CN101275158A - 优良粪肠球菌的筛选制备方法及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种优良粪肠球菌的筛选制备方法及其应用。粪肠球菌为肠球菌属中最常见的即为代表种，粪肠球菌生活在人体肠道里，通常对人体不仅无害而且有益。但它有时也会引发严重感染，并对抗生素有抵抗力。本发明将粪肠球菌进行反复培养和筛选，通过研究其形态特征、培养特征、生理生化反应、代谢产物、遗传性状及蛋白表达、遗传稳定性、中试生产指标等内容，优选出其中生命力旺盛、生长速度快、发酵单位高、发酵周期短、发酵产物含量高、生产适应性强的菌株作为生产菌种，并形成规模化生产。其发酵液具有调节免疫力功能、抗肿瘤等功能。

Description

优良粪肠球菌的筛选制备方法及其应用

技术领域

本发明涉及一种优良粪肠球菌的筛选制备方法及其应用。

背景技术

微生物是与人类关系密切的一类微小生物体，具有种类的多样性和功能的复杂性.在药物的研发中某些微生物发挥了十分重要的作用，微生物药物研发的主要环节包括菌种的选育，发酵工艺优化，提取与精制工艺的研究等。

早在十九世纪人们就发现被溶血性链球菌感染的癌症患者肿块自然消退的现象，人们先后发现很多微生物及其制剂有一定的药理活性。

肠球菌属在1984年从链球菌属中分离出来成为独立的新菌属，现根据DNA同源性，发现过去被划分为D群链球菌的肠球菌与链球菌属同源程度低，故将其列为肠球菌属，仍属链球菌科。依据Facklam和Collins的分类，肠球菌属内包括十二个种及一个变异株，它们是：粪肠球菌(E.faecalis)、屎肠球菌(E.faecium)、鸟肠球菌(E.avium)、酪黄肠球菌(E.casseliflavus)、坚忍肠球菌(E.durans)、鸡肠球菌(E.galinarum)、芒地肠球菌(E.mundii)、恶臭肠球菌(E.maladoratum)、希拉肠球菌(E.hirae)、孤立肠球菌(E.solitarius)、棉子糖肠球菌(E.raffinosus)、假鸟肠球菌(E.pseudoavium)、粪肠球变异株(E.faecalis var)。

粪肠球菌为肠球菌属中最常见的即为代表种，粪肠球菌又叫粪链球菌，菌形圆或椭圆，可顺链的方向延长，直径0.5-1.0微米，大多数成双或短链状排列，通常不运动。在丰富培养基上菌落大而光滑，直径1-2mm，全缘，罕见色素。其营养要求低，在普通营养琼脂上也可生长。能在10℃或45℃pH9.6或含6.5％NaCl肉汤培养基中生长，并能耐65℃30分钟。它可利用精氨酸为能源，发酵山梨醇，不发酵阿拉伯糖。在简单的培养基上生长不需叶酸。粪肠球菌生活在人体肠道里，通常对人体不仅无害而且有益。但它有时也会引发严重感染，并对抗生素有抵抗力。目前还没有文献报道粪肠球菌代谢产物具有一定的药理作用。

发明内容

本发明的目的是提供一种生命力旺盛、生长速度快、发酵单位高、发酵周期短、发酵产物含量高、生产适应性强的优良粪肠球菌的筛选制备方法。

本发明的另一目的是提供一种采用优良粪肠球菌的发酵液在医药领域的应用。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：

优良粪肠球菌的筛选制备方法，其特殊之处在于：所述的优良粪肠球菌的筛选方法如下：

在健康人肠道中采集标本，涂布在血平板上，37℃静置培养18-24小时，挑菌落周围无溶血圈的菌落，显微镜观察确认为粪肠球菌后，采用单菌落分离纯化；将分离得到的一系列粪肠球菌培养在下列培养基中：葡萄糖0.5％，胰胨0.4％，蛋白胨0.6％，酵母膏0.3％，牛肉膏0.5％，氯化钠0.5％，水100ml，pH7.2。37℃静置培养三日后，离心，将上清液或其稀释液叠加在含一定量抗血清的沉淀管中，一定时间内观察沉淀环的出现及环的厚薄，以判断菌株产生多肽的能力，选择产生多肽能力强的菌株；再将产生多肽能力强的菌株的菌液1ml注射于健康家兔皮内，观察红肿、溃疡的出现，判断菌株毒性大小；最终选择产生多肽能力强，且对实验动物毒性低，细菌及菌落形态较典型的粪肠球菌作为生产菌株；该菌种已于2007年10月19日由中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，编号为CGMCCNo.2220；

