CN108553409A - 一种表没食子儿茶素没食子酸酯纳米线制剂及其制备方法和应用 - Google Patents

一种表没食子儿茶素没食子酸酯纳米线制剂及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种表没食子儿茶素没食子酸酯纳米线制剂及其制备方法和应用，该表没食子儿茶素没食子酸酯纳米线制剂包括聚氰基丙烯酸正丁酯纳米线以及负载在聚氰基丙烯酸正丁酯纳米线上的表没食子儿茶素没食子酸酯。偶然发现聚氰基丙烯酸正丁酯纳米线具有抑菌效果，这种应用可以拓宽聚氰基丙烯酸正丁酯纳米线的应用领域，并提供新的抑菌材料。本发明表没食子儿茶素没食子酸酯纳米线制剂的杀菌率比聚氰基丙烯酸正丁酯纳米线和EGCG的杀菌率的总和更高。

Description

一种表没食子儿茶素没食子酸酯纳米线制剂及其制备方法和 应用
技术领域
本发明涉及一种表没食子儿茶素没食子酸酯纳米线制剂及其制备方法和应用。
背景技术
申请号为201610276036.1的中国发明专利申请公开了一种聚氰基丙烯酸正丁酯纳米线制备方法，该方法制备得到的聚氰基丙烯酸正丁酯纳米线无毒无害，生物相容性好，生物降解性好，可以作为生物材料应用，但是该申请却没有对聚氰基丙烯酸正丁酯纳米线的其它应用进行研究。
表没食子儿茶素没食子酸酯((-)-Epigallocatechin-3-O-gallate，EGCG)是从绿茶中分离得到的儿茶素类单体物质，是茶多酚中含量最高、生物活性最强的有效成分，它主要具有有抗氧化、清除自由基、抗肿瘤、降血脂、提高免疫力和抗炎等多种生理功效。此外也有很多研究已经证实EGCG对各种细菌、病毒、真菌及植物病原体表现出较高的抗菌活性。
但是由于EGCG具有多酚结构，在储存和应用中很不稳定使得它的生物利用率低，从而导致严重限制了其在食品、医药等领域的广泛应用。为改善这些缺陷，很多研究者致力于EGCG纳米粒技术的研究，如EGCG壳聚糖纳米粒，EGCGβ-乳球蛋白纳米粒和EGCG环糊精纳米粒的研究，这些研究致力于球形的纳米技术，但纳米颗粒尺寸的缩小会造成一些问题。比如对大多数纳米颗粒而言，如何在一次实验之后回收样品是十分棘手的问题，因为一旦这些纳米颗粒分散到溶液中，除非高速离心，否则很难将纳米颗粒再从溶液中收集起来。而且抗菌效果不升反降，达不到有效的抑菌或杀菌效果。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种聚氰基丙烯酸正丁酯纳米线的新的应用，并根据该应用提供一种抑菌效果更好的表没食子儿茶素没食子酸酯纳米线制剂及其制备方法和应用，以及相应抑菌药物。
为了解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案：本发明提供聚氰基丙烯酸正丁酯纳米线作为抑菌剂的应用。
这里的聚氰基丙烯酸正丁酯纳米线可按照申请号为201610276036.1的中国发明专利申请公开的制备方法获得，在此不做赘述。
本发明提供一种表没食子儿茶素没食子酸酯纳米线制剂，包括聚氰基丙烯酸正丁酯纳米线以及负载在聚氰基丙烯酸正丁酯纳米线上的表没食子儿茶素没食子酸酯。
进一步地，所述表没食子儿茶素没食子酸酯纳米线制剂的包封率为81.16～90.31％。在实施本发明的过程，发明人发现在此包封率下，表没食子儿茶素没食子酸酯纳米线制剂的抑菌效果更好，其中表没食子儿茶素没食子酸酯为被包裹药物，聚氰基丙烯酸正丁酯纳米线为包裹材料。
