CN108179127B - 一株用于发酵青绿饲料的粪肠球菌及其菌剂的生产方法 - Google Patents

一株用于发酵青绿饲料的粪肠球菌及其菌剂的生产方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一株用于发酵青绿饲料的粪肠球菌及其菌剂的生产方法，其中，该粪肠球菌的保藏编号为CGMCC No.14617；该生产方法包括以下步骤：(1)将菌株接种在种子培养基中，36℃～38℃培养24h；(2)将发酵的种子接入发酵培养基中，36℃～38℃培养24h；(3)将发酵液离心，混入冻干保护剂，冷冻干燥。本发明的有益之处在于：(1)该粪肠球菌可以有效改善青贮饲料的饲用品质，提高青贮饲料的感官评价，调节青贮饲料的pH值，控制氨态氮与总氮的比值，增加乳酸含量；(2)该生产方法发酵时间短，活菌数高，发酵24h后活菌数可以达到2000亿/克以上，冻干后活菌数可以达到400亿/克以上。

Description

一株用于发酵青绿饲料的粪肠球菌及其菌剂的生产方法
技术领域
本发明涉及一株菌株及其菌剂的生产方法，具体涉及一株用于发酵青绿饲料的粪肠球菌及其菌剂的生产方法，属于微生物技术领域。
背景技术
青贮饲料是指：含水率为65％～75％的青绿饲料经切碎后，在密闭缺氧的条件下，通过厌氧乳酸菌的发酵作用，抑制各种杂菌的繁殖，而得到的一种粗饲料。
青贮饲料气味酸香、柔软多汁、适口性好、营养丰富、利于长期保存，是家畜优良饲料来源，主要用于喂养反刍动物，比新鲜饲料耐储存，营养成分强于干饲料。
发明内容
本发明的第一个目的在于提供一株用于发酵青绿饲料、可有效改善青贮饲料的饲用品质、提高青贮饲料的感官评价、调节青贮饲料的pH值、控制氨态氮与总氮的比值、增加乳酸含量的菌株。
本发明的第二个目的在于提供含有上述菌株、发酵时间短、活菌数高的菌剂的生产方法。
为了实现上述第一个目标，本发明采用如下的技术方案：
一株用于发酵青绿饲料的菌株，其特征在于，分类命名为粪肠球菌(Enterococcusfaecalis)，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCNo.14617，保藏日期为2017年09月15日。
为了实现上述第二个目标，本发明采用如下的技术方案：
含有前述菌株的菌剂的生产方法，其特征在于，包括以下步骤：
Step1：将菌株接种在种子培养基中，36℃～38℃培养24h；
Step2：将发酵的种子接入发酵培养基中，控制pH值5.0～9.0，发酵温度30℃～40℃，转速200rpm～300rpm，通气比1:0.3～1:0.8，罐压0.02MPa～0.07MPa，培养24h；
Step3：将所得发酵液离心，按菌体：冻干保护剂质量比为1:1～4的比例混合均匀；
Step4：将混合后的菌体置于冷冻干燥机中进行冷冻干燥得到菌粉。
前述的生产方法，其特征在于，在Step1中，前述种子培养基为TSA培养基。
前述的生产方法，其特征在于，在Step2中，前述发酵培养基为：按质量百分比计，胰蛋白胨1.5％、大豆蛋白胨0.5％、牛肉膏1％、酵母膏0.5％、柠檬酸氢二铵0.2％、葡萄糖2％、氯化钠0.5％，pH自然。
前述的生产方法，其特征在于，在Step3中，前述冻干保护剂为：按重量比计，麦芽糊精：脱脂奶粉：葡萄糖＝4～8：1～6：1～3。
本发明的有益之处在于：
1、本发明提供的保藏编号为CGMCC No.14617的粪肠球菌(Enterococcusfaecalis)，可以有效改善青贮饲料的饲用品质，提高青贮饲料的感官评价，调节青贮饲料的pH值，控制氨态氮与总氮的比值，增加乳酸含量。
