CN110506884A - 一种双赖氨酸抗菌剂及制备方法及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于食品安全领域，具体涉及一种双赖氨酸抗菌剂及制备方法及应用。本发明利用双赖氨酸的优良抗菌效果，并结合冷等离子体对固体双赖氨酸进行表面处理改性，进一步提高抗菌效果，制备一种安全绿色、无毒副作用的新型抗菌剂。该新型抗菌剂能有效杀死各种食源性病原菌，院内感染菌如耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)等，与单独的双赖氨酸相比，抗菌效果有了明显的提高。本发明操作简单，冷等离子体处理技术都较成熟，且应用广泛，有很好的市场应用价值。
Description
技术领域
本发明属于食品安全领域，具体涉及一种双赖氨酸抗菌剂及制备方法及应用。
背景技术
随着人们生活水平的提高，对食品的营养质量及安全性的要求也越来越高，尤其近几年食品安全问题层出不穷，人们对食品问题的关注度越来越高。利用抗菌肽的广谱高效抗菌性、热稳定性好、安全无毒副作用、作用范围广等优势吸引着广大研究者的不断探索研究新的天然防腐产品。同时在医学生物、保健品、饲料添加剂、食品保鲜及农业领域等应用广泛，利用物理手段对肽进行修饰改造，提高抗菌肽的抗菌活性及稳定性将是肽的研究重点，尤其是在食品领域对天然抗菌剂的研发，解决目前天然抗菌剂性质不稳定的问题，提供新的研究方向，从而提高我国对食品防腐保鲜添加剂的研究开发水平。
双赖氨酸，又名赖氨酰赖氨酸(Lysyllysine，L-Lys-L-Lys，KK)是由两个赖氨酸残基组成的二肽，属于短阳离子二肽。二肽分子结构简单，它是蛋白质消化或蛋白质分解代谢的不完全分解产物，是蛋白质发挥活性作用的基础部分。与长链肽相比，阳离子短肽的制备简单，产率较高，成本低，有利于批量合成，并且抗菌肽大多为阳离子肽，是理想的临床药物。已知一些二肽具有生理学或细胞信号传导作用，双赖氨酸信号在功能蛋白转运过程中起到定位高尔基体或内质网的重要作用，目前国内外只聚集于双赖氨酸在生理代谢方向的研究，对于其抑菌作用的研究较少。
等离子体(plasma)是指高度电离的气体，气体在受到外界高能量作用时电离产生的由大量带电粒子离子、电子和中性粒子原子、分子所组成的表现为电荷中性的体系。冷等离子体又称为非平衡等离子体，由于其电子温度高而离子温度低、粒子化学活性强、成本低、易操作等优点，在实际应用中具有明显的优势。该技术已成功地应用于包装材料的表面杀菌，以及根据需要进行的功能改性。冷等离子体中绝大部分粒子的能量均略高于聚合物中的化学键能，通过电场加速后低温等离子体完全有足够的能量引起聚合物表面的各种化学键发生断裂或重新组合，因而会对分子材料表面进行改性。与化学改性等传统改性方法相比，等离子体技术具有低温、高活性、无副产物等优点，已成为研究热点之一。例如利用等离子体技术处理一些可食用膜，可以改变膜的表面粗糙度，提高膜的表面亲水性。再如用等离子体处理低密度聚乙烯，会提高乳酸链球菌肽的吸附量，对食品达到抗菌保鲜效果。因此，我们可以尝试使用冷等离子体对双赖氨酸进行表面处理改性，疏水性和电荷平衡的轻微改变可以引起抗微生物选择性或活性的显著变化，进一步提高双赖氨酸的抗菌效果。
国内有很多关于冷等离子体应用在食品抗菌保鲜领域的专利申请。中国专利CN107034585A公开了冷等离子体预处理制备一种g-C3N4纳米纤维抗菌膜及其制备方法与用途；中国专利CN109566726A公开了一种基于冷等离子体技术的蔬菜保鲜方法；中国专利CN107523940A公开了一种经过冷等离子体处理后得到滁菊精油/丝素蛋白抗菌膜的制备方法及用途，但是关于双赖氨酸的专利还没有。
将冷等离子体与双赖氨酸相结合，制备得到具有优良抗菌效应的抗菌剂，具有良好的应用前景和市场价值。
发明内容
本发明的目的是提供一种经冷等离子体处理的双赖氨酸抗菌剂及制备方法及其在食品安全领域中的应用。