本发明还提供上述表没食子儿茶素没食子酸酯纳米线制剂作为抗菌剂的应用
本发明提供一种抑菌药物，包括药用辅料和功能原料，所述功能原料包括上述表没食子儿茶素没食子酸酯纳米线制剂和/或聚氰基丙烯酸正丁酯纳米线。该药物可制成片剂、注射剂、栓剂、丸剂等药物常用制剂，均属于本发明的保护范畴。具体制备方法可参照制药领域的常规方法制备，所用药用辅料可根据剂型不同选择制药领域通用的辅料。
本发明提供上述表没食子儿茶素没食子酸酯纳米线制剂的制备方法，包括以下步骤：
(1)原料配置
有机相原料的配置：在丙酮中分散表没食子儿茶素没食子酸酯、α-氰基丙烯酸正丁酯和乙酸乙酯；
水相原料的配置：在超纯水中分散表面活性剂和稳定剂，并调节成酸性；
(2)聚合反应
搅拌条件下，将有机相原料逐渐加入到水相原料中进行自发界面缩聚合反应。
进一步地，表面活性剂为十二烷基硫酸钠，稳定剂为右旋糖苷-70。右旋糖苷-70也作为表面活性剂用，相比其他表面活性剂和稳定剂，十二烷基硫酸钠价廉易得，助溶，且易助形成纳米线的模板形乳化剂，右旋糖苷-70价廉易得，助溶，高效维持稳定，也可作为提供碳源能源物质，具有无毒无害维持EGCG纳米线稳定的作用。
进一步地，水相原料的配比为：每100毫升超纯水中分散有十二烷基硫酸钠0.6～1.2克、右旋糖苷-70 0.8～1.2克。在实施本发明的过程，发明人发现采用此配比，能够保证获得纳米线。
进一步地，有机相原料的配比为：每100毫升无水丙酮中分散有表没食子儿茶素没食子酸酯0.02～0.08克、α-氰基丙烯酸正丁酯0.1～0.5毫升、乙酸乙酯3.0～8.0毫升。采用这个配比，得到的有机相更加稳定。
进一步地，水相原料的酸性程度达到pH值2～3.5。PBCA在酸性条件下聚合缓慢易得到纳米线，在实施本发明的过程，发明人发现采用pH值2～3.5的酸性条件，不仅能保证聚合缓慢得到稳定纳米线，而且使得表没食子儿茶素没食子酸酯载酸性条件下保持不被氧化从而能够有效负载在纳米线中。
进一步地，自发界面缩聚合反应的时间为2.5～3小时。在实施本发明的过程，发明人发现此范围能够保证反应充分。
所述的丙酮既为有机相助溶剂也为EGCG的溶解剂，有机相溶剂为丙酮和乙酸乙酯。
进一步地，还包括以下步骤：
(3)后处理
反应完成后，先除去有机相，再进行过滤，之后调节pH值至6.0±0.1。采用这样的处理后，表没食子儿茶素没食子酸酯纳米线制剂能够保持稳定状态。且此pH条也不会影响细菌正常生长，可进一步说明EGCG纳米线具有强抑菌作用。
进一步地，除去有机相通过在30～40℃条件下真空旋转蒸发除去。可以防止未被包裹的EGCG被高温氧化。
经过后处理之后，可再通过搅拌处理获得含有所述表没食子儿茶素没食子酸酯纳米线制剂的混悬液或通过冷冻干燥处理获得所述表没食子儿茶素没食子酸酯纳米线制剂的冻干粉，其形态为乳白色混悬液或白色冻干粉，表没食子儿茶素没食子酸酯纳米线制剂形状为线形或纤维形，粒径尺寸长2-5微米，宽小于100纳米，混悬液在超纯水中分散指数为0.27～0.49，电动势为-30.32～-45.26mV，表没食子儿茶素没食子酸酯纳米线制剂的包封率为81.16～90.31％。
本发明的有益效果体现在：
发明人偶然发现聚氰基丙烯酸正丁酯纳米线具有抑菌效果，这种应用可以拓宽聚氰基丙烯酸正丁酯纳米线的应用领域，并提供新的抑菌材料。