所述的优良粪肠球菌的发酵制备工艺如下：

(一)发酵过程：

所述发酵过程的发酵培养基是：牛肉膏0.2-0.8％，酵母膏0.2-0.8％，蛋白胨0.3-0.8％，葡萄糖0.1-0.9％，氯化钠0.2-0.6％；经灭菌温度105-125℃，时间30分钟，蒸汽压力0.11-0.13Mpa灭菌后备用。

(1).一级发酵罐：

将优良的摇瓶菌种在无菌条件下按1-10％接种量接入灭菌后的一级发酵罐。罐压不超过0.02Mpa，通气量以能翻动培养液为宜，连续充分搅拌，在25-40℃恒温培养10-50小时；

(2).二级发酵罐：

将一级发酵培养液在无菌条件下按2-20％接种量接入灭菌后的二级发酵罐，罐压不超过0.02Mpa，通气量以能翻动培养液为宜，连续充分搅拌；在25-35℃恒温培养50-100小时。灭活采用加温使发酵液温度达到70-120℃，保温20-60分钟，冷却静置后放罐。

(二)提纯过程：

(1).发酵液浓缩：将发酵后的发酵液用浓缩器进行浓缩，使浓缩液体积与发酵液体积比控制在1∶15-25，控制pH 7.0-7.4制成发酵浓缩液。

(2).浓缩液的精制提纯：浓缩液按珍珠岩1-2.0％及活性炭2-4.0％加入进行精制提纯，搅拌10-20分钟，过滤后再抽滤提纯，制成发酵精制液。

(3).浓缩液加入80-99％乙醇，体积量比控制在1∶1.5-1∶5.5或酌情而定。充分搅拌静置后，离心去除上清液，沉淀用蒸馏水溶解，调pH5.0，得到溶解液并将溶解液静置。再将溶解液离心去除杂质得到上清液，准确量取清液体积，按上清液体积计算出所需乙醇量，调pH值，将乙醇缓慢加入到上清液中，并充分搅拌，静置后离心去除上清液得到沉淀物。沉淀物再用蒸馏水溶解，调pH，离心，上清液再加乙醇沉淀。这样的工艺反复操作至中间检测合格为止，得到的沉淀物真空干燥3-8小时，即得到粪肠球菌生产的发酵物。

优良粪肠球菌的应用，其特殊之处在于：根据优良粪肠球菌发酵制备的发酵液，是将粪肠球菌进行反复培养，筛选出生命力旺盛、生长速度快、发酵单位高、发酵周期短、发酵产物含量高、生产适应性强的菌株作为生产菌种，经一级发酵和二级发酵，将发酵液精制提纯得到的；

所述的发酵液具有调节免疫力功能、抗肿瘤的功能、抗炎功能、刺激骨髓造血干细胞的功能、降血脂功能、降血糖功能、抗氧化功能、改善记忆功能、缓解视疲劳功能、促进排铅功能、清咽功能、降血压功能、改善睡眠功能、促进泌乳功能、缓解体力疲劳功能、提高缺氧耐受力功能、对辐射危害有保护功能、减肥功能、改善生长发育功能、增加骨密度功能、改善营养性贫血功能、对化学性肝损伤有保护功能、祛痤疮功能、祛黄褐斑功能、改善皮肤水分功能、改善皮肤油份功能、调节肠道菌群功能、促进消化功能、通便功能、对胃粘膜损伤有保护功能等多方面的作用。

本发明的优点是：将粪肠球菌进行反复培养和筛选，通过研究其形态特征、培养特征、生理生化反应、代谢产物、遗传性状及蛋白表达、遗传稳定性、中试生产指标等内容，优选出其中生命力旺盛、生长速度快、发酵单位高、发酵周期短、发酵产物含量高、生产适应性强的菌株作为生产菌种，并形成规模化生产。

