CN105494625B - 一种抑菌保护剂以及制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种抑菌保护剂及其制备方法和应用，所述制备方法包括以下步骤：将桑黄(Phellinus baumii)子实体粉碎后加入乙醇中，进行乙醇浸提；将乙醇浸提后所得混合物过滤，分别得到残渣和浸提液；将所得浸提液浓缩至乙醇挥发完全，即得抑菌保护剂。本发明制备方法操作简便，能较好的满足工业化生产的需求。利用该制备方法制备的抑菌保护剂来源于可食用真菌，安全可靠，具有广谱抑菌性，对有益菌生长的无抑制作用，在抑制有害微生物的同时保护了有益微生物的存活率，有广阔的市场前景和应用价值。

Description

一种抑菌保护剂以及制备方法和应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种抑菌保护剂以及制备方法和应用。

背景技术

目前，天然物质用于食品保鲜已达到市场份额的25％，并且以每年6％-10％速度递增。世界食品供应量的25％被微生物污染。我国虽然对于食品法规越来越开放，但对食品安全要求则是越来越严格。随着人们消费水平及意识的提高，天然的、安全的食品成为消费者的主要消费趋势。而天然抑菌成分主要分动物源抑菌成分、植物源抑菌成分以及微生物源抑菌成分。由于微生物源抑菌剂具有易获取、来源广、成本低、便于扩大培养等诸多优势，成为近年食品保鲜剂开发的一个重要的方向。

乳制品作为易变质食品之一，如何保留乳品原有的品质及特性，避免受到微生物等因素的影响，始终是乳品加工、运输、和贮存过程中的重要问题。乳制品抑菌方式包括乳制品内源的成分作用，如具有广谱抑菌特性的抗菌肽、乳铁蛋白及其水解产物乳铁素、微生物发酵产生的有机酸等，均可作为食品的天然防腐剂；另有学者研究发现，德氏乳杆菌保加利亚亚种、嗜热链球菌、干酪乳杆菌、嗜酸乳杆菌、双歧杆菌等可以取代在肠道中生长的多数腐败细菌，减少由腐败菌产生的易腐败代谢物，延长了乳制品的保质期。

除产品内源的抑菌体系外，从其他来源提取天然抑菌成分添加到产品中也成为乳制品防腐的重要手段。此类外源抑菌成分主要包括抑菌类酶制剂、天然精油、多酚类等。如目前研究最透彻、应用最广的是乳酸链球菌肽(Nisin)，Nisin能有效地控制有害细菌，特别是耐热的芽孢杆菌及梭菌的生长和繁殖，以达到延长不同乳制品货架期的目的。然而，与乳制品内源性抑菌体系相比，添加的外源抑菌成分存在作用范围小、不具广谱抑菌性的弊端。并且为保证食品的安全性，按规定可添加于乳制品中的抑菌物质种类有限，Nisin因具有用量少、抗菌能力强等特点，是唯一可用于乳制品的抑菌添加剂，其他成分添加剂对人体可能会产生一定的毒性，一定程度上限制了乳制品的抑菌物质的开发，为开发长货架期的乳制品带来一定困难。故此现阶段缺少一种作用范围广，具广谱抗菌性的，高效的，容易获取，能够大规模生产并应用于乳制品的外源抑菌成分。

发明内容

本发明要解决的技术问题是针对目前用于乳制品中添加的外源抑菌成分存在着不具广谱抑菌性、作用范围小，能确保安全无毒的种类极少等缺陷，本发明提供了一种抑菌保护剂及其制备方法和应用，该抑菌保护剂来源于微生物，作用范围广且具广谱抑菌性，天然，安全，制备方法简单可靠，适合大规模生产以及在乳制品市场中应用。

