CN102108337A - 一种干酪乳杆菌及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一株干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)BBE10-212，保藏编号CCTCC M2010163。该菌株具有较高的藻毒素清除效率，同时该菌株又可高效地清除胆固醇。将该菌株用于保健食品领域，具有提高人体免疫力、协助营养消化等诸多方面的功效。

Description

一种干酪乳杆菌及其应用

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，涉及一种干酪乳杆菌及其应用。 

背景技术

国际营养学界给“益生菌”的定义是：指一类有益人类健康的肠道生理细菌，还常被描述为“良性”或“健康”的细菌。它包括保加利亚乳杆菌、嗜热链球菌、双岐杆菌、嗜酸乳杆菌、唾液乳杆菌、发酵乳杆菌等细菌。应用于人体的益生菌产品有益生菌发酵的乳制品、肉制品、果蔬制品等，医药保健行业。乳酸菌是益生菌中的主要一类，具有抗肿瘤、缓解乳糖不耐症、增强免疫力、降低胆固醇、调整肠道菌群等生理作用。乳酸菌主要用于发酵肉制品、发酵水产品等发酵食品的生产中，抑制了腐败菌和致病菌的生长及毒素的产生，使发酵食品的保存期大大延长，有利于储藏和流通，食用安全性更好，营养成分更丰富。 

微囊藻毒素(MCs)是由富营养化水体中的铜绿微囊藻、水华鱼腥藻、念珠藻等蓝藻产生的一种环状七肽物质。微囊藻毒素以动物肝脏为作用靶器官，能够特异性地抑制蛋白磷酸酶活性从而诱发癌症等一系列病变。由于毒性强、在食物链中波及范围广以及具有鲜明的地域特征，微囊藻毒素日益成为危害人类健康的重要杀手。目前，干预MCs的手段可分为物理防治、化学防治以及生物防治。其中，微生物处理法中部分益生菌对MCs的干预作用因其安全性(GRAS)而成为真正能够实现在清除MCs过程中与水源、食品“零距离”接触的生物防治剂。同时，由于益生菌定殖人体肠道后在抑制有害微生物生长、提高人体免疫力、协助消化和营养吸收等诸多方面发挥的长期功效，使得益生菌作为体内MCs“清道夫”的价值更加突出。 

近年来，国内外大量研究发现，食用活性乳酸菌食品具有减少人体血清中胆固醇的能力，这个结论已被大量的体内及体外实验所证实。1974年，Mann和Spoerry发现，非洲Masai人大量饮用由乳杆菌发酵的乳制品，其体内血清胆固醇含量普遍较低。1977年，Gilliland对肠道乳杆菌的降胆固醇作用进行了研究，提出了乳酸菌在生长过程中通过降解胆盐促进胆固醇的分解代谢，从而降低胆固醇含量的观点。尽管乳酸菌降低培养基中胆固醇含量、减少人和动物血清胆固醇含量的益生作用得到了大量的证实，但具体的机理至今尚无定论。 

发明内容

本发明提供了一株干酪乳杆菌BBE10-212(Lactobacillus casei BBE-212)，已于2010年6月28日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO: M 2010163，地址：中国武汉武汉大学，其分类学命名为干酪乳杆菌BBE10-212(Lactobacillus casei BBE-212)；其16SrDNA序列如核苷酸序列表中SEQ ID NO:1所示，以其16SrDNA全序列为基础的系统发育树如说明书附图1所示。 

本发明提供了一种所述干酪乳杆菌的应用，将培养好的干酪乳杆菌用于清除藻毒素。 

为解决上述技术问题，将培养好的干酪乳杆菌调整菌浓的比例至10⁸CFU mL^-1-10¹⁰CFUmL^-1之间，接种至藻毒素浓度范围为100μg L^-1-1000μg L^-1之间的溶液中，置于37℃摇床(150r min^-1)避光培养。 

所述干酪乳杆菌为从泡菜、腊肠等传统发酵食品中筛选，其保藏条件如下：从生长良好的平板上取2-3环益生菌移入MRS培养基中，37℃静置培养20h，取0.7mL移入盛有0.3mL无菌甘油的甘油管中，放-70℃冰箱保存。 

所述MRS培养基为：葡萄糖20g L^-1，蛋白胨1O g L^-1，牛肉膏10g L^-1，酵母浸出汁5gL^-1，无水乙酸钠5g L^-1，磷酸二氢钾2g L^-1，柠檬酸三铵2g L^-1，MgSO₄·7H₂O 0.2g L^-1，MnSO₄·H₂O 0.05g L^-1，Tween-80l mL L^-1，pH 5.5。 

所述干酪乳杆菌培养条件为：将甘油管保藏的益生菌接入MRS液体培养基，在37℃静置培养20h至对数中后期，以2％接种量取-70℃甘油贮存液接种于MRS培养基中，37℃静置培养20h。 

在微囊藻毒素浓度为1000μg L^-1的条件下，10⁹CFU mL^-1的菌体与之共培养24h后，降解率高达到20％(图2)。在微囊藻毒素浓度为100μg L^-1的条件下，菌浓为10⁹CFU mL^-1的菌体与之共培养24h后，降解率最高达到82％。在微囊藻毒素起始浓度为500μg L^-1的条件下，菌浓为1O⁹CFU mL^-1的菌体与之共培养24h后，降解率最高达到52％。 

本发明还提供了一种所述干酪乳杆菌的应用，是用于清除胆固醇。 

为解决上述技术问题，将活化好的干酪乳杆菌调菌悬液浓度为3×10⁹CFU mL^-1。按2％的接种量接种到含100μg mL^-1胆固醇的MRS液体培养基中，37℃厌氧培养24h。 

本发明自泡菜、腊肠中筛选出一株干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)BBE10-212，该菌株既具有较高的藻毒素清除效率，又可高效地清除胆固醇。将该菌株用于保健食品领域，具有可抑制有害微生物生长、提高人体免疫力、协助营养消化等诸多方面的功效。 

附图说明

图1：于酪乳杆菌系统发育树 

图2：干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)BBE10-212对高浓度藻毒素的清除 

具体实施方式

实施例1：干酪乳杆菌筛选方法 

从泡菜、腊肠等传统发酵食品中取一定样品加入到30mL MRS培养基中富集培养，37℃培养20h。将培养液梯度稀释，涂布于添加0.02％溴甲酚紫的MRS平板，37℃培养箱中培养48h。挑取使溴甲酚紫变色圈明显的的单菌落。反复进行平板划线分离，重复三次得到纯化的单菌落，供下一步鉴定用。 

鉴定主要通过：1)菌落特征观察：用肉眼直接观察，挑选菌落直径在1-3mm之间，圆形降起，表面光滑或稍粗糙，乳白、灰白或暗黄色等符合乳酸菌菌落特征的菌株。2)个