CN104931696A - 免疫层析分析试剂盒、免疫层析分析装置以及免疫层析分析方法 - Google Patents
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Abstract
本发明的课题在于提供一种免疫层析分析试剂盒,其中即使是从口腔内采集的含有唾液的血液检体,也能够实现高灵敏度的检测,并且可以在没有感觉到疼痛和压力的情况下进行免疫层析分析,通过以下免疫层析分析试剂盒来解决上述课题:其中,在检体稀释液以及检测部的展开方向上游的至少一者中含有烷基葡糖苷类以及阴离子型表面活性剂。本发明还提供一种免疫层析分析装置以及免疫层析分析方法。
Description
技术领域
本发明涉及免疫层析分析试剂盒、免疫层析分析装置以及免疫层析分析方法。
背景技术
测定血液、尿等检体中所含的各种成分临床上在把握患者的健康状态方面极其重要,一直以来,对应该成分采用了各种测定方法。作为其一,已知通过免疫反应使检体中所含的被检测物质发色,并确认该发色信号的免疫层析分析装置以及分析方法。
免疫层析分析装置的最简单的结构为样本添加部、标记物保持部、担载有检测部的层析介质、以及吸收部互相连接的结构。
另一方面,2011年世界的糖尿病患者数存在3亿6600万人,据预测,2030年将达到5亿5200万人(成人人口的约10%)。另外,据认为所谓的糖尿病预备军也在其同等以上。
一直以来,是通过测定血糖值来进行糖尿病的诊断,但是近年来,由于血中的血红蛋白上结合有糖的糖化血红蛋白(糖化ヘモグロビン)(糖化血红蛋白(グリコヘモグロビン))、特别是血红蛋白β链的N末端缬氨酸残基糖化的血红蛋白A1c(以下,称为“HbA1c”)相对于总血红蛋白量的浓度反映过去1至2个月的平均血糖值,因此正作为适于糖尿病的诊断或糖尿病的追踪观察的指标使用。
然而一直以来,HbA1c的测定通过HPLC法、毛细管电泳法、酶法、免疫学测定方法等来实施,但是因为这些方法需要针对特定的装置或分析的专业知识,因此存在这样的问题:在小规模的医院或家庭等中不能简单获知HbA1c的值。
另外,关于HbA1c的血中浓度,由于血中成分存在个人差异,因此通过同时测定HbA1c以外的血红蛋白并掌握HbA1c量相对于HbA1c和HbA1c以外的血红蛋白的总血红蛋白量的比率,来判断糖尿病的阴性或阳性,但在此情况下还存在这样的问题:需要通过上述方法分别测定HbA1c和HbA1c以外的血红蛋白,因此测定的繁杂程度进一步恶化。
这里,(例如)专利文献1提出了简单测定HbA1c的方法。该方法首先将所采血液与使血红蛋白β链的N末端在蛋白质表面露出的成分(N末端露出剂(露出剤))混合,使HbA1c的抗原决定基在血红蛋白蛋白质的表面露出从而制备样本液,之后向样本添加部滴加。通过毛细管现象使样本液在抗体固定化膜上展开,在抗体固定化膜上展开的样本液到达抗HbA1c抗体涂布部,在这里仅样本液中的HbA1c发生反应并被检测。
接着,进一步在抗体固定化膜上展开的样本液到达抗HbA0抗体涂布部,仅样本液中的HbA0发生反应并被检测,其他血红蛋白不发生反应而是移动至吸水垫。
由此分别检测样本液中的HbA0以及HbA1c。与HPLC法、毛细管电泳法、酶法、免疫学测定法等不同,该方法不需要针对特定的装置或分析的专业知识,因此可简单地获知HbA1c的值。
[现有技术文献]
[专利文献]
[专利文献1]日本特开2012-251789号公报
发明内容
[发明要解决的课题]
然而,专利文献1中记载的方法是测定血液检体中的HbA1c的方法,因此存在这样的问题:样品不可避免地来自指血等,采血时使用针,每次都伴随着疼痛和精神压力。
在不使用针就可采集的唾液检体中,虽然能够测定诸如血红蛋白那样的比较不需要灵敏度的物质,但是测定诸如HbA1c那样的需要高灵敏度的极少量物质则是困难的。另外,在免疫层析分析中,由于唾液成分的存在,还存在灵敏度进一步降低的问题。
因此,本发明的目的在于提供一种免疫层析分析试剂盒、免疫层析分析装置以及免疫层析分析方法,其能够解决上述课题,即使对于不使用针而从口腔内微量采集血液成分得到的含有唾液等夹杂物的血液检体,也能够通过实现高灵敏度的检测,从而在不感受到疼痛和压力的情况下进行免疫层析分析。
[解决课题的手段]
本发明人经过深入研究,结果发现,在免疫层析分析中,通过在检测部的展开方向的上游含有烷基葡糖苷类以及阴离子型表面活性剂,即使是从口腔内采集的含有唾液等夹杂物的血液检体,也能够通过实现高灵敏度的检测,从而在不感受到疼痛和压力的情况下实施免疫层析分析,并由此完成了本发明。
即,本发明如下所述。
1.一种免疫层析分析试剂盒,其含有用于稀释并展开从口腔内采集的血液检体的检体稀释液和免疫层析分析装置,该免疫层析分析装置包括样本添加部、标记物保持部、担载有检测部的层析介质部以及吸收部。
2.前述1中记载的免疫层析分析试剂盒,其中在所述检体稀释液以及所述检测部的展开方向上游的至少一者中含有烷基葡糖苷类以及阴离子型表面活性剂。
3.前述1或2中记载的免疫层析分析试剂盒,其中所述血液检体中的被检测物质为血液中的糖化蛋白质。
4.前述3中记载的免疫层析分析试剂盒,其中所述糖化蛋白质为HbA1c。
5.前述2~4中任意一项记载的免疫层析分析试剂盒,其中所述烷基葡糖苷类为含有碳数为5~15的烷基的烷基葡糖苷或者烷基麦芽苷。