2、本发明提供的菌剂的生产方法，发酵时间短，活菌数高，发酵24h后活菌数可以达到2000亿/克以上，冻干后活菌数可以达到400亿/克以上。
具体实施方式
以下结合具体实施例对本发明作具体的介绍。
一、菌株的分离与筛选
我们将采集于诸城的青贮饲料样品，利用稀释分离培养的方法，涂布于TSA培养基上，在37℃厌氧培养罐中培养24h，然后从中挑选出了生长较快、菌落整齐单一的一株。
随后我们利用16S rRNA序列同源性分析技术对该株菌进行了分子鉴定，并将得到的序列在NCBI中进行了比对，比对结果显示：我们挑选的菌株与粪肠球菌(Enterococcusfaecalis)的序列相似性为99％。
2017年09月15日，我们将该菌株送至中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)进行保藏，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCCNo.14617。
二、准备培养基
1、种子培养基
种子培养基为TSA培养基：按质量百分比计，胰蛋白胨1.5％、大豆蛋白胨0.5％、氯化钠0.5％、琼脂1.5％，pH自然。
2、发酵培养基
发酵培养基为新配方培养基：按质量百分比计，胰蛋白胨1.5％、大豆蛋白胨0.5％、牛肉膏1％、酵母膏0.5％、柠檬酸氢二铵0.2％、葡萄糖2％、氯化钠0.5％，pH自然。
我们在TSA培养基的基础上省去了琼脂，添加了牛肉膏、酵母膏、柠檬酸氢二铵和葡萄糖，营养更充分，粪肠球菌生长会更快，产量会更高。
三、生产菌剂
1、获得种子液
将菌株接种在种子培养基中，36℃～38℃培养24h。
在本实施例中，培养温度为37℃。
2、发酵培养
将发酵的种子接入发酵培养基中，控制pH值5.0～9.0，发酵温度30℃～40℃，转速200rpm～300rpm，通气比1:0.3～1:0.8，罐压0.02MPa～0.07MPa，培养24h。
在本实施例中，发酵条件为：pH值7.0，发酵温度37℃，转速220rpm，通气比1:0.5，罐压0.05MPa。
3、加入冻干保护剂
(1)确定冻干保护剂的配方
冻干保护剂为：按重量比计，麦芽糊精：脱脂奶粉：葡萄糖＝4～8：1～6：1～3。
Figure BDA0001569983560000041
Figure BDA0001569983560000051
将所得发酵液离心，按菌体：冻干保护剂质量比为1:1的比例混合均匀，然后将混合后的菌体置于冷冻干燥机中进行冷冻干燥得到菌粉。
对照组：不加冻干保护剂。
经检测，各组菌粉对应的活菌数如下：
活菌数
第1组 1060亿/克
第2组 1082亿/克
第3组 1100亿/克
第4组 1073亿/克
第5组 1042亿/克
对照组 500亿/克
由上表可知，麦芽糊精：脱脂奶粉：葡萄糖在4～8：1～6：1～3这个范围内，均可较好的保护菌体，其中，麦芽糊精：脱脂奶粉：葡萄糖＝6：3：2混合时，保护效果最好。
(2)确定冻干保护剂的用量
将所得发酵液离心，按菌体：冻干保护剂(麦芽糊精：脱脂奶粉：葡萄糖＝6：3：2)质量比为1:1～4的比例混合均匀，然后将混合后的菌体置于冷冻干燥机中进行冷冻干燥得到菌粉，经检测，各组菌粉对应的活菌数如下：
菌体：冻干保护剂 活菌数
第1组 1:1 1100亿/克
第2组 1:2 700亿/克
第3组 1:3 560亿/克
第4组 1:4 420亿/克
由上表可知，菌体：冻干保护剂在1:1～4这个范围内，均可较好的保护菌体，考虑到冻干保护剂的使用成本，菌体：冻干保护剂＝1:1是最佳的使用方案。
(3)将菌体与冻干保护剂混合
在本实施例中，将菌体与冻干保护剂按质量比1:1的比例混合均匀，其中，冻干保护剂使用的是麦芽糊精：脱脂奶粉：葡萄糖＝6：3：2混合。
4、冷冻干燥