本发明表没食子儿茶素没食子酸酯纳米线制剂具有高效抑制金黄葡萄球菌，大肠杆菌，枯草芽孢杆菌和四联球菌的作用，其中对金黄葡萄球菌，大肠杆菌抑菌和杀菌效果明显，具有广谱抗菌杀菌，抗菌持久的特点，它不仅可作为体外抑菌的防腐剂也可以作为体内抗感染的抗菌剂，有高稳定性，控缓释(PBCA聚合材料负载药物产物本身就有缓慢释放作用，很多文献已经证明)，也可最大限度地充分利用绿茶中表没食子儿茶素没食子酸酯的生物利用价值。
本发明表没食子儿茶素没食子酸酯纳米线制剂的杀菌率比聚氰基丙烯酸正丁酯纳米线和EGCG的杀菌率的总和更高，也就是说组合后的技术效果比每个技术特征效果的总和更优越。
本发明表没食子儿茶素没食子酸酯纳米线制剂的制备方法，工艺简单，重复性高，耗能低，反应前后均无有害、有毒物质参与或生成，毒性小，安全性高。
附图说明
图1为实施例1制得的表没食子儿茶素没食子酸酯纳米线制剂的扫描电镜(SEM)图；
图2是实施例1制得的表没食子儿茶素没食子酸酯纳米线制剂与相关对照的X-衍射图；
图3为实施例1制得的表没食子儿茶素没食子酸酯纳米线制剂的Zeta电位图；
图4为实施例5的生存率(杀菌)实验的细菌生存率图；
图5为实施例5的抗菌实验的菌群计数(CFU)图；
图6为实施例5的扫描电镜试验的抑菌扫描电镜(SEM)图；
图7为实施例6的溶血实验照片。
具体实施方式
下面将结合实施例来详细说明本发明。
实施例1
表没食子儿茶素没食子酸酯纳米线制剂的制备
制备方法包括以下步骤：
(1)原料配置
有机相原料的配置：将0.04克EGCG加入到100毫升无水丙酮中，超声5分钟，充分溶解得到溶液一，备用；将0.2毫升α-氰基丙烯酸正丁酯和4.0毫升乙酸乙酯充分混合后立即加入溶液一，混匀，得到有机相原料，备用；
水相原料的配置：将0.8克十二烷基硫酸钠、1.0克右旋糖苷-70和100毫升超纯水混合，然后用1mol/L盐酸调pH值至3.0，得到水相原料，备用；
(2)聚合反应
将所述有机相原料在室温下磁力搅拌20分钟后，缓慢逐滴加入到所述水相原料中，并在750r/min的磁力搅拌条件下进行自发界面缩聚合2.5小时；
(3)后处理
反应完成后，先在40℃的条件下旋转蒸发除去有机相，然后使用5微米滤纸过滤，之后用1mol/L氢氧化钠调pH值至6.0，最后在750r/min的磁力搅拌条件下搅拌半小时制得表没食子儿茶素没食子酸酯纳米线制剂的混悬液，或在-80℃条件下冻干并经过48小时冷冻干燥制得表没食子儿茶素没食子酸酯纳米线制剂的冻干粉。
本实施例制得的表没食子儿茶素没食子酸酯纳米线制剂的扫射电镜(SEM)图见图1，X-衍射图件图2，Zeta电位图见图3。
图2中，B为EGCG；C为EGCG和聚氰基丙烯酸正丁酯纳米线的混合物；D为表没食子儿茶素没食子酸酯纳米线制剂；E为聚氰基丙烯酸正丁酯纳米线，从图2中可以看出，如果EGCG在纳米线表面的话，就会是C图的效果，而在D图中没有显现B图的任何特征峰，比较D和E图可知EGCG被聚氰基丙烯酸正丁酯纳米线包裹。本实施例制得的表没食子儿茶素没食子酸酯纳米线制剂的包封率为89.35％。
结合图1和图3，本实施例得到了形态均匀，为线形或纤维形，粒径长为2.5～5.5μm，柱直径小于100nm的表没食子儿茶素没食子酸酯纳米线制剂，其电动势为-35.62±3.92mV，具有很高的稳定性。
实施例2
表没食子儿茶素没食子酸酯纳米线制剂的制备
制备方法包括以下步骤：
(1)原料配置
有机相原料的配置：将0.06克EGCG加入到100毫升无水丙酮中，超声5分钟，充分溶解得到溶液一，备用；将0.3毫升α-氰基丙烯酸正丁酯和6.0毫升乙酸乙酯充分混合后立即加入溶液一，混匀，得到有机相原料，备用；
