当UV吸收值＞0.05时，用10ml的EP管收集。当样品上完后，将A管道进样端放入HIC buffer A中，用HIC bufferA冲洗柱子；当UV吸收值＜0.1时，停止收集穿透，继续运行至各项值稳定。

3.3.3目的蛋白的洗脱

设置用100％HIC buffer B洗脱，为了使洗脱体积尽量的小(方便下一步分子筛上样)，先将柱子上面的毛细管卸下来，流速1ml/min通100％HIC buffer B约1-2min，将毛细管中的HIC buffer A排出。然后改流速为1ml/min，进行洗脱，并马上用5ml的EP管盛接。当UV吸收值＜0.1时，停止盛接，并对所接样品进行标记(参见图3)。

3.3.4柱子的清洗

设置改用0.5M NaOH溶液进行清洗柱子，平稳后改用HIC buffer B洗柱，平稳后改用100％HIC buffer A平衡柱子。平衡好后，用20％的乙醇冲洗，待cond值降至0.005以下时将柱子取下，上下接口用配套的螺丝帽拧死，保存于4℃冰箱中。用20％的乙醇清洗机器。

3.4分子筛

3.4.1平衡分子筛柱

使用的柱子是24ml supperdex-75(GE Healthcare预装柱)。设置最大耐压为1.8MPa，然后用流速为1ml/min pH 8.020mM Tris-Cl进行清洗柱子。当cond、UV、pH等稳定后，设置UV吸收值auto zero。

3.4.2上样

采取从上样环上样。用注射器吸取样品，暂停机器(pause)，设置成load状态下注射入1ml，再设置成inject，然后继续(continue)。

3.4.3目的蛋白的洗脱

当UV吸收值大于0.05时马上用1.5ml的EP管收集样品，当UV吸收值低于0.1时停止收集，并对EP管进行标记。继续用Tris-Cl洗柱子，当出现盐峰后并恢复平稳，进行第二次上样，以此循环至样品上完(参见图4)。

2.3.4.4柱子的清洗

当把洗脱全部收集完后，继续用Tris-Cl洗柱子，平衡好后，将柱子取下，上下接口用配套的螺丝帽拧死，保存于4℃冰箱中。用20％的乙醇清洗机器。

2.3.5最终纯化产物的SDS-PAGE电泳图检测

图中箭头所指的便是目的蛋白RBP4。从上图(图5)可以看到只有4、5、8、9样品中含有目的蛋白RBP4，而且很纯。将纯净的样品收集起来，封口，放入-20摄氏度冰箱中冷冻保存。

泳道1是蛋白Marker；泳道2-5是第一批肾小管损伤病人尿液样品经过离子交换层析、疏水层析和分子筛后分管收集的蛋白样品；泳道6-9是第二批肾小管损伤病人尿液样品经过离子交换层析、疏水层析和分子筛后分管收集的蛋白样品。

实施例4抗视黄醇结合蛋白4单克隆抗体的制备

4.1动物的免疫

选取4-6周Balb/c雌性小鼠，每组4只，使用构建好的DNA疫苗进行Balb/c小鼠的免疫。

免疫的剂量：每只小鼠50μg pBudCE4.1-RBP4重组质粒和20μg佐剂CpG ODN 1826(上海生工合成)的混合物，免疫的方式：用肌肉注射后用ECM830电转仪电穿孔(美国BTX公司产品)，电穿孔的目的是让DNA疫苗更好的被注射部位的肌肉细胞甚至抗原呈递细胞吸收。免疫程序：1，3，6周三次免疫，4-5，7周眼眶取血进行ELISA检测。融合前3天取0.1mg纯化好的天然RBP蛋白进行皮下多点注射，作为回忆刺激。

4.2杂交瘤细胞株的构建及单克隆抗体的制备

回忆刺激后三天融合。取免疫后小鼠的脾脏细胞和鼠骨髓瘤细胞SP2/0采用聚乙二醇(PEG)常规融合法做融合。

融合后加HAT选择性培养基，筛选采用ELISA法，所用筛选用抗原为纯化好的天然的RBP4蛋白。

经过三次有限稀释法克隆化筛选得到3株杂交瘤细胞株，效价见表1：

Clone	Ig subclass	Ab titer(OD450±SD)*
			S-17-4	IgG1，κ	1.090±0.002
SA-64-11	IgG2a，κ	1.159±0.041
			S-113-7	IgG2a，κ	1.520±0.033

