CN114624447B - 一种用于新型冠状病毒的检测试纸及其制备工艺 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种用于新型冠状病毒的检测试纸包括样品垫、金标结合垫、层析反应膜、吸水垫和PVC底板;采用本发明所制备用于新型冠状病毒的检测试纸,能有效提高新冠病毒阳性检出效率,有效地节约了试剂,提高生产效率。
Description
技术领域
本发明属于生物检测技术领域,具体涉及一种用于新型冠状病毒的检测试纸及其制备工艺。
背景技术
冠状病毒是一个大型病毒家族,已知可引起感冒以及中东呼吸综合征(MERS)和严重急性呼吸综合征(SARS)等较严重疾病。人感染了冠状病毒后常见体征有呼吸道症状、发热、咳嗽、气促和呼吸困难等。在较严重病例中,感染可导致肺炎、严重急性呼吸综合征、肾衰竭,甚至死亡。SARS-CoV-2感染人体后,除了对靶器官产生致病过程外,病毒基因组编码的结构蛋白、非结构蛋白还刺激机体免疫系统,产生特异性免疫应答,分泌病原体特异性IgM和IgG抗体至血液循环中,而IgG常发病2周后出现,是病毒感染最可靠的指标,滴度快速上升可提示近期感染,否则为既往感染。目前新SARS-CoV-2的检测主要依赖核酸检测,核酸检测方法具有较高的灵敏度和特异性,但是新型冠状病毒核酸检测目前存在三个主要的问题:部分样本核酸检测阴性,采样是主要的原因,下呼吸道采样阳性率高但是不容易大规模推广,上呼吸道采样操作方便,但是采样不标准容易产生假阴性;(2)核酸检测操作比较复杂,难以实现自动化;(3)核酸检测对实验室环境有一定的要求,需要专业的PCR实验室,临床大规模推广收到一定的限制。以上三点不足导致目前新型冠状病毒检测单独依赖核酸检测无法满足疫情防控的需求,为了提高新型冠状病毒检测能力,需要提供快速、准确、安全的检测手段,与现有的核酸检测方法协同使用甚至取代核酸检测方法,进一步提高检测能力。
发明内容
为了解决现有技术中存在的问题,本发明的目的在于提供一种用于新型冠状病毒的检测试纸及其制备工艺。
为了达到上述目的,本发明采用如下技术手段:
一种用于新型冠状病毒的检测试纸,包括样品垫、金标结合垫、反应垫、吸水垫和PVC底板。
优选地,所述金标结合垫上包被胶体金结合物。
优选地,所述胶体金结合物由以下方法制备获得:S1,制备胶体金;S2,利用抗体、水、蛋白分散剂以及步骤S1所制得的胶体金制备体金结合物。
优选地,所述抗体包括SARS-Cov-2单克隆抗体A和兔IgG抗体。
优选地,所述蛋白分散剂由以下重量份数物质组成:10-30份牛血清蛋白、10-30份聚乙二醇、1-5份甘油三酯、1-2份氨基酸和8-12份共聚维酮。
优选地,所述S1制备胶体金的具体过程如下:将重铬酸钾溶于40℃热水中,得到重铬酸钾溶液,后将其倒入浓硫酸中,得到酸洗液,将玻璃器皿放入酸洗液中浸泡48小时,后用纯化水洗涤3-5次后烘干,得到洗净的玻璃器皿备用;将柠檬酸三钠与氯金酸分别加到洗净的玻璃器皿中,并分别用50mL的纯化水溶解,得到质量分数为1%的柠檬酸三钠溶液和0.02%的氯金酸溶液;将氯金酸溶液加热至沸腾,并保持沸腾5min,在沸腾的条件下加入柠檬酸三钠溶液,保持沸腾20min,停止加热,保持搅拌冷却至室温,即可得到胶体金溶液;其中,重铬酸钾、热水和浓硫酸按重量份数计如下:重铬酸钾120份;热水1000份;浓硫酸368份。
优选地,所述S2的具体过程如下:步骤一:抗体、水和蛋白分散剂中进行旋涡使其混匀,得到抗体分散液,其中抗体分散液中抗体的浓度为1ug/mL;步骤二:将碳酸钾溶液加入到胶体金溶液中并进行搅拌混匀,对胶体金溶液进行pH值调节;步骤三:在搅拌的条件下将抗体分散液逐滴加入到步骤二所得到的胶体金溶液中,保持搅拌20-30min,后于低温下搅拌30-60min,并离心、浓缩,即可得到胶体金结合物;其中,抗体、水和蛋白分散剂的重量份数如下:抗体0.001份、水1000份和蛋白分散剂0.01份。
