CN111551744A - 新城疫病毒N蛋白IgY抗体胶体碳检测试纸及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种新城疫病毒N蛋白IgY抗体胶体碳检测试纸及其应用，属于新城疫病毒N蛋白IgY抗体胶体快速检测的技术领域，所述检测试纸中，结合垫为包被有兔抗鸡IgY‑胶体碳复合物的胶体碳垫，所述硝基纤维素膜上设有由山羊抗兔IgG包被的质控线和新城疫病毒N蛋白重组抗原包被的检测线。利用该试纸可以迅速检测新城疫病毒N蛋白IgY抗体水平，相比较现有的ELISA、化学发光检测、荧光PCR检测等检测方法，本发明更加的方便快捷，利于推广使用。
Description
技术领域
本发明属于新城疫病毒N蛋白IgY抗体快速检测的技术领域，尤其涉及一种新城疫病毒N蛋白IgY抗体胶体碳检测试纸及其应用。
背景技术
新城疫(newcastle disease,ND)是由新城疫病毒引起禽的一种急性、热性、败血性和高度接触性传染病。以高热、呼吸困难、下痢、神经紊乱、黏膜和浆膜出血为特征。世界动物卫生组织将其列为必须报告的动物传染病之一。
NDV的感染率和病死率可达100％,ND主要在鸡群中发病。ND最先于1926年发现于印度尼西亚,Doyle于1927年分离出病毒株,并将其命名。ND可在全球大范围内流行,一旦发病,因其具有传播速度快、发病率和病死率高等特征,会对家禽业产生巨大的影响,造成的损失不可估量。新城疫曾在世界范围内引起三次大的流行传播,前两次分别起源于东南亚及远东,而第三次NDV的感染对象由家禽转移到鸽子,发病症状与禽类相似,但鸽临床上并未表现高度呼吸困难。随着研究的不断深入,不同类型的疫苗被研发出来,使得20世纪90年代之后,ND再没有出现大规模流行传播,但是局部发病还是存在的,其危害不可小觑,更不容忽视。
研究发现，新城疫病毒粒子外有囊膜，囊膜表面有纤突，其基因组是长约15kB的单股负链RNA；其基因分为不同的节段，编码6种结构蛋白：核衣壳蛋白(NP)，磷酸化蛋白(P)，基质蛋白(M)，融合蛋白(F)，血凝素-神经氨酸酶蛋白(HN)及具有RNA依赖性的RNA聚合酶蛋白(L)。
其中，核衣壳蛋白(NP)具有高度的免疫原性，能介导细胞免疫作用。而新城疫病毒N蛋白IgY抗体作为饲料添加剂在使用中发现对新城疫病毒有较好的治疗作用和预防作用；新城疫病毒N蛋白IgY抗体检测也能检测家禽注射新城疫病毒疫苗是否成功；并且该检测试纸也可以在疫情爆发时进行定性确定是否时新城疫病毒。
目前市面上关于新城疫病毒N蛋白IgY抗体检测的试剂尚未报道，中国专利文献公开了一种应用表位多肽建立的鸡新城疫病毒抗体免疫胶体金快速检测试纸条，包括PVC底板，及设于PVC底板上的样品垫、金标抗体结合垫、硝酸纤维素膜和吸收垫，其中金标抗体结合垫上吸附有胶体金标记的多肽P25，硝酸纤维素膜上喷涂有兔抗鸡IgG包被的检测线和新城疫病毒多肽P25表位抗体包被的质控线。
中国专利文献CN200710169103.0公开了一种鸡新城疫抗体免疫胶体金快速检测试剂盒及应用，该胶体金检测试纸盒中，结合垫上包被胶体金标记的抗鸡IgG Fc片段单克隆抗体，检测线上包被有鸡新城疫病毒重组血凝素HN蛋白，质控线上包被有兔抗鼠IgG。
胶体金检测试剂临床满足即使检测的要求，但受限于检测灵敏度不高，原辅料价格昂贵以及环保等因素，需要寻找新的新的替代标记探针。
