JP5310154B2 - クロマトグラフィー分析用ストリップの製造方法 - Google Patents
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Description
(1)保持部材12に、標識試薬を保持させ、標識試薬保持部12aを設ける。
(2)支持体18上に、検出部材14を接着又はラミネートにより固定する。
(3)検出部材14上の検出領域14aに捕捉試薬溶液を、対照試薬固定部14bに対照試薬溶液をそれぞれ線状に塗布する。
(4)検出部材14を30〜60℃で15〜90分間乾燥させ、捕捉試薬及び対照試薬を検出部材14上に固定化する。
(5)捕捉試薬及び対照試薬を固定化した検出部材14をブロッキング及び洗浄処理する。
(6)ブロッキング及び洗浄処理した検出部材14を乾燥させる。
(7)支持体18上に、採取部材10、保持部材12及び吸収部材16を接着する。
(8)このようにして形成した多層構造カードを、目的とする幅のストリップ状に切断する。
液体試料中のヒトIgE(免疫グロブリンE)を検出する用の、図5及び6に示されるクロマトグラフィー分析用ストリップ1を、以下の手順により作製した。標識試薬として金コロイド標識ヤギ抗ヒトIgE抗体、捕捉試薬を構成する特異結合物質として抗ヒトIgEモノクローナル抗体、非イオン性界面活性剤として「NP−40」((株)同仁化学研究所製)、対照試薬として抗ヤギIgGモノクローナル抗体を用いた。
(1)標識試薬溶液の調製
クエン酸金コロイド溶液(田中貴金属(株)製、粒子径40nm)及びヤギ抗ヒトIgE抗体を用いて、常法に従い、金コロイド標識ヤギ抗ヒトIgE抗体(標識試薬)溶液を得た。
(2)保持部材12への塗布
得られた標識試薬溶液を、520nmにおけるOD(Optical Density)が8(OD520=8)となるように調整し、保持部材12(17mm×250mmの短冊状)の長辺方向の片側端に、18μL/cmにて塗布した。塗布は、高精度定量分注装置(BioDot社製、「XYZ3050」)を用いて行った。
(3)保持部材12の乾燥
標識試薬溶液を塗布した保持部材12を、真空ポンプ(Savant社製、「GP100」)に連結したアクリル製密閉容器に入れ、真空ポンプによる吸引を17時間行い、乾燥させた。
抗ヒトIgEモノクローナル抗体溶液(1mg/mL)に、非イオン性界面活性剤として「NP−40」((株)同仁化学研究所製)を、最終濃度が0.1%となるように加えて、捕捉試薬溶液を調製した。
(5)対照試薬溶液の調製
抗ヤギIgGモノクローナル抗体溶液(0.1mg/mL)に、ウシ血清アルブミン(シグマ(SIGMA)社製、「A7906−100G」)を、最終濃度が0.1%となるように加えて、対照試薬溶液を調製した。
得られた捕捉試薬溶液及び対照試薬溶液を、ニトロセルロース膜(日本ミリポア(株)製、「SHF1800225」)に塗布した。その際、捕捉試薬溶液は1.0μL/cm、対照試薬溶液は1.25μL/cmにて塗布した。塗布は、量分注装置(BioDot社製、「XYZ3050」)を用いて行った。
(7)検出部材14(ニトロセルロース膜)の乾燥
捕捉試薬溶液及び対照試薬溶液を塗布したニトロセルロース膜を、恒温槽(アドバンテック(Advantech)(株)製、「CI−410」)の中で、37℃にて60分間静置した。
乾燥させたニトロセルロース膜(検出部材14)を、ブロッキング液(1%カゼイン/50mMホウ酸/pH8.5)に浸漬し、30分間静置した。その後、ニトロセルロース膜をブロッキング液から引き上げ、洗浄液(0.5%スクロース/0.05%コール酸ナトリウム/50mMホウ酸/pH7.5)に浸漬し、30分間静置した。
(9)検出部材14(ニトロセルロース膜)の乾燥
次いで、ニトロセルロース膜を洗浄液から引き上げ、「キムタオル」(日本製紙クレシア(株)製)の上に静置した。オーバーナイトでニトロセルロース膜を風乾して乾燥させ、乾燥後は使用時まで超低湿保管庫(東洋リビング(株)製、「スーパードライ」)の中で保管した。
