CN104830730A - 一株具有抗甜瓜枯萎菌和抗甜瓜疫霉菌活性的植物乳杆菌ab-4及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种具有抗甜瓜枯萎活性的植物乳杆菌Lactobacillus plantarum AB-4，保藏号为CGMCC No.9656。本发明的植物乳杆菌L.plantarum AB-4表现出对甜瓜疫霉和甜瓜枯萎菌的有效抑制性；具有良好的热稳定性，其发酵上清在经过100℃处理后仍有良好的抑菌率；其发酵上清经中性蛋白酶、蛋白酶K和或胰蛋白酶酶解处理后仍具有一定的抑菌活性；其发酵上清具有耐贮藏特性，在常温贮藏20d后仍具有良好的抑菌活性。

Description

一株具有抗甜瓜枯萎菌和抗甜瓜疫霉菌活性的植物乳杆菌AB-4及其应用

【技术领域】

本发明属于生物技术领域，特别涉及一株分离自蒙古国酸驼奶的植物乳杆菌菌株(Lactobacillus plantarum AB-4)，以及所述植物乳杆菌在发酵制品、生物农药或果蔬保鲜剂中的应用。

【技术背景】

植物的所有侵染性病害中，真菌性病害数量最为繁多，约占所有病害数量的70％以上。甜瓜枯萎病是由尖孢镰刀菌甜瓜专化型(Fusariumoxysporum f.sp.Melonis)引起的病害，从苗期到生长发育期均可染病，常造成大片瓜田植株枯萎死亡，是危害甜瓜种植业的重要土传病害。目前，化学防治是控制甜瓜枯萎病的主要措施，但是长期使用化学农药会使病原菌产生抗药性，而且其化学残留和污染环境等弊端不符合现代社会所提倡的绿色无公害产品。

甜瓜疫霉病是由甜瓜疫霉菌(Phytophthora drechsleri Tucker)感染甜瓜植株引起的真菌病害，甜瓜疫霉病是甜瓜生产上重要病害，一旦发病则难于控制。叶、茎和果实均可被侵染。同样地，化学防治是目前控制甜瓜疫霉病的主要措施。因此，现有技术中缺乏绿色、无公害的真菌病害防治方法。

乳酸菌的抑菌机理主要表现在以下五个方面：一是乳酸菌产生乙酸、丙酸、乳酸和苯乳酸等有机酸，使环境中的pH值显著降低且保持酸性，抑制不耐酸有害菌的生长繁殖；二是乳酸菌产生抗生素或细菌素的蛋白质或肽类物质，对有害菌有抑制或杀灭作用；三是乳酸菌产生的过氧化氢能激活过氧化氢酶—硫氰酸系统，抑制或杀灭有害菌；四是乳酸菌产生的二氧化碳可抑制部分霉菌和革兰氏阴性菌；五是乳酸菌通过拮抗作用与有害菌竞争营养物质，从而达到抑菌作用。

然而，现有的乳酸菌大多只对大肠杆菌等常见致病菌具有抑制作用。《来源于酸马奶的植物乳杆菌Bx6-2抑制甜瓜疫霉菌的研究》(《天津科技大学学报》25卷1期)公开了一株具有抗甜瓜疫霉活性的植物乳杆菌Bx6-2，并公开了其对甜瓜疫霉抑制率达58％。然而，并没有公开该菌株对于其他致病菌是否同样具有抑制活性。

【发明内容】

本发明的目的是克服现有技术缺陷，提供一株对多种病菌具有抑制活性的植物乳杆菌，能够应用于多种作物病害的防治中，实现绿色、无公害的真菌病害防治，即生物防治技术，具有无残留、无污染、成本低、兼防兼治、增产增收、保持生态平衡、能起到长效的效果。

为了实现上述目的，本发明提供一株具有抗菌活性的植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)AB-4，已于2014年9月15日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物菌种保藏中心，保藏号为CGMCCNo.9656。

本发明还提供上述植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)AB-4在抗甜瓜枯萎和甜瓜疫霉菌的应用。