胶体碳免疫层析(Colloidal gold-based immunochromato graphic assay,GICA)技术是一种将胶体碳标记技术、免疫检测技术和层析分析技术等多种方法有机结合在一起的固相标记免疫检测技术，具有简便、省时、样本用量少、结果易判读等特点，常在资源匮乏或非实验室环境中进行目标物的定性、半定量和定量检测。应用范围包括生物医学中的病原体、药物、激素和代谢物检测，植物检疫，兽医，饲料/食品和环境指标的测试。相比较ELISA、化学发光检测、荧光PCR检测等检测方法，本发明更加的方便快捷，利于推广使用。
新型纳米材料胶体碳是胶体金的理想替代品，本发明用的胶体碳与胶体金的标记机制相似却不相同。与胶体金比，胶体碳具有明显的优势，稳定性更高，胶体碳与NC膜黑白颜色对比更容易分辨，所需标记蛋白少，灵敏度更高，碳材料环保等。本申请旨在以胶体碳免疫层析技术为基础，开发一种新的灵敏度更高、检测线性更广的针对新城疫病毒N蛋白IgY抗体检测试剂。
发明内容
本发明的目的就在于为了解决上述问题而提供一种新城疫病毒N蛋白IgY抗体胶体碳检测试纸及其方法，以提供一种针对新城疫病毒N蛋白IgY的快速检测方法，从而快速检测待测样本中是否真正含有新城疫病毒N蛋白卵黄抗体，保证饲养业主的利益。
本发明通过以下技术方案来实现上述目的：
本发明提供了一种新城疫病毒N蛋白IgY抗体胶体碳检测试纸，包括PVC底板，及依次搭接在PVC底板上的样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜和吸水垫，其中，所述结合垫为包被有兔抗鸡IgY-胶体碳复合物的胶体碳垫，所述硝基纤维素膜上设有由山羊抗兔IgG包被的质控线和新城疫病毒N蛋白重组抗原包被的检测线。
本发明还提供了上述新城疫病毒N蛋白IgY抗体胶体碳检测试纸的制备方法，包括以下步骤：
(1)制备纯化的新城疫病毒N蛋白重组抗原；
(2)制备硝酸纤维素膜：将山羊抗兔IgG和纯化的新城疫病毒N蛋白重组抗原分别稀释后，包被在硝酸纤维素膜上的质控线和检测线上；
(3)样品垫处理；
(4)胶体碳标记兔抗鸡IgY：取兔抗鸡IgY，将胶体碳与兔抗鸡IgY混合，离心，重悬沉淀，获得兔抗鸡IgY-胶体碳复合物；
(5)制备胶体碳垫：将兔抗鸡IgY-胶体碳复合物均匀喷在结合垫上，充分干燥，获得胶体碳垫；
(6)组装：在干燥环境下，将样品垫、胶体碳垫、包被好的硝酸纤维素膜和吸水垫粘贴在PVC板上，裁切，获得所述试纸。
作为本发明的进一步优化方案，所述步骤(1)中，制备纯化的新城疫病毒N蛋白重组抗原的步骤包括：根据新城疫病毒N蛋白基因序列制备新城疫病毒N蛋白的大肠杆菌重组菌，将重组菌发酵表达并离心获得菌体，将菌体破碎，离心取上清，将上清过亲和层析柱，即为纯化的新城疫病毒N蛋白重组抗原。
作为本发明的进一步优化方案，所述步骤(2)中，山羊抗兔IgG和纯化的新城疫病毒N蛋白重组抗原分别以20mM的PB缓冲液稀释至终浓度为2mg/ml，再以1μL/cm的喷量喷施在质控线和检测线上，充分干燥。
作为本发明的进一步优化方案，所述步骤(3)中，将样品垫用样品垫处理液浸泡处理3h，充分干燥，获得处理后的样品垫。
作为本发明的进一步优化方案，所述样品垫处理液的配方按重量计，包括：0.1mol/L的Tris溶液、1％PVP、0.4％Casein、0.5％NaCl、0.2％TritonX-100，调节pH至7.0。
作为本发明的进一步优化方案，所述步骤(4)中，用胶体稀释溶液重悬沉淀，所述胶体稀释溶液的组分及其质量百分比包括：20mM Tris、10％蔗糖、5％海藻糖、0.5％牛血清白蛋白、0.5％PEG2000、0.1％吐温20，调节pH至7.0。
作为本发明的进一步优化方案，所述步骤(5)中，兔抗鸡IgY-胶体碳复合物在结合垫上的喷洒量为3μL/cm。