附件材料1：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏菌种保藏受理通知书复印件。保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期：2007年10月19日，保藏编号：2220，分类命名：粪肠球菌Enterococcus faecalis。

附件材料2：粪肠球菌的检测鉴定报告。

具体实施方案

一、菌种选育

在健康人肠道中采集标本，涂布在血平板上，37℃静置培养18-24小时，挑菌落周围无溶血图的菌落，显微镜观察确认为粪肠球菌后，采用单菌落分离纯化。将分离得到的一系列粪肠球菌培养在下列培养基中：葡萄糖0.5％，胰胨0.4％，蛋白胨0.6％，酵母膏0.3％，牛肉膏0.5％，氯化钠0.5％，水100ml，pH7.2。37℃静置培养三日后，离心，将上清液或其稀释液叠加在含一定量抗血清的沉淀管中，一定时间内观察沉淀环的出现及环的厚薄，以判断菌株产生多肽的能力，选择产生多肽能力强的菌株。再将产生多肽能力强的菌株的菌液1ml注射于健康家兔皮内，观察红肿、溃疡的出现，判断菌株毒性大小。最终选择产生多肽能力强，且对实验动物毒性低，细菌及菌落形态较典型的粪肠球菌作为生产菌株。该菌种已于2007年10月19日由中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，编号为CGMCCNo.2220。

筛选出的粪肠球菌的特征是：1.苹兰氏染色：革兰氏染色呈阳性“G⁺”2.形态特征：菌株细胞呈球形或卵圆形，细胞大小为0.6～0.7μm×1.6～1.8μm，细胞生长中度，不太饱满。3.培养特征：菌株在血平板或有机物平板上菌落有圆形，也有小颗粒状，有突起，有光泽，略有粘性，半透明，生长中度，菌膜较薄，乳脂色，无色素产生。4.生理生化特征：见表1、2

                表1、菌株的生理生化特征

                                               

特征                        菌株

                                                

溶血现象                    无溶血现象

10℃生长                    +

45℃生长                    +

3％NaCL生长                 -

5％NaCL生长                 -

6.5％NaCL生长               -

接触酶反应                  -

牛奶凝固                    +

牛奶胨化                    +

明胶液化                    -

胆盐                        -

V-P反应                     -

吲哚反应                    -

七叶灵反应                  -

精氨酸水解酶产生            -

B-葡萄糖酸苷酸酶产生        +

                                         

表2、菌株的糖利用试验

本发明优选出其中生命力旺盛、生长速度快、发酵单位高、发酵周期短、发酵产物含量高、生产适应性强的菌株作为生产菌种，并形成规模化生产(表3)。

表3粪肠球菌菌株发酵周期及多肽含量情况

二、具体制备工艺

(一)菌种制备：

以经过精心选育的粪肠球菌作为生产菌种。

1.斜面种子制备：

按配比配制斜面培养基：牛肉膏0.2-0.8％，酵母膏0.2-0.8％，蛋白胨0.3-0.8％，葡萄糖0.1-0.8％，氯化钠0.2-0.6％，琼脂1-5％，绵羊血5-10％；pH 7.0-7.4；斜面培养基经在温度105-125℃，时间20-30分钟，蒸汽压力0.11-0.13Mpa灭菌后待用；启封菌种冷冻管，在无菌条件下接入血斜面，接种后置25-40℃恒温培养24-30小时。

2.摇瓶种子液制备：

按配比配制摇瓶培养基：牛肉膏0.2-0.8％，酵母膏0.2-0.8％，蛋白胨0.3-0.8％，葡萄糖0.1-0.8％，氯化钠0.2-0.6％；pH 7.0-7.4；摇瓶培养基经在温度105-125℃，时间30分钟，蒸汽压力0.11-0.13Mpa灭菌后待用；将培养好的斜面菌种在无菌条件下按1-9％接种量接入摇瓶种子培养基内，25-40℃恒温培养10-30小时。

(二)发酵过程：

所述发酵过程的发酵培养基是：牛肉膏0.2-0.8％，酵母膏0.2-0.8％，蛋白胨0.3-0.8％，葡萄糖0.1-0.9％，氯化钠0.2-0.6％；经灭菌温度105-125℃，时间30分钟，蒸汽压力0.11-0.13Mpa灭菌后备用。