6.前述2~5中任意一项记载的免疫层析分析试剂盒,其中所述阴离子型表面活性剂为选自由十二烷基磺酸钠、十二烷基苯磺酸钠以及聚氧乙烯月桂基醚硫酸钠组成的组中的一种以上。
7.前述2~6中任意一项记载的免疫层析分析试剂盒,其中在所述检测部的展开方向上游含有1~1700μg的所述烷基葡糖苷类、和8~800μg的所述阴离子型表面活性剂。
8.前述1~7中任意一项记载的免疫层析分析试剂盒,其特征在于,使用牙间刷从口腔内采集血液检体。
9.一种免疫层析分析装置,其用于检测从口腔内采集的血液检体中的被检测物质,并且包括样本添加部、标记物保持部、担载有检测部的层析介质部以及吸收部,其中在所述检测部的展开方向上游含有烷基葡糖苷类以及阴离子型表面活性剂。
10.一种免疫层析分析方法,其为这样一种方法:使用包括样本添加部、标记物保持部、担载有检测部的层析介质部以及吸收部的免疫层析分析装置,对从口腔内采集的血液检体中所含的被检测物质进行检测,该方法包括以下工序(1)~(4):
(1)向样本添加部中添加检体处理液的工序,该检体处理液通过检体稀释液对所述血液检体进行稀释而得到;
(2)通过标记物保持部中所保持的标记物识别被检测物质的工序;
(3)在烷基葡糖苷类以及阴离子型表面活性剂的存在下,将所述血液检体以及标记物作为移动相在层析介质部中展开的工序;
(4)用检测部检测展开后的移动相中的被检测物质的工序。
[发明效果]
本发明的免疫层析分析试剂盒、免疫层析分析装置以及免疫层析分析方法通过在检体稀释液以及检测部的展开方向上游的至少一者中含有烷基葡糖苷类,在被检测物质到达检测部之前,被检测物质与烷基葡糖苷类接触并使从口腔内采集的含有唾液的血液检体中的被检测物质稳定化,因此可以以高灵敏度检测被检测物质。
另外,通过在检体稀释液以及检测部的展开方向上游的至少一者中含有烷基葡糖苷类并含有阴离子型表面活性剂,可有助于抑制由唾液成分引起的检测反应的反应性降低。
附图简要说明
[图1]图1(a)和图1(b)示出了免疫层析分析装置的结构。
[图2]图2示出了含有唾液的血液检体(检体处理液1)和血液检体(检体处理液2)的发色度变化率的评价。
[图3]图3示出了含有唾液的血液检体(检体处理液1)和血液检体(检体处理液2)的发色度变化率的评价。
[图4]图4示出了含有唾液的检体(检体处理液1’)和不含唾液的检体(检体处理液2’)的发色度变化率的评价。
[符号说明]
1 免疫层析分析装置
11 塑料制粘合片
12 样本添加部
13 标记物保持部
14 层析介质部
15 吸收部
16 涂布有抗HbA1c抗体的抗HbA1c抗体涂布部
17 涂布有抗血红蛋白抗体的抗HbA0抗体涂布部
18 作为对照物的涂布有抗IgG抗体的抗IgG抗体涂布部
具体实施方式
下面,进一步详细说明本发明。
本发明中所用的血液检体为(例如)从口腔内采集的诸如血液、血浆或者血清之类的血液样本,特别是含有唾液的检体。
作为本发明的被检测物质,可列举(例如)α-胎蛋白(AFP)以及癌胚抗原(CEA)等肿瘤标记物、铁蛋白、前列腺特异抗原(PSA)以及免疫球蛋白G(IgG)等血清蛋白质、类风湿因子、生长激素(GH)以及促肾上腺皮质激素(ACTH)等激素相关物质、流感病毒、腺病毒、衣原体抗原以及A群溶血性链球菌抗原等细菌抗原、以及衍生自血红蛋白的蛋白质等。
这些当中,优选的是血液中的被检测物质,可列举(例如)衍生自血红蛋白的蛋白质、血浆蛋白、脂蛋白、分泌蛋白、激素、补体、脂质、胆固醇、糖、其他生物体内成分、生物体内给药及其代谢产物等。其中,从本发明的效果的观点出发,优选为血液中的糖化白蛋白或糖化血红蛋白等糖化蛋白质,更优选为HbA1c。
以下将HbA1c作为被检测物质、将HbA1c以外的血红蛋白作为成为判定阴性或者阳性的基准的物质,以此为例进行说明,但本发明并不限于下述例子。
本发明的免疫层析分析试剂盒含有用于稀释并展开含唾液的血液检体的检体稀释液和免疫层析分析装置,该免疫层析分析装置包括样本添加部、标记物保持部、担载有检测部的层析介质部以及吸收部。
检体稀释液可充当用于将血液检体以及标记物作为移动相在层析介质部中展开的展开液。
从展开性良好并且不阻碍抗原抗体反应的观点出发,检体稀释液优选含有非离子型表面活性剂。
作为非离子型表面活性剂,可列举(例如)聚氧乙烯烷基醚、聚氧乙烯/聚氧丙烯烷基醚、聚氧乙烯失水山梨糖醇脂肪酸酯、聚氧乙烯对叔辛基苯基醚、聚氧乙烯对叔壬基苯基醚、烷基多葡糖苷、脂肪酸二乙醇酰胺以及烷基单甘油醚等。
检体稀释液(例如)以水为溶剂,并且可含有比例为(例如)0.01~5质量%的非离子型表面活性剂,优选含有的比例为0.03~3.0质量%,更优选含有的比例为0.3~3.0质量%。另外,为了调整pH,还可适当添加缓冲液类、无机盐类等添加剂。
检体稀释液中优选预先含有烷基葡糖苷类。由此,被检测物质与该烷基葡糖苷类接触,并且使含有唾液的血液检体中的被检测物质稳定化,从而可防止灵敏度的降低。
作为烷基葡糖苷类,可列举(例如)苄基-α-D-葡糖苷、苄基-β-D-葡糖苷、辛基-α-D-葡糖苷、辛基-β-D-葡糖苷、癸基-α-D-葡糖苷、癸基-β-D-葡糖苷、十二烷基-α-D-葡糖苷、十二烷基-β-D-葡糖苷、十五烷基-α-D-葡糖苷、十五烷基-β-D-葡糖苷、苄基-α-D-麦芽苷、苄基-β-D-麦芽苷、辛基-α-D-麦芽苷、辛基-β-D-麦芽苷、癸基-α-D-麦芽苷、癸基-β-D-麦芽苷、十二烷基-α-D-麦芽苷、十二烷基-β-D-麦芽苷、十五烷基-α-D-麦芽苷以及十五烷基-β-D-麦芽苷等,并优选为烷基的碳数为5~15的烷基葡糖苷或者烷基麦芽苷。