水相原料的配置：将0.6克十二烷基硫酸钠、0.8克右旋糖苷-70和100毫升超纯水混合，然后用1mol/L盐酸调pH值至2.5，得到水相原料，备用；
(2)聚合反应
将所述有机相原料在室温下磁力搅拌23分钟后，缓慢逐滴加入到所述水相原料中，并在780r/min的磁力搅拌条件下进行自发界面缩聚合2.7小时；
(3)后处理
反应完成后，先在37℃的条件下旋转蒸发除去有机相，然后使用6微米滤纸过滤，之后用1mol/L氢氧化钠调pH值至6.0，最后在780r/min的磁力搅拌条件下搅拌半小时制得表没食子儿茶素没食子酸酯纳米线制剂的混悬液，或在-80℃条件下冻干并经过48小时冷冻干燥制得表没食子儿茶素没食子酸酯纳米线制剂的冻干粉。
本实施例制得的表没食子儿茶素没食子酸酯纳米线制剂的包封率为85.91％。
实施例3
表没食子儿茶素没食子酸酯纳米线制剂的制备
制备方法包括以下步骤：
(1)原料配置
有机相原料的配置：将0.08克EGCG加入到100毫升无水丙酮中，超声5分钟，充分溶解得到溶液一，备用；将0.4毫升α-氰基丙烯酸正丁酯和8.0毫升乙酸乙酯充分混合后立即加入溶液一，混匀，得到有机相原料，备用；
水相原料的配置：将1.0克十二烷基硫酸钠、1.2克右旋糖苷-70和100毫升超纯水混合，然后用1mol/L盐酸调pH值至2.0，得到水相原料，备用；
(2)聚合反应
将所述有机相原料在室温下磁力搅拌27分钟后，缓慢逐滴加入到所述水相原料中，并在820r/min的磁力搅拌条件下进行自发界面缩聚合2.9小时；
(3)后处理
反应完成后，先在33℃的条件下旋转蒸发除去有机相，然后使用7微米滤纸过滤，之后用1mol/L氢氧化钠调pH值至5.9，最后在820r/min的磁力搅拌条件下搅拌半小时制得表没食子儿茶素没食子酸酯纳米线制剂的混悬液，或在-80℃条件下冻干并经过48小时冷冻干燥制得表没食子儿茶素没食子酸酯纳米线制剂的冻干粉。
本实施例制得的表没食子儿茶素没食子酸酯纳米线制剂的包封率为81.16％。
实施例4
表没食子儿茶素没食子酸酯纳米线制剂的制备
制备方法包括以下步骤：
(1)原料配置
有机相原料的配置：将0.02克EGCG加入到100毫升无水丙酮中，超声5分钟，充分溶解得到溶液一，备用；将0.5毫升α-氰基丙烯酸正丁酯和3.0毫升乙酸乙酯充分混合后立即加入溶液一，混匀，得到有机相原料，备用；
水相原料的配置：将1.2克十二烷基硫酸钠、0.9克右旋糖苷-70和100毫升超纯水混合，然后用1mol/L盐酸调pH值至3.5，得到水相原料，备用；
(2)聚合反应
将所述有机相原料在室温下磁力搅拌30分钟后，缓慢逐滴加入到所述水相原料中，并在850r/min的磁力搅拌条件下进行自发界面缩聚合3小时；
(3)后处理
反应完成后，先在30℃的条件下旋转蒸发除去有机相，然后使用8微米滤纸过滤，之后用1mol/L氢氧化钠调pH值至6.1，最后在850r/min的磁力搅拌条件下搅拌半小时制得表没食子儿茶素没食子酸酯纳米线制剂的混悬液，或在-80℃条件下冻干并经过48小时冷冻干燥制得表没食子儿茶素没食子酸酯纳米线制剂的冻干粉。
本实施例制得的表没食子儿茶素没食子酸酯纳米线制剂的包封率为90.31％。
实施例5
聚氰基丙烯酸正丁酯纳米线及表没食子儿茶素没食子酸酯纳米线制剂的抗菌性质实验
实验材料：
1.实验菌株：耐药性的大肠杆菌ATCC 8739，枯草芽孢杆菌ATCC 6633，金黄色葡萄球菌ATCC 6538和四联球菌ATCC 27858，均由安徽农业大学生命科学学院提供。