本发明所述的双赖氨酸抗菌剂的制备方法：是先将固体双赖氨酸用冷等离子体处理，再加入去离子水溶解经过冷等离子体处理后的双赖氨酸，彻底溶解后得到相应浓度的双赖氨酸溶液，即为双赖氨酸抗菌剂。
所述的经过冷等离子体处理后的双赖氨酸，采用如下的方法进行彻底溶解：将双赖氨酸加入去离子水后首先旋涡震荡2min，之后水浴30min，水浴温度为60-70℃，然后在室温下放置24h后备用，室温为25-30℃，使用前涡旋振荡30s。
所述的得到相应浓度的双赖氨酸溶液的使用浓度为3.3-8.3mg/mL。
所述冷等离子体以氧气和氮气为激发气体，处理双赖氨酸前以100(标准立方厘米)/min(sccm)的流量充入氮气，冷等离子体处理时间为3.5-4.5min，处理功率为350-450W。
所述氧气和氮气的体积比为1:4。
本发明想法新颖，现有的发明中尚缺乏对于双赖氨酸作为抗菌剂的制备方法及其结合物理抗菌手段的表述，如本发明所述的抗菌剂以双赖氨酸阳离子短肽为主要抗菌物质，成分单一，冷等离子体是一种无残留的冷杀菌技术，通过结合冷杀菌处理手段达到更高效的抗菌效果，本发明的抗菌剂绿色安全，区别于常见的食品抗菌添加剂复杂、高成本的化学制备方法，从而避免了应用到食品抗菌保鲜领域中对人体产生的潜在健康威胁。
附图说明
图1冷等离子体/双赖氨酸抗菌剂对大肠杆菌的抗菌效果。
图2冷等离子体/双赖氨酸抗菌剂对金黄色葡萄球菌的抗菌效果。
图3冷等离子体/双赖氨酸抗菌剂对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的抗菌效果。
具体实施方式
通过下面实例说明本发明的具体实施方式，但本发明的保护内容，不仅局限于此。
实施例1双赖氨酸-冷等离子体抗菌剂的制备方法
1实验材料
双赖氨酸：合肥国肽生物科技有限公司
2实验方法
(1)分别准确称取两份重量为0.1g的固体双赖氨酸，置于室温备用；
(2)将其中一份0.1g的固体双赖氨酸，暴露于冷源氮气等离子体下，以350-450W的处理功率连续作用3.5-4.5min即得到经冷等离子体处理后的双赖氨酸；
(3)将处理后的双赖氨酸和未经处理的双赖氨酸分别溶解于2mL的无菌去离子水中，25℃旋涡震荡2min，充分溶解，将溶解后的双赖氨酸水浴30min，水浴温度为60-70℃，最后得到两份浓度均为50mg/mL的双赖氨酸溶液；
(4)将所得到的两份双赖氨酸溶液在室温下放置24h后使用，室温约为25-30℃，使用前吸取不同体积的双赖氨酸溶液稀释到不同的应用浓度，并且涡旋振荡30s。
实施例2双赖氨酸-冷等离子体抗菌剂对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抗菌性能评价
1实验菌
食源性病源菌：大肠杆菌(Escherichia coli IFO 3301)；金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus 30179)
2实验材料
①不经冷等离子体处理的双赖氨酸。
②经冷等离子体处理后的双赖氨酸。
3实验仪器
4实验方法
在磷酸盐缓冲液中[Phosphate-Buffered Saline,PBS,0.03mol/L,pH(7.2-7.4)]中加入经过冷等离子体处理后的双赖氨酸溶液，其中双赖氨酸的有效浓度为3.3mg/mL，并接入供试菌大肠杆菌和金黄色葡萄球菌(108-109CFU/mL)，振荡均匀后，在37℃全温空气摇床中振荡(120r/min)培养。以不加双赖氨酸的一组为空白对照组；以不经冷等离子体处理的双赖氨酸溶液为KK组；以加入经过冷等离子处理后的双赖氨酸为Plasma/KK组，用平板菌落计数法测定残存菌数。分别在0h、24h时取适量培养液进行十倍梯度稀释到合适的浓度，然后移取100μL稀释液滴到固体培养基上，涂布均匀之后放入37℃恒温恒湿培养箱中倒置培养。48h后进行平板菌落计数，从而对抗菌剂的抗菌活性进行评价。实验一式三份，结果取平均值。