検出部材14(ニトロセルロース膜)の上流側の端部(フロー開始部)の、検出領域14a及び対照試薬固定部14bが設けられている側の面に、保持部材12の標識試薬保持部側の端部を約1mm重ね合わせた。検出部材14の下流側の端部(フロー終了部)の、検出領域14a及び対照試薬固定部14bが設けられている側の面に、吸収部材16の端部を約1mm重ね合わせた。検出部材14の上記面と反対側から、支持部材18(Adhesives Research社製、「ARcare7815」)を、保持部材12、検出部材14及び吸収部材16を接着するように貼り合わせた。支持部材18と反対の側から、青色紙テープ(シャムロック(Shamrock)社製、ラベリングテープ、13mm幅)を、保持部材12と検出部材14とを接着するように貼り合わせた。さらに、50mm幅の青色紙テープを、検出部材14、吸収部材16及び支持部材18を接着するように、吸収部材16全体を覆うようにして貼り合わせた。
(11)裁断
得られた積層体を、フロー方向に沿って1.5mm幅に裁断し、クロマトグラフィー分析用ストリップ1を得た。裁断には、裁断機(Kinematic Automation社製、「Matrix2360」)を用いた。
検体として、生理食塩水(大塚製薬(株)製)と、管理血清を生理食塩水で100倍希釈したものとを調製した。管理血清を生理食塩水で100倍希釈したもののうち、総IgE値が0.15(IU/mL)未満であるものを「N(<0.15)」、2.0(IU/mL)であるものを「VL(2.0)」、5.6(IU/mL)であるものを「QC4(5.6)」、10.8(IU/mL)であるものを「M01(10.8)」、21.0(IU/mL)であるものを「M00(21.0)」とした。生理食塩水の検体は、総IgE値が0(IU/mL)であるため「SL(0)」とした。陰性検体としてSL(0)及びN(<0.15)を、陽性検体として、VL(2.0)、QC4(5.6)、M01(10.8)及びM00(21.0)を用いた。
得られた各検体10μLを、それぞれ1.5mLチューブ(アズワン(株)製)に採取した。そのチューブ内に、上記作成手順により得られたクロマトグラフィー分析用ストリップ1を入れた。その際、採取部材10(保持部材12)が各検体に浸るような方向で入れた。対照試薬固定部14bまで検体が浸透したことを確認後、別に用意した精製水30μLが入った1.5mLチューブにストリップ1を移した。その際、採取部材10(保持部材12)が精製水に浸るような方向で入れた。10分経過後、パラフィルム(American National Can社製)上にストリップ1を置き、目視により観察した。試験は、各検体についてn=3で行った。
対照試薬固定部14bにラインが現れた場合を試験成立とした。一方、対照試薬固定部14bにラインが現れなかった場合は、検体の展開が好適に行われなかったことや、ストリップ1の不良が疑われるため、試験不成立とした。検出領域14aにラインが確認されなかった場合は陰性、対照試薬固定部14bのラインより薄いラインが認められた場合は弱陽性、対照試薬固定部14bのラインと同等以上に濃いラインが認められた場合は強陽性とした。
試験結果を図7に示す。図7は、非イオン性界面活性剤(NP−40)を0.1%の濃度で含む捕捉試薬を用いて作製したクロマトグラフィー分析用ストリップ1について、総IgE濃度が異なる6種の検体(SL(0)、N(<0.15)、VL(2.0)、QC4(5.6)、M01(10.8)及びM00(21.0))を用いて、各検体につき3回ずつ試験を行った結果を示す図である。試験の結果、検体としてSL(0)及びN(<0.15)を用いた場合は陰性、VL(2.0)及びQC4(5.6)を用いた場合は弱陽性、M01(10.8)及びM00(21.0)を用いた場合は強陽性を示した。