使用这类化合物的话,能够促进唾液等中含有的夹杂物的可溶化,并进一步抑制被检测物质与检测物质的反应性降低,并且从对含水的展开成分的溶解性的观点出发也是适当的。更优选的是使用烷基的碳数为7~15的烷基葡糖苷类,进一步优选的是使用烷基的碳数为8~12的烷基葡糖苷类。
其中,最适合使用辛基-β-D-葡糖苷、癸基-β-D-葡糖苷、十二烷基-β-D-葡糖苷、辛基-β-D-麦芽苷、癸基-β-D-麦芽苷、十二烷基-β-D-麦芽苷。
检体稀释液中的烷基葡糖苷类的含量优选为0.025~50mM,更优选为0.1~20mM,进一步优选为5~20mM。
通过在0.025mM以上,促进烷基葡糖苷类的唾液成分的可溶化,并且抑制口腔内采集的含有唾液的血液检体中的被检测物质的检测反应的反应性降低。通过在50mM以下,不会发生由于烷基葡糖苷类的浓度过高所引起的对检测反应的阻碍,从而使高灵敏度的检测成为可能,并且也是经济上优选的浓度。
另外,在检体稀释液中,优选预先同时含有烷基葡糖苷类与阴离子型表面活性剂。由此,有助于抑制由唾液成分引起的检测反应的反应性降低。另外,其具有使所采集的血液中的HbA1c的抗原决定基在血红蛋白蛋白质的表面露出的功能。具体而言,其功能是作为使血红蛋白β链N末端在蛋白质表面露出的成分(N末端露出剂)。
作为阴离子型表面活性剂,可列举(例如)十二烷基苯磺酸钠(SDBS)、十二烷基磺酸钠(SDS)、C12~C18的烷基的磺酸钠(烷烃磺酸钠)、二烷基磺基琥珀酸钠、胆酸钠、脱氧胆酸钠和聚氧乙烯月桂基醚硫酸钠(SLES)等。
这其中,特别优选的是十二烷基磺酸钠、十二烷基苯磺酸钠、脱氧胆酸钠以及聚氧乙烯月桂基醚硫酸钠。更加优选使用十二烷基磺酸钠、十二烷基苯磺酸钠以及聚氧乙烯月桂基醚硫酸钠。
检体稀释液中的阴离子型表面活性剂的浓度优选为0.01~1.5%(w/v),更优选为0.05~1.0%,进一步优选为0.1~0.6%。
通过在0.01%以上,有助于抑制由唾液成分引起的检测反应的反应性降低,通过在1.5%以下,不会发生由于标记试剂的凝集引起的展开不良或阴离子型表面活性剂的浓度过高引起的检测反应的阻碍,从而使更高灵敏度的检测成为可能。
免疫层析分析装置包括样本添加部、标记物保持部、担载有检测部的层析介质部以及吸收部。以下参照附图对本发明的层析分析装置进行说明。图1(a)以及图1(b)为用于说明本发明的免疫层析分析装置的例子的示意图,图1(a)为截面图、(b)为平面图。
如图1(a)所示,免疫层析分析装置1中,在塑料制粘合片11上沿试剂盒的长度方向依次分别设置有:样本添加部12、含有经标记物标记的抗血红蛋白抗体的标记物保持部13、层析介质部14、和吸收部15。
另外,在层析介质部14上分别设置有作为检测部的涂布有抗HbA1c抗体的抗HbA1c抗体涂布部16、涂布有抗血红蛋白抗体的抗血红蛋白抗体涂布部17、作为对照的涂布有抗IgG抗体的抗IgG抗体涂布部18。
塑料制粘合片11是构成免疫层析分析装置1的基材,并且通过在一面上涂布粘合剂或者粘附胶带而使一面变为粘合面,将下述的各构成部位的一部分或全部在该粘合面上紧贴。关于塑料制粘合片11的材质,适当选择对样本具有不透过性、非透湿性的材质即可。
样本添加部12可以由具有以下性质的多孔片构成:其能够迅速吸收下面所述的检体处理液,但保持力弱、检体处理液能够快速地移动至抗原抗体反应区域。作为该多孔片,可列举(例如)由玻璃纤维、纤维素、聚对苯二甲酸乙二醇酯、聚氨酯、聚醋酸酯、醋酸纤维素、硝化纤维、尼龙、棉布等构成的垫、纤维以及膜等。其中,优选使用选自由玻璃纤维、纤维素以及聚对苯二甲酸乙二醇酯组成的组中的一种构成样本添加部12。
此时,在使用选自由玻璃纤维、纤维素以及聚对苯二甲酸乙二醇酯组成的组中的一种作为构成样本添加部12的材料的情况下,HbA1c和阴离子型表面活性剂的接触效率变高,并且获得以下详细描述的、阴离子型表面活性剂作为N末端露出剂有效发挥作用的效果。
由于上述理由,样本添加部12优选预先含有上述烷基葡糖苷类。样本添加部12中的烷基葡糖苷类的含量优选为1~1700μg,更优选为3.5~700μg,进一步优选为175~700μg。
通过在1μg以上,促进烷基葡糖苷类的唾液成分的可溶化,并且抑制口腔内采集的含有唾液的血液检体中被检测物质的检测反应的反应性降低。通过在1700μg以下,不会发生由于烷基葡糖苷类的浓度过高所引起的对检测反应的阻碍,从而使高灵敏度的检测成为可能,并且也是经济上优选的浓度。
另外,样本添加部12可以含有0.5~1100μg/cm2的烷基葡糖苷类,优选含有2~500μg/cm2,更优选含有100~500μg/cm2。
另外,由于上述理由,在样本添加部12中优选预先同时含有烷基葡糖苷类与阴离子型表面活性剂。样本添加部12中的阴离子型表面活性剂的含量优选为8~800μg,更优选为10~500μg,进一步优选为16~480μg。
通过在8μg以上,可有助于抑制由唾液成分引起的检测反应的反应性降低,通过在800μg以下,不会发生由于标记试剂的凝集引起的展开不良或阴离子型表面活性剂的浓度过高引起的检测反应的阻碍,从而使更高灵敏度的检测成为可能。