为解决上述技术问题，本发明提供的技术方案之一是，一种抑菌保护剂的制备方法，所述制备方法包括以下步骤：

1)将桑黄子实体粉碎后加入乙醇中，进行乙醇浸提；

2)将步骤1)乙醇浸提后所得混合物过滤，分别得到残渣和浸提液；

3)将步骤2)所得浸提液浓缩至乙醇挥发完全，得到的浓缩物，即抑菌保护剂。

本发明步骤1)为：将桑黄子实体粉碎后加入乙醇中，进行乙醇浸提。其中，本发明步骤1)所述的桑黄子实体为桑黄(Phellinus baumii)菌种栽培得到。所述栽培条件为常规，只要能由桑黄菌种得到桑黄子实体即可。桑黄作为一种珍贵的传统药用真菌，它最早记载于《药性论》，传统中医认为桑黄味甘辛，是国际认同的食品领域中相率最高的一种食药用真菌。目前，对于桑黄子实体水提物的生物活性有诸多报道，如抗氧化、抗衰老、提高免疫力、抗突变、抗纤维化、抗肺炎等诸多生物功效。所述的桑黄子实体较佳地在粉碎前经过干燥，所述的干燥为常规干燥方法。所述的粉碎为常规的，较佳地为使用粉碎机粉碎子实体，更佳地为将桑黄子实体粉碎至约0.5～3cm³的颗粒，最佳地为将桑黄子实体粉碎成为约1cm³的颗粒。所述的乙醇为常规的，较佳地为浓度为70％～100％的乙醇，更佳地为浓度为75％～95％的乙醇，最佳地为浓度为85％～95％的乙醇，所述百分比为体积百分比；所述乙醇的用量是常规的，较佳地为5～30倍体积的乙醇，更佳地为10～20倍体积的乙醇，最佳地为15～20倍体积的乙醇，所述体积倍数相对于桑黄子实体体积。所述的乙醇浸提为常规的，较佳地浸提时间为12～48小时(h)，更佳地浸提时间为12～36小时，最佳地浸提时间为24～36小时，浸提温度为常规温度，较佳为室温，更佳为10℃～40℃，最佳为25℃～30℃。

本发明步骤2)为：将步骤1)乙醇浸提后所得混合物过滤，分别得到残渣和浸提液。其中，所述的过滤是常规的，较佳的是使用4层纱布进行过滤。

本发明所述制备方法在步骤3)之前较佳地还包括步骤2’)即将步骤2)所述的残渣再次进行乙醇浸提，将所得浸提液与步骤2)所得浸提液合并。

本发明步骤3)为：将步骤2)所得浸提液浓缩至乙醇挥发完全，得到的浓缩物，即抑菌保护剂。其中，所述的浓缩为常规的，较佳地为在减压状态下，使用旋转蒸发仪对提取液进行减压浓缩，更佳地为减压浓缩的过程中控制温度不高于50℃。

本发明所述制备方法较佳地在步骤3)之后还包括步骤4)为将步骤3)所得的浓缩物经过冷冻干燥得到抑菌保护剂。

本发明所述制备方法较佳地在步骤4)之后还包括步骤5)：将步骤4)所述的抑菌保护剂加乙醇进行溶解，得到不同浓度的抑菌保护剂溶液，所述的乙醇为常规的，较佳地为70％～100％的乙醇，所述百分比为体积百分比，所述抑菌保护剂溶液浓度较佳的为0.01mg/mL～10mg/mL。

为解决上述技术问题，本发明提供的技术方案之二是，一种抑菌保护剂，所述抑菌保护剂由前述制备方法制备而得。

本发明中，当前述制备方法优选地包括步骤4)时，即相应制备得到不同浓度的抑菌保护剂溶液。所述抑菌保护剂溶液浓度较佳的为0.01mg/mL～10mg/mL。所述抑菌保护剂或所述的抑菌保护剂溶液的作用温度为常规的，较佳地为4～37℃。