イムノクロマトリーダーICA1000M140(浜松ホトニクス)を用いて、試験後の各ストリップ1の検出領域14a及び対照試薬固定部14bの吸光度(mAbs)を測定した。各ストリップ1について、検出領域14aの吸光度測定値を対照試薬固定部14bの吸光度測定値で除した値(以下「(a/b)値」という。)を求めた。さらに、各検体について、(a/b)値の平均値(n=3)を求めた。表1に、総IgE濃度が異なる3種の検体(N(<0.15)、QC4(5.6)及びM00(21.0))について得られた(a/b)値の平均値(n=3)を示す。
捕捉試薬を構成する非イオン性界面活性剤であるNP−40の濃度を、それぞれ、0、0.05、0.1、0.15、0.2%として、実施例1と同様にして、5種のクロマトグラフィー分析用ストリップ1を作製した。5種のストリップ1それぞれについて、実施例1と同様の試験を行った。ただし、陽性検体として、VL(2.0)、QC4(5.6)、M01(10.8)及びM00(21.0)を用いる代わりに、総IgE値が6.3(IU/mL)であるもの(B04(6.3))と、24.7(IU/mL)であるもの(B02(24.7))を用いた。
実施例1の作製手順(4)において、非イオン性界面活性剤として、それぞれ「NP−40」、「Tween20」、「Triton X−100」を、最終濃度が0.1%となるように用いてクロマトグラフィー分析用ストリップ1を作製した。比較例として、非イオン性界面活性剤の代わりにエチレングリコールを最終濃度が1%又は3%となるように添加したもの、及び添加剤を何も加えなかったものも作製した。
−:総IgE値が0(IU/mL)である生理食塩水検体での偽陽性反応なし
0:陰性(検出領域14aのラインなし)
1:弱陽性(検出領域14aのラインが対照試薬固定部14bのラインより薄い)
2:強陽性(検出領域14aのラインが対照試薬固定部14bのラインと同等以上に濃い)
NP−40濃度が0.05%である捕捉試薬溶液を用いて、実施例1と同様に、クロマトグラフィー分析用ストリップ1を得た(洗浄液:0.5%スクロース/0.05%コール酸ナトリウム/50mMホウ酸/pH7.5:以下「ホウ酸系」とする。)。また、NP−40濃度が0.05%である捕捉試薬溶液を用いて、洗浄液を0.5%スクロース/0.05%コール酸ナトリウム/50mMトリス/pH7.5(以下「トリス系」とする。)としたこと以外は、実施例1と同様にして、クロマトグラフィー分析用ストリップ1を得た。これら洗浄液の種類が異なる2種のストリップ1の保存安定性を、以下のようにして調べた。
Claims (5)
- 被検出物質に特異的に結合する特異結合物質を含む捕捉試薬が固定化されている検出領域を備えるクロマトグラフィー分析用ストリップを製造する方法であって、
前記特異結合物質を含む捕捉試薬溶液を用いて前記捕捉試薬を前記検出領域に固定化する固定化工程と、
前記捕捉試薬を固定化させた前記検出領域に、ブロッキング液を塗布又は浸漬するブロッキング工程と、
前記ブロッキング液を塗布又は浸漬した前記検出領域を、ホウ酸を含む洗浄液で洗浄処理する洗浄工程と、
をこの順に含み、前記捕捉試薬溶液が、非イオン性界面活性剤を含む、クロマトグラフィー分析用ストリップの製造方法。 - 前記クロマトグラフィー分析用ストリップが、前記被検出物質に特異的に結合する標識試薬が保持されている標識試薬保持部を更に備える、請求項1に記載の製造方法。
- 前記クロマトグラフィー分析用ストリップが、前記標識試薬に特異的に結合する対照試薬が固定化されている対照試薬固定部を更に備える、請求項2に記載の製造方法。
- 前記固定化工程の後、前記ブロッキング工程の前に、前記捕捉試薬を固定化させた前記検出領域を乾燥させる乾燥工程を含む、請求項1〜3のいずれか一項に記載の製造方法。
- 前記洗浄工程の後に、洗浄処理した前記検出領域を乾燥させる乾燥工程を含む、請求項1〜4のいずれか一項に記載の製造方法。
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