另外,样本添加部12可以含有5~500μg/cm2的阴离子型表面活性剂,优选含有6~320μg/cm2,更优选含有10~300μg/cm2。
另外,根据需要,还可向样本添加部12中添加硫氰酸钠、胍盐酸盐或者EDTA等各种添加剂。
标记物保持部13保持(例如)经标记物标记的抗血红蛋白抗体。标记物保持部13中的抗血红蛋白抗体可以与检体处理液中的血红蛋白特异性地结合。作为这种抗体,可列举多克隆抗体、或单克隆抗体等。单克隆抗体以及多克隆抗体或者其片段是公知的且可以获得,并且可以通过公知的方法制备。
作为产生抗体的动物种类,可列举(例如)人、小鼠、大鼠、兔子、山羊等。作为免疫球蛋白,可以是IgG、IgM、IgA、IgE或者IgD的任意一者。单克隆抗体可以这样获得:通过常规方法,将经抗原免疫的小鼠的脾脏细胞与骨髓瘤细胞杂交,选择产生目标抗体的杂交瘤,获得从该杂交瘤中产生的血红蛋白抗体(参照(例如)科勒(ケーラー)和米尔斯坦(ミルスタイン)的技术[Nature 256(1975)495-497])。多克隆抗体可以这样获得:通过常规方法,利用抗原将产生动物(例如,人、小鼠、大鼠、兔子、山羊以及马等)进行免疫获得抗血清,从该抗血清中分离目标抗体而获得。
作为标记物,优选为可以通过视觉确认着色的有色物质,并且可以适当采用业界周知的标记物。可列举(例如)金属胶粒、非金属胶粒、着色乳胶以及酶标记等,从标记的稳定性的观点出发,优选为即使时间流逝也难以褪色的金属胶粒。作为金属胶粒,除金、铂、铜、银、钯胶体以外,还可使用它们混合后的颗粒等,特别是,由于在适当的粒径下金胶粒呈现红色,所以优选。
金属胶粒的平均粒径为(例如)1~500nm,从获得强烈色彩的方面考虑,优选为10nm~150nm、更优选为20~100nm的范围。作为非金属胶粒,可列举(例如)硒胶体等。可以通过常规方法制备金属胶粒以及非金属胶粒,此时,调节粒径以呈现所需色彩。另外,也可使用市售品。
作为着色乳胶,可列举(例如)利用使聚苯乙烯等高分子聚合物的颗粒呈现红色或蓝色的着色剂着色后的乳胶,并且可通过常规方法制备。作为酶标记,可列举(例如)过氧化物酶、碱性磷酸酶、葡萄糖氧化酶和半乳糖苷酶等。使用酶标记的情况下,使相对于该酶的基质以及根据需要的发色试剂反应,检测通过该反应产生的发色。
需要说明的是,可按照周知的手段制备经标记物标记的抗体。例如,作为在抗体上担载金胶粒的方法,可列举(例如)物理吸附或化学结合等周知的方法。具体而言,可以(例如)通过以下方法进行制备:向金颗粒以胶体状分散的溶液中加入抗体使之发生物理吸附,然后添加牛血清白蛋白溶液等封闭蛋白,将未结合抗体的颗粒表面封闭。另外,关于抗原抗体反应,可采用公知的夹心法、竞争法或将它们组合的方法。
作为标记物保持部13的材质,可列举(例如)玻璃纤维、纤维素、聚对苯二甲酸乙二醇酯、聚氨酯、聚醋酸酯、尼龙以及棉布等。
由于上述理由,标记物保持部13优选预先含有上述烷基葡糖苷类。标记物保持部13中的烷基葡糖苷类的含量优选为1~1700μg,更优选为3.5~700μg,进一步优选为175~700μg。
通过在1μg以上,促进烷基葡糖苷类的唾液成分的可溶化,并且抑制口腔内采集的含有唾液的血液检体中被检测物质的检测反应的反应性降低。通过在1700μg以下,不会发生由于烷基葡糖苷类的浓度过高所引起的对检测反应的阻碍,从而使高灵敏度的检测成为可能,并且也是经济上优选的浓度。
另外,标记物保持部13可以含有0.5~1100μg/cm2的烷基葡糖苷类,优选含有2~500μg/cm2,更优选含有100~500μg/cm2。
另外,由于上述理由,在标记物保持部13中优选预先同时含有烷基葡糖苷类与阴离子型表面活性剂。标记物保持部13中的阴离子型表面活性剂的含量优选为8~800μg,更优选为10~500μg,进一步优选为16~480μg。
通过在8μg以上,有助于抑制由唾液成分引起的检测反应的反应性降低,通过在800μg以下,不会发生由于标记试剂的凝集引起的展开不良或阴离子型表面活性剂的浓度过高引起的检测反应的阻碍,从而使更高灵敏度的检测成为可能。
另外,标记物保持部13可以含有5~500μg/cm2的阴离子型表面活性剂,优选含有6~320μg/cm2,更优选含有10~300μg/cm2。
层析介质部14只要是能够通过毛细管现象吸收样本检体并使之移动的物质即可,可由(例如)硝化纤维素、醋酸纤维素、尼龙、聚醚砜、聚乙烯醇、聚酯、玻璃纤维、聚烯烃、纤维素、以及它们的混合纤维等构成。
设置在层析介质部14上的检测部的抗HbA1c抗体涂布部16、抗血红蛋白抗体涂布部17、抗IgG抗体涂布部18可以由(例如)能够担载固定各自的抗体的材料构成,作为该材料可列举(例如)硝化纤维素等。
由于上述理由,层析介质部14优选预先含有上述烷基葡糖苷类。层析介质部14中的烷基葡糖苷类的含量优选为1~1700μg,更优选为3.5~700μg,进一步优选为175~700μg。
通过在1μg以上,促进烷基葡糖苷类的唾液成分的可溶化,并且抑制口腔内采集的含有唾液的血液检体中被检测物质的检测反应的反应性降低。通过在1700μg以下,不会发生由于烷基葡糖苷类的浓度过高所引起的对检测反应的阻碍,从而使高灵敏度的检测成为可能,并且也是经济上优选的浓度。
另外,层析介质部14可以含有0.5~1100μg/cm2的烷基葡糖苷类,优选含有2~500μg/cm2,更优选含有100~500μg/cm2。