2.牛乳膏蛋白胨培养基：在950ml去离子水中加入牛乳膏0.3g，蛋白胨1.0g，NaCl0.5g，琼脂2g(固体培养基)摇动容器直至溶质溶解用5mol/L NaOH调pH至7.0，用去离子水定容至1L。
3.灭菌：牛乳膏蛋白胨培养基在15psi高压下蒸汽灭菌30min。
4.倒平板，接种，37℃培养等。
实验方法与结果
5.1生存率(杀菌)实验
将活化好单菌落大肠杆菌，枯草芽孢杆菌，金黄色葡萄球菌和四联球菌接种与液体培养基于37℃培养过夜，离心收集，水洗，混悬在0.9％NaCl测其OD600为0.5，然后接种于含相同浓度(80μg/mL)的聚氰基丙烯酸正丁酯纳米线(图4中以空白纳米线指代)、EGCG、实施例1制得的表没食子儿茶素没食子酸酯纳米线制剂(图4中以EGCG纳米线指代)的液体培养液中，于37℃、200r/min摇床中作用12h，然后混合物被离心收集，水洗，用0.9％NaCl调成10-6菌悬液，取其100μl涂于固体培养基中，最后37℃再培养24h。用无菌水代替药液做同样的处理作为阳性对照，即无药组。
用下面公式测其细菌生存率：
实验结果见附图4，结果表明：
聚氰基丙烯酸正丁酯纳米线对金黄色葡萄球菌的杀菌率为15.68％，EGCG对金黄色葡萄球菌的杀菌率为13.57％，实施例1制得的表没食子儿茶素没食子酸酯纳米线制剂对金黄色葡萄球菌的杀菌率为72.41％。
聚氰基丙烯酸正丁酯纳米线对大肠杆菌的杀菌率为21.02％，EGCG对大肠杆菌的杀菌率为14.86％，实施例1制得的表没食子儿茶素没食子酸酯纳米线制剂对大肠杆菌的杀菌率为58.67％。
聚氰基丙烯酸正丁酯纳米线对枯草芽孢杆菌为9.33％，EGCG对枯草芽孢杆菌的杀菌率为4.73％，实施例1制得的表没食子儿茶素没食子酸酯纳米线制剂对枯草芽孢杆菌的杀菌率为47.45％。
聚氰基丙烯酸正丁酯纳米线对四联球菌的杀菌率为3.14％，EGCG对四联球菌的杀菌率为1.33％，实施例1制得的表没食子儿茶素没食子酸酯纳米线制剂对四联球菌的杀菌率为37.25％。
可以看出，聚氰基丙烯酸正丁酯纳米线对大肠杆菌，枯草芽孢杆菌和金黄色葡萄球菌均有一定的杀菌效应，对属于真菌界四联球菌杀菌作用较弱。
本发明表没食子儿茶素没食子酸酯纳米线制剂对大肠杆菌，枯草芽孢杆菌和金黄色葡萄球菌均有较强的杀菌效应，对属于真菌界四联球菌杀菌作用稍弱，由结果可知其具有广谱抗菌性质。
而值得注意的是，对大肠杆菌，枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌和四联球菌，本发明表没食子儿茶素没食子酸酯纳米线制剂的杀菌率比聚氰基丙烯酸正丁酯纳米线和EGCG的杀菌率的总和更高，也就是说组合后的技术效果比每个技术特征效果的总和更优越。
5.2抗菌实验
处于生长期(OD600＝0.5)大肠杆菌和金黄葡萄球菌分别与12.5ug/mL聚氰基丙烯酸正丁酯纳米线(图5中以空白纳米线指代)、EGCG，实施例1制得的表没食子儿茶素没食子酸酯纳米线制剂(图5中以EGCG纳米线指代)，青霉素和卡那霉素以1:100混合并在37℃、200r/min作用12h，离心收集细菌，水洗，混悬于0.9％NaCl并将其稀释到10-6，取100微升稀释液涂于牛乳膏蛋白胨固体培养基中，倒置于37℃恒温培养箱中培养18h，用相机拍CFU菌落照片。其中，青霉素和卡那霉素组作为革兰氏阳性和革兰氏阴性对照组，无药物作用的不同的细菌作为空白组，无细菌作用只有生理盐水作用为细菌对照组。