进一步优选地,当抗体为SARS-Cov-2单克隆抗体A时,将胶体金溶液的pH值调节至7-8;当抗体为兔IgG抗体时,将胶体金溶液的pH值调节至8-9。
一种用于新型冠状病毒的检测试纸的制备工艺,包括如下步骤:
S101,利用上述方法分别制备SARS-Cov-2单克隆抗体A胶体金结合物和兔IgG抗体胶体金结合物;
S102,将胶体金结合物喷于处理好的金标结合垫上,并烘干待用;
S103,在层析反应膜上喷涂检测线和质控线,烘干待用,分别将样品垫、金标结合垫、层析反应膜和吸水垫从左到右分别搭接组装在PVC底板上,并切割成等宽的小试纸条,装进检测卡中,干燥保存待用。
优选地,步骤S103中所述的层析反应膜为硝酸纤维素膜;检测线上包被SARS-Cov-2单克隆抗体B;所述质控线上包被抗兔IgG多抗。
本发明的有益效果
相对于现有技术,本发明具有以下有益效果:
本发明所制备的胶体金粒径均匀,显著提高了检测效率;本发明采用了蛋白分散剂,能够在生产胶体金结合物的同时对胶体金颗粒进行封闭,无需额外添加牛血清蛋白对胶体金进行封闭,采用本发明所制备用于新型冠状病毒的检测试纸,能有效提高新冠病毒阳性检出效率,有效的节约了试剂,提高生产效率。
附图说明
图1示出了实施例3所制备的用于新型冠状病毒的检测试纸;
图2示出了实施例3所制备的用于新型冠状病毒的检测试纸的检测结果。
图中标记为:1、样品垫;2、金标结合垫;3、层析反应膜;4、吸水垫;5、PVC底板;31、检测线;32、质控线。
具体实施方式
除非另有说明、从上下文暗示或属于现有技术的惯例,否则本申请中所有的份数和百分比都基于重量,且所用的测试和表征方法都是与本申请的提交日期同步的。在适用的情况下,本申请中涉及的任何专利、专利申请或公开的内容全部结合于此作为参考,且其等价的同族专利也引入作为参考,特别这些文献所披露的关于本领域中的合成技术、产物和加工设计、聚合物、共聚单体、引发剂或催化剂等的定义。如果现有技术中披露的具体术语的定义与本申请中提供的任何定义不一致,则以本申请中提供的术语定义为准。
本申请中的数字范围是近似值,因此除非另有说明,否则其可包括范围以外的数值。数值范围包括以1个单位增加的从下限值到上限值的所有数值,条件是在任意较低值与任意较高值之间存在至少2个单位的间隔。例如,如果记载组分、物理或其它性质(如分子量,熔体指数等)是100至1000,意味着明确列举了所有的单个数值,例如100,101,102等,以及所有的子范围,例如100到166,155到170,198到200等。对于包含小于1的数值或者包含大于1的分数(例如1.1,1.5等)的范围,则适当地将1个单位看作0.0001,0.001,0.01或者0.1。对于包含小于10(例如1到5)的个位数的范围,通常将1个单位看作0.1。这些仅仅是想要表达的内容的具体示例,并且所列举的最低值与最高值之间的数值的所有可能的组合都被认为清楚记载在本申请中。
关于化学化合物使用时,除非明确地说明,否则单数包括所有的异构形式,反之亦然(例如,“己烷”单独地或共同地包括己烷的全部异构体)。另外,除非明确地说明,否则用“一个”,“一种”或“该”形容的名词也包括其复数形式。
术语“包含”,“包括”,“具有”以及它们的派生词不排除任何其它的组分、步骤或过程的存在,且与这些其它的组分、步骤或过程是否在本申请中披露无关。为消除任何疑问,除非明确说明,否则本申请中所有使用术语“包含”,“包括”,或“具有”的组合物可以包含任何附加的添加剂、辅料或化合物。相反,出来对操作性能所必要的那些,术语“基本上由……组成”将任何其他组分、步骤或过程排除在任何该术语下文叙述的范围之外。术语“由……组成”不包括未具体描述或列出的任何组分、步骤或过程。除非明确说明,否则术语“或”指列出的单独成员或其任何组合。