本发明还提供了一种利用上述新城疫病毒N蛋白IgY抗体胶体碳检测试纸对新城疫病毒N蛋白IgY抗体检测的方法，步骤包括：将待测样品加入试纸的样品垫上，室温平放静置15min，若试纸的质控线和检测线上均出现一条黑线，则待测样品中含有新城疫病毒N蛋白IgY抗体，为阳性；若试纸的质控线上有黑线，检测线上无黑线，则待测样品中不含新城疫病毒N蛋白IgY抗体，为阴性；且待测样品中新城疫病毒N蛋白IgY抗体含量与试纸检测线的色线深浅成正比，即样品中新城疫病毒N蛋白IgY抗体含量越高，色线越深。
本发明的有益效果在于：本发明提供了一种新城疫病毒N蛋白IgY抗体胶体碳检测试纸及其应用，利用检测试纸检测后，阳性结果说明所检测样本新城疫病毒N蛋白IgY抗体阳性且达到了要求的抗体水平，阴性结果说明样本新城疫病毒N蛋白IgY抗体阴性或未达到要求的抗体水平，该试纸条可迅速检测新城疫病毒N蛋白IgY抗体水平，填补了新城疫病毒N蛋白IgY抗体目前无针对性检测试剂的空白，相比较ELISA、化学发光检测、荧光PCR检测等检测方法，本发明更加的方便快捷，利于推广使用。
附图说明
图1是新城疫病毒N蛋白IgY抗体胶体碳检测试纸的结构示意图。
具体实施方式
下面结合附图对本申请作进一步详细描述，有必要在此指出的是，以下具体实施方式只用于对本申请进行进一步的说明，不能理解为对本申请保护范围的限制，该领域的技术人员可以根据上述申请内容对本申请作出一些非本质的改进和调整。
实施例1
本实施例提供了一种新城疫病毒N蛋白IgY抗体胶体碳检测试纸的制备方法，步骤包括：
(1)制备纯化的新城疫病毒N蛋白重组抗原：
从GENBANK获取新城疫病毒N蛋白基因序列(Genbank登录号:AB124609.1)，送南京金斯瑞生物科技有限公司公司合成该段基因序列，重组至质粒pET32a中，转至大肠杆菌BL21中，制备新城疫病毒N蛋白的大肠杆菌重组菌，将重组菌发酵表达并离心获得菌体，将菌体使用高压均质机破碎并使用超声破碎仪二次破碎，离心取上清，将上清过亲合层析柱，即为纯化的新城疫病毒N蛋白重组抗原。
(2)制备硝酸纤维素膜
将山羊抗兔IgG和纯化的新城疫病毒N蛋白重组抗原分别以20mM的PB缓冲液稀释至终浓度为2mg/ml，然后分别均匀喷在硝酸纤维素膜4上的质控线C和检测线T，喷量均为1μL/cm，37℃4h充分干燥。
(3)样品垫处理
配置样品垫处理液100ml(按重量计，组分包括0.1M Tris、1％PVP、0.4％Casein、0.5％NaCl、0.2％TritonX-100，调PH至7.0)，将玻璃纤维8964置于样品垫处理液中浸泡3h，取出充分干燥(37℃24小时，彻底干燥)。使用前将玻璃纤维裁剪成30*1.6cm；获得样品垫2。
(4)胶体碳标记兔抗鸡IgY
碳标记试剂盒采购于北京纳晶科技生物有限公司，取出碳标记试剂盒，8000r/min离心10min后收集胶体碳颗粒，涡旋振荡混匀后超声处理3min，复溶后的胶体碳溶液为深黑色。取100ml胶体碳溶液，加入9μL 0.2M K2CO3将胶体碳溶液的pH值调至6.5；取3mg兔抗鸡IgY，去离子水中至浓度为0.5mg/ml。按以下组合将兔抗鸡IgY与胶体碳混合：每3mg兔抗鸡IgY，加入100ml胶体碳溶液；混合30min后，加入20％的BSA 10mL，室温作用结合30min后，先1500r/min低速离心10min，取上清；再10000r/min高速离心30min，取沉淀。加入100ml PBS重悬沉淀，再10000r/min高速离心30min，取沉淀。用胶体稀释溶液20mL(按重量计，胶体稀释溶液的组分及其质量百分比包括：20mM Tris,10％蔗糖，5％海藻糖，0.5％牛血清白蛋白，0.5％PEG2000.0.1％吐温20，pH 7.0)重悬沉淀，即为兔抗鸡IgY-胶体碳复合物。
