CN108570422B

CN108570422B - 一株布氏乳杆菌菌株及其青贮饲料发酵剂

Info

Publication number: CN108570422B
Application number: CN201710138380.9A
Authority: CN
Inventors: 郝薇; 宋潇; 范彧; 解林奇; 王安如
Original assignee: Tianjin Changnong Science & Technology Co ltd; Beijing Dabeinong Technology Group Co Ltd
Current assignee: Tianjin Dabeinong Biotechnology Co ltd; Beijing Dabeinong Biotechnology Co Ltd
Priority date: 2017-03-09
Filing date: 2017-03-09
Publication date: 2021-11-05
Anticipated expiration: 2037-03-09
Also published as: CN108570422A

Abstract

本发明公开了一株布氏乳杆菌(Lactobacillus buchneri)菌株，其保藏号为CGMCC No.12850。该菌株具有优秀的抗氧化能力，耐酸，为异型发酵乳酸菌、能够产生大量乙酸，利用此菌株作为青贮饲料发酵剂可以提高饲料营养成分的稳定性，延长发酵后的青贮饲料的有氧稳定性，与其他菌株相比具有明显的优势，可作为青贮饲料发酵剂应用于畜禽养殖中，应用前景广阔。

Description

一株布氏乳杆菌菌株及其青贮饲料发酵剂

技术领域

本发明属于微生物益生菌应用技术领域，涉及一株布氏乳杆菌(Lactobacillusbuchneri)及其青贮饲料发酵剂。

背景技术

布氏乳杆菌作为一种异型发酵的乳酸菌，在青贮发酵过程中能将乳酸分解成乙酸和丙二醇，相对于乳酸而言，乙酸等挥发性脂肪酸是一种更有效的抗真菌的酸类物质，能够提高青贮饲料的有氧稳定性,尽管对有氧稳定性的提高程度不尽相同，但所表现的积极效应是稳定的。

实际利用布氏乳杆菌的过程中，在青贮过程中损失的饲料养分相对较多，这就要通过提高家畜生产性能来弥补异型发酵所产生的潜在的营养损失。因此，寻求一种具有优秀的抗氧化能力的，特别是具有优秀的超氧自由基清除能力的布氏乳杆菌，在提高青贮饲料有氧稳定性的同时，阻止或延缓饲料中某些营养物质氧化，提高饲料利用率，成为青贮添加剂菌种筛选及研发亟待解决的问题。

发明内容

为了解决上述问题，本发明提供一株布氏乳杆菌及其青贮饲料发酵剂。

本发明提供了一株布氏乳杆菌，该菌株从发酵成熟的玉米青贮中分离经过初筛复筛得到，在MRS培养基上的菌落形态为乳白色，直径0.1～0.5cm，菌落突起，湿润，边缘生长稀疏，有辐射状，无光泽，不透明。菌体杆状，单个或呈短链排列存在，革兰氏染色阳性菌株，无芽孢。经过糖发酵实验可以初步鉴定为布氏乳杆菌。

利用细菌通用引物对筛选出的菌株进行16s rDNA PCR扩增后鉴定，经NCBI序列比对结果相似性最高(100％)的是布氏乳杆菌，故分子鉴定分离到的菌株为布氏乳杆菌。

将该菌株命名为布氏乳杆菌DBNBS03(Lactobacillus buchneri DBNBS03)，于2016年8月15日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏编号为：CGMCCNo.12850。

本发明还提供包含该布氏乳杆菌的青贮饲料发酵剂。

在本发明一个实施方案中，所述青贮饲料发酵剂为菌粉，所述菌粉还含有冻干保护剂。

其中，所述的冻干保护剂含有20％的脱脂奶粉、5％的蔗糖、1％的维生素C和1％的谷氨酸钠。

其中，所述布氏乳杆菌的含量为3.5×10¹⁰CFU/g。

本发明还提供所述布氏乳杆菌的发酵方法，其包括如下步骤：按体积比为1％-5％的接种量向发酵培养基中接入培养16-22h的所述布氏乳杆菌的种子液，发酵过程中控制pH7.0-7.5，发酵温度37℃，转速80rpm，通气比1:0.4，罐压0.05MPa。