本发明还提供上述植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)AB-4在农药和果蔬保鲜剂中的应用。

本发明还提供上述植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)AB-4在发酵制品中的应用。

以下将更详细地说明本发明的技术方案。

在本发明中，将用到以下培养基：

MRS琼脂培养基的组成是：大豆蛋白胨10g、牛肉膏5g、酵母粉4g、葡萄糖20g、Tweeen 801ml、磷酸二氢钠2g、无水乙酸钠5g、柠檬酸三胺2g、硫酸锰0.02g、硫酸镁0.1g，蒸馏水1L，调节pH至6.2左右，琼脂15g，121℃、15min灭菌后倒到培养皿形成平板。

MRS液体培养基：大豆蛋白胨10g、牛肉膏5g、酵母粉4g、葡萄糖20g、Tweeen 801ml、磷酸二氢钠2g、无水乙酸钠5g、柠檬酸三胺2g、硫酸锰0.02g、硫酸镁0.1g，蒸馏水1L，调节pH至6.2左右，121℃、15min灭菌。

M17培养基的组成是：胰蛋白胨5g、大豆蛋白胨5g、肉蛋白胨5g、酵母粉2.5g、抗坏血酸0.5g、硫酸镁0.25g、二钠甘油19g、琼脂11g、蒸馏水1L。

TPY增菌培养液的组成是：乳糖10g、牛肉膏5g、酵母粉5g、酪蛋白胨10g、大豆蛋白胨5g、磷酸氢二钾2.5g、磷酸二氢钾2.5g、硫酸镁0.1g、吐温800.25g、L-半胱氨酸盐酸盐0.5g、蒸馏水1L，121℃、15min灭菌。

本发明的植物乳杆菌(L.plantarum)AB-4是从酸驼奶(fermentedCamel milk)中分离的新型植物乳杆菌，将采集的乳制品样品(酸驼奶)做梯度稀释后(10^-4，10^-5，10^-6)涂布于含有放线菌酮(0.1wt％，OXID公司)和硫酸粘菌素(0.1wt％，OXID公司)的MRS琼脂培养基或者M17琼脂培养基(OXID公司)上，30℃厌氧培养48h～72h，挑取单菌落，转接于TPY增菌培养液中，30℃培养24h～48h，划线接种于MRS琼脂培养基，30℃培养24h～48h，观察记录菌落形态和革兰氏染色细胞形态特征，并同时进行过氧化氢酶试验。将革兰氏染色阳性、过氧化氢酶试验阴性的菌，暂定为乳酸菌。将菌株接种于MRS液体培养基中，37℃培养24h～48h后备用。

观察所得备用菌株形态学特性：细胞呈直杆状，有圆形末端，长3.0-8.0μm，宽0.9-1.2μm，呈单个、成对，或短链状出现(见图1)，有些菌能减少硝酸盐，偶尔有些菌株表现出拟过氧化氢酶活性。

观察所得备用菌株的菌落形态特性：在MRS琼脂培养基上生长形成乳白色菌落，不透明，圆形，表面光滑，中央凸起，直径约为1.2-1.5mm(见图2)。

所得备用菌株的分子生物学鉴定：将冷冻保存的备用菌株接种于TPY增菌培养液中，30℃恒温培养24h，经TPY增菌培养液传代培养2～3代后，取2mL对数生长末期的菌体培养物置于无菌EP管内离心，经8000×g离心3min(4℃)后收集菌体，弃上清，采用乳酸菌专用CTAB冻融法提取菌株的基因组DNA。

采用通用引物，正向引物是27f(对应于Escherichia coil 8-27位碱基)：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′；反向引物是1495r(对应于Escherichia coil 1495-1515位碱基)：5′-CTACGGCTACCTTGTTACGA-3′，以菌体DNA为扩增模板PCR扩增16S rRNA基因区域，扩增产物经纯化后进行16S rRNA基因序列测定，然后通过基因序列比对和系统发育关系研究进行种属鉴定，得到待筛选的菌株，其系统发育树状图(见图3)。