(5)制备碳标释放垫
将上述制备的兔抗鸡IgY-胶体碳复合物按照3μL/cm的喷量均匀喷在玻璃纤维素膜(30*0.7cm)上，充分干燥(30℃，烘干过夜)，获得胶体碳释放垫3。
(6)组装
在干燥间内准备好吸水垫5、样品垫2、PVC底板1，在PVC底板1中央贴上步骤2.2包被好的硝酸纤维素膜4，硝酸纤维素膜4上缘粘贴吸水垫5，硝酸纤维素膜4下缘粘贴步骤2.7制备的胶体碳垫3，胶体碳垫3下缘粘贴样品垫2，各组分相互叠加部分为1-2mm，完成后用裁切机将贴好的试纸板切成3.7mm宽的试纸条，如图1所示。将切好的试纸条装入卡壳中，再将试纸条和干燥剂密封于铝箔袋中，完成产品的组装。
试验例1
本实施例提供了一种新城疫病毒N蛋白IgY抗体胶体金检测试纸的制备方法，其中，利用胶体金标记兔抗鸡IgY获得复合物，并喷洒在玻璃纤维素膜上，获得胶体金释放点，其它步骤同实施例1。
试验例2
试纸检测效果验证：
分别利用实施例1、试验例1-2的试纸和酶联免疫吸附法(ELISA)检测抗体浓度，步骤包括：试纸平放于桌面上，根据新城疫病毒N蛋白IgY抗体出厂时要求的抗体水平，取新城疫病毒N蛋白IgY抗体，用10mM的PBS溶液稀释至50ng/ml浓度、100ng/ml浓度、200ng/ml浓度、400ng/ml浓度，作为检测样品，同时设置空白对照。分别取检测样品和空白对照50-100μL，加入样品垫2，室温静置15min，根据质控线和检测线的颜色读取结果：若试纸的质控线和检测线上均出现一条黑线，则待测样品中含有新城疫病毒N蛋白IgY抗体，为阳性；若试纸的质控线上有黑线，检测线上无黑线，则待测样品中不含新城疫病毒N蛋白IgY抗体，为阴性；且待测样品中新城疫病毒N蛋白IgY抗体含量与试纸检测线的色线深浅成正比，即样品中新城疫病毒N蛋白IgY抗体含量越高，色线越深。酶联免疫吸附法(ELISA)检测抗体浓度按照常规酶联免疫吸附法进行。
结果如下表1和表2所示：
表1：不同方法检测新城疫病毒N蛋白IgY抗体浓度结果
| 样品浓度 | 50ng/ml | 100ng/ml | 200ng/ml | 400ng/ml | 800ng/ml | 空白 |
| 实施例1 | 阳性(色浅) | 阳性(色浅) | 阳性(正常) | 阳性(正常) | 阳性(色深) | 阴性 |
| 试验例1 | 阴性 | 阳性(色浅) | 阳性(色浅) | 阳性(正常) | 阳性(正常) | 阴性 |
| 试验例2 | 阳性 | 阳性(色浅) | 阳性(色浅) | 阳性(正常) | 阳性(色深) | 阴性 |
| ELISA | 阳性 | 阳性 | 阳性 | 阳性 | 阳性 | 阴性 |
表1可以看出，本发明的胶体碳试纸条的检测结果与ELISA检测结果具有高度一致性，说明本发明胶体碳试纸条的准确率为100％，利用本申请的胶体碳试纸条检测新城疫病毒N蛋白IgY抗体及其含量是可行的。由于色线深浅与抗体含量成正比，抗体含量越高，色线越深。同试验例1和2的对照结果可以明显看出本发明的准确率和灵敏度要优于胶体金的，同时本发明在结合垫上包被的兔抗鸡IgY-胶体碳复合物，其在灵敏度和环保性上均优于胶体金法。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。
Claims (9)
