CN111990643B - 一种智能释放型蛋白金属离子抗菌纳米颗粒及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于食品抗菌添加剂领域，具体涉及一种智能释放型蛋白金属离子抗菌纳米颗粒及其制备方法。本发明采用纳米沉淀法将蓍草精油包裹在玉米醇溶蛋白中，调节溶液pH，使蛋白表面带负电，通过静电相互作用螯合带正电的锌金属离子。利用细菌金属蛋白酶的特性，将其作为“生物开关”，当含有Zn2+金属蛋白酶的细菌遇到螯合后的纳米颗粒，其蛋白酶活性被激活，从而水解纳米颗粒表面蛋白，使包裹的蓍草精油释放出来，进而杀死细菌。该种新型抗菌纳米颗粒能有效抑制多种细菌如大肠杆菌O157:H7，金黄色葡萄球菌和单增李斯特菌等，且能将抗菌剂智能释放。
Description
技术领域
本发明属于食品抗菌添加剂领域，具体涉及一种智能释放型蛋白金属离子抗菌纳米颗粒及其制备。
背景技术
蓍草精油(Achillea essential oil)，通常从蓍草花，叶、茎等部位经水蒸气蒸馏而得，传统上被用作消炎药，用于治疗头痛和控制伤口出血。但是，由于蓍草精油的挥发性、在空气、光照和高温下的可分解性，限制了它的多种工业应用。
近年来，纳米颗粒作为药物运输载体，因其粒径小、比表面积大等特点，受到研究人员的广泛关注。玉米醇溶蛋白(Zein)，旧称米朊，等电点6.5，富含谷氨酸(21％～26％)、亮氨酸(20％)、脯氨酸(10％)和丙氨酸(10％)，疏水性氨基酸和含硫氨基酸含量均较高，是一种广泛存在于植物中的食物蛋白，具有优良的可塑性，无害性和生物降解性。在制药工业中，它常被用来包裹胶囊，控制释放和掩盖味道。目前，国内已有一些关于Zein纳米颗粒方面的专利申请，中国专利CN110051006A公开了玉米醇溶蛋白/阿拉伯胶复合纳米颗粒及其制备方法；中国专利CN110698865A公开了一种柔性及颗粒大小可控的玉米醇溶蛋白纳米颗粒及其制备方法和用途；中国专利CN110693036A公开了超声辅助透析驱动玉米醇溶蛋白自组装制备纳米颗粒方法。
然而，纳米颗粒包裹精油由于释放效率难以控制，其抗菌活性受到限制。为了实现纳米颗粒中精油的智能释放，本发明充分利用细菌中金属蛋白酶 (Metalloproteinase)的活性。金属蛋白酶是活性中心依赖于金属离子的一类蛋白酶，大多数金属蛋白酶是Zn2+金属蛋白酶。低浓度的金属离子可以增强这种酶的活性。不少细菌中都含有金属蛋白酶，如大肠杆菌O157:H7，单增李斯特菌，蜡样芽孢杆菌等。基于此和蛋白酶水解蛋白质的特性，本发明介绍了一种表面螯合金属离子的蛋白纳米颗粒，如此纳米颗粒遇到细菌，细菌中的金属蛋白酶活性因受金属离子刺激而增强，从而水解表面蛋白释放精油；如未遇到细菌，精油则继续包裹在蛋白中。
本发明采用纳米沉淀法将蓍草精油包裹在玉米醇溶蛋白中，同时调节溶液 pH使蛋白表面带负电，通过静电相互作用螯合带正电的锌金属离子。当含有Zn2+金属蛋白酶的细菌遇到螯合后的纳米颗粒，其蛋白酶活性被激活，从而水解纳米颗粒表面蛋白，使包裹的蓍草精油释放出来，进而杀死细菌，实现了纳米颗粒中精油的智能释放，极大程度提高了抗菌效率。
发明内容
本发明的目的是公开一种智能释放型蛋白金属离子抗菌纳米颗粒及其制备方法。其实质为利用纳米沉淀法将蓍草精油包埋于玉米醇溶蛋白中，并螯合上 Zn2+，形成智能释放型抗菌纳米颗粒。当遇到含有Zn2+金属蛋白酶的细菌时，纳米颗粒表面蛋白被水解，从而达到抗菌剂的智能释放。
本发明所述抗菌纳米颗粒的制备方法是先将玉米醇溶蛋白溶于乙醇水溶液中，磁力搅拌12h，完全溶解后，添加蓍草精油，制得溶剂相；采用聚醚F68 水溶液为非溶剂相，其中聚醚F68与水的质量体积比为1.5:100。将溶剂相转入非溶剂相中均质，随后在排气罩中蒸发15h以除去乙醇。然后，加入NaOH溶液调溶液pH＝12，最后，加入ZnSO4，25℃水浴振荡反应1h后，于透析袋中透析48h，制得抗菌纳米颗粒。
所述溶剂相中，玉米醇溶蛋白的浓度为15-25mg/mL，乙醇水溶液的体积百分比为80％-90％；蓍草精油的添加浓度为3-5mg/mL。
