CN109725148B

CN109725148B - 一种免疫磁珠保存液

Info

Publication number: CN109725148B
Application number: CN201811648695.9A
Authority: CN
Inventors: 曲晓莹; 吴清平; 蔡芷荷; 卢勉飞; 滕昆仑; 李泽康; 林干�
Original assignee: Guangdong Huankai Microbial Sci and Tech Co Ltd; Guangdong Yuewei Edible Mushroom Technology Co Ltd; Guangdong Huankai Biotechnology Co Ltd
Current assignee: Guangdong Huankai Microbial Sci and Tech Co Ltd; Guangdong Yuewei Edible Mushroom Technology Co Ltd; Guangdong Huankai Biotechnology Co Ltd
Priority date: 2018-12-30
Filing date: 2018-12-30
Publication date: 2022-05-03
Anticipated expiration: 2038-12-30
Also published as: CN109725148A

Abstract

本发明公开了一种免疫磁珠保存液，含有缓冲液、惰性蛋白质、甘油、水溶性糖、人工合成高分子聚合物、蛋白稳定剂、还原性物质、氨基酸、螯合剂、血清、表面活性剂和防腐剂。本发明的免疫磁珠保存液，使免疫磁珠可以在4℃保存条件下一年内维持较高的活性，为免疫磁珠在实际检测中的应用提供了保障。

Description

一种免疫磁珠保存液

技术领域

本发明属于微生物检测技术领域，特别涉及一种免疫磁珠保存液。

背景技术

免疫磁珠(Immunomagnetic beads,IMBS)是对具有超顺磁性的微粒表面进行化学修饰，使之与特异性抗体牢固结合，成为能捕获特异性抗原的磁珠。

将免疫磁珠与待测溶液混合，如有相应抗原存在，免疫磁珠就会将其捕获，形成抗原-免疫磁珠复合物，并在适当的磁场条件下分离出来，达到富集目标抗原的目的。

作为一种具有特异性的分离富集技术，免疫磁珠在多个领域都有重要的应用价值，如DNA提取、蛋白纯化、细胞筛选、食源性致病微生物富集等。免疫磁珠的应用范围越来越广。

免疫磁珠的制备相对较为复杂，对设备、反应条件有一定的要求，大部分情况下无法满足现场制备的条件。事先制备好免疫磁珠保存备用，更有利于免疫磁珠的推广普及。免疫磁珠上的活性物质如抗体等的稳定性较差，一般难以长期保存。

冻存是抗体等活性物质有效的保持活性的方式。但是冷冻保存会造成磁珠的聚集结团从而使性能下降，所以免疫磁珠也不能像抗体一样进行冷冻保存。

为避免磁珠聚集现象的发生，免疫磁珠较为适合的保存温度是4～8℃，但是在保存温度下，磁珠上偶联的抗体容易出现活性丧失的问题，这严重限制了免疫磁珠的保持期。免疫磁珠性能的不稳定严重阻碍了其在实际中的应用效果和产品推广。

市场上商品化的免疫磁珠保存液鲜有出售，而常规的保存液一般为添加了抑菌剂和1％BSA的PBS或Tris-HCl缓冲液，保存期只有十天左右，保存效果不能令人满意。此外，使用过程中发现，由于偶联的抗体不同，保存液的保存效果也存在一定的差异，通用性较差。因此需要开发一种适用于免疫磁珠4～8℃保存液。

发明内容

本发明的目的在于提供一种可以有效维持免疫磁珠活性，延长免疫磁珠保存期的保存液。

本发明所采取的技术方案是：

一种免疫磁珠保存液，含有缓冲液、惰性蛋白质、甘油、水溶性糖、人工合成高分子聚合物、蛋白稳定剂、还原性物质、氨基酸、螯合剂、血清、表面活性剂和防腐剂。

作为上述免疫磁珠保存液的进一步改进，保存液各组分的浓度为：10～100g/L惰性蛋白质、5～30g/L甘油、40～150g/L水溶性糖、1～25g/L人工合成高分子聚合物、50.5～205g/L蛋白稳定剂、9～60g g/L还原性物质、2～25g/L氨基酸、0.5～12g/L螯合剂、0.5～7v/v％血清、2～15g/L表面活性剂，适量防腐剂。