1.一种新城疫病毒N蛋白IgY抗体胶体碳检测试纸，包括PVC底板，及依次搭接在PVC底板上的样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜和吸水垫，其特征在于，所述结合垫为包被有兔抗鸡IgY-胶体碳复合物的胶体碳垫，所述硝基纤维素膜上设有由山羊抗兔IgG包被的质控线和新城疫病毒N蛋白重组抗原包被的检测线。
2.一种如权利要求1所述的新城疫病毒N蛋白IgY抗体胶体碳检测试纸的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)制备纯化的新城疫病毒N蛋白重组抗原；
(2)制备硝酸纤维素膜：将山羊抗兔IgG和纯化的新城疫病毒N蛋白重组抗原分别稀释后，包被在硝酸纤维素膜上的质控线和检测线上；
(3)样品垫处理；
(4)胶体碳标记兔抗鸡IgY：取兔抗鸡IgY，将胶体碳与兔抗鸡IgY混合，离心，重悬沉淀，获得兔抗鸡IgY-胶体碳复合物；
(5)制备胶体碳垫：将兔抗鸡IgY-胶体碳复合物均匀喷在结合垫上，充分干燥，获得胶体碳垫；
(6)组装：在干燥环境下，将样品垫、胶体碳垫、包被好的硝酸纤维素膜和吸水垫粘贴在PVC板上，裁切，获得所述试纸。
3.根据权利要求2所述的一种新城疫病毒N蛋白IgY抗体胶体碳检测试纸的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)中，制备纯化的新城疫病毒N蛋白重组抗原的步骤包括：根据新城疫病毒N蛋白基因序列制备新城疫病毒N蛋白的大肠杆菌重组菌，将重组菌发酵表达并离心获得菌体，将菌体破碎，离心取上清，将上清过亲和层析柱，即为纯化的新城疫病毒N蛋白重组抗原。
4.根据权利要求2所述的一种新城疫病毒N蛋白IgY抗体胶体碳检测试纸的制备方法，其特征在于，所述步骤(2)中，山羊抗兔IgG和纯化的新城疫病毒N蛋白重组抗原分别以20mM的PB缓冲液稀释至终浓度为2mg/ml，再以1μL/cm的喷量喷施在质控线和检测线上，充分干燥。
5.根据权利要求2所述的一种新城疫病毒N蛋白IgY抗体胶体碳检测试纸的制备方法，其特征在于，所述步骤(3)中，将样品垫用样品垫处理液浸泡处理3h，充分干燥，获得处理后的样品垫。
6.根据权利要求2所述的一种新城疫病毒N蛋白IgY抗体胶体碳检测试纸的制备方法，其特征在于，所述样品垫处理液的配方按重量计，包括：0.1mol/L的Tris溶液、1％PVP、0.4％Casein、0.5％NaCl、0.2％TritonX-100，调节pH至7.0。
7.根据权利要求2所述的一种新城疫病毒N蛋白IgY抗体胶体碳检测试纸的制备方法，其特征在于，所述步骤(4)中，用胶体稀释溶液重悬沉淀，所述胶体稀释溶液的组分及其质量百分比包括：20mM Tris、10％蔗糖、5％海藻糖、0.5％牛血清白蛋白、0.5％PEG2000、0.1％吐温20，调节pH至7.0。
8.根据权利要求2所述的一种新城疫病毒N蛋白IgY抗体胶体碳检测试纸的制备方法，其特征在于，所述步骤(5)中，兔抗鸡IgY-胶体碳复合物在结合垫上的喷洒量为3μL/cm。
9.一种利用如权利要求1所述的胶体碳检测试纸检测新城疫病毒N蛋白IgY抗体的方法，其特征在于，步骤包括：将待测样品加入试纸的样品垫上，室温平放静置15min，若试纸的质控线和检测线上均出现一条黑线，则待测样品中含有新城疫病毒N蛋白IgY抗体，为阳性；若试纸的质控线上有黑线，检测线上无黑线，则待测样品中不含新城疫病毒N蛋白IgY抗体，为阴性；且待测样品中新城疫病毒N蛋白IgY抗体含量与试纸检测线的色线深浅成正比。
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