1.一级发酵罐：

将优良的摇瓶菌种在无菌条件下按1-10％接种量接入灭菌后的一级发酵罐。罐压不超过0.02Mpa，通气量以能翻动培养液为宜，连续充分搅拌，在25-40℃恒温培养10-50小时；

2.二级发酵罐：

将一级发酵培养液在无菌条件下按2-20％接种量接入灭菌后的二级发酵罐，罐压不超过0.02Mpa，通气量以能翻动培养液为宜，连续充分搅拌；在25-35℃恒温培养50-100小时。灭活采用加温使发酵液温度达到70-120℃，保温20-60分钟，冷却静置后放罐。

(三)提纯过程：

1.发酵液浓缩：将发酵后的发酵液用浓缩器进行浓缩，使浓缩液体积与发酵液体积比控制在1∶15-25，控制pH 7.0-7.4制成发酵浓缩液。

2.浓缩液的精制提纯：浓缩液按珍珠岩1-2.0％及活性炭2-4.0％加入进行精制提纯，搅拌10-20分钟，过滤后再抽滤提纯，制成发酵精制液。

3.浓缩液加入80-99％乙醇，体积量比控制在1∶1.5-1∶5.5或酌情而定。充分搅拌静置后，离心去除上清液，沉淀用蒸馏水溶解，调pH5.0，得到溶解液并将溶解液静置。再将溶解液离心去除杂质得到上清液，准确量取清液体积，按上清液体积计算出所需乙醇量，调pH值，将乙醇缓慢加入到上清液中，并充分搅拌，静置后离心去除上清液得到沉淀物。沉淀物再用蒸馏水溶解，调pH，离心，上清液再加乙醇沉淀。这样的工艺反复操作至中间检测合格为止，得到的沉淀物真空干燥3-8小时，即得到粪肠球菌生产的发酵物。

三、上述方法得到的粪肠球菌发酵物的检验：

[性状]本品为白色或微黄色无定形粉末；无臭、无味。

本品在水中易溶，在乙醇、氯仿及丙酮中不溶。

比旋度：取本品，精密称定，加水溶解并稀释成每1ml中约含10mg的溶液，依法测定(中国药典2000年版二部附录vI E)，比旋度为+70℃至+80℃。

[鉴别]1、取本品10mg，加水0.5ml使溶解，加a-萘酚乙醇溶液(5-100)1ml，摇匀，沿管壁缓缓加硫酸0.5ml，数分钟后，界面呈紫红色。

2、取本品，加水制成每1ml中含1mg的溶液，取约10ul点于滤纸上，晾干，用无水乙醇固定，置高硝酸溶液(取高碘酸1.2g，加水30ml溶解后。加0.2mol/L醋酸钠溶液1.5ml与乙醇100ml，混匀即得。置暗处保存，可使用数月)中浸泡5分钟，取出，用70％乙醇溶液冲洗，置还原液(取碘化钾5g，硫代硫酸钠5g，加水100ml使溶解，再加乙醇150ml、2mol/L盐酸液2.5ml，随加随搅拌，临用时配)中浸泡5分钟，取出，用70％乙醇溶液冲洗，置品红亚硫酸试液中浸泡约30分钟，取出，用焦亚硫酸钠溶液(取焦亚硫酸钠0.4g，加盐酸1ml，加水溶解使成100ml，即得)，冲洗，晾干，在滤纸片点样处应呈紫红色。

3、取供试品和对照品适量，分别加氯化钠注射液制成每1ml中含1mg的溶液作为供试品溶液和对照品溶液，按免疫原性测定法试验，供试品和对照品管应均无溶血发生。

[检查]1、酸度：取本品，加水制成每1ml中含10mg的溶液，依法测定(中国药典2000年版二部附录VI H)，pH值应为3.0-5.0。

2、吸收度：取本品，加水制成每1ml中含0.4mg的溶液，照分光光度法(中国药典2000年版二部附录VIA)，在260nm的波长处，其吸收度不得大于0.25，在280nm的波长处，其吸收度不得大于0.20。