将混合后的菌体置于冷冻干燥机中进行冷冻干燥得到菌粉。
四、活菌数测定
样品1：发酵液离心后得到菌体，从中采集10g作为样品1。
样品2：冷冻干燥后得到菌粉，从中采集10g作为样品2。
将样品1和样品2分别进行稀释分离培养，涂布在MRS培养基上，培养24h进行活菌落计数。
Figure BDA0001569983560000061
Figure BDA0001569983560000071
由上表可知，两样品的活菌数均较高。
五、发酵青绿饲料
取两吨新鲜的、粉碎的玉米秸秆作为基质，向基质中喷洒1kg上述菌粉，然后放入青绿饲料发酵池中，密封发酵45d。
发酵结束后，将饲料搅拌均匀，取100g进行样品鉴定。
1、感官评价
颜色 气味 酸味 结构
黄绿色，有光泽 芳香酸味 浓 湿润、紧密
由上表可以看出，本发明提供的保藏编号为CGMCC No.14617的粪肠球菌(Enterococcus faecalis)可以提高青贮饲料的感官评价，使青贮饲料品相、卖相更好。
2、饲用品质
从奶牛场随机选择10头成年正常产奶，并且体重在500kg、日产奶量在20kg以上的泌乳牛，其中，5头作为实验组饲喂上述发酵饲料，5头作为对照组饲喂原始饲料。
每天测定平均日产奶量，连续测定7天，测定结果如下：
Figure BDA0001569983560000072
Figure BDA0001569983560000081
由上表可以看出，本发明提供的保藏编号为CGMCC No.14617的粪肠球菌(Enterococcus faecalis)可以有效改善青贮饲料的饲用品质，使青贮饲料更有营养，并且更易被吸收。
3、pH值、氨态氮与总氮比值、乳酸含量
pH值 氨态氮与总氮比值 乳酸含量
4.2 5.1％ 1.2％
由上表可以看出，本发明提供的保藏编号为CGMCC No.14617的粪肠球菌(Enterococcus faecalis)不仅可以调节(降低)青贮饲料的pH值，使青贮饲料不易被杂菌污染，有效保护了青贮饲料，而且可以控制氨态氮与总氮的比值(更低)，使青贮饲料蛋白质分解较少，有效保护了青贮饲料的营养，同时还可以增加乳酸含量，乳酸含量是评定青贮饲料品质的可靠指标，优质的青贮饲料中含较多的乳酸，可以提高口感和营养吸收。
需要说明的是，上述实施例不以任何形式限制本发明，凡采用等同替换或等效变换的方式所获得的技术方案，均落在本发明的保护范围内。

Claims (1)

1.含有用于发酵青绿饲料的粪肠球菌的菌剂的生产方法，其特征在于，包括以下步骤：
Step1：将粪肠球菌接种在种子培养基中，36℃～38℃培养24h；
Step2：将发酵的种子接入发酵培养基中，控制pH值5.0～9.0，发酵温度30℃～40℃，转速200rpm～300rpm，通气比1:0.3～1:0.8，罐压0.02MPa～0.07MPa，培养24h；
Step3：将所得发酵液离心，按菌体：冻干保护剂质量比为1:1的比例混合均匀；
Step4：将混合后的菌体置于冷冻干燥机中进行冷冻干燥得到菌粉，其中：
在Step1中，所述种子培养基为TSA培养基；
在Step2中，所述发酵培养基为：按质量百分比计，胰蛋白胨1.5％、大豆蛋白胨0.5％、牛肉膏1％、酵母膏0.5％、柠檬酸氢二铵0.2％、葡萄糖2％、氯化钠0.5％，pH自然；
在Step3中，所述冻干保护剂为：按重量比计，麦芽糊精：脱脂奶粉：葡萄糖＝4～8：1～6：1～3；
粪肠球菌保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCNo.14617，保藏日期为2017年09月15日。
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