为了使本发明所解决的技术问题、技术方案及有益效果更加清楚明白,以下结合实施例,对本发明进行进一步详细说明。
实施例
以下例子在此用于示范本发明的优选实施方案。本领域内的技术人员会明白,下述例子中披露的技术代表发明人发现的可以用于实施本发明的技术,因此可以视为实施本发明的优选方案。但是本领域内的技术人员根据本说明书应该明白,这里所公开的特定实施例可以做很多修改,仍然能得到相同的或者类似的结果,而非背离本发明的精神或范围。
除非另有定义,所有在此使用的技术和科学的术语,和本发明所属领域内的技术人员所通常理解的意思相同,在此公开引用及他们引用的材料都将以引用的方式被并入。
那些本领域内的技术人员将意识到或者通过常规试验就能了解许多这里所描述的发明的特定实施方案的许多等同技术。这些等同将被包含在权利要求书中。
用于新型冠状病毒的检测试纸包括依次相连的样品垫1、金标结合垫2、反应垫3、吸水垫5和PVC底板5。样品垫1、金标结合垫2、反应垫3和吸水垫4从左到有分别搭接组装在PVC底板5上。其中样品垫1右侧叠加一部分压在金标结合垫2左侧上,金标结合垫2右侧叠加一部分压在反应垫3左侧上,反应吸水垫4左侧叠加一部分压在反应吸水垫3右侧上。其中在反应垫3上分别划有检测线31和质控线32,检测线31靠近金标结合垫2,质控线32靠近吸水垫4。
SARS-Cov-2单克隆抗体A为安源医药科技上海有限公司的货号NmAb17;
SARS-Cov-2单克隆抗体B为安源医药科技上海有限公司的货号NmAb12。
实施例1胶体金的制备
将120g重铬酸钾溶于1000mL的40℃热水中,得到重铬酸钾溶液,后加入200m的浓硫酸,得到酸洗液,将玻璃器皿放入酸洗液中浸泡48小时,后用纯化水洗涤3-5次后烘干,得到洗净的玻璃器皿备用;将柠檬酸三钠与氯金酸分别加到洗净的玻璃器皿中,并分别用50mL的纯化水溶解,得到质量分数为1%的柠檬酸三钠溶液和0.02%的氯金酸溶液;将氯金酸溶液加热至沸腾,并保持沸腾5min,在沸腾的条件下加入柠檬酸三钠溶液,保持沸腾20min,停止加热,保持搅拌冷却至室温,即可得到胶体金溶液。
实施例2制备体金结合物
一,制备SARS-Cov-2单克隆抗体A胶体金结合物
步骤一:将0.001gSARS-Cov-2单克隆抗体A、1000mL水和0.01g蛋白分散剂中进行旋涡使其混匀,得到SARS-Cov-2单克隆抗体A分散液,其中SARS-Cov-2单克隆抗体A分散液中SARS-Cov-2单克隆抗体A浓度为1ug/mL;步骤二:将碳酸钾溶液加入到实施例1所制得的胶体金溶液中并进行搅拌混匀,将胶体金溶液的pH值调节至7.5;步骤三:在搅拌的条件下将新型冠状病毒蛋白分散液逐滴加入到步骤二所得到的胶体金溶液中,保持搅拌25min,后于低温下搅拌45min,并离心、浓缩,即可得到SARS-Cov-2单克隆抗体A胶体金结合物。
其中,蛋白分散剂由20份牛血清蛋白、20份聚乙二醇、3份甘油三酯、2份氨基酸和10份共聚维酮组成。
二,制备兔IgG抗体胶体金结合物
步骤一:将0.001g兔IgG抗体、1000mL水和0.01g蛋白分散剂中进行旋涡使其混匀,得到兔IgG抗体分散液,其中兔IgG抗体分散液中兔IgG抗体的浓度为1ug/mL;步骤二:将碳酸钾溶液加入到实施例1所制得的胶体金溶液中并进行搅拌混匀,将胶体金溶液的pH值调节至8.5;步骤三:在搅拌的条件下将兔IgG抗体分散液逐滴加入到步骤二所得到的胶体金溶液中,保持搅拌25min,后于低温下搅拌45min,并离心、浓缩,即可得到兔IgG抗体胶体金结合物。
