CN105753170B - 植物乳杆菌在抑制微囊藻毒素上的应用 - Google Patents

植物乳杆菌在抑制微囊藻毒素上的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了植物乳杆菌在抑制微囊藻毒素的应用，其保藏号为CGMCCN0.11875。同时考察了菌体浓度、温度、菌体活性对抑制性的影响，结果表明，活性较高、浓度较高、在37℃环境下的唾液乳杆菌对微囊藻毒素具有明显的抑制作用，可以用来抑制污染水质中的微囊藻毒素，保护水体。

Description

植物乳杆菌在抑制微囊藻毒素上的应用
技术领域
本发明属于微生物领域，公开了植物乳杆菌在抑制微囊藻毒素上的应用。
背景技术
微囊藻毒素(Microcystin，MC)是一类具有生物活性的环状七肽化合物，为分布最广泛的肝毒素。主要由淡水藻类铜绿微囊藻(Microcystis aeruginosa)产生。具有相当的稳定性。它能够强烈抑制蛋白磷酸酶的活性，还是强烈的肝脏肿瘤促进剂。中国生活饮用水标准限制饮用水中该毒素含量为1μg/L。近年来由于水体污染的日趋严重，出现各种水质问题，而由蓝藻爆发引起的水中微囊藻毒素含量超标问题也频繁出现。
植物乳杆菌与人类、动物的生活关系密切，是一种常见于奶油、肉类及许多蔬菜发酵制品、青贮饲料中的乳酸菌，能通过胃并定植于肠道发挥有益作用，例如维持肠道内菌群的平衡、促进营养物质吸收、缓解乳糖不耐症及抑制肿瘤细胞的形成等多种功能，目前研究报道较多的应用领域包括食品、饲料、医疗保健、化妆品、美容、水产养殖、工农业生产、生物防腐剂、益生菌制剂等等。
发明内容
本发明在研究植物乳杆菌的功能过程中，意外发现其对微囊毒素的抑制功能。
具体地，本发明在养殖水体的动植物体内提取分离得到一种乳杆菌，经鉴定为一种新的植物乳杆菌，其于2015年12月14日保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏号为CGMCC NO：11875，分类命名的拉丁文名称为植物乳杆菌Lactobacillus plantarum。
本发明的植物乳杆菌16S rDNA序列SEQ No1所示。
培养乳杆菌所用的是MRS培养基，培养基配方为：葡萄糖30g，蛋白胨10g，酵母粉7.5g，无水乙酸钠5g，K2HP042g，硫酸镁0.8g，硫酸锰0.2g，柠檬酸二铵2g，PH7.0-7.5，培养温度为37℃。
菌种的形态
植物乳杆菌在培养基上培养48h，生成的的菌落图如图1所示，菌落边缘整齐，表面光滑、呈乳黄色；将单菌落取样在电子显微镜下(放大倍数为1800倍)进 行观察，观察结果如图2所示，细胞形态为杆状，革兰氏染色鉴定为革兰氏阳性，无芽孢和鞭毛。
本发明进一步发现了该植物乳杆菌在抑制微囊藻毒素的应用。
在具体应用时，将植物乳杆菌置于含有微囊藻毒素的水体中，在4～50℃下混合作用。
优选地，将植物乳杆菌置于含有微囊藻毒素的水体中，在30～40℃下混合作用。最为优选地，在37℃下混合作用。
优选地，在应用时，所述植物乳杆菌的浓度大于108CFU/mL。
在研究时发现，菌体浓度与毒素清除率之间具有一定的正相关性。
在应用时，所述的植物乳杆菌为活菌或者死菌。其中，优选地，植物乳杆菌的活性越高，其对微囊藻毒素的抑制效果越好。
附图说明
图1为不同浓度的植物乳杆菌对微囊藻毒素的抑制效果图；
图2为不同温度的植物乳杆菌对微囊藻毒素的抑制效果图；
图3为不同活性的植物乳杆菌对微囊藻毒素的抑制效果图；
图4为植物乳杆菌菌落图；
图5为植物乳杆菌镜检图。
具体实施方式：
本发明在养殖水体的动植物体内提取分离得到一种乳杆菌，经鉴定为一种新的植物乳杆菌，其于2015年12月14日保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏号为CGMCCNO：11875，分类命名的拉丁文名称为植物乳杆菌Lactobacillus plantarum。
本发明的植物乳杆菌16SrDNA序列如序列表所示。通过对该菌株的16SrDNA进行PCR扩增，回收扩增产物测序，序列与GenBank数据库中已经登录的序列进行同源性比较，该菌株的16SrDNA序列与植物乳杆菌同源性达99％。
培养乳杆菌所用的是MRS培养基，培养基配方为：葡萄糖30g，蛋白胨10g，酵母粉7.5g，无水乙酸钠5g，K2HPO42g，硫酸镁0.8g，硫酸锰0.2g，柠檬酸二铵2g，PH7.0-7.5，培养温度为37℃。
菌种的形态：植物乳杆菌在培养基上培养48h，生成的的菌落图如图4所示，形成明显的变色圈，菌落表面光滑、有光泽、中央隆起、边缘整齐、呈乳黄色；将单菌落取样在电子显微镜下(放大倍数为1800倍)进行观察，观察结果如图5所示，细胞形态为杆状，革兰氏染色鉴定为革兰氏阳性，无芽孢和鞭毛。
本发明进一步研究了植物乳杆菌对不同浓度微囊藻毒素的抑制作用实验。