为解决上述技术问题，本发明提供的技术方案之三是，抑菌保护剂在乳制品的应用。

在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实例。

本发明所用试剂和原料均市售可得。

本发明的积极进步效果在于：本发明开发了一种抑菌保护剂的制备方法，该制备方法操作简便，能较好的满足工业化生产的需求。利用该制备方法制备的抑菌保护剂来源于可食用真菌，安全可靠，具有广谱抑菌性，可不同程度抑制大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、枯草芽孢杆菌、单增李斯特菌等有害细菌的生长，另对啤酒酵母、白霉、青霉等真菌类微生物也有一定的抑制作用，但对保加利亚乳杆菌、嗜热链球菌、双歧杆菌的有益菌生长的无抑制作用，所以，本发明的抑菌保护剂在抑制有害微生物的同时保护了有益微生物的存活率，这在乳制品中尤为重要，故此，本发明提供的抑菌保护剂存在广阔的市场应用价值。

附图说明

图1为不同浓度的抑菌保护剂对啤酒酵母生长抑制作用。

图2为不同浓度的抑菌保护剂对巴氏杀菌乳菌群总数的作用。

具体实施方式

下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。

本发明所涉及的室温均为0～40℃。

桑黄菌种栽培得到子实体后，将子实体粉碎，在干燥的子实体粉碎物中加入5倍体积无水乙醇浸提；室温静置浸提48h后，将乙醇浸泡桑黄子实体得到的混合物过滤，重复上述步骤对过滤所得残渣进行第二次浸提；合并量两次乙醇浸提液，进行减压浓缩，待乙醇完全挥发后，进行冷冻干燥，得到桑黄子实体乙醇提取物即抑菌保护剂；该桑黄乙醇提取物用乙醇进行溶解，制备所得0.01mg/mL、0.1mg/mL、1mg/mL、5mg/mL、10mg/mL不同浓度的桑黄醇提物溶液即为抑菌保护剂溶(简称抑菌保护液)。

固体肉汤培养基(即肉汤琼脂培养基)制备：取营养肉汤1.8g，琼脂1.2g，加入100mL去离子水溶解，121℃灭菌20min后，待用。

液体肉汤培养基制备：取营养肉汤1.8g，加入100mL去离子水溶解，121℃灭菌20min后，待用。

取革兰氏阴性菌大肠杆菌(Escherichia coli)、宋内氏志贺氏菌(ShigellaCastellani)、沙门氏菌(salmonella)分别进行菌种复苏后，将菌体接种于液体肉汤培养基37℃下振荡培养18h，调节培养后菌液中菌种浓度在10⁵～10⁶个/mL，取1mL调节后菌液与呈液态的肉汤琼脂培养基混合均匀后倒至培养皿中；待培养基凝固后，将20μL浓度分别为0.01mg/mL、0.1mg/mL、1mg/mL、5mg/mL、10mg/mL抑菌保护液分别滴在混有有害微生物的固体培养基(平板)上，以20μL无菌水作为对照组(空白对照)；37℃下静置培养36h后测量平板抑菌圈大小，抑菌圈大小反应保护剂抑菌能力，抑菌圈越大，抑菌能力越强(如表1所示)。在本发明抑菌保护剂存在时，混有有害微生物的平板可以观察到抑菌圈，且随着抑菌保护剂浓度的增大抑菌圈直径增大，尤其是抑菌保护剂浓度为0.1mg/mL～5mg/mL时，随着浓度增大，抑菌圈明显增大，由此可得出结论本发明抑菌保护剂能有效抑制革兰氏阴性菌，且浓度的越大抑菌效果越好，尤其是浓度为0.1mg/mL～5mg/mL时，随着浓度的增大，抑菌效果明显增加。

表1不同作用浓度抑菌保护剂对革兰氏阴性菌抑制情况

实施例2抑菌保护剂对革兰氏阳性菌的抑制

桑黄菌种栽培得到子实体后，将子实体粉碎，在干燥的子实体粉碎物中加入30倍体积70％乙醇浸提；室温静置浸提12h后，将乙醇浸泡桑黄子实体得到的混合物过滤，重复上述步骤对过滤所得残渣进行第二次浸提；合并量两次乙醇浸提液，进行减压浓缩，待乙醇完全挥发后，进行冷冻干燥，得到桑黄子实体乙醇提取物即抑菌保护剂；该桑黄乙醇提取物，使用乙醇进行溶解，制备得浓度分别为0.01mg/mL、0.1mg/mL、1mg/mL、5mg/mL、10mg/mL的桑黄醇提物溶液即为抑菌保护剂溶液。