其中,蛋白分散剂由20份牛血清蛋白、20份聚乙二醇、3份甘油三酯、2份氨基酸和10份共聚维酮组成。
实施例3用于新型冠状病毒的检测试纸的制备
S101,利用实施例1和实施例2的方法制备胶体金结合物;
S102,将实施例2所制得的SARS-Cov-2单克隆抗体A胶体金结合物和兔IgG抗体胶体金结合物同时喷于处理好的金标结合垫上,并烘干待用;
S103,在硝酸纤维素膜上喷涂SARS-Cov-2单克隆抗体B形成检测线和抗兔IgG多抗形成质控线,烘干待用,分别将样品垫、金标结合垫、层析反应膜和吸水垫从左到右分别搭接组装在PVC底板上,并切割成等宽的小试纸条,装进检测卡中,干燥保存待用。
对比例1
对比例1与实施例3的区别在于,对比例1不含蛋白分散剂,采用常规静电吸附法制备胶体金结合物;
对比例2
对比例2与实施例3的区别在于,对比例2的蛋白分散剂用量为0.1g。
对比例3
对比例3与实施例3的区别在于,对比例3的蛋白分散剂的组分如下:40份牛血清蛋白、20份聚乙二醇、3份甘油三酯、2份氨基酸和10份共聚维酮;
对比例4
对比例4与实施例3的区别在于,对比例4的蛋白分散剂的组分如下:20份牛血清蛋白、10份聚乙二醇、3份甘油三酯和2份氨基酸;
对比例5
对比例5与实施例3的区别在于,对比例5的胶体金制备时并未使用新制的酸洗液清洗玻璃器皿。
对比例6
对比例6为购买自艾康生物技术Flowflex的SARS-CoV-2Antigen Rapid Test;
本发明通过咽拭子采集患者的分泌物,放入标本稀释液稀释后得到待测样本,将待测样本滴加到实施例3所制备的检测试纸的样品垫上,放置10-30分钟,然后肉眼观测,结果见图2;当检测结果为阳性时,均会出现T线和C线;当检测结果为阴性时,值出现C线;只出现T线或T线、C线均未出现,则说明该检测试纸失效。
新冠病毒抗原检测试剂国家参考品(中国食品药品检定研究院):
【类别】体外诊断试剂参考品
【批号】370095-202001
【性状】液体
【用途】本参考品原料为新型冠状病毒培养物及其他呼吸道病原体培养物,使用含有磷酸盐缓冲液、血清白蛋白(约1%)、海藻糖(或蔗糖、乳糖,5%)及明胶(或明胶水解物、右旋糖酐,1%)的通用缓冲液稀释制备而成。适用于新型冠状病毒抗原检测试剂(包括但不限于胶体金法、免疫荧光法、化学发光法等)的质量控制与评价。
【组成和规格】
【使用方法和要求】
1.使用方法:
1)阳性参考品P1~P8:使用各试剂稀释液或纯水进行1:10稀释后进行检测;
2)阴性参考品N1~N20:直接使用原倍进行检测;
3)最低检测限参考品S:使用各试剂稀释液或纯水进行1:50、1:100、1:200、1:400、1:800及1:1600稀释后标记为S1~S6,分别对以上6个浓度进行检测;
4)重复性参考品R:使用各试剂稀释液或纯水进行1:10、1:100稀释后标记为R1和R2,对以上两个浓度分别进行10次检测。
2.本参考品使用时,应满足:
1)阳性符合率:P1~P8均为阳性,符合率为8/8;
2)阴性符合率:N1~N20均为阴性,符合率为20/20;
3)最低检测限:S1~S4均为阳性,S5、S6不作要求;
4)重复性:R1和R2的10次检测结果应均为阳性,且显色度均一无差别;或10次检测结果的CV不大于20.0%(如适用,如有相关行业标准可执行标准要求)。
【包装】螺口塑料冻存管
【贮藏】长期保存应置于-80℃及以下。
【注意事项】
1.本参考品应在-80℃及以下保存。建议使用前进行分装,并避免3次以上反复冻融;
2.本参考品使用的原料均经过灭活处理,但未对其灭活效率进行充分的验证,使用过程中仍应将这些组分作为潜在的传染源对待,操作应按实验室安全管理条例执行;