3、总氮量：取本品，照氮测定法(中国药典2000年版二部附录VII D第二法)测定。按干燥品计算，含总氮量应为0.8-2.0％。

4、免疫原性：取供试品和对照品适量，分别加氯化钠注射液制成每1ml中含10mg的溶液，再分别用磷酸盐缓冲液制成1∶2、1∶4、1∶8、1∶16、1∶32、1∶64、1∶128、1∶256的稀释液作为供试品溶液和对照品溶液，依法检查(附免疫原性测定法)，供试品不溶血管的最低浓度应不得高于对照品相应浓度的一倍以上。

5、干燥失重  取本品，在105℃干燥至恒重，减失重量不得过5.0％(中国药典2000年版二部附录VIII L)。

6、重金属  取本品，在1.0g，依法检查(中国药典2000年版VIII H)含重金属不得过百万分之二十。

7、异常毒性  取本品，加氯化钠注射液制成每1ml中含0.5mg的溶液，依法检查(中国药典2000年版附录XI C)。按静脉注射法给药，应符合规定(供注射用)。

四、发酵物中有效成分含量测定

1.对照品溶液的制备

精密称取经105℃干燥至恒重的D-甘露糖对照品0.1g置100ml量瓶中，加水溶解并稀释至刻度。摇匀；精密量取5ml，置100ml的量瓶中，加水至刻度，摇匀。每1ml中含甘露糖50ug。

2.供试品溶液的制备

取本品适量，精密称定，加水溶解制成每1ml中含40ug的溶液。

3.标准曲线的制备

精密称取对照品溶液0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0ml，分别置具塞试管中，各加水至1.0ml，再加3％苯酚溶液1.0ml，摇匀，冲入硫酸4.5ml，摇匀，放置于室温，以0管为空白。照分光光度法(中国药典2000年版二部附录IV A)在490nm的波长处测定吸收度。以甘露糖ug数对相应的吸收度，计算回归方程。

4.测定法

精密量取供试品溶液1.0ml，照标准曲线制备项下自“再加3％苯酚溶液1.0ml”起，依法操作，测定吸收度，由回归方程计算甘露糖的含量。

五、免疫原性测定法(补体结合法)；

1、试液

A.酸盐缓冲液(pH7.2)

取氯化钠8.5g、磷酸氢二钠0.565g及磷酸二氢钾0.135g，加水至1000ml使其溶解，加10％硫酸镁溶液1ml，摇匀。

B.1％羊红细胞悬液

羊血红细胞的制备：由绵羊颈静脉无菌采血于盛有等量阿氏液(取葡萄糖20.5g、枸椽酸钠8.0g、氯化钠4.2g，枸椽酸5.5g，加水至1000ml使溶解，100℃灭菌30分钟)的无菌容器中，4℃保存。

1％羊血红细胞悬液的制备：取上述羊血红细胞适量，用氯化钠注射液洗涤三次，每次离心5分钟(2000转/分)，取压积羊血红细胞，用氯化钠注射液制成1％羊血红细胞悬液。取悬液，用氯化钠注射液稀释20倍制成供试品溶液，另取等量悬液加水稀释20倍作为空白溶液，照分光光度法(中国药典2000年版二部附录IV A)，在541nm的波长处测定，其吸收度应为0.65-0.70，如超出限度应调节1％羊红细胞悬液的浓度。

C.溶血素及致敏羊血红细胞

溶血素的制备：取上述压积羊血红细胞，用氯化钠注射液制成25％羊血红细胞悬液。取家兔1只，静脉注射上述羊血红细胞悬液，每日一次，共七次，前三次3ml，后三次5ml，末次注射后七日采血。分离血清，56℃。30分钟灭活，分装，0℃以下保存。

溶血素单位的测定：取溶血素适量，加磷酸盐缓冲液分别制成1∶1000、1∶2000、1∶3000、1∶4000、1∶5000、1∶6000、1∶7000、1∶8000、1∶9000、1∶10000的稀释液，各取0.1ml置试管中，加1％羊血细胞悬液0.1ml，摇匀，加稀释度为1∶30的豚鼠血清(补体)0.2ml及磷酸盐缓冲液0.2ml，摇匀，37℃保温30分钟，完全溶血管的最高稀释度为1单位溶血素。