另外,由于上述理由,在层析介质部14中优选预先同时含有烷基葡糖苷类与阴离子型表面活性剂。层析介质部14中的阴离子型表面活性剂的含量优选为8~800μg,更优选为10~500μg,进一步优选为16~480μg。
通过在8μg以上,有助于抑制由唾液成分引起的检测反应的反应性降低,通过在800μg以下,不会发生由于标记试剂的凝集引起的展开不良或阴离子型表面活性剂的浓度过高引起的检测反应的阻碍,从而使更高灵敏度的检测成为可能。
另外,层析介质部14可以含有5~500μg/cm2的阴离子型表面活性剂,优选含有6~320μg/cm2,更优选含有10~300μg/cm2。
在本发明的免疫层析分析装置中,在上述检测部的展开方向上游含有上述烷基葡糖苷类以及阴离子型表面活性剂。这里,在本说明书中,“检测部的展开方向上游”是指,向着免疫层析分析装置的长度方向,将以检测部为基准的情况下的样本添加部一侧作为上游侧的、相对的方向。具体而言,可列举(例如)样本添加部12、标记物保持部13以及层析介质部14等。
如上所述,优选在检体稀释液、位于检测部的展开方向上游的样本添加部12、标记物保持部13以及层析介质部14的至少一者中预先含有烷基葡糖苷类以及阴离子型表面活性剂。从有效抑制由唾液成分引起的检测反应的反应性降低或抑制由于标记试剂的凝集引起的展开不良的观点出发,更优选在检体稀释液以及样本添加部的至少一者中预先含有烷基葡糖苷类以及阴离子型表面活性剂。特别优选在检体稀释液中预先含有烷基葡糖苷类、在样本添加部中预先含有阴离子型表面活性剂。
作为构成吸收部15的材料,可列举具有迅速吸收过剩检体处理液的能力的材料,可使用纤维素纤维或者玻璃滤纸等。
接下来,对本发明的免疫层析分析方法进行说明。本发明的免疫层析分析方法是使用上述说明的免疫层析分析装置,对从口腔内采集的血液检体中所含的被检测物质进行检测的分析方法,其包括以下工序(1)~(4)。
(1)向样本添加部中添加检体处理液的工序,该检体处理液通过检体稀释液对所述血液检体进行稀释而得到;
(2)通过标记物保持部中所保持的标记物识别被检测物质的工序;
(3)在烷基葡糖苷类以及阴离子型表面活性剂的存在下,将血液检体以及标记物作为移动相在层析介质部中展开的工序;
(4)用检测部检测展开后的移动相中的被检测物质的工序。
以下,以被检测物质为HbA1c的情况为例,对各工序进行说明。在工序(1)中,首先,制备用检体稀释液对从口腔中采集的血液检体进行稀释的检体处理液。检体稀释液可充当用于将工序(3)中的血液检体以及标记物作为移动相在层析介质部中展开的展开液。
将检体稀释液与从患者的口腔内采集的血液检体混合从而制备检体处理液,并滴在样本添加部12上。需要说明的是,从患者采集血液检体的位置可列举(例如)龈沟。另外,采集方法可列举(例如)使用牙间刷的方法。
在工序(2)中,到达标记物保持部13的检体处理液中的血红蛋白与通过标记物标记的抗血红蛋白抗体发生抗原抗体反应,从而形成复合体。即,作为被检测物质的HbA1c也通过保持在标记物保持部13中的标记物而被识别。
在工序(3)中,将检体以及标记物,即检体处理液、抗血红蛋白抗体与血红蛋白的复合体作为移动相在层析介质部14中展开。此时,检体处理液中所含的非离子型表面活性剂使该展开的展开性优化,另外,如上所述,其发挥出不阻碍随后的抗原抗体反应的效果。
另外,在烷基葡糖苷类以及阴离子型表面活性剂的存在下将检体以及标记物作为移动相在层析介质部中展开的过程中,在检体稀释液以及检测部的展开方向上游的至少一者中包含烷基葡糖苷类以及阴离子型表面活性剂。
接着,在工序(4)中,在层析介质部14中展开的作为移动相中的被检测物质的HbA1c到达抗HbA1c抗体涂布部16,在通过那里时HbA1c与抗HbA1c抗体反应从而固定化。HbA1c以外的血红蛋白以及检体处理液不与抗HbA1c抗体涂布部16反应从而通过,但到达抗血红蛋白抗体涂布部17时,HbA1c以外的血红蛋白与抗血红蛋白抗体反应从而固定化。
需要说明的是,未与抗原反应的标记物或者在抗体涂布部16以及17处未反应的标记物在抗IgG抗体涂布部18处与抗IgG抗体反应从而固定化,并且作为显示展开正常进行的对照而发色。其它样本液成分不发生反应从而移动至吸收部15。由此,可确认各涂布部中由于HbA1c以及HbA1c以外的血红蛋白的存在所引起的发色信号。需要说明的是,抗HbA1c抗体以及抗血红蛋白抗体可以是如上所述的单克隆抗体、多克隆抗体的任意一者。
血中成分存在个人差异,如果只简单地通过使HbA1c发色而确认其强度的话,糖尿病的判定是困难的。因此,可以使HbA1c以及HbA1c以外的血红蛋白同时发色,从两者的发色程度的比较进行该判断。
具体而言,例如,比较HbA1c以及HbA1c以外的血红蛋白的发色信号,HbA1c的发色信号比HbA1c以外的血红蛋白的发色信号更强的情况下,即可判定为阳性。相反,HbA1c的发色信号与HbA1c以外的血红蛋白的发色信号相同或者比其更弱的情况下,即可判定为阴性。
[实施例]
以下,通过实施例和比较例对本发明进一步说明,但本发明并不限于下述例子。
<试验例1>
试验例1中,将被检测物质设为“含有唾液的血液检体中的糖化蛋白质(HbA1c)”,并使检体稀释液中含有烷基葡糖苷类、使样本添加部中含有阴离子型表面活性剂,由此来对烷基葡糖苷类和阴离子型表面活性剂有助于抑制由唾液成分引起的检测反应的反应性降低的效果进行确认。