其中，所述的发酵培养基含有下述重量百分比的组分：蛋白胨1％，牛肉膏1％，酵母膏0.5％，柠檬酸氢二铵0.2％，葡萄糖2％，吐温80 0.1％，乙酸钠0.5％，磷酸氢二钾0.2％，硫酸镁0.058％，硫酸锰0.025％。

本发明的布氏乳杆菌用于青贮饲料发酵剂中，主要用于青贮饲料中添加的发酵剂。

本发明还提供一种青贮发酵方法，将所述的布氏乳杆菌菌粉按30g～50g菌粉/吨青贮原料的比例，用自来水溶解后，均匀喷洒在青贮原料中，真空密封，置于室温阴凉处，发酵30天以上。

本发明的布氏乳杆菌DBNBS03，该菌株具有优秀的抗氧化能力，耐酸，为异型发酵乳酸菌、能够产生大量乙酸，利用此菌株作为青贮饲料发酵剂可以提高饲料营养成分的稳定性，延长发酵后的青贮饲料的有氧稳定性，与其他菌株相比具有明显的优势，可作为青贮饲料发酵剂应用于畜禽养殖中，应用前景广阔。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

实施例1布氏乳杆菌DBNBS03的筛选

1、初筛

采集发酵成熟的玉米青贮及苜蓿青贮样品20份，分别称取10g样品，加入90mL无菌水制成菌悬液，于180r/min振荡30min，梯度稀释至合适梯度，涂布于MRS培养基上，培养获得75株乳酸菌。

MRS液体培养基的制作方法是：蛋白胨10.0g，牛肉膏10.0g，酵母膏5.0g，柠檬酸氢二铵2.0g，葡萄糖20.0g，吐温80 1.0mL，乙酸钠5.0g，磷酸氢二钾2.0g，硫酸镁0.58g，硫酸锰0.25g，pH6.2～6.6，蒸馏水1000mL，高压蒸汽灭菌后备用。

MRS固体培养基的制作方法是：蛋白胨10.0g，牛肉膏10.0g，酵母膏5.0g，柠檬酸氢二铵2.0g，葡萄糖20.0g，吐温80 1.0mL，乙酸钠5.0g，磷酸氢二钾2.0g，硫酸镁0.58g，硫酸锰0.25g，琼脂2％，pH6.2～6.6，蒸馏水1000mL，高压蒸汽灭菌后备用。

2、复筛

(1)布氏乳杆菌的筛选

将初筛得到的菌落分别接种于糖发酵培养基中，布氏乳杆菌可以分解葡萄糖产酸产气、可以分解麦芽糖、果糖、木糖、阿拉伯糖、松三糖、蜜二糖。不能分解乳糖、甘露醇、纤维二糖、半乳糖、山梨醇、甘露糖、棉籽糖、山梨糖、水杨苷、七叶苷、淀粉。培养获得布氏乳酸菌15株。

糖发酵培养基的配制方法是：蛋白胨1％，酵母膏0.5％，吐温80 0.1％，盐溶液A(磷酸二氢钾10g，磷酸氢二钾10g蒸馏水100ml)0.5％(体积比)，盐溶液B(七水硫酸镁11.5g，二水硫酸锰2.4g，七水硫酸亚铁0.68g，蒸馏水100ml)0.5％(体积比)。以上成分溶解后调pH至6.8～7.2，分装试管。高压灭菌121℃20～30min。阿拉伯糖、木糖、核糖、葡萄糖、甘露糖、果糖、半乳糖、蔗糖、麦芽糖、纤维二糖、乳糖、覃糖、棉籽糖、松三糖、淀粉、菊粉、甘露糖、山梨醇、肌醇、七叶苷、水杨苷、扁桃苷、葡萄糖酸钠各10克，将以上各糖配制成10％水溶液，经过滤灭菌后用无菌操作加到无菌基础培养基中。