制备植物乳杆菌上清液：

把冻存的待筛选的菌株接种到5mL的MRS液体培养基中，震荡混匀，37℃恒温培养24h，以2％的接种量连续活化三代，取第三代的发酵液以4000×g离心10min，取上清，上清液经0.22um微膜过滤，-20℃冰箱保存备用。

利用打孔法测定待复筛的植物乳杆菌的抗甜瓜枯萎活性：

将在PDA(Potato Dextrose Agar)培养基(OXID公司)上活化好的甜瓜枯萎菌用PBS缓冲液洗下来制成10⁵的孢子菌悬液，把菌悬液按1％(V/V)接入PDA培养基中，震荡混匀，然后把含菌培养基倒到培养皿中，制成含菌平板。

在每个平板上用8mm打孔器均匀打出2个小孔并标注植物乳杆菌的测试编号，每孔加入100μL相对应植物乳杆菌MRS发酵上清液，于4℃冰箱中扩散12h后37℃培养恒温48h，观测抑菌圈的大小。选取小孔周围有明显和较大抑菌圈(抑菌圈>30.00mm)的植物乳杆菌作复筛菌株。

菌丝生长速率法测定植物乳杆菌的抗甜瓜枯萎菌活性：

将筛选得到的植物乳杆菌发酵上清液以5％(V/V)的比例加入到20mL的PDA培养集中，倒入灭菌培养皿内形成平板，等培养基凝固后，用打孔器(直径7mm)从培养4天的甜瓜枯萎菌落边缘制取菌饼，接种于含植物乳杆菌无细胞提取液的PDA培养基平皿中央，每皿接一个菌饼。以加入相同体积分数的无菌水为对照，每个处理设三次重复，置于28℃培养箱中恒温培养48h，测量实验组和对照组的菌落直径(mm)，取平均值利用公式求抑菌率。

利用打孔法测定待复筛的植物乳杆菌的抗甜瓜疫霉菌活性：

同上述打孔法相同，用相同的方法检测待复筛菌株对甜瓜疫霉菌的抑菌圈大小。

通过以上方法选育出同时具有较强抗甜瓜枯萎活性和抗甜瓜疫霉菌性质稳定的植物乳杆菌，命名为植物乳杆菌L.plantarum AB-4。

试验抑菌活性随上清浓度的变化：

将植物乳杆菌AB-4的发酵上清液分别以体积分数为0.1％、0.5％、1％、5％和10％与20ml的PDA培养基混合，再分别倒入灭菌培养皿内，随后利用上述的菌丝生长速率法测量实验组和对照组菌落直径(mm)，计算不同浓度下植物乳杆菌发酵上清液对甜瓜枯萎和甜瓜疫霉菌的抑菌率。

观察上清液发酵时间对抑菌率的影响：

将植物乳杆菌AB-4接种于MRS液体培养基中进行活化，活化2代后，将第3代的菌株分别接种于多个液体培养基中继续培养，从0小时开始，每两小时取出三个平行样，在600nm下测定植物乳杆菌的OD值，并按照上述菌丝生长速率法测定各个不同时间点发酵上清液对甜瓜枯萎菌的抑菌效果。

观察不同温度对发酵上清液抑菌率的影响：

将发酵上清液分别在50、60、70、80、100℃水浴中加热10min，以未处理的植物乳杆菌AB-4发酵上清液为对照，利用上述的菌丝生长速率法测定菌落直径并计算其抑菌率。

观察pH对发酵上清液抑菌率的影响：

将发酵上清液分别用1mol/L的NaOH和1mol/L的HCl溶液调pH至2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0。以未处理的植物乳杆菌AB-4发酵上清作为对照，利用上述的菌丝生长速率法测定不同pH条件下发酵上清液的抑菌率。