作为上述免疫磁珠保存液的进一步改进，惰性蛋白质为BSA、酪蛋白钠中的至少一种。

作为上述免疫磁珠保存液的进一步改进，水溶性糖为蔗糖、海藻糖中的至少一种。

作为上述免疫磁珠保存液的进一步改进，人工合成高分子聚合物为PVP、PEG10000、明胶中的至少一种。

作为上述免疫磁珠保存液的进一步改进，还原性物质为三(2-羧乙基)膦、抗坏血酸中的至少一种。

作为上述免疫磁珠保存液的进一步改进，氨基酸为半胱氨酸、精氨酸、组氨酸、甲硫氨酸中的至少一种。

作为上述免疫磁珠保存液的进一步改进，螯合剂为EDTA。

作为上述免疫磁珠保存液的进一步改进，血清为胎牛血清。

作为上述免疫磁珠保存液的进一步改进，表面活性剂为吐温-20。

作为上述免疫磁珠保存液的进一步改进，防腐剂为Proclin300。

作为上述免疫磁珠保存液的进一步改进，保存液组分为：5～60g/L BSA、5～60g/L酪蛋白钠、5～30g/L甘油、20～90g/L蔗糖、20～80g/L海藻糖、1～10g/L PVP、1～20g/L PEG10000、50～200g/L商品化蛋白酶稳定剂、0.5～5g/L明胶、5～60g/L三(2-羧乙基)膦、1～8g/L抗坏血酸、0.5～4g/L半胱氨酸、0.5～7g/L甲硫氨酸，0.5～9g/L精氨酸、0.5～5g/L组氨酸、0.5～7v/v％胎牛血清、0.5～12g/L EDTA、2～15g/L吐温-20、1～4g/L Proclin300、pH7.0～7.5的缓冲液。

作为上述免疫磁珠保存液的进一步改进，保存液组分含有：30～50g/L BSA、30～40g/L酪蛋白钠、10～30g/L甘油、50～70g/L蔗糖、60～80g/L海藻糖、3～5g/L PVP、9～12g/L PEG 10000、100～150g/L蛋白酶稳定剂、2～4g/L明胶、30～50g/L三(2-羧乙基)膦、4～6g/L抗坏血酸、0.5～3g/L半胱氨酸、1.5～5.5g/L甲硫氨酸，2～6g/L精氨酸，1～3g/L组氨酸、3～5v/v％胎牛血清、2～5g/L EDTA、5～8g/L吐温-20、1～1.5g/L Proclin300、pH7.0～7.5的缓冲液。

作为上述免疫磁珠保存液的进一步改进，保存液组分含有：35g/L BSA、40g/L酪蛋白钠、17g/L甘油、55g/L蔗糖、65g/L海藻糖、3.8g/L PVP、10.5g/L PEG 10000、130g/L蛋白酶稳定剂、2.5g/L明胶、36g/L三(2-羧乙基)膦、4.5g/L抗坏血酸、1.5g/L半胱氨酸、2.8g/L甲硫氨酸，4.6g/L精氨酸，1.5g/L组氨酸、3.7v/v％胎牛血清、4g/L EDTA、7g/L吐温-20、1.5g/L Proclin300、pH7.0～7.5的缓冲液。