致敏羊血红细胞的制备：临用前，将2％的羊血红细胞悬液与2单位溶血索等体积混合，37℃保温15分钟即得。

补体：取三只以上的豚鼠，心脏采血，离心分离血清，0℃以下保存。

补体单位的测定：取补体适量，加磷酸盐缓冲液，分别制成1∶40、1∶60、1∶80、1∶100、1∶120、1∶140、1∶160、1∶180的稀释液，各取0.2ml置试管中，加0.2ml磷酸盐缓冲液，摇匀，37℃保温30分钟后，分别加致敏羊血红细胞0.2ml，摇匀，37℃再保温30分钟。完全溶血管的最高稀释度为1单位的补体。

抗体：取对照品适量，加氯化钠注射液制成每1ml中含10mg的对照品溶液免疫家兔，隔日采用耳静脉注射对照品溶液一次。第一次注射0.2ml，第二次至第五次各注射0.5ml，第六次至第十次各注射1.0ml，第十一次至第十五次各注射2.0ml，末次注射后三日采血，离心分离血清，56℃下30分钟灭活，分装，0℃以下保存(临用前，需56℃30分钟再次灭活)。

抗体单位的测定：取抗体适量，加磷酸盐缓冲液分别制成1∶2、1∶4、1∶8、1∶16、1∶32、1∶64、1∶128的稀释液，各取0.1ml置试管中，加对照品溶液0.1ml及2单位补体0.2ml，摇匀，于4-8℃放置4小时以上，置37℃保温30分钟，不溶血管的最高稀释度为1单位抗体。同时设抗原(不加抗体，以0.1ml磷酸盐缓冲液代替)、抗体(不加抗原，以0.1ml磷酸盐缓冲液代替)、补体(不加抗原，抗体，以0.2ml磷酸盐缓冲液代替)对照管，以上三种对照管应全溶血；另设的致敏羊血红细胞(不加抗原、抗体和补体，以0.4ml磷酸盐缓冲液代替)对照管应不溶血。

2、免疫原性测定法

取对照品与供试品适量，照药品项下的规定制成不同浓度的对照品溶液和供试品溶液，各取0.1ml置试管中，加入2单位抗体0.1ml及2单位补体0.2ml.摇匀，于4-8℃放置4小时以上，置37℃保温30分钟，加入致敏羊血红细胞0.2ml，摇匀，37℃再保温30分钟。观察各管的溶血情况，不溶血管的最低浓度代表对照品的免疫原性。同时设抗原(不加抗体，以0.1ml磷酸盐缓冲液代替)、抗体(不加抗原，以0.1ml磷酸盐缓冲液代替)、补体(不加抗原、抗体、以0.2ml磷酸盐缓冲液代替)对照管，以上三种对照管应全溶血：另设的致敏羊血红细胞(不加抗原、抗体和补体，以0.4ml磷酸盐缓冲液代替)对照管应不溶血。

优良粪肠球菌在医药领域的应用，根据优良粪肠球菌发酵制备的发酵液，是将粪肠球菌进行反复培养，筛选出生命力旺盛、生长速度快、发酵单位高、发酵周期短、发酵产物含量高、生产适应性强的菌株作为生产菌种，经一级发酵和二级发酵，将发酵液精制提纯得到的；

所述的发酵液具有调节免疫力功能、抗肿瘤的功能、抗炎功能、刺激骨髓造血干细胞的功能、降血脂功能、降血糖功能、抗氧化功能、改善记忆功能、缓解视疲劳功能、促进排铅功能、清咽功能、降血压功能、改善睡眠功能、促进泌乳功能、缓解体力疲劳功能、提高缺氧耐受力功能、对辐射危害有保护功能、减肥功能、改善生长发育功能、增加骨密度功能、改善营养性贫血功能、对化学性肝损伤有保护功能、祛痤疮功能、祛黄褐斑功能、改善皮肤水分功能、改善皮肤油份功能、调节肠道菌群功能、促进消化功能、通便功能、对胃粘膜损伤有保护功能等多方面的作用。

Claims (2)