实验结果见附图5，结果表明：
聚氰基丙烯酸正丁酯纳米线对革兰氏阴性菌大肠杆菌和和革兰氏阳性菌金黄葡萄球菌均有较强的抗菌作用；
本发明表没食子儿茶素没食子酸酯纳米线制剂对革兰氏阴性菌大肠杆菌和和革兰氏阳性菌金黄葡萄球菌均有很强的抗菌作用，虽然对革兰氏阳性金黄葡萄球菌作用没有青霉素和卡那霉素强，但对革兰氏阴性大肠杆菌强于青霉素，由结果可知其具有广谱抗菌性质。
而值得注意的是，对革兰氏阴性菌大肠杆菌和和革兰氏阳性菌金黄葡萄球菌，本发明表没食子儿茶素没食子酸酯纳米线制剂的抗菌作用比聚氰基丙烯酸正丁酯纳米线和EGCG的抗菌作用的总和更高，也就是说组合后的技术效果比每个技术特征效果的总和更优越。
5.3扫描电镜试验
对数期的大肠杆菌和金黄葡萄球菌分别与实施例1制得的表没食子儿茶素没食子酸酯纳米线制剂(图6中以EGCG纳米线指代)按照1：100的比例将菌液重悬浮于新的牛肉膏蛋白胨液体培养基中，培养条件为37℃，200转/分钟，12小时。加药组的浓度分别为6.25μg/mL，12.5μg/mL和25μg/mL，不含药物为空白组。次日，以3000转，5分钟的条件对上述培养细胞进行离心收集，使用PBS(PBS,PH 7.5,0.1M)缓冲溶液洗脱两遍(目的将培养基去除)。利用2.5％的戊二醛溶液对收集到的细胞进行过夜固定，再次使用PBS(PBS,pH 7.5,0.1M)冲洗两遍(目的去除戊二醛)，然后进行乙醇梯度(35％、50％、70％、80％、95％和100％)脱水，期间每步应持续20分钟，脱水全过程都应在4℃环境中进行。最后，进行二氧化碳临界点干燥仪器干燥。12小时后，置于SEM中观察细胞形态。
实验结果见附图6，结果表明：
空白组大肠杆菌和金黄葡萄球菌形态是完整，并且外表上还依附着光滑的细胞膜，而被不同浓度EGCG纳米线处理组，细菌形态由放大区域可清楚看到细菌细胞膜形态发生改变，有的细胞膜出现褶皱、缩水、破损的现象，严重的出现细胞膜消亡现象。甚至在高浓度的EGCG纳米线作用细菌后，从放大区域明显看到细菌内含物的流出。SEM的结果表明，EGCG纳米线对于实验菌株大肠杆菌(革兰氏阴性菌)和金黄葡萄球菌(革兰氏阳性菌)的细胞膜破坏是明显的，细胞膜的破损势必会影响细胞的生长、繁殖，从而达到抑菌或杀菌的作用。
实施例1至实施例4制得的表没食子儿茶素没食子酸酯纳米线制剂的扫射电镜(SEM)图、X-衍射图、电动势直观图以及生存率(杀菌)实验和抗菌实验结果与实施例1制得的表没食子儿茶素没食子酸酯纳米线制剂相近，为简洁描述起见，不再赘述。
实施例6
溶血试验
步骤：将10mL新鲜抽取的兔血立即加入到含有肝素钠真空采血管中，取出一部分，以加入10mL生理盐水，摇匀，然后离心6min(3000r/min)，弃去上清液，用生理盐水洗涤红细胞三次，以移去血清蛋白。洗涤完毕，将最后离心得到的红细胞分散在生理盐水中配成2wt％的红细胞悬浮液。将实施例1制得的表没食子儿茶素没食子酸酯纳米线制剂溶解在生理盐水中配成25、12.5和6.25μg.mL-1的溶液。4.0mL不同浓度的表没食子儿茶素没食子酸酯纳米线制剂生理盐水溶液，4.0mL去离子水和4.0mL生理盐水分别为测试组、阳性对照组和阴性对照组。每组设三个平行样管。所有的试管都放在37℃恒温水浴中恒温30min。然后往每个试管中加入0.4mL 2wt％的红细胞悬浮液，并将其放入37℃恒温水浴中恒温60min。接着将所有试管中的溶液都离心10min(3000r/min)，然后分别取出上清液。通过测量上清液在545nm处的吸光度值来计算溶血度。根据ISO 10993-4:2002，阴性对照组的吸光度值小于0.03，而阳性对照组的吸光度值为0.8±0.3。最后溶血率(Hemolytic ratio)用每组的平均值按照下列公式计算。