作为上述免疫磁珠保存液的进一步改进，缓冲液为PBS缓冲液或Tris-HCl缓冲液。

一种免疫磁珠的保存方法，包括将免疫磁珠分散在上述免疫磁珠保存液中。

作为上述免疫磁珠保存方法的进一步改进，保存温度为4～8℃，特别为4℃。

本发明的有益效果是：

本发明的免疫磁珠保存液，使免疫磁珠可以在4℃保存条件下一年内维持较高的活性，为免疫磁珠在实际检测中的应用提供了保障。

具体实施方式

惰性蛋白质的主要作用在于保持抗体活性，作为上述免疫磁珠保存液的进一步改进，惰性蛋白质为BSA、酪蛋白钠中的至少一种。

作为上述免疫磁珠保存液的进一步改进，人工合成高分子聚合物为PVP、PEG10000、明胶中的至少一种。其可以维持免疫磁珠结构，利于其分散。

作为上述免疫磁珠保存液的进一步改进，螯合剂为EDTA。

作为上述免疫磁珠保存液的进一步改进，血清为胎牛血清。

防腐剂可以是常用的对抗体活性无影响的防腐剂。作为上述免疫磁珠保存液的进一步改进，防腐剂为安全性更好的Proclin300。当然，也可以使用其他防腐剂如叠氮化钠等。

缓冲液的作用在于维持保存液的pH稳定，只要不影响抗体的活性即可。作为上述免疫磁珠保存液的进一步改进，缓冲液为常用且具有良好安全性的PBS缓冲液或Tris-HCl缓冲液。

下面对本发明的具体实施方式进行详细描述，但应当理解本发明的保护范围并不受具体实施方式的限制。

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径可购得。

免疫磁珠保存液的配制

免疫磁珠保存液按照表1不同配方进行配制，示例性的缓冲液为0.2MPBS，pH为7.0～7.5。本领域技术人员也可以使用其他缓冲液。

表1免疫磁珠保存液配方

注：“/”表示不添加。

保存液保存效果的检测

保存效果检测方法为：使用无菌生理盐水稀释菌液至10³cfu/mL并用螺旋接种仪计数，取1mL稀释好的菌液置于1.5m离心管中，加20μL免疫磁珠样品，旋转混合吸附10min，放在磁力架上进行磁力分离，移去残液并将其进行TSA平板涂布计数，避免吸到磁珠，用PBST洗液洗涤三次，最后加入100微升PBST溶液重悬磁珠，把全部磁珠悬液转移到显色培养基涂板均匀后放在37℃培养18h，平板进行菌落计数并按照以下公式(1)计算得到捕获率(capture efficiency，CE)：

其中，N₁表示为磁珠吸附到的菌落数；N₂表示残液中的菌落计数。

沙门氏菌免疫磁珠的保存实验

将沙门氏菌免疫磁珠分散在不同保存液中，4℃环境下，进行为期一年的捕获率检测，结果如表2所示。

表2、不同保存液对沙门氏菌免疫磁珠的保存效果

结果显示，例4、例5、例6的保存液对沙门氏菌都有较好的保存效果，其中例5的保存效果最好。

大肠埃希氏菌O157免疫磁珠的保存实验

将大肠埃希氏菌O157免疫磁珠分散在不同保存液中，4℃环境下，进行为期一年的捕获率检测，结果如表3所示。

表3、不同保存液对大肠埃希氏菌O157免疫磁珠的保存效果

结果显示，例4、例5、例6对大肠埃希氏菌O157免疫磁珠都有较好的保存效果，其中例4与例5效果十分接近。

金黄色葡萄球菌免疫磁珠的保存实验

将金黄色葡萄球菌免疫磁珠分散在不同保存液中，4℃环境下，进行为期一年的捕获率检测，结果如表4所示。

表4、不同保存液对金黄色葡萄球菌免疫磁珠的保存效果

结果显示，例4、例5、例6对金黄色葡萄球菌免疫磁珠都有较好的保存效果，其中例5效果最佳。

由表2～表4的数据可知，例5的保存液对多种免疫磁珠均具有很好的保护效果，适用性最广。

Claims

1.一种免疫磁珠保存液，其特征在于：保存液含有：

10～100g/L惰性蛋白质、5～30g/L甘油、40～150g/L水溶性糖、1～25g/L人工合成高分子聚合物、50.5～205g/L蛋白酶稳定剂、9～60g/L还原性物质、2～25g/L氨基酸、0.5～12g/L螯合剂、0.5～7v/v％血清、2～15g/L表面活性剂，适量防腐剂、缓冲液。