所述溶剂相与非溶剂相的体积比为1:3；均质速度为3000-5000r/min；均质时间为3-5min。
所述最终调得pH＝12的溶液中，ZnSO4的添加浓度为1.0-2.0mmol/L。
所用透析袋蛋白截留分子量为500。
本发明想法新颖，产品结构特殊，充分发挥了各组分的优越性，制备出一种高靶向性、高抗菌性的智能释放型蛋白金属离子抗菌纳米颗粒，本发明制得的智能释放型蛋白金属离子抗菌纳米颗粒具体优点如下：
(1)单一精油易挥发且不稳定，采用纳米沉淀法制备纳米颗粒，该方法制备工艺简单，安全无毒无害。且该抗菌纳米颗粒粒径小，产品稳定性好，包封率较高。
(2)普通纳米颗粒缺乏“生物开关”，该纳米颗粒利用细菌金属蛋白酶的酶活性，实现智能释放，一旦遇到含金属蛋白酶的细菌，能高效水解表面蛋白，使纳米颗粒结构破坏，从而使纳米颗粒内包埋物蓍草精油释放，杀死细菌。
附图说明
图1蓍草精油对大肠杆菌O157:H7的杀菌曲线
图2智能释放型蛋白金属离子抗菌纳米颗粒对大肠杆菌O157:H7的抗菌效果
具体实施方式
通过下面实例说明本发明的具体实施方式，但本发明的保护内容，不仅局限于此。
实施例1蓍草精油对大肠杆菌O157:H7的杀菌效果
1实验材料
模式菌种：大肠杆菌O157:H7(Escherichia coli O157:H7)
2实验方法
在磷酸盐缓冲液中[Phosphate-Buffered Saline，PBS，0.03mol/L，pH(7.2-7.4)]接入供试菌大肠杆菌O157:H7(105-106CFU/mL)后，加入一定浓度(2mg/mL， 4mg/mL)的蓍草精油，振荡均匀后，在37℃全温空气摇床中振荡(120r/min)培养，分别在0h、0.5h、1h、2h、4h和8h时取适量培养液进行十倍梯度稀释到 102-103CFU/mL，然后移取100μL稀释液滴到固体培养基上，涂布均匀之后放入 37℃恒温恒湿培养箱中倒置培养。48h后进行平板菌落计数，从而对抗菌剂的抗菌活性进行评价。以不加蓍草精油的一组为对照组，实验一式三份，结果取平均值。
3蓍草精油对大肠杆菌O157:H7的杀菌效果评价
如图1所示，在2mg/mL蓍草精油作用8h后，大肠杆菌O157:H7菌落总数从6.46LogCFU/mL降至4.30Log CFU/mL，杀菌率达到99％；在4mg/mL蓍草精油作用8h后，大肠杆菌O157:H7菌落总数从6.46Log CFU/mL下降至1.21 Log CFU/mL，杀菌率达到99.999％，结果表明蓍草精油有较强的杀菌效果。
实施例2智能释放型蛋白金属离子抗菌纳米颗粒的制备
1实验材料
2实验方法
智能释放型蛋白金属离子抗菌纳米颗粒制备步骤如下：
①溶剂相的制备：将0.2g玉米醇溶蛋白溶于10mL 85％的乙醇水溶液中，磁力搅拌12h，完全溶解后，添加蓍草精油(4mg/mL)。
②非溶剂相的制备：30mL聚醚F68水溶液(1.5％，w/v)。
③溶剂相转入非溶剂相，3000r/min均质3min，随后在排气罩中蒸发15h,以除去乙醇。
④螯合：用0.2mol/L NaOH将蛋白溶液pH调至12，加入ZnSO4(1mmol/L)， 25℃水浴摇床振荡反应1h，最后于透析袋中透析48h，制得抗菌纳米颗粒。
实施例3智能释放型蛋白金属离子抗菌纳米颗粒的表征
1实验材料
智能释放型蛋白金属离子抗菌纳米颗粒
2实验仪器
激光粒度仪 Nano ZS90 英国马尔文仪器有限公司
气相色谱-质谱联用仪(GC-MS) 6890GC/5973NMSD 美国安捷伦公司
3实验方法
①采用激光粒度仪(Nano ZS90)测定智能释放型蛋白金属离子抗菌纳米颗粒的粒径，多分散系数(PDI)和Zeta电位。
②使用GC-MS测定抗菌纳米颗粒中蓍草精油的包封率。气相色谱(GC)条件为：DB-WAX弹性石英毛细管色谱柱(0.25mm×60m，膜厚0.25μm)，溶剂延迟为10min。进样量为1.0μL，分流比1：20；载气为高纯氦气，流速1.0 mL/min。进样口温度为250℃，检测器温度为280℃。升温程序如下：初始温度设为60℃，保持1min；以4℃/min的速度升温至120℃，然后以10℃/min的速度升温至150℃，保持5min，最后以10℃/min的速度升至 250℃，保持5min。质谱(MS)条件：电离方式为EI源，电子能量70eV；质量扫描范围m/z：33-500amu。