1、优良粪肠球菌的筛选制备方法，其特征在于：所述的优良粪肠球菌的筛选方法如下：

在健康人肠道中采集标本，涂布在血平板上，37℃静置培养18-24小时，挑菌落周围无溶血圈的菌落，显微镜观察确认为粪肠球菌后，采用单菌落分离纯化；将分离得到的一系列粪肠球菌培养在下列培养基中：葡萄糖0.5％，胰胨0.4％，蛋白胨0.6％，酵母膏0.3％，牛肉膏0.5％，氯化钠0.5％，水100ml，pH7.2；37℃静置培养三日后，离心，将上清液或其稀释液叠加在含一定量抗血清的沉淀管中，一定时间内观察沉淀环的出现及环的厚薄，以判断菌株产生多肽的能力，选择产生多肽能力强的菌株；再将产生多肽能力强的菌株的菌液1ml注射于健康家兔皮内，观察红肿、溃疡的出现，判断菌株毒性大小；最终选择产生多肽能力强，且对实验动物毒性低，细菌及菌落形态较典型的粪肠球菌作为生产菌株；该菌种已于2007年10月19日由中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，编号为CGMCCNo.2220；

所述的优良粪肠球菌的发酵制备工艺如下：

(一)发酵过程：

所述发酵过程的发酵培养基是：牛肉膏0.2-0.8％，酵母膏0.2-0.8％，蛋白胨0.3-0.8％，葡萄糖0.1-0.9％，氯化钠0.2-0.6％；经灭菌温度105-125℃，时间30分钟，蒸汽压力0.11-0.13Mpa灭菌后备用；

(1).一级发酵罐：

将优良的摇瓶菌种在无菌条件下按1-10％接种量接入灭菌后的一级发酵罐。罐压不超过0.02Mpa，通气量以能翻动培养液为宜，连续充分搅拌，在25-40℃恒温培养10-50小时；

(2).二级发酵罐：

将一级发酵培养液在无菌条件下按2-20％接种量接入灭菌后的二级发酵罐，罐压不超过0.02Mpa，通气量以能翻动培养液为宜，连续充分搅拌；在25-35℃恒温培养50-100小时。灭活采用加温使发酵液温度达到70-120℃，保温20-60分钟，冷却静置后放罐；

(二)提纯过程：

(1).发酵液浓缩：将发酵后的发酵液用浓缩器进行浓缩，使浓缩液体积与发酵液体积比控制在1∶15-25，控制pH 7.0-7.4制成发酵浓缩液；

(2).浓缩液的精制提纯：浓缩液按珍珠岩1-2.0％及活性炭2-4.0％加入进行精制提纯，搅拌10-20分钟，过滤后再抽滤提纯，制成发酵精制液；

(3).浓缩液加入80-99％乙醇，体积量比控制在1∶1.5-1∶5.5或酌情而定。充分搅拌静置后，离心去除上清液，沉淀用蒸馏水溶解，调pH5.0，得到溶解液并将溶解液静置；再将溶解液离心去除杂质得到上清液，准确量取清液体积，按上清液体积计算出所需乙醇量，调pH值，将乙醇缓慢加入到上清液中，并充分搅拌，静置后离心去除上清液得到沉淀物。沉淀物再用蒸馏水溶解，调pH，离心，上清液再加乙醇沉淀；这样的工艺反复操作至中间检测合格为止，得到的沉淀物真空干燥3-8小时，即得到粪肠球菌生产的发酵物。

2、优良粪肠球菌的应用，其特征在于：根据优良粪肠球菌发酵制备的发酵液，是将粪肠球菌进行反复培养，筛选出生命力旺盛、生长速度快、发酵单位高、发酵周期短、发酵产物含量高、生产适应性强的菌株作为生产菌种，经一级发酵和二级发酵，将发酵液精制提纯得到的；

所述的发酵液具有调节免疫力功能、抗肿瘤的功能、抗炎功能、刺激骨髓造血干细胞的功能、降血脂功能、降血糖功能、抗氧化功能、改善记忆功能、缓解视疲劳功能、促进排铅功能、清咽功能、降血压功能、改善睡眠功能、促进泌乳功能、缓解体力疲劳功能、提高缺氧耐受力功能、对辐射危害有保护功能、减肥功能、改善生长发育功能、增加骨密度功能、改善营养性贫血功能、对化学性肝损伤有保护功能、祛痤疮功能、祛黄褐斑功能、改善皮肤水分功能、改善皮肤油份功能、调节肠道菌群功能、促进消化功能、通便功能、对胃粘膜损伤有保护功能等多方面的作用。