Atest,A-,A+分别为测试组、阴性对照组、阳性对照组的平均吸光度值。如果溶血率超过5％，一般认为测试样品发生了溶血作用。
图7为阳性对照(水)、不同浓度(μg/ml)的表没食子儿茶素没食子酸酯纳米线制剂和阴性对照(0.9％NaCL)的溶血照片，从图中可清楚地比较各组的溶血情况。
结果显示各测试浓度的表没食子儿茶素没食子酸酯纳米线制剂的最大溶血率为3.9±0.86％，小于5％，在测试浓度范围内表没食子儿茶素没食子酸酯纳米线制剂没有发生溶血现象，该表没食子儿茶素没食子酸酯纳米线制剂能满足一般生物实验要求。
应当理解本文所述的例子和实施方式仅为了说明，并不用于限制本发明，本领域技术人员可根据它做出各种修改或变化，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.聚氰基丙烯酸正丁酯纳米线作为抑菌剂的应用。
2.一种表没食子儿茶素没食子酸酯纳米线制剂，其特征在于，包括聚氰基丙烯酸正丁酯纳米线以及负载在聚氰基丙烯酸正丁酯纳米线上的表没食子儿茶素没食子酸酯。
3.如权利要求2所述的表没食子儿茶素没食子酸酯纳米线制剂，其特征在于，所述表没食子儿茶素没食子酸酯纳米线制剂的包封率为81.16～90.31％。
4.如权利要求2或3所述表没食子儿茶素没食子酸酯纳米线制剂作为抗菌剂的应用。
5.一种抑菌药物，其特征在于：包括药用辅料和功能原料，所述功能原料包括如权利要求2或3所述表没食子儿茶素没食子酸酯纳米线制剂和/或聚氰基丙烯酸正丁酯纳米线。
6.如权利要求2所述的表没食子儿茶素没食子酸酯纳米线制剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)原料配置
有机相原料的配置：在丙酮中分散表没食子儿茶素没食子酸酯、α-氰基丙烯酸正丁酯和乙酸乙酯；
水相原料的配置：在超纯水中分散表面活性剂和稳定剂，并调节成酸性；
(2)聚合反应
搅拌条件下，将有机相原料逐渐加入到水相原料中进行自发界面缩聚合反应。
7.如权利要求6所述的表没食子儿茶素没食子酸酯纳米线制剂的制备方法，其特征在于，表面活性剂为十二烷基硫酸钠，稳定剂为右旋糖苷-70，水相原料的配比为：每100毫升超纯水中分散有十二烷基硫酸钠0.6～1.2克、右旋糖苷-70 0.8～1.2克。
8.如权利要求6或7所述的表没食子儿茶素没食子酸酯纳米线制剂的制备方法，其特征在于，有机相原料的配比为：每100毫升无水丙酮中分散有表没食子儿茶素没食子酸酯0.02～0.08克、α-氰基丙烯酸正丁酯0.1～0.5毫升、乙酸乙酯3.0～8.0毫升。
9.如权利要求6或7所述的表没食子儿茶素没食子酸酯纳米线制剂的制备方法，其特征在于，水相原料的酸性程度达到pH值2～3.5。
10.如权利要求6或7所述的表没食子儿茶素没食子酸酯纳米线制剂的制备方法，其特征在于，还包括以下步骤：
(3)后处理
反应完成后，先除去有机相，再进行过滤，之后调节pH值至6.0±0.1。
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