2.根据权利要求1所述的一种免疫磁珠保存液，其特征在于：惰性蛋白质独立为BSA、酪蛋白钠中的至少一种；水溶性糖独立为蔗糖、海藻糖中的至少一种；人工合成高分子聚合物独立为PVP、PEG10000、明胶中的至少一种；还原性物质独立为三(2-羧乙基)膦、抗坏血酸中的至少一种；氨基酸独立为半胱氨酸、精氨酸、组氨酸、甲硫氨酸中的至少一种；螯合剂独立为EDTA；血清独立为胎牛血清；表面活性剂独立为吐温-20；防腐剂独立为Proclin300。

3.根据权利要求1所述的一种免疫磁珠保存液，其特征在于：保存液组分为：5～60g/LBSA、5～60g/L酪蛋白钠、5～30g/L甘油、20～90g/L蔗糖、20～80g/L海藻糖、1～10g/L PVP、1～20g/L PEG 10000、50～200g/L蛋白酶稳定剂、0.5～5g/L明胶、5～60g/L三(2-羧乙基)膦、1～8g/L抗坏血酸、0.5～4g/L半胱氨酸、0.5～7g/L甲硫氨酸，0.5～9g/L精氨酸、0.5～5g/L组氨酸、0.5～7v/v％胎牛血清、0.5～12g/L EDTA、2～15g/L吐温-20、1～4g/LProclin300、pH7.0～7.5的缓冲液。

4.根据权利要求1所述的一种免疫磁珠保存液，其特征在于：保存液组分含有：30～50g/L BSA、30～40g/L酪蛋白钠、10～30g/L甘油、50～70g/L蔗糖、60～80g/L海藻糖、3～5g/L PVP、9～12g/L PEG 10000、100～150g/L蛋白酶稳定剂、2～4g/L明胶、30～50g/L三(2-羧乙基)膦、4～6g/L抗坏血酸、0.5～3g/L半胱氨酸、1.5～5.5g/L甲硫氨酸，2～6g/L精氨酸，1～3g/L组氨酸、3～5v/v％胎牛血清、2～5g/L EDTA、5～8g/L吐温-20、1～1.5g/LProclin300、pH7.0～7.5的缓冲液。

5.根据权利要求1所述的一种免疫磁珠保存液，其特征在于：保存液组分含有：35g/LBSA、40g/L酪蛋白钠、17g/L甘油、55g/L蔗糖、65g/L海藻糖、3.8g/L PVP、10.5g/L PEG10000、130g/L蛋白酶稳定剂、2.5g/L明胶、36g/L三(2-羧乙基)膦、4.5g/L抗坏血酸、1.5g/L半胱氨酸、2.8g/L甲硫氨酸，4.6g/L精氨酸，1.5g/L组氨酸、3.7v/v％胎牛血清、4g/L EDTA、7g/L吐温-20、1.5g/L Proclin300、pH7.0～7.5的缓冲液。

6.根据权利要求1～5任一项所述的一种免疫磁珠保存液，其特征在于：缓冲液为PBS缓冲液或Tris-HCl缓冲液。

7.一种免疫磁珠的保存方法，包括将免疫磁珠分散在免疫磁珠保存液中，其特征在于：免疫磁珠保存液如权利要求1～6任一项所述。

8.根据权利要求7所述的保存方法，其特征在于：保存温度为4～8℃。

9.根据权利要求7所述的保存方法，其特征在于：保存温度为4℃。