实施例1
按照下面的顺序制作图1(a)和图1(b)所示的免疫层析分析装置1。
(1)样本添加部12
这样制作样本添加部12:向玻璃纤维垫(ミリポア公司制,商品名:玻璃纤维结合垫(conjugate pad),尺寸纵向32mm(检体处理液展开方向)、横向150mm,厚度0.43mm)上,以60μg/cm2的比例均匀添加十二烷基硫酸钠(SDS),在50℃下干燥4小时。
(2)抗HbA1c抗体涂布部16、抗血红蛋白抗体涂布部17、抗IgG抗体涂布部18的制作
作为膜,使用了由硝化纤维素制成的片材(ミリポア公司制,商品名:HF120、250mm×25mm)。用含有5质量%的蔗糖以及5质量%的异丙醇的10mM磷酸缓冲液(pH7.4)将抗HbA1c单克隆抗体、抗血红蛋白单克隆抗体或抗IgG单克隆抗体稀释成0.1mg/ml的浓度,通过抗体涂布机(BioDot公司制)将150μL该稀释后的溶液在膜上以1mm的宽度涂布至各自的位置,使之在50℃下干燥30分钟并在室温下干燥一晚,从而在层析介质部14上分别设置抗HbA1c抗体涂布部16、抗血红蛋白抗体涂布部17、抗IgG抗体涂布部18。
(3)标记物溶液的制备
向0.5mL金胶体悬浊液(田中贵金属工业株式会社制:平均粒径40nm)中,加入0.1mL用Tris缓冲液(pH8.5)稀释为0.1mg/mL浓度的抗血红蛋白单克隆抗体,室温下静置10分钟。然后,加入0.1ml的含有0.01质量%的PEG-SH(日本油脂株式会社制、商品名:SUNBRIGHT ME-200SH、分子量20000)的Tris缓冲液(pH8.5)(添加后的PEG-SH浓度:0.001质量%),室温下静置10分钟。然后,充分搅拌后,在8000×g下进行离心分离15分钟,除去上清液后,加入0.1ml的含有1质量%的牛血清白蛋白的磷酸缓冲液(pH7.4),从而制备标记物溶液。
(4)免疫层析分析装置1的制作
向220μl上述制备的标记物溶液中添加100μl的含有25质量%的海藻糖水溶液的磷酸缓冲液(pH9.0),将此溶液均匀地添加至8mm×100mm的玻璃纤维垫(ミリポア公司制)上以后,用真空干燥机干燥,从而制备了标记物保持部13。然后,向塑料制粘合片11上粘合上面制备的样本添加部12、经标记物标记的标记物保持部13、层析介质部14,进一步粘合通用的吸收部15,用切割机将宽度切为5mm,从而制作免疫层析分析装置1。此时,每个装置含有的SDS的量为96μg。
以下面的配方,搅拌各成分从而制备检体稀释液。
作为葡糖苷类的C8葡糖苷(同仁化学株式会社制,制品名:n-辛基-β-D-葡糖苷):10mM
作为非离子型表面活性剂的TritonX-100(SIGMA公司制,商品名)与Tween20(和光纯药株式会社制,商品名)的质量比为1:5的混合物:1.2质量%
作为缓冲液的Bicine缓冲液:50mM
作为无机盐的氯化钾:0.6质量%
作为添加剂的酪蛋白钠:2.0质量%
余量:水
检体的采集
通过混合HbA1c浓度已知的血液(该血液通过分别刺破健康成年男性以及糖尿病男性患者的指尖来采集),调整成HbA1c浓度为5.5%的血液。另外,从健康成人男性采集唾液。
检体处理液1的制备
将血液和唾液混合成(容量比)1∶49,以前者∶后者(容量比)为1∶19混合该混合物和上述检体稀释液,从而制备检体处理液1。
检体处理液2的制备
以前者∶后者(容量比)为1∶1000混合不含唾液的血液和上述检体稀释液,从而制备检体处理液2。
检体处理液3的制备
将混合HbA1c浓度已知的血液(其通过分别刺破健康成年男性以及糖尿病男性患者的指尖来采集)而调整的HbA1c浓度为6.5%的血液1μL和含有唾液的血液检体(从健康成人男性的口腔内,用牙间刷刺破龈沟采集)浸渍在1.0mL的检体稀释液中并搅拌,从而制备检体处理液3。
免疫层析分析的实施
向如上所述制作的免疫层析分析装置1的样本添加部12上供给110μl检体处理液1,展开10分钟后通过免疫层析阅读器(浜松ホトニクス(株)社制,制品名)测定检测部的发色的程度。关于通过免疫层析阅读器得到的测定值,在各实施例和比较例中重复3次试验。
以同样的方法对检体处理液2实施免疫层析分析。
含有唾液的血液检体(检体处理液1)和血液检体(检体处理液2)的发色度变化率的评价
由下式求得的发色度变化率在表1以及图2中示出。
发色度变化率(%)=100×(检体处理液1的平均测定值)/(检体处理液2的平均测定值)
100%表示没有变化,数值越小表示对含有唾液的检体的灵敏度降低越大。
实施例2
除了将实施例1中检体稀释液中的烷基葡糖苷类从C8葡糖苷变为C12葡糖苷的n-十二烷基-β-D-葡糖苷(花王株式会社制,制品名:マイドール12)以外,重复实施例1。结果在表1以及图2中示出。
实施例3
除了将实施例1中检体稀释液中的烷基葡糖苷类从C8葡糖苷变为C10葡糖苷的n-癸基-β-D-葡糖苷(花王株式会社制,制品名:マイドール10)以外,重复实施例1。结果在表1以及图2中示出。
实施例4
除了将实施例1中样本滴加部中所含的阴离子型表面活性剂从SDS变为SDBS(关东化学株式会社制,制品名:十二烷基苯磺酸钠)以外,重复实施例1。结果在表1以及图2中示出。
实施例5