表13株杂交瘤细胞株的抗体效价及亚型鉴定

*此效价是指在培养杂交瘤细胞时上清中的抗体的效价

实施例5单克隆抗体的鉴定和分析

5.1抗体的配对实验

(1)包被S-113-7单抗：将腹水用1％的BSA(用1x PBS配制)稀释成2μg/ml浓度，100μl/孔，共5孔，第5孔不加抗原作为阴性对照。4℃静置过夜。用洗涤液(1X PBS，按1ml/L比例加入吐温)洗涤3遍。

(2)封闭：0.3ml/孔5％的BSA(PBS配制)37℃静置3h。用洗涤液洗涤3遍。

(3)加入抗原：将纯化好的天然RBP蛋白用1％的BSA(用PBS配制)稀释成8ng/ml、4ng/ml、2ng/ml、1ng/ml各100μl，按序加入孔中，第5孔不加，37℃静置2h。用洗涤液洗涤5遍。

(4)加入检测单抗(二抗)：将标记了HRP(辣根过氧化物酶)的SA-64-11抗体进行10000倍的比例稀释，100μl/孔加入，37℃静置2h。用洗涤液洗涤5遍。

(5)加入底物显色：将TMB A、B液等体积混合(各250μl，现配现用)，按100μl/孔加入，37℃静置15min。

(6)终止显色：将2M H₂SO₄按50μl/孔加入。

(7)测量及结果：用酶标仪在450nm波长下测量OD值

从图6中我们可以看到，这两株单克隆抗体识别RBP4的不同位点，可以很好的配对，检测灵敏度高(1-8ng/ml呈线性变化)，可以用于制备RBP4检测试剂盒。

实施例6尿液中RBP4蛋白的免疫印迹检测

正常人尿液共3例N1，N2，N3；肾小管疾病病人尿液共3例P1，P2，P3。阳性对照是纯化好的天然视黄醇蛋白；阴性对照是BSA。

免疫印迹实验：

在本实验中，所使用的抗体是抗RBP4鼠单克隆抗体

实验流程如下：

(1)SDS-PAGE：

样品：阳性对照纯化好的天然视黄醇蛋白；肾小管疾病病人尿液P1，P2，P3(来源于上海第六人民医院肾脏科)；正常人尿液N1，N2，N3

上样量：5μl

上层胶：4％，下层胶12％，上层胶100V 30分钟，下层胶150V 1小时。

(2)转膜：

电流：200mA，90分钟。

(3)封闭：

3％脱脂奶粉封闭2小时。

(4)杂交：

一抗：克隆号S-113-7和SA-64-11两株抗体均以1∶2000稀释在相应的封闭液中，4℃杂交过夜。

二抗：羊抗兔HRP(上海中科英沐生物科技有限公司)，1∶1000稀释，杂交1小时。

(5)显色：

实验结果见图7(克隆号S-113-7单克隆抗体实验结果图)和图8(克隆号SA-64-11单克隆抗体实验结果图)。结果表明，本发明人所制备的抗RBP4鼠单克隆抗体能够有效的识别肾小管疾病病人尿液中的RBP4，而对正常人尿液中的痕量RBP4没有反应(免疫印迹法一般仅能检测1ng以上的目的蛋白，而试验时每个泳道本发明人仅加了5μl尿液，按照正常人尿液的RBP4水平，其中所含的RBP4不足1ng)。

3.结论

目前常规制备抗体使用的免疫抗原为原核蛋白表达系统制备的重组蛋白和人工合成的多肽。原核蛋白表达系统具备外源基因的高通量表达、易于扩大再生产、低成本等的优点，但是，目前现有技术中根据原核表达系统制备的重组蛋白常常存在与天然蛋白不同的一些特点，造成使用其制备的抗体难以检测出天然蛋白，或者检测效果不理想，无法达到临床的灵敏性要求。而抗原表位的预测的不确定性也使人工合成的多肽制备抗体存在一定的问题。

另一方面，使用纯化的天然蛋白免疫动物得到的抗体虽然应用价值高，但是提取天然蛋白比较困难。天然蛋白本身可能具有毒性，对免疫的动物存在危害；天然蛋白含量较低，提取一定纯度的天然蛋白技术要求高；动物免疫需要一定量的蛋白，提取到指定量的天然蛋白可能需要大量的组织样品，部分病人组织样品是少量的，不适宜从中提取天然蛋白作为免疫抗原。

RBP4天然蛋白具有一定的毒性，大量注射Balb/c小鼠可能会造成死亡，难于得到脾细胞，对于制备杂交瘤细胞株带来了一定的困难。鉴于DNA疫苗作为第3代疫苗，具有其自身的多个特点。DNA疫苗在哺乳动物体内表达，保持了蛋白抗原的空间构想，强于原核表达抗原，类似于天然抗原且DNA疫苗在动物体内持久微量表达，不断刺激免疫系统，故毒性相对降低。因此我们采用DNA疫苗免疫的方法来制备抗视黄醇结合蛋白4杂交瘤细胞株。我们构建了pBudCE4.1-RBP4重组质粒，将此构建好的DNA疫苗免疫小鼠，制备抗RBP4鼠单克隆抗体。