观察蛋白酶对发酵上清抑菌率的影响：

将发酵上清液分别用1mol/L的NaOH溶液调节pH至7.0，分别加入1mg/mL胰蛋白酶、中性蛋白酶和蛋白酶K，于37℃水浴处理2h，然后在100℃下煮沸灭活3min终止酶反应，再将pH调节至原来发酵上清液的pH，以未处理的植物乳杆菌发酵上清为对照，利用上述的菌丝生长速率法测定经不同蛋白酶处理后的发酵上清液的抑菌率。

观察常温贮藏对发酵上清液抑菌率的影响：

将发酵上清液分别在常温下放置3d、5d、10d、15d、20d，以未处理的植物乳杆菌AB-4发酵上清液为对照，利用上述的菌丝生长速率法测定不同贮藏时间后的发酵上清液的抑菌率。

本发明提供植物乳杆菌L.plantarum AB-4具有一般植物乳杆菌的特性，可作为发酵剂或添加剂，在发酵乳制品及其他健康保健食品中应用。

本发明的植物乳杆菌L.plantarum AB-4抑制肠道致病菌，改善宿主的肠内微生物环境，具有整肠效果。本发明的植物乳杆菌L.plantarumAB-4具有耐过氧化氢酶和蛋白酶的稳定性，能存活于包括人在内的动物的胃肠器官内，从而对宿主的健康有利的微生物。本发明的植物乳杆菌L.plantarum AB-4是具有益生菌活性的益生菌，当以干燥的细胞形态或发酵产物形态用于人或动物的情况下，能够对宿主的肠道菌群产生有利的影响。

上述用于预防和治疗肠道疾病的组合物中含有的植物乳杆菌L.plantarum AB-4能够以活菌体或死菌体方式存在，但是优选为以活菌体方式存在。一般活菌体具有治疗并改善由肠道菌群的异常发酵而引起的诸多症状的效果，用于人以及动物时，能够密集、停留在肠内的消化管道壁上，从而起到使有害菌不能够停留的作用，并且产生乳酸来降低肠内的pH值，抑制有害细菌的繁殖。并且，所用的活菌体生成细菌素和过氧化物，从而能够抑制病原菌的繁殖，对负责吸收营养成分的肠绒毛的活动起到帮助作用。此外，能够生成帮助吸收、利用营养素的物质，对于动物来说改善其饲料转化率，还能够产生一种能够中和病原菌产生的毒性物质的物质。

对于上述本发明的用于预防或治疗肠道疾病的组合物的给药方式没有特别限定，但是优选为经口给药。虽然给药量根据肠道疾病的种类、疾病程度、年龄、性别、人种、治疗或预防目的等有所不同，但是一般情况下以成人为基础。

制备成上述各个剂型时，可以加入各个剂型的制备所需的并在药剂学可接受的载体或添加剂来制备。制备成具有典型的用于经口给药的剂型时，上述载体可以使用选自稀释剂、润滑剂、粘结剂、崩解剂、甜味剂、稳定剂以及防腐剂中的一种或多种，作为添加剂可以使用选自香料、维生素类以及抗氧化剂

上述载体以及添加剂只要是药剂学上允许使用的均可，优选地，作为稀释剂具体有乳糖、玉米淀粉、大豆油、微晶纤维素或甘露醇等，作为润滑剂有硬脂酸镁或滑石粉，作为粘合剂有聚乙烯吡咯烷酮或羟丙基纤维素。此外，优选地，作为崩解剂有羧甲基纤维素钙、羧基乙酸淀粉钠、波拉克林钾或交联聚维酮，作为甜味剂有白糖、果糖、山梨醇或阿斯巴甜，作为稳定剂有羧甲基纤维素钠、环糊精、白蜡或黄原胶，作为防腐剂有对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸丙酯或山梨酸钾。

上述本发明的组合物可以作为食品使用。例如发酵乳制品及其他健康保健食品中，还包括人们每日经常摄取的一般的食品。用于保健功能性食品的情况下，可以和食品学上允许的载体或添加剂一起制备成本技术领域公知的常规保健功能性食品的剂型，作为所述保健功能性食品例如可以制备成散剂、颗粒剂、片剂、胶囊剂、悬浮剂、乳剂、糖浆剂、液体剂、浸膏、茶、果冻或饮料等。上述食品学允许使用的载体或添加剂，根据需要制备的剂型可以选择使用在本技术领域允许使用的公知的任一载体或添加剂。