5实验结果
如图1、图2所示，在3.3mg/mL双赖氨酸作用24h后，大肠杆菌和金黄色葡萄球菌菌数分别从8.09log CFU/mL和9.55log CFU/mL分别下降至5.78log CFU/mL和4.78log CFU/mL，杀菌率达到99.9％和99.99％，而经过冷等离子体处理后的双赖氨酸作用后大肠杆菌和金黄色葡萄球菌菌数分别下降至4.28log CFU/mL和2.12log CFU/mL，杀菌率达到99.99％和99.999％，结果表明经冷等离子体处理后双赖氨酸的抗菌效果增强，这也证实了plasma表面改性处理能够进一步提高双赖氨酸的抗菌性能。
实施例3双赖氨酸-冷等离子体抗菌剂对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的抗菌性能评价
1实验菌
院内感染病原菌：耐甲氧西林金黄色葡萄球菌MRSA(Methicillin-resistantStaphylococcus aureus T34)
2实验材料
①不经冷等离子体处理的双赖氨酸。
②经冷等离子体处理后的双赖氨酸。
3实验方法
在磷酸盐缓冲液中[Phosphate-Buffered Saline,PBS,0.03mol/L,pH(7.2-7.4)]中加入3.3mg/mL的经过冷等离子体处理后的双赖氨酸(KK)抗菌剂，然后接入供试菌(108-109CFU/mL)，加入后振荡均匀，在37℃全温空气摇床中振荡(120r/min)培养48h。以不加双赖氨酸的一组为空白对照组；以不经冷等离子体处理的双赖氨酸溶液为KK组；以加入经过冷等离子处理后的双赖氨酸为Plasma/KK组，用平板菌落计数法测定残存菌数，实验重复三次，结果取平均值。
4实验结果
由图3可知，在不经冷等离子体处理的双赖氨酸作用24h后，耐甲氧西林金黄色葡萄球菌菌数从9.28log CFU/mL降至5.85log CFU/mL，杀菌率达到99.99％；而在经过冷等离子体处理后的双赖氨酸抗菌剂作用后，耐甲氧西林金黄色葡萄球菌菌数从9.30log CFU/mL下降至4.04log CFU/mL，杀菌率达到99.999％。结果表明，冷等离子体处理过双赖氨酸对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)的抗菌效果增强，这也证实了plasma表面改性处理能够进一步提高双赖氨酸的抗菌性能。
Claims (7)
1.一种双赖氨酸抗菌剂，其特征在于，采用如下方法制备：先将固体双赖氨酸用冷等离子体处理，再加入去离子水溶解经过冷等离子体处理后的双赖氨酸，彻底溶解后得到双赖氨酸溶液，即为双赖氨酸抗菌剂。
2.如权利要求1所述的一种双赖氨酸抗菌剂，其特征在于，所述的经过冷等离子体处理后的双赖氨酸，采用如下的方法进行彻底溶解：将双赖氨酸加入去离子水后首先旋涡震荡2min，之后水浴30min，水浴温度为60-70℃，然后在室温下放置24h后备用。
3.如权利要求2所述的一种双赖氨酸抗菌剂，其特征在于，室温为25-30℃，使用前涡旋振荡30s。
4.如权利要求1所述的一种双赖氨酸抗菌剂，其特征在于，所述双赖氨酸抗菌剂中所含双赖氨酸的使用浓度为3.3-8.3mg/mL。
5.如权利要求1所述的一种双赖氨酸抗菌剂，其特征在于，所述冷等离子体以氧气和氮气为激发气体，处理双赖氨酸前以100(标准立方厘米)/min(sccm)的流量充入氮气，冷等离子体处理时间为3.5-4.5min，处理功率为350-450W。
6.如权利要求1所述的一种双赖氨酸抗菌剂，其特征在于，所述氧气和氮气的体积比为1:4。
7.如权利要求1-6任一权利要求所述的一种双赖氨酸抗菌剂的用途，其特征在于，在食品安全领域，作为一种高效安全、无毒副作用的抗菌剂，以应对微生物污染。
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