肾小管疾病导致肾小管蛋白重吸收功能下降时，尿液中RBP4含量就会上升，在病情进行的初期约1-3mg/24h，严重时高于3mg/24h以上。(以正常人每天排尿量1.5升计算，约为0.67-2ug/ml，为正常人的10倍以上)。鉴于此，我们使用GE Healthcare AKTA纯化系统，确立了从肾小管疾病病人尿液中提取天然RBP4蛋白工艺方法。且在有限稀释法克隆化筛选时使用纯化好的天然提取的视黄醇结合蛋白4，有利于筛选到特异性针对天然视黄醇结合蛋白4的杂交瘤细胞株。

通过上述方法获得了3株杂交瘤细胞株，通过ELISA试验验证了其中2株杂交瘤细胞株产生的抗RBP4鼠单克隆抗体能够配对，且针对天然视黄醇结合蛋白4的不同位点。将这两株杂交瘤细胞株产生的抗体进一步免疫印迹实验验证其能灵敏的识别人体中天然的视黄醇结合蛋白4，从而可以用于对相关疾病的诊断或检测。

实施例7RBP4蛋白的ELISA试剂盒

1.已包被SA-64-11单克隆抗体的固相载体(本实施例中使用96孔酶标板)；

2.HRP酶标记的S-113-7抗体；

3.天然RBP4蛋白作为阳性对照品；

4.含10％小牛血清的PBS为稀释液；

5.1X PBST(1X PBS，按1ml/L比例加入吐温)为洗涤液；

6.2M H₂SO₄为酶反应终止液；

7.TMB为底物(分A、B液)；附产品使用说明书一份。

实施例8RBP4的ELISA试剂盒

1.已包被SA-64-11的固相载体(本实施例中使用48孔酶标板)；

2.HRP标记的RBP4蛋白多克隆抗体；

3.重组RBP4蛋白为阳性对照品；

4.含10％小牛血清的PBS为稀释液；

5.1X PBST洗涤液(同实施例7)；

6.2M H₂SO₄为酶反应终止液

7.TMB为底物(分A、B液)；附产品使用说明书一份。

以上试剂盒阴性对照均采取不加RBP4蛋白的方式。本领域技术人员也可以根据需要在试剂盒中增加其他辅助试剂，或采用碱性磷酸酯酶标记上述抗体，并选用相应的显色剂等。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

序列表

<110>上海中科英沐生物科技有限公司

<120>视黄醇结合蛋白单抗、其杂交瘤细胞及其制备方法和用途

<130>090725

<160>2

<170>PatentIn version 3.1

<210>1

<211>32

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<223>引物

<400>1

cggggtacca tgatgaagtg ggtgtgggcg ct                    32

<210>2

<211>35

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<223>引物

<400>2

ccgctcgagt cgctacaaaa ggtttctttc tgatc                 35

Claims (10)

1.一种杂交瘤细胞系，其特征在于，所述杂交瘤细胞系的保藏号为CCTCC NO：-C200946。

2.一种抗RBP4单克隆抗体，其特征在于，所述单克隆抗体是由保藏号为CCTCC NO：-C200946的杂交瘤细胞系产生。

3.权利要求2所述单克隆抗体的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

(a)扩增产生所述单克隆抗体的杂交瘤细胞株；

(b)从扩增产物中回收抗RBP4单克隆抗体。

4.权利要求2所述单克隆抗体的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

(a)扩增保藏号为CCTCC NO：-C200946的杂交瘤细胞株；

(b)腹腔注射动物；

(c)回收腹水并从腹水中分离抗RBP4单克隆抗体。

5.一种组合物，其特征在于，所述组合物包括权利要求2所述的单克隆抗体和药学上可接受的载体和/或赋形剂。

6.一种试剂盒，其特征在于，所述试剂盒含有权利要求2所述的单克隆抗体。

7.权利要求6所述试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求2所述的单克隆抗体和保藏号为CCTCC NO：-C200951的杂交瘤细胞系所产生的单克隆抗体。

8.权利要求6所述试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求2所述的单克隆抗体和抗RBP4多克隆抗体。

9.权利要求7所述试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还含有标记或显色剂。

10.权利要求2所述的单克隆抗体在制备检测RBP4蛋白的定性或定量的试剂盒中的应用。

Images