实施例1：
以2％接种量接种于MRS培养基中，37℃静置培养。取37℃静置培养20h(对数中后期)的发酵液，离心10min(3200×g，4℃)收集菌体，再用磷酸盐缓冲液(pH 7.0)洗涤离心2次，调整菌浓在109CFU mL-1左右。将获得的菌体重悬于含微囊藻毒素浓度为100μg L-1的磷酸盐缓冲液(pH 7.0)中，置于37℃摇床(150r min-1)避光培养。培养24h后取样，离心10min(12000×g，4℃)，取上清液用HPLC检测微囊藻毒素的残存浓度。计算获得菌株对微囊藻毒素的清除率为82％。
所述微囊藻毒素的检测采用高效液相的方法：
色谱柱：Agilent ZORBAX Eclipse XDB-C18(4.6×150mm，5.0μm)
流动相∶乙腈∶H2O(0.05％TFA)＝40∶60(v/v)
进样量：20μl；流速：1mL/min；柱温：40℃
检测器：DAD 238nm；MC-LR保留时间：3.48min
实施例2：
微囊藻毒素初始浓度为500μgL-1
以2％接种量接种于MRS培养基中，37℃静置培养。取37℃静置培养20h(对数中后期)的发酵液，离心10min(3200×g，4℃)收集菌体，再用磷酸盐缓冲液(pH 7.0)洗涤离心2次，调整菌浓在109CFU mL-1左右。将获得的菌体重悬于含MC-LR浓度为500μg L-1的磷酸盐缓冲液(pH 7.0)中，置于37℃摇床(150r min-1)避光培养。培养24h后取样，离心10min(12000×g，4℃)，取上清液用HPLC检测微囊藻毒素残存浓度。计算获得菌株对微囊藻毒素的清除率为52％。
实施例3：
微囊藻毒素初始浓度为1000μg L-1。
以2％接种量接种于MRS培养基中，37℃静置培养。取37℃静置培养20h (对数中后期)的发酵液，离心10min(3200×g，4℃)收集菌体，再用磷酸盐缓冲液(pH 7.0)洗涤离心2次，调整菌浓在109CFU mL-1左右。将获得的菌体重悬于含MC-LR浓度为1000μg L-1的磷酸盐缓冲液(pH 7.0)中，置于37℃摇床(150r min-1)避光培养。培养24h后取样，离心10min(12000×g，4℃)，取上清液用HPLC检测微囊藻毒素残存浓度。计算获得菌株对微囊藻毒素的清除率为20％。
通过上述实验，可以确定植物乳杆菌对各种浓度的微囊藻毒素均具有抑制作用，可用于水体中抑制微囊藻毒素。
实施例4植物乳杆菌活性对微囊藻毒素的抑制作用实验。
如图3所示，本实施例利用活菌、乙醇致死菌、热致死菌、盐酸致死菌对微囊藻毒素的抑制作用进行搞研究，结果表明，活菌和死菌均具有一定的清除效果，但对微囊藻毒素的清除率显著低于活细胞，从而表明菌体的活性是影响其毒素清除效率的重要因素之一。可以确定乳杆菌对微囊藻毒素的清除与菌体的代谢活性具有较大的相关性。
实施例5植物乳杆菌浓度对微囊藻毒素的抑制作用实验。
植物乳杆菌浓度的差异对其清除微囊藻毒素的影响情况如图1所示。结果表明，菌体浓度为1010CFU/mL时，两株实验菌经24h对微囊藻毒素(起始毒素浓度1000μg/L)的清除率达到80％以上，而菌浓为108CFU/mL时实验菌株对微囊藻毒素的清除率均低于10％。通过实验可以确定植物乳杆菌浓度对清除微囊藻毒素具有显著的影响作用。高浓度菌液对藻毒素的清除效果高于低浓度菌液，菌体浓度与毒素清除率之间具有一定的正相关性。
实施例6植物乳杆菌温度对微囊藻毒素的抑制作用实验。
植物乳杆菌在4℃、25℃、37℃以及45℃下的微囊藻毒素清除效果如图2所示。结果表明，植物乳杆菌在37℃时的毒素清除效果最好，在低温(4℃，25℃)和高温(45℃)下，清除效果均不理想。
通过上述对比实验，活性较高，浓度较高，在37℃环境下的植物乳杆菌对微囊藻毒素具有明显的抑制作用，可以用来抑制污染水质中的微囊藻毒素，保护水体。

Claims (4)

1.一种植物乳杆菌在抑制微囊藻毒素的应用，所述植物乳杆菌于2015年12月14日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC NO.11875，在应用时，将植物乳杆菌置于含有微囊藻毒素的水体中，在30~40℃下混合作用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，在应用时，所述植物乳杆菌的浓度大于108CFU/mL。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，在应用时，菌体浓度与毒素清除率之间具有正相关性。
4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，在应用时，所述的植物乳杆菌为活菌或者死菌。
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