上述本发明的组合物还可以作为饲料添加剂或饲料来使用。上述饲料添加剂还可以使用包括选自柠檬酸、富马酸、己二酸、乳酸、苹果酸等有机酸；或膦酸钠、磷酸钾、酸性焦磷酸盐、聚磷酸盐(聚合磷酸盐)等磷酸盐；或多元酚、儿茶酸、α-生育酚、迷迭香提取物、维生素C、绿茶提取物、甘草提取物、壳聚糖、鞣酸、植酸等天然抗氧化剂中的一种或多种。作为饲料使用的情况下，可以将上述组合物制备成常规饲料形态，可以包括常规饲料成分。

上述植物乳杆菌AB-4还可制备为用于抑制甜瓜枯萎病菌和甜瓜甜瓜疫霉菌的组合物，其中植物乳杆菌AB-4以活菌或发酵制品的作为组合物的活性成分，并配合农业上允许使用的载体或助剂，制成适合农业使用的制剂。

本发明的植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)AB-4，已于2014年9月15日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物菌种保藏中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏号为CGMCC No.9656。

【附图说明】

图1L.plantarum AB-4菌落形态图片

图2L.plantarum AB-4菌体显微镜图片(X1000)

图3L.plantarum AB-4的系统发育树状图

图4L.plantarum AB-4的MRS发酵上清液在不同浓度时的抑菌率

图5L.plantarum AB-4的不同培养时间的发酵上清液抑菌率

图6L.plantarum AB-4不同温度处理后的抑菌率

图7L.plantarum AB-4不同的pH的下的抑菌率

图8L.plantarum AB-4经蛋白酶处理后的抑菌率

图9L.plantarum AB-4常温贮藏后的抑菌率

【具体实施方式】

下面结合附图和实施例对本发明作进一步说明，以下实施例仅为说明性的，本发明并不受这些实例的限制。

本发明中的试验菌株：所用的347株植物乳杆菌由内蒙古农业大学“乳品生物技术与工程”教育部重点实验室分离、鉴定并保存，它们分别分离自内蒙古、新疆、青海、西藏、甘肃、云南、四川以及蒙古国地区的传统发酵食品中，347株植物乳杆菌的16S核糖体RNA信息都已上传到NCBI数据库。

尖孢镰刀菌甜瓜专化型(F.oxyspoorum f.sp.Melonis)(即甜瓜枯萎病菌)和甜瓜疫霉菌(Phytophthora drechsleri Tucker)均由内蒙古农业大学“乳品生物技术与工程”教育部重点实验室提供，面向所有的研究者开放。

实施例1：植物乳杆菌AB-4的筛选

将347株植物乳杆菌分别进行分离和鉴定，包括观察其菌株形态学特性并进行分子生物学鉴定，包括采用通用引物，正向引物是27f(对应于Escherichia coil 8-27位碱基)：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′；反向引物是1495r(对应于Escherichia coil 1495-1515位碱基)：5′-CTACGGCTACCTTGTTACGA-3′，以菌体DNA为扩增模板PCR扩增16S rRNA基因区域，扩增产物经纯化后进行16S rRNA基因序列测定，然后通过基因序列比对和系统发育关系研究进行种属鉴定，得到待筛选的菌株，冻存备用。

制备待筛选的菌株的发酵上清：把冻存的植物乳杆菌保藏液接种到5mL的MRS液体培养基中，震荡混匀，37℃恒温培养24h，以2％的接种量连续活化三代，取第三代植物乳杆菌的发酵液以4000×g离心10min，上清液经0.22μm微膜过滤，-20℃冰箱保存备用。