培养基制备参照实施例1制备方法。

取革兰氏阳性菌单增李斯特菌(Listeria monocytogenes)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、藤黄微球菌(Micrococcus luteus)以及枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)分别进行菌种复苏后，将菌体接种于液体肉汤培养基37℃下振荡培养18h，调节培养后菌液中菌种浓度在10⁵～10⁶个/mL，取1mL调节后菌液与呈液态的肉汤琼脂培养基混合均匀后倒至培养皿中；待培养基凝固后，将20μL浓度分别为0.01mg/mL、0.1mg/mL、1mg/mL、5mg/mL、10mg/mL抑菌保护液分别滴在混有有害微生物的培养基上，以20μL无菌水作为对照组；37℃下静置培养36h后测量平板抑菌圈大小，抑菌圈大小反应保护剂抑菌能力(如表2所示)。在本发明抑菌保护剂存在时，混有有害微生物的平板可以观察到抑菌圈，且随着抑菌保护剂浓度的增大抑菌圈直径增大，尤其是抑菌保护剂浓度为0.01mg/mL～5mg/mL时，随着浓度增大，抑菌圈明显增大，由此可得出结论本发明抑菌保护剂能有效抑制革兰氏阳性菌，且浓度的越大抑菌效果越好，尤其是浓度为0.01mg/mL～5mg/mL时，随着浓度的增大，抑菌效果明显增加。

表2不同作用浓度抑菌保护剂对革兰氏阳性菌抑制情况

实施例3抑菌保护剂对霉菌的抑制

将该桑黄菌种栽培得到的子实体后，将子实体粉碎，在干燥的子实体粉碎物中加入20倍体积95％乙醇浸提；室温静置浸提24h后，将乙醇浸泡桑黄子实体得到的混合物过滤，重复上述步骤对过滤所得残渣进行第二次浸提；合并量两次乙醇浸提液，进行减压浓缩，待乙醇完全挥发后，进行冷冻干燥，得到桑黄子实体乙醇提取物即抑菌保护剂。

固体PDA培养基配制：取PDA琼脂粉4g，加入100mL去离子水溶解，121℃灭菌20min后，待用。

分别取青霉(Penicillium candidum)、白霉菌株(Geotrichum candidum)，进行活化并进行固体扩大培养；将经121℃高压灭菌15min后的抑菌保护剂与PDA培养基混合均匀，使抑菌保护剂终浓度分别为0.01mg/mL、0.1mg/mL、1mg/mL，倒入培养皿中，待平板(固体培养基)凝固后，以空白PDA固体培养基为对照组(空白对照)，分别挑取青霉、白霉菌种于平板中心，30℃培养7天后，分别测量青霉、白霉在平板中的直径，对霉菌生长的抑制作用与霉菌生长圈直径大小呈负相关(结果如表3所示)。本发明的抑菌保护剂存在时霉菌生长圈直径相对于空白对照缩小，所以本发明抑菌保护剂能够有效抑制霉菌的生长，且霉菌生长圈直径随着本发明抑菌保护剂浓度增大而缩小，由此可见抑菌保护剂浓度越大抑菌效果越好。

表3抑菌保护剂对霉菌的抑制作用

实施例4抑菌保护剂对霉菌的抑制

将该桑黄菌种栽培得到的子实体后，将子实体进行干燥，将干燥后的子实体粉碎，在干燥的子实体粉碎物中加入20倍体积95％乙醇浸提；室温静置浸提24h后，将乙醇浸泡桑黄子实体得到的混合物过滤，重复上述步骤对过滤所得残渣进行第二次浸提；合并量两次乙醇浸提液，进行减压浓缩，待乙醇完全挥发后，进行冷冻干燥，得到桑黄子实体乙醇提取物即抑菌保护剂。