利用以下公式计算抗菌纳米颗粒中蓍草精油的包封率：
4智能释放型蛋白金属离子抗菌纳米颗粒的表征
智能释放型蛋白金属离子抗菌纳米颗粒的各表征参数如表1所示。该抗菌纳米颗粒的粒径为275.43nm，粒径小便于药物运输。PDI用于表征纳米颗粒粒径分布情况，PDI介于0～0.3之间时，表示其粒径分布窄，颗粒具有良好的均一性。该抗菌纳米颗粒PDI为0.254，表明粒径分布比较集中，颗粒比较均一。Zeta电势是用于表征纳米颗粒体系稳定性的参数，Zeta电势较高(±10～±30mV)的纳米颗粒相对较稳定。因此，该发明制得的纳米颗粒稳定性良好，该抗菌纳米颗粒包封率为23.47％，该结果表明产品性能较好。
实施例4智能释放型蛋白金属离子抗菌纳米颗粒的抗菌性能评价
1实验材料
抗菌剂：智能释放型蛋白金属离子抗菌纳米颗粒
模式菌种：大肠杆菌O157:H7(Escherichia coli O157:H7)
2实验仪器
立式压力蒸汽灭菌锅 HVE50 日本Hirayama株式会社
生化培养箱 LRH 上海一恒科学仪器有限公司
3实验方法
在营养琼脂平板上滴加100μL大肠杆菌O157:H7菌液(106-7CFU/mL)，用无菌涂布棒涂布均匀后，在平板中央放置直径为6mm的滤纸片，吸取30μL智能释放型蛋白金属离子抗菌纳米颗粒滴加在滤纸片上。于超净台中静置5min 后置于37℃恒温恒湿培养箱中培养24h，测量抑菌圈直径的大小。滤纸片上未滴加抗菌纳米颗粒的为空白对照组(图2A)；滴加未螯合的纳米颗粒的为阴性对照组(图2B)；滴加智能释放型蛋白金属离子抗菌纳米颗粒的为实验组(图2C)。 4智能释放型蛋白金属离子抗菌纳米颗粒的抗菌性能评价
智能释放型蛋白金属离子抗菌纳米颗粒的抑菌圈实验结果如图2所示，由图可知，不添加纳米颗粒的空白对照组(A)中未出现抑菌圈，添加未螯合的纳米颗粒的滤纸片(B)周围出现了透明圈，其直径为10.18mm，而实验组添加智能释放型蛋白金属离子抗菌纳米颗粒的滤纸片(C)周围出现了更明显的透明圈，其直径为14.46mm。这结果表明螯合后的纳米颗粒对大肠杆菌O157:H7明显有更好的抑制效果。
表1智能释放型蛋白金属离子抗菌纳米颗粒的参数表征
表1
Claims (1)
1.一种智能释放型蛋白金属离子抗菌纳米颗粒的制备方法，其特征在于：采用纳米沉淀法将蓍草精油包裹在玉米醇溶蛋白中，同时调节溶液pH使蛋白表面带负电，通过静电相互作用螯合带正电的锌金属离子，当含有Zn2+金属蛋白酶的细菌遇到螯合后的纳米颗粒，其蛋白酶活性被激活，从而水解纳米颗粒表面蛋白，使包裹的蓍草精油释放出来，进而杀死细菌，实现了纳米颗粒中精油的智能释放，提高了抗菌效率，具体步骤如下：先将玉米醇溶蛋白溶于乙醇水溶液中，磁力搅拌至完全溶解后，添加蓍草精油，制得溶剂相；采用聚醚F68水溶液为非溶剂相，将溶剂相转入非溶剂相中均质，随后在排气罩中蒸发以除去乙醇；然后，加入NaOH溶液调溶液pH值，加入Zn金属盐，水浴振荡反应后于透析袋中透析，制得抗菌纳米颗粒；磁力搅拌时间为12 h；聚醚F68水溶液中，聚醚F68与水的质量体积比为1.5:100；在排气罩中蒸发的时间为15h；水浴振荡反应的温度为25℃，反应时间为1h；所用透析袋蛋白截留分子量为500，透析时间为48h；所述溶剂相中，玉米醇溶蛋白的浓度为15-25 mg/mL，乙醇水溶液的体积百分比为80%-90%；蓍草精油的添加浓度为3-5 mg/mL；所述溶剂相与非溶剂相的体积比为1:3；均质速度为3000-5000 r/min；均质时间为3-5 min；最终调得pH=12的溶液中，加入的Zn金属盐为ZnSO4，ZnSO4的添加浓度为1.0-2.0 mmol/L。
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