制备指示菌孢子悬液：将指示菌真菌：尖孢镰刀菌甜瓜专化型(F.oxyspoorum f.sp.Melonis)(即甜瓜枯萎病菌)和甜瓜疫霉菌(Phytophthora drechsleri Tucker)(均由内蒙古农业大学“乳品生物技术与工程”教育部重点实验室提供)分别接种在PDA培养基斜面上，在28℃培养箱内培养4-7d，观察其菌落形态及最佳培养时间，使指示菌活力恢复至正常，用PBS缓冲液(含有0.05wt％吐温80)清洗其培养基，分别清洗到90mL的PBS缓冲液中制成10⁵cfu/mL的甜瓜枯萎菌孢子悬液和甜瓜疫霉菌孢子悬液。

在每个平板上用8mm打孔器均匀打出2个小孔并标注植物乳杆菌的试验编号，每孔加入100μL相对应植物乳杆菌MRS发酵上清液，于4℃冰箱中扩散12h后37℃培养恒温48h，观测抑菌圈的大小。选取扩散孔周围有明显和较大抑菌圈(抑菌圈>30.00mm)的植物乳杆菌作为复筛菌株。

将待复筛的植物乳杆菌发酵上清液以5％(V/V)的比例加入到20mL的PDA培养集中，倒入灭菌培养皿内形成平板，等培养基凝固后，用打孔器(直径7mm)从培养4天的甜瓜枯萎菌落边缘制取菌饼，接种于含植物乳杆菌无细胞提取液的PDA培养基平皿中央，每皿接一个菌饼。以加入相同体积分数的无菌水为对照，每个处理设三次重复，置于28℃培养箱中恒温培养48h，测量实验组和对照组的菌落直径(d，单位为mm)，取平均值利用公式求抑菌率，综合打孔法和菌丝生长速率法筛选出对甜瓜枯萎菌具有最好抑菌活性的菌株。

同上述打孔法相同，用相同的方法检测对甜瓜疫霉菌的抑菌圈大小。以此选育出同时具有较强抗甜瓜枯萎活性和抗甜瓜疫霉菌性质稳定的植物乳杆菌，命名为植物乳杆菌L.plantarum AB-4。

实施例2：L.plantarum AB-4的MRS发酵上清液的抗菌的活性和抑菌率大小测定

在每个平板上用7mm打孔器均匀打出2个小孔并标注编号，每孔加入100μL该植物乳杆菌的MRS发酵上清液，于4℃冰箱中扩散12h后28℃培养恒温48h，观测抑菌圈的大小，用游标卡尺测量菌株的抑菌圈大小。

此外，将发酵上清液以5％(V/V)的比例加入到20mL的PDA培养集中，倒入灭菌的培养皿内形成平板，等培养基凝固后，在培养基中央用打孔器(直径7mm)打孔，再从培养4天的甜瓜枯萎菌落边缘制取菌饼，接种于含植物乳杆菌无细胞提取液的PDA培养基平皿中央，每皿接一个菌饼。以加入相同体积分数的无菌水为对照，每个处理设三次重复，置于28℃培养箱中恒温培养48h，测量实验组和对照组的菌落直径(d，单位为mm)，取平均值用下面的公式求抑菌率。

抑菌率＝(d对照-d处理)/(d对照-7)×100％

L.plantarum AB-4的MRS发酵上清液的抗甜瓜枯萎菌的抑菌效果如表1。

表1 L.plantarum AB-4抑制甜瓜枯萎菌的抑菌圈大小(mm)

从表1中可知，L.plantarum AB-4的MRS发酵上清液用打孔法测定的抑菌圈大小为36.16±5.68mm，对甜瓜枯萎菌的存活率大小为50.11±0.42％，在同类植物乳杆菌中属于最好的，该菌对甜瓜枯萎菌的抑菌活性在菌丝生长法和琼脂扩散法类似都表现出较强的抗甜瓜枯萎菌活性。

以相同方法测试对甜瓜疫霉菌的抑菌效果：在每个平板上用7mm打孔器均匀打出2个小孔并标注植物乳杆菌的菌号，每孔加入100μL该植物乳杆菌的MRS发酵上清液，于4℃冰箱中扩散12h后28℃培养恒温48h，观测抑菌圈的大小，用游标卡尺测量菌株的抑菌圈大小，如表2。