(2)耐酸能力

配制不同pH的MRS液体培养基，将上述MRS液体培养基用0.1mol/L的盐酸分别调节pH值至3.5、4.0、4.5、5.0、5.5。将筛选获得的布氏乳杆菌接种到不同pH的MRS培养基中，37℃静置培养24小时，稀释涂布平板法计数。其中，菌株DBNBS03具有较强的耐酸性，在pH为3.5的MRS培养基中仍能够检测出存活的布氏乳杆菌，存活率约为11.7％。

(3)产酸能力

测定有机酸使用采用高效液相色谱同时定量法。

仪器：采用岛津10A高效液相色谱仪，岛津SPD-10A检测器。色谱条件：Shodex KC-811色谱柱(8mm×300mm)，3mM高氯酸为流动相，检测波长210nm，流速1mL/min，进样量5μL，柱温50℃。有机酸标准溶液的配制：分别准确称取乳酸、乙酸1.1765g、0.05050g，用超纯水定溶于25mL容量瓶中，配制乳酸、乙酸标准母液，再分别稀释为相应浓度的标准液，于4℃下冷藏备用。样品的制备：将培养该布氏乳杆菌的MRS培养基8000rpm离心10分钟后，用0.45nm滤膜过滤，浸提液待机分析。此菌株和实验室其他有效菌株及某些国内外产品分离菌株(国内是从宝来利来某产品分离得到的，命名BL-1，国外是从拉曼某产品分离得到的，命名为LM-1)的产酸能力比较如下表1所示：

表1：乳酸菌菌株产酸能力测定

通过表1可知，DBNBS03与国内外部分产品及实验室之前所筛选出的乳酸菌菌株相比能够产生更多的乙酸，当其作为青贮饲料发酵剂作用于青贮时，青贮饲料中会产生大量乙酸。乙酸具有抗真菌作用，其含量的增加能够抑制青贮饲料中酵母的生长繁殖，有效防止或延缓青贮饲料有氧变质的发生。

(4)菌株鉴定

利用细菌通用引物对筛选出的菌株进行16s rDNA PCR扩增后鉴定，经NCBI序列比对，DBNBS03结果相似性最高(100％)的为布氏乳杆菌，故分子鉴定DBNBS03为布氏乳杆菌。

(5)抑菌能力测定

指示菌：大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、单核细胞增生李斯特氏菌、沙门氏菌、荧光假单胞菌、葡萄酒酵母、红酵母、黑曲霉、灰绿青霉。乳酸菌选用MRS培养基，单核细胞增生李斯特氏菌选用TSA+YE培养基，酵母和霉菌选用YPD培养基，其他指示菌选择营养肉汤培养基，用麦氏比浊法制成1×10¹⁰cfu/mL的菌悬液,用于本试验；

制备乳酸菌菌液：初筛分离得到的布氏乳杆菌DBNBS03，以5％接种量接种于MRS液体培养液中，37℃，静止培养至稳定期，取发酵液12000rpm离心10min，上清液用0.22μm滤膜过滤，除去菌体及其他杂质上清液备用；

抑菌活性测定：抑菌活性测定采用琼脂扩散法，1.2％的琼脂，按每平皿10mL倾倒在无菌平皿中晾干；制备含0.7％琼脂适宜指示菌生长的软琼脂培养基，冷至50℃左右，每100mL接入0.6mL过夜培养的指示菌菌液，在底层有琼脂的平皿上倾倒6mL含有指示菌的软琼脂培养基，晾干；用打孔器在涂有指示菌的培养基上打孔，孔直径6mm；在孔中加入50μL发酵上清液，超净工作台上放置3h；置于适宜培养条件下进行培养，测量抑菌圈大小并记录。

表2：布氏乳杆菌DBNBS03对指示菌的抑制作用

通过表2可知，布氏乳杆菌菌株DBNBS03对大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、单核细胞增生李斯特氏菌、荧光假单胞菌、酿酒酵母以及霉菌的生长都有显著的抑制作用，布氏乳杆菌能够产生细菌素或类细菌素，不仅能抑制革兰氏阳性菌，而且对革兰氏阴性菌和真菌也有抑制作用，可以有效抑制常见的病原菌，并且能够有效抑制青贮饲料中酵母菌的增殖，有助于提高青贮饲料的有氧稳定性。