除了将实施例1中检体稀释液中的烷基葡糖苷类从C8葡糖苷变为C12麦芽苷(花王株式会社制,制品名:マイドール12)以外,重复实施例1。结果在表1以及图2中示出。
比较例1
除了在实施例1中在检体稀释液中不含烷基葡糖苷类并且在样本滴加部中不含SDS以外,重复实施例1。结果在表1以及图2中示出。
比较例2
除了在实施例1中在检体稀释液中不含C8葡糖苷以外,重复实施例1。结果在表1以及图2中示出。
比较例3
除了在实施例1中在样本滴加部中不含SDS以外,重复实施例1。结果在表1以及图2中示出。
比较例4
除了在实施例1中在检体稀释液中含有10mM与C8葡糖苷同为非离子型表面活性剂的Briji35(ICI Americas Inc公司制)代替C8葡糖苷以外,重复实施例1。结果在表2以及图3中示出。
比较例5
除了在实施例1中在检体稀释液中含有10mM与C8葡糖苷同为非离子型表面活性剂的NP-40(ナカライテスク株式会社制,制品名:ノニデット(注册商标)P-40)代替C8葡糖苷以外,重复实施例1。结果在表2以及图3中示出。
比较例6
除了在实施例1中在检体稀释液中含有10mM与C8葡糖苷同为非离子型表面活性剂的MEGA-10(株式会社同人化学研究所制,n-癸酰基-N-甲基-D-葡糖胺)代替C8葡糖苷以外,重复实施例1。结果在表2以及图3中示出。
[表1]
[表2]
从表1以及表2所示实施例的结果,可以知道通过在检测部的展开方向上游含有烷基葡糖苷类以及阴离子型表面活性剂,抑制了由于血液检体中含有唾液而导致的检测灵敏度的降低。
另外,在比较例1和2中,在不含烷基葡糖苷类的情况下,含有或不含阴离子型表面活性剂,发色度的变化率均没有差别。
另一方面,可以知道,在比较例3和实施例1中,在含有烷基葡糖苷类的情况下,含有阴离子型表面活性剂的一方抑制了检测灵敏度的降低。
因此可知,通过烷基葡糖苷类以及阴离子型表面活性剂两者的存在,可以协同作用,从而抑制由于血液检体中含有唾液而导致的检测灵敏度的降低。
另外,关于表2和图3中示出的比较例4~6的结果,含有与烷基葡糖苷类同为非离子型表面活性剂的Briji35、NP-40、MEGA-10代替实施例1的烷基葡糖苷类的情况下,与实施例1相比发色度变化率明显变低。由该结果可以明确,本申请发明中,由于在非离子型表面活性剂中特别使用了烷基葡糖苷类,因此即使是含有唾液的血液检体中的被检测物质,也能明显地以良好的灵敏度进行检测。
<试验例2>
在试验例2中,将试验例1中的被检测物质改为“含有唾液的血液检体中的糖化蛋白质”以外的物质进行试验,并确认通过将被检测物质设为“含有唾液的血液检体中的糖化蛋白质”得到了本申请发明特有的显著的效果。在本试验中,将被检测物质设为腺病毒抗原进行试验。
比较例7
在比较例7中,按照下面的顺序制作免疫层析分析装置。
(1)样本添加部以与实施例1相同的方法制作。
(2)检测部的制作
作为膜,使用了由硝化纤维素制成的片材(ミリポア公司制,商品名:HF120、250mm×25mm)。用含有5质量%的蔗糖以及5质量%的异丙醇的10mM磷酸缓冲液(pH7.4)将抗腺病毒单克隆抗体或抗IgG单克隆抗体稀释成0.1mg/ml的浓度,通过抗体涂布机(BioDot公司制)将150μL该稀释后的溶液在膜上以1mm的宽度涂布至各自的位置,使之在50℃下干燥30分钟并在室温下干燥一晚,从而在层析介质部上分别设置抗腺病毒单克隆抗体涂布部、抗IgG抗体涂布部。
(3)标记物溶液的制备
向0.5mL金胶体悬浊液(田中贵金属工业株式会社制:平均粒径40nm)中,加入0.1mL用Tris缓冲液(pH8.5)稀释为0.1mg/mL浓度的抗腺病毒单克隆抗体,室温下静置10分钟。然后,加入0.1ml的含有0.01质量%的PEG-SH(日本油脂株式会社制、商品名:SUNBRIGHT ME-200SH、分子量20000)的Tris缓冲液(pH8.5)(添加后的PEG-SH浓度:0.001质量%),室温下静置10分钟。然后,充分搅拌后,在8000×g下进行离心分离15分钟,除去上清液后,加入0.1ml的含有1质量%的牛血清白蛋白的磷酸缓冲液(pH7.4),从而制备标记物溶液。
(4)免疫层析分析装置的制作
向220μl上述制备的标记物溶液中添加100μl的含有25质量%的海藻糖水溶液的磷酸缓冲液(pH9.0),将此溶液均匀地添加至8mm×100mm的玻璃纤维垫(ミリポア公司制)上以后,用真空干燥机干燥,从而制备了标记物保持部。然后,向塑料制粘合片上粘合上面制备的样本添加部、经标记物标记的标记物保持部、层析介质部,进一步粘合通用的吸收部,用切割机将宽度切为5mm,从而制作免疫层析分析装置。此时,每个装置含有的SDS的量为96μg。
以下面的配方,搅拌各成分从而制备检体稀释液。
作为葡糖苷类的C8葡糖苷(同仁化学株式会社制,制品名:n-辛基-β-D-葡糖苷):10mM
作为非离子型表面活性剂的TritonX-100(SIGMA公司制,商品名)与Tween20(和光纯药株式会社制,商品名)的质量比为1:5的混合物:1.2质量%
作为缓冲液的Bicine缓冲液:50mM
作为无机盐的氯化钾:0.6质量%
作为添加剂的酪蛋白钠:2.0质量%
余量:水
检体的采集
将1μg/mL的钝化腺病毒抗原作为检测物质,从健康成人男性采集唾液。
检体处理液1’的制备
将钝化腺病毒抗原和唾液混合成(容量比)1∶49,以前者∶后者(容量比)为1∶19混合该混合物和上述检体稀释液,从而制备检体处理液1’。