表2 L.plantarum AB-4抑制甜瓜疫霉菌的抑菌圈大小(mm)

可见，L.plantarum AB-4的MRS发酵上清液对甜瓜疫霉菌的抑菌圈大小为17.37±1.98mm，对甜瓜疫霉菌同样表现出较强的抑菌活性。

实施例3：L.plantarum AB-4的MRS发酵上清液在不同浓度时的抗甜瓜枯萎菌抑菌率

将植物乳杆菌的发酵上清液分别以体积分数为0.1％、0.5％、1％、5％和10％与20ml的PDA培养基混合，再分别倒入灭菌培养皿内，等培养基凝固后，利用上述的菌丝生长速率法计算不同浓度下植物乳杆菌发酵上清液的抑菌率。

由图4可知，L.plantarum AB-4的抑菌率随浓度的升高而增大，在其浓度为10％时抑菌率最大为64.01±0.34％，而在其浓度为0.1％时抑菌率最小为0.34±0.24％，证明菌株AB-4的抗甜瓜枯萎活性随浓度的增大而增大。

实施例4：L.plantarum AB-4培养时间对其抗甜瓜枯萎菌抑菌率的影响

将菌接种于MRS液体培养基中进行活化，活化2代后，将第3代的菌株分别接种于多个液体培养基中继续培养，从0h开始，每两小时取出三个平行样，在600nm下测定植物乳杆菌的OD值，并按照上述菌丝生长速率法测定各个不同时间点发酵上清液的抑菌效果。以培养时间为横坐标，以OD值和抑菌率为纵坐标绘制菌株生长曲线。

由图5可知，L.plantarum AB-4在0h到2h时OD值变化小，处于延滞期，这期间细胞的生理状态逐渐恢复，菌体开始生长；2h到14h时为对数生长期，OD值上升速度最快，此期间细胞分裂周而复始，处于积极生长的状态；从14h到24h为稳定期，细胞停止生长，菌体的生长状态稳定。同时，该菌株的抑菌率随着时间和OD值的增加成线性增长，当在稳定期18h左右时，该菌的发酵上清液的抑菌率达到最大值，抑菌率最大值为50.68±0.68％，在20h后稳定期将要结束时，抑菌率也呈下降趋势，这是由于菌体不再生长，而维持当前菌体的生存的物质不断在消耗，这些营养物质正是抑制甜瓜枯萎菌的主要物质，所以抑菌效果有所减弱。以上分析证明菌株L.plantarum AB-4在18h时有最高的抑菌活性。

实施例5：L.plantarum AB-4抑菌物质对温度的稳定性测定

将该植物乳杆菌的发酵上清液分别在50、60、70、80、100℃水浴中加热10min，以未处理的植物乳杆菌发酵上清液为对照，利用上述的菌丝生长速率法测定菌落直径并计算其抑菌率。

由图6可知，L.plantarum AB-4的发酵上清液经过不同温度处理后，L.plantarum AB-4对于甜瓜枯萎菌的抑菌率都大于46％，且随处理温度的不断升高，该菌对甜瓜枯萎病菌的抑菌活性与对照相比并无固定降低现象。仅在100℃处理10min后该菌的抑菌率显著降低(P>0.05)，但此时该菌的的抑菌率依旧可以达到46.13±0.19％，发生上述现象的原因可能是发酵液加热时抑菌物质发生热分解而产生了一些抑菌活性肽。以上分析证明发酵液中的抑菌物质对高温并不敏感，具有很好的热稳定性。

实施例6：L.plantarum AB-4的MRS发酵上清液在不同pH条件下对甜瓜枯萎菌的抑菌率

将筛选得到植物乳杆菌的发酵上清液分别用1mol/L的NaOH和1mol/L的HCl溶液调pH至2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0。以未处理的植物乳杆菌发酵上清液为对照，利用上述的菌丝生长速率法测定不同pH条件下发酵上清液对甜瓜枯萎病菌的抑菌率。