(6)抗氧化能力测定

布氏乳杆菌菌株DBNBS03、宝来利来产品中菌株BL-1、拉曼产品中菌株LM-1液体活化后，以质量分数为3％接种量接种于MRS液体培养基，37℃静置培养18h，3000r/min，离心15min，收集菌体。离心后的菌体用pH值为7.4的磷酸缓冲溶液(PBS)洗涤3次，重新悬浮于PBS缓冲溶液中，调整菌数至10⁹cfu/ml，将菌体液超声波冰浴破碎，细胞残骸于10000r/min离心10min，上清液即为无细胞提取物。

二苯代苦味酰基(DPPH·)自由基测定

DPPH·溶于无水乙醇，反应时1ml提取液加1ml浓度为0.2mmol/L的DPPH·，室温下静置30min后，在517nm处测吸光度变化。

DPPH·的清除率(％)＝[1－(A1－A2)/A3]×100

式中：A1表示未加样品的DPPH溶液的原始吸光度；A2表示样品在测定波长时的吸光度；A3表示加样后DPPH溶液的吸光度。超氧阴离子自由基(O2·)测定

反应体系包括浓度为150mmol/L的Tris－HCl(pH8.2)、浓度为3mmol/L的二乙三胺五乙酸、浓度为1.2mmol/L邻苯三酚和0.5ml样品，总反应体积为3.5ml。25℃恒温水浴反应10min，测OD325。

O2·清除率(％)＝[1－(A11－A10)/(A01－A00)]×100

式中:A00为不含样品和邻苯三酚；A01为不含样品，含邻苯三酚；A10为含样品，不含邻苯三酚；A11为含样品和邻苯三酚。

表3不同菌株对DPPH和超氧阴离子自由基(O2·)的清除作用(％)

DPPH·是一种稳定的以氮为中心的自由基，若能清除它，则表示菌株具有降低羟自由基、烷自由基或超氧自由基等自由基的有效浓度。超氧阴离子自由基(O2·)是第一氧自由基，可以通过一系列反应生成其它氧自由基，具有重要的生物功能。研究结果表明，DBNBS03菌株的发酵上清液清除DPPH·的能力最强，清除率为90.9％，发酵液上清和无细胞提取物对O2·的清除作用分别为15.9％及10.4％，其清除自由基的作用明显高于其它菌株。

实施例2布氏乳杆菌的发酵和菌粉的制备

布氏乳杆菌DBNBS03的发酵：所用发酵培养基是按重量百分比：蛋白胨1％，牛肉膏1％，酵母膏0.5％，柠檬酸氢二铵0.2％，葡萄糖2％，吐温80 0.1％，乙酸钠0.5％，磷酸氢二钾0.2％，硫酸镁0.058％，硫酸锰0.025％配制的。按体积比为3％的接种量向发酵培养基中接入培养18h的所述布氏乳杆菌的种子液，发酵过程中控制pH7.2，发酵温度37℃，转速80rpm，通气比1:0.4，罐压0.05MPa。培养至16h为发酵终点，放罐，得到布氏乳杆菌DBNBS03活菌数为5.5×10⁹CFU/mL。

所得发酵液经离心得到菌体后，按菌体：保护剂溶液＝1:10加入保护剂溶液(20％的脱脂奶粉、5％的蔗糖、1％的维生素C、1％谷氨酸钠)，充分混匀。将上述混匀后的菌液置于冷冻干燥机中进行冻干，得到冻干后的菌粉，活菌数约为3.5×10¹⁰CFU/g。

实施例3布氏乳杆菌DBNBS03作为青贮饲料发酵剂的应用

本实验研究了不同布氏乳杆菌菌株对青贮发酵品质和有氧稳定性的影响。选择了宝来利来产品中菌株BL-1、拉曼产品中菌株LM-1和本发明的布氏乳杆菌DBNBS03进行了比较。