检体处理液2’的制备
以前者∶后者(容量比)为1∶1000混合钝化腺病毒抗原和上述检体稀释液,从而制备检体处理液2’。
免疫层析分析的实施
向如上所述制作的免疫层析分析装置的样本添加部上供给110μl检体处理液1’,展开10分钟后通过免疫层析阅读器(浜松ホトニクス(株)社制,制品名)测定检测部的发色的程度。关于通过免疫层析阅读器得到的测定值,在各比较例中重复3次试验。
以同样的方法对检体处理液2’实施免疫层析分析。
含有唾液的腺病毒检体(检体处理液1’)和不含唾液的腺病毒检体(检体处理液2’)的发色度变化率的评价
由下式求得的发色度变化率在表3以及图4中示出。
发色度变化率(%)=100×(检体处理液1’的平均测定值)/(检体处理液2’的平均测定值)
100%表示没有变化,数值越小表示对含有唾液的检体的灵敏度降低越大。
比较例8
除了在比较例7中在样本滴加部中不含SDS以外,重复比较例7。结果在表3以及图4中示出。
比较例9
除了在比较例7中在检体稀释液中不含烷基葡糖苷类以外,重复比较例7。结果在表3以及图4中示出。
比较例10
除了在比较例7中在检体稀释液中不含烷基葡糖苷类、在样本滴加部中不含SDS以外,重复比较例7。结果在表3以及图4中示出。
[表3]
关于表3和图4中示出的比较例7~10的结果,将被检测物质设为腺病毒的情况下,即使检体处理液中含有烷基葡糖苷类和阴离子型表面活性剂,也几乎看不到其发色度变化率上的差异。由此可知,本申请发明中,通过将“含有唾液的血液检体中的糖化蛋白质”用作被检测物质,能够得到被检测物质的灵敏度提高这样的效果。
实施例6
除了在实施例1的检体处理液1的制备中,使用HbA1c浓度为5.5%、6.0%、6.5%的各种血液,并且仅对含有唾液的血液检体进行分析以外,重复实施例1。另外,在免疫层析分析中,不使用免疫层析阅读器,而是以目视判定检测部的发色程度。结果在表4中示出。需要说明的是,表中的评价基准如下。
+:能够确认红色发色
++:能够确认强的红色的发色
+++:能够确认非常强的红色的发色
[表4]
HbA1c浓度 | 5.5% | 6.0% | 6.5% |
目视判定 | + | ++ | +++ |
实施例7
除了代替实施例6中的检体处理液1而使用检体处理液3对含有唾液的血液试验检体进行试验以外,重复实施例6。目视判定,结果确认了非常强的红色发色(+++)。另外,以牙间刷采集HbA1c浓度为6.5%以上的糖尿病患者的血液检体,在用检体稀释液稀释处理至1000倍进行试验的情况下,获得了同样的结果。
尽管用特定的实施方案对本发明的进行了详细地说明,但是对本领域技术人员而言应该清楚,可以在不脱离本发明的意图和范围的情况下进行各种变更和变形。需要说明的是,本申请基于2014年4月30日提交的日本专利申请(特愿2014-093844),其全文通过引用并入本文。
Claims (10)
1.一种免疫层析分析试剂盒,其含有用于稀释并展开从口腔内采集的血液检体的检体稀释液和免疫层析分析装置,该免疫层析分析装置包括样本添加部、标记物保持部、担载有检测部的层析介质部以及吸收部。
2.根据权利要求1所述的免疫层析分析试剂盒,其中在所述检体稀释液以及所述检测部的展开方向上游的至少一者中含有烷基葡糖苷类以及阴离子型表面活性剂。
3.根据权利要求1或2所述的免疫层析分析试剂盒,其中所述血液检体中的被检测物质为血液中的糖化蛋白质。
4.根据权利要求3所述的免疫层析分析试剂盒,其中所述糖化蛋白质为HbA1c。
5.根据权利要求2~4中任意一项所述的免疫层析分析试剂盒,其中所述烷基葡糖苷类为含有碳数为5~15的烷基的烷基葡糖苷或者烷基麦芽苷。
6.根据权利要求2~5中任意一项所述的免疫层析分析试剂盒,其中所述阴离子型表面活性剂为选自由十二烷基磺酸钠、十二烷基苯磺酸钠以及聚氧乙烯月桂基醚硫酸钠组成的组中的一种以上。
7.根据权利要求2~6中任意一项所述的免疫层析分析试剂盒,其中在所述检测部的展开方向上游含有1~1700μg的所述烷基葡糖苷类、和8~800μg的所述阴离子型表面活性剂。
8.根据权利要求1~7中任意一项所述的免疫层析分析试剂盒,其特征在于,使用牙间刷从口腔内采集血液检体。
9.一种免疫层析分析装置,其用于检测从口腔内采集的血液检体中的被检测物质,并且包括样本添加部、标记物保持部、担载有检测部的层析介质部以及吸收部,其中在所述检测部的展开方向上游含有烷基葡糖苷类以及阴离子型表面活性剂。
10.一种免疫层析分析方法,其为这样一种方法:使用包括样本添加部、标记物保持部、担载有检测部的层析介质部以及吸收部的免疫层析分析装置,检测从口腔内采集的血液检体中所含的被检测物质,该方法包括以下工序(1)~(4):
(1)向样本添加部中添加检体处理液的工序,所述检体处理液通过检体稀释液对所述血液检体进行稀释而得到;
(2)通过标记物保持部中所保持的标记物识别被检测物质的工序;
(3)在烷基葡糖苷类以及阴离子型表面活性剂的存在下,将所述血液检体以及标记物作为移动相在层析介质部中展开的工序;
(4)用检测部检测展开后的移动相中的被检测物质的工序。
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
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