进行了与实施例3相同的霉菌抑制实验，发现本发明的抑菌保护剂存在时霉菌生长圈直径相对于空白对照缩小，得到了与实施例3相同的结论：本发明抑菌保护剂能够有效抑制霉菌的生长。

实施例5抑菌保护剂对酵母的抑制

将该桑黄菌种栽培得到的子实体后，将子实体粉碎，在干燥的子实体粉碎物中加入15倍体积90％乙醇浸提；室温静置浸提12h后，将乙醇浸泡桑黄子实体得到的混合物过滤，重复上述步骤对过滤所得残渣进行第二次浸提；合并量两次乙醇浸提液，进行减压浓缩，待乙醇完全挥发后，进行冷冻干燥，得到桑黄子实体乙醇提取物即抑菌保护剂。

取啤酒酵母菌种(Saccharomyces cerevisiae)进行复活，挑取活化后的酿酒酵母扩大培养，并取180μL酵母发酵液与20μL抑菌保护液均匀混合于bioscreen10*10孔板(购自芬兰Bioscreen公司)，使抑菌保护剂终浓度分别为0.02mg/mL、0.2mg/mL、2mg/mL，以乙醇作为空白对照，30℃，连续震荡，测定宽波长与600nm的吸光值，间隔20min读数，连续测定2000min。酵母菌体浓度与吸光值成正比，抑菌效果如图1和表4所示：在本发明的抑菌保护剂存在的情况下，吸光值小，酵母菌浓度低，所以本发明的抑菌保护剂能显著抑制啤酒酵母生长，并且浓度越大的抑菌保护剂抑菌效果越好。

表4不同浓度醇提物作用下酵母生长曲线吸光值

实施例6抑菌保护剂对巴氏杀菌乳菌群总数的作用

将该桑黄菌种栽培得到的子实体后，将子实体粉碎，在干燥的子实体粉碎物中加入10倍体积85％乙醇浸提；室温静置浸提36h后，将乙醇浸泡桑黄子实体得到的混合物过滤，重复上述步骤对过滤所得残渣进行第二次浸提；合并量两次乙醇浸提液，进行减压浓缩，待乙醇完全挥发后，进行冷冻干燥，得到桑黄子实体乙醇提取物即抑菌保护剂。

将灭菌后的抑菌保护剂与新鲜牛乳混合均匀，使抑菌保护剂在牛乳中的终浓度分别为0mg/mL、0.05mg/mL、0.1mg/mL、1mg/mL，均质后进行巴氏杀菌，置于10℃下保存，每隔24h测定牛乳中细菌总数，连续测定2周(结果如图2和表5所示)。在有本发明的抑菌保护剂存在的情况下，保鲜牛乳菌群总数低于不存在本发明的抑菌保护剂的对照组，可见，本发明的抑菌保护剂能有效控制保鲜牛奶乳中菌群总数，起到延长货架期的作用。并且随着本发明的抑菌保护剂的浓度的提高，保存相同时间的保鲜牛奶乳中菌群总数越低，所以，抑菌保护剂浓度越高抑菌效果越好。

表5不同浓度抑菌剂作用下菌群总数变化

实施例7抑菌保护剂对有益菌的作用

将该桑黄菌种栽培得到的子实体后，将子实体粉碎，在干燥的子实体粉碎物中加入15倍体积75％乙醇浸提；室温静置浸提24h后，将乙醇浸泡桑黄子实体得到的混合物过滤，重复上述步骤对过滤所得残渣进行第二次浸提；合并量两次乙醇浸提液，进行减压浓缩，待乙醇完全挥发后，进行冷冻干燥，得到桑黄子实体乙醇提取物即抑菌保护剂。