3.参考品N1~N20、P5~P7使用56℃或65℃热灭活,P1~P4、S和R使用β-丙内酯进行灭活。
将实施例3和对比例1-6所制备的检测试纸按照上述方法进行试验检测,结果见表1。
表1,试验结果
注“/”表示未检出。
由以上结果可知,本发明所制备的检测试纸具有优异的特异性,其阳性符合率和阴性符合率均满足国家标准,并且具有优异的检测灵敏度,可重复性高。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考,就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解,在阅读了本发明的上述讲授内容之后,本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改,这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
Claims (5)
1.一种用于新型冠状病毒的检测试纸,包括样品垫、金标结合垫、层析反应膜、吸水垫和PVC底板;其特征在于,所述金标结合垫上包被胶体金结合物;所述胶体金结合物由以下方法制备获得:S1,制备胶体金;S2,利用抗体、水、蛋白分散剂以及步骤S1所制得的胶体金制备体金结合物;其中,所述抗体包括SARS-Cov-2单克隆抗体A和兔IgG抗体;
所述蛋白分散剂由以下重量份数物质组成:40份牛血清蛋白、20份聚乙二醇、3份甘油三酯、2份氨基酸和10份共聚维酮,
所述S2的具体过程如下:步骤一:抗体、水和蛋白分散剂中进行旋涡使其混匀,得到新型抗体分散液,其中新分散液中抗体的浓度为1ug/mL;步骤二:将碳酸钾溶液加入到胶体金溶液中并进行搅拌混匀,将胶体金pH值调节至7-9;步骤三:在搅拌的条件下将抗体分散液逐滴加入到步骤二所得到的胶体金溶液中,保持搅拌20-30min,后于低温下搅拌30-60min,并离心、浓缩,即可得到胶体金结合物,
所述抗体、水和蛋白分散剂的重量份数如下:抗体0.001份、水1000份和蛋白分散剂0.01份。
2.根据权利要求1所述的一种用于新型冠状病毒的检测试纸,其特征在于,所述S1制备胶体金的具体过程如下:将重铬酸钾溶于40℃热水中,得到重铬酸钾溶液,后将其倒入浓硫酸中,得到酸洗液,将玻璃器皿放入酸洗液中浸泡48小时,后用纯化水洗涤3-5次后烘干,得到洗净的玻璃器皿备用;将柠檬酸三钠与氯金酸分别加到洗净的玻璃器皿中,并分别50mL纯化水溶解,得到质量分数为1%的柠檬酸三钠溶液和0.02%的氯金酸溶液;将氯金酸溶液加热至沸腾,并保持沸腾5min,在沸腾的条件下加入柠檬酸三钠溶液,保持沸腾20min,停止加热,保持搅拌并冷却至室温,即可得到胶体金溶液。
3.一种权利要求1所述的用于新型冠状病毒的检测试纸的制备工艺,其特征在于,包括如下步骤:
S101,分别制备SARS-Cov-2单克隆抗体A胶体金结合物和兔IgG抗体胶体金结合物;
S102,将胶体金结合物喷于处理好的金标结合垫上,并烘干待用;
S103,在层析反应膜上喷涂检测线和质控线,烘干待用,分别将样品垫、金标结合垫、层析反应膜和吸水垫从左到右分别搭接组装在PVC底板上,并切割成等宽的小试纸条,装进检测卡中,干燥保存待用。
4.根据权利要求3所述的用于新型冠状病毒的检测试纸的制备工艺,其特征在于,步骤S103中所述的层析反应膜为硝酸纤维素膜。
5.根据权利要求3所述的用于新型冠状病毒的检测试纸的制备工艺,其特征在于,所述检测线上包被SARS-Cov-2单克隆抗体B;所述质控线上包被抗兔IgG多抗。
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