试验处理：1)对照组：不添加任何发酵剂，青贮自然发酵；2)DBNBS03组：实验室发酵生产的菌粉作为发酵剂，用量：30g菌粉/吨青贮；3)BL-1组：用BL-1菌株制作的菌粉作为发酵剂，用量：30g菌粉/吨青贮；4)LM-1组：用LM-1菌株制作的菌粉作为发酵剂，用量：30g菌粉/吨青贮。

试验方法：将不同处理的菌粉按比例用自来水溶解在不同的喷雾器中，均匀喷洒在青贮中，真空密封，置于室温阴凉处，在发酵30天时开袋检测青贮发酵品质、营养成分以及好氧稳定性。

表4不同布氏乳杆菌对青贮发酵品质的影响

注:同行不同字母表示差异显著

由表4可看出，添加DBNBS03菌株的青贮乙酸含量为最高，并且明显高于对照组，而氨态氮含量明显低于其他组，这是因为添加DBNBS03菌株的青贮中较高浓度的乙酸抑制了青贮中的有害微生物对青贮中蛋白质的分解，从而减少了氨态氮的生成。

表5不同布氏乳杆菌对青贮营养成分的影响

注:同行不同字母表示差异显著

由表5可知，添加乳酸菌的各个处理组与对照组青贮相比，粗蛋白、粗脂肪含量均无显著差异。而相比于其他处理组，添加DBNBS03菌株的青贮饲料在青贮过程中干物质回收率与对照组无显著差异，且显著高于其他两组乳酸菌处理组；添加DBNBS03菌株的青贮饲料干物质消化率为47.85％DM，与对照组差异不显著，而其他两组乳酸菌添加组青贮的干物质消化率均显著降低。

表6不同布氏乳杆菌对青贮开封后有氧稳定性的影响

从表6可以看出，相比于其他处理组，添加DBNBS03菌株的青贮能够明显延长青贮从开封到开始升温的时间和从开始升温到变质的时间。由此可见，布氏乳杆菌DBNBS03作为一种发酵剂用于青贮发酵不仅能够显著提高有氧稳定性，同样具有良好的抗氧化性能，具有良好的应用价值。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims

1.一株布氏乳杆菌(Lactobacillus buchneri)菌株，其保藏号为CGMCC No.12850。

2.含有权利要求1所述菌株的青贮饲料发酵剂。

3.如权利要求2所述的青贮饲料发酵剂，其特征在于，其为菌粉，所述菌粉还含有冻干保护剂。

4.如权利要求3所述的青贮饲料发酵剂，其特征在于，所述的冻干保护剂含有20％的脱脂奶粉、5％的蔗糖、1％的维生素C和1％的谷氨酸钠。

5.如权利要求2-4任一项所述的青贮饲料发酵剂，其特征在于，所述布氏乳杆菌的含量为1×10¹⁰～1×10¹¹CFU/g。

6.一种权利要求1所述的布氏乳杆菌菌株的发酵方法，其包括如下步骤：按体积比为1％-5％的接种量向发酵培养基中接入培养16-22h的所述布氏乳杆菌的种子液，发酵过程中控制pH7.0-7.5，发酵温度37℃，转速80rpm，通气比1:0.4，罐压0.05MPa。

7.如权利要求6所述的布氏乳杆菌菌株的发酵方法，其特征在于，所述的发酵培养基含有下述重量百分比的组分：蛋白胨1％，牛肉膏1％，酵母膏0.5％，柠檬酸氢二铵0.2％，葡萄糖2％，吐温80 0.1％，乙酸钠0.5％，磷酸氢二钾0.2％，硫酸镁0.058％，硫酸锰0.025％。

8.一种青贮饲料发酵方法，其特征在于，将权利要求1所述的布氏乳杆菌的菌粉按30g～50g菌粉/吨青贮原料的比例，用自来水溶解后，均匀喷洒在青贮原料中，真空密封，置于室温阴凉处，发酵30天以上。