由图7可知，L.plantarum AB-4的无菌上清液在酸性条件下抑菌活性强，随着pH的升高，菌株代谢产物的抑菌活性逐渐减弱，抑菌率呈线性下降趋势，说明低pH值是植物乳杆菌代谢产物产生抑菌作用的必要条件。该菌的无菌上清液在pH为2.0的条件下抑菌率最大，三株植物乳杆菌的抑菌率均在60％以上；在pH为2-3时，三株植物乳杆菌的抑菌率均高于未经酸碱处理的对照抑菌率，说明酸性环境能增强其抑菌活性；在pH为10.0时，该菌的抑菌活性最小，证明碱性环境下抑菌物质可能已经被破坏，通过以上分析证明该菌株的抑菌活性在酸性条件下可达到最大值。

实施例7：L.plantarum AB-4的发酵上清经不同的蛋白酶处理后的抑菌率

将筛选得到的植物乳杆菌发酵上清液分别用1mol/L的NaOH溶液调节pH至7.0，分别加入1mg/mL胰蛋白酶、中性蛋白酶和蛋白酶K，于37℃水浴处理2h，然后在100℃下煮沸灭活3min终止酶反应，再将pH调节至原来发酵上清液的pH，以未处理的植物乳杆菌发酵上清作为对照，利用上述的菌丝生长速率法测定不同pH条件下发酵上清液对甜瓜枯萎病菌的抑菌率。

由图8可知，L.plantarum AB-4的发酵上清液经中性蛋白酶、蛋白酶K和胰蛋白酶处理后，该菌的抑菌率显著降低，但是并未完全消失，这说明该菌株的抑菌物质中除了有蛋白类的抑菌物质外还含有有非蛋白类的抑菌物质，其抑菌活性具有一定的蛋白酶稳定性。

实施例8：L.plantarum AB-4的发酵上清液常温贮藏后的抑菌率

将筛选得到菌株的发酵上清液分别在常温25℃下放置3d、5d、10d、15d、20d，以未处理的植物乳杆菌发酵上清液为对照，利用上述的菌丝生长速率法测定不同贮藏时间下的下发酵上清液对甜瓜枯萎病菌的抑菌率。

由图9可知，该菌的发酵上清液随着在常温下一段时间，抑菌率并无固定下降趋势，均在45％以上。菌株AB-4发酵液在常温下放置3d、5d、20d后抑菌率与对照相比差异不显著(P>0.05)，在常温下放置20d后抑菌率仍为47.16±0.10％，以上分析证明L.plantarum AB-4的发酵上清液的抗甜瓜枯萎菌在一但时间内具有保持稳定性的能力。

综上所述，本发明的植物乳杆菌L.plantarum AB-4表现出对甜瓜疫霉和甜瓜枯萎菌的有效抑制性；具有良好的热稳定性，其发酵上清在经过100℃处理后仍有良好的抑菌率；其发酵上清经中性蛋白酶、蛋白酶K和或胰蛋白酶酶解处理后仍具有一定的抑菌活性；其发酵上清具有耐贮藏特性，在常温贮藏20d后仍具有良好的抑菌活性。

Claims (9)

1.一株具有抗菌活性的植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)AB-4，已于2014年9月15日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物菌种保藏中心，保藏号为CGMCC No.9656。

2.权利要求1所述的植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)AB-4在抗甜瓜枯萎病菌中的应用。

3.权利要求1所述的植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)AB-4在抗甜瓜疫霉病菌中的应用。

4.权利要求1所述的植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)AB-4在农药和果蔬保鲜剂中的应用。

5.权利要求1所述的植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)AB-4在发酵制品中的应用。

6.根据权利要求5所述的应用，所述发酵制品是发酵乳。

7.权利要求1所述的植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)AB-4作为发酵剂或食品添加剂的应用。

8.权利要求1所述的植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)AB-4在制备预防或治疗肠道疾病的药物中的应用。

9.权利要求1所述的植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)AB-4在动物饲料中的应用。