固体MRS培养基配制：取MRS粉末(购于德国Merck公司)6.82g，琼脂1.2g，加入100mL去离子水溶解，121℃灭菌20min后，待用。

固体M17培养基配制：取M17粉末(购于德国Merck公司)4.25g，琼脂1.2g，加入100mL去离子水溶解，121℃灭菌20min后，待用。

液体MRS培养基配制：取MRS粉末(购于德国Merck公司)6.82g，加入100mL去离子水溶解，121℃灭菌20min后，待用。

液体M17培养基配制：取M17粉末(购于德国Merck公司)4.25g，加入100mL去离子水溶解，121℃灭菌20min后，待用。

分别取保加利亚乳杆菌(Lactobacillus bulgaricus)、嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)两种有益菌株，复苏，保加利亚乳杆菌、双歧杆菌使用液体MRS培养基、嗜热链球菌使用液体M17培养基扩大培养后，调节培养后菌液中菌体浓度为10⁵～10⁶cfu/mL，取1mL调节后菌液与呈液态的固体MRS培养基(固体M17培养基，根据菌种选择)混合均匀后倒至培养皿中；待培养基(平板)凝固后，将20μL浓度分别为0.1mg/mL、1mg/mL、10mg/mL抑菌保护液滴在培养基上，适当培养条件48h后，测定抑菌圈直径，结果如表6所示。加入本发明抑菌保护剂后对于保加利亚乳杆菌并没有产生可见的抑菌圈，只有在浓度很高时才在嗜热链球菌平板上观察到很小的抑菌圈，所以本发明的抑菌保护剂对有益菌无显著抑制作用。

表6抑菌保护剂对有益菌的作用

本发明采用乙醇提取法，对桑黄子实体中抑菌成分进行提取，并应用于乳制品抑菌研究，本发明选取了具有代表性的有害细菌、真菌作为抑菌对象，通过研究发现桑黄子实体水提物，在0.01mg/mL～10mg/mL作用浓度范围内能够有效抑制大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、枯草芽孢杆菌、单增李斯特菌、啤酒酵母、白霉、青霉等不利于鲜奶保鲜的有害微生物滋生；在0.01mg/mL～10mg/mL作用浓度范围内，对保加利亚乳杆菌、嗜热链球菌有益菌无显著抑制作用，因此可以理解为，本发明桑黄水提物可以在不损害有益微生物的前提下有效抑制乳制品中有害微生物的生长，能够作为抑菌保护剂应用于乳制品的开发。

对比实施例1Nisin和本发明抑菌保护剂对不同菌群的作用

培养基配制参照实施例1、实施例3和实施例7；

分别取保加利亚乳杆菌、嗜热链球菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌以及大肠杆菌；分别进行菌种复苏后，将菌体接种于液体培养基(液体肉汤培养基、液体MRS培养基、液体M17培养基；根据所培养的菌种选择，选择标准同实施例1和6)37℃下振荡培养18h，调节培养后菌液中菌种浓度为10⁵～10⁶个/mL，取1mL调节后菌液与呈液态的固体培养基(肉汤琼脂培养基、固体MRS培养基、固体M17培养基；根据所培养的菌种选择，选择标准同实施例1和7)混合均匀后倒至培养皿中；待培养基(平板)凝固后，将20μL浓度为0.5mg/mL和1mg/mL抑菌保护剂溶液(按照实施例1中的方法制备而得)和Nisin溶液分别滴在混有有害微生物的培养基上；37℃下静置培养36h后测量平板抑菌圈大小结果如下(表7)：Nisin对大肠杆菌(革兰氏阴性菌)无抑菌圈，无抑制作用，而本发明抑菌保护剂对大肠杆菌有较强的抑制作用。

表7Nisin溶液和本发明抑菌保护剂对革兰氏阳性及阴性菌的作用

按照同实施例3中的操作：分别取青霉、白霉菌株，进行活化并进行固体扩大培养；将灭菌后的抑菌保护剂溶液(按照实施例3中的方法制备而得)以及Nisin溶液分别与PDA培养基混合均匀，使抑菌保护剂和Nisin终浓度分别为0.1mg/mL、1mg/mL，倒入培养皿，待培养基凝固后，以空白的PDA固体培养基作为对照组(空白对照)，分别挑取青霉、白霉菌接种于平板中心，30℃培养7天后，分别测量青霉、白霉在平板中的直径，对霉菌生长的抑制作用与霉菌生长圈直径大小呈负相关(结果如表8所示)：Nisin存在时霉菌的生长圈直径和空白对照组相似，即Nisin对霉菌无抑制作用，而本发明抑菌保护剂存在时，霉菌生长圈直径较对照组小，霉菌生长圈直径为对照组的一半左右，尤其是在浓度较高时，霉菌生长圈直径为对照组的三分之一甚至更小。

表8Nisin溶液和抑菌保护剂对霉菌的作用

可见，Nisin抑菌谱较窄，虽然对于革兰氏阳性菌有较好的抑制作用，抑菌作用由于本发明的抑菌剂，但Nisin对于革兰氏阴性菌以及霉菌均无抑制作用。而本发明的抑菌剂可以有效抑制革兰氏阴性菌以及霉菌的生长。

对比实施例2桑黄液体发酵菌丝体提取物的抑菌作用

桑黄菌种进行液体发酵得到菌丝体，使用实施例1中的提取方法得到菌丝体提取物，利用菌丝体提取物以及本发明抑菌保护剂进行和对比实施例1相同的抑菌试验，将对比实施例1中的Nisin换成菌丝体提取物进行实验，得到本对比实施例，相关实验操作参照对比实施例1。结果如表9-10所示：在本对比实施例浓度下，菌丝体提取物存在时在革兰氏阴性菌平板上观察不到抑菌圈，本发明抑菌保护剂存在时则能观察到；菌丝体提取物存在时在革兰氏阳性菌平板上可以观察到抑菌圈，但是浓度相同时，菌丝体提取物组得到的抑菌圈小于本发明抑菌保护剂组；菌丝体提取物存在时霉菌的生长圈直径大于同一浓度下本发明抑菌保护剂存在时的霉菌的生长圈直径，所以，本发明抑菌保护剂抑菌效果较菌丝体提取物好。

表9菌丝体提取物和本发明抑菌保护剂对革兰氏阳性及阴性菌的作用

表10菌丝体提取物和本发明抑菌保护剂对霉菌的作用

应理解，在阅读了本发明的上述内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims (11)

1.一种抑菌保护剂在乳制品中抑制有害微生物保护有益微生物的应用，其特征在于，所述抑菌保护剂的制备方法包括以下步骤：

1）将桑黄（Phellinus baumii）子实体粉碎后加入乙醇中，进行乙醇浸提；

2）将步骤1）乙醇浸提后所得混合物过滤，分别得到残渣和浸提液；

3）将步骤2）所得浸提液浓缩至乙醇挥发完全，得到的浓缩物，即抑菌保护剂；

所述的乙醇浸提的浸提温度为室温，所述的室温为0～40℃。

2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，步骤1）中所述的桑黄子实体在粉碎前经过干燥。

3.如权利要求1所述的应用，其特征在于，步骤1）所述的乙醇为5～30倍体积的乙醇，所述体积倍数相对于桑黄子实体体积。

4.如权利要求1所述的应用，其特征在于，步骤1）所述的乙醇为浓度为70%～100%的乙醇，所述百分比为体积百分比。

5.如权利要求4所述的应用，其特征在于，步骤1）所述的乙醇为浓度为75%~95%的乙醇，所述百分比为体积百分比。

6.如权利要求4所述的应用，其特征在于，步骤1）所述的乙醇为浓度为85%~95%的乙醇，所述百分比为体积百分比。

7.如权利要求1所述的应用，其特征在于，步骤1）所述的乙醇浸提的浸提时间为12～48小时。

8.如权利要求7所述的应用，其特征在于，步骤1）所述的乙醇浸提的浸提时间为12～36小时。

9.如权利要求7所述的应用，其特征在于，步骤1）所述的乙醇浸提的浸提时间为24～36小时。

10.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述制备方法在步骤3）之前还包括步骤2’），所述步骤2’）即将步骤2）所述的残渣再次进行乙醇浸提，将所得浸提液与步骤2）所得浸提液合并。

11.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述制备方法在步骤3）之后还包括步骤4），所述步骤4）为将步骤3）所得的浓缩物经过冷冻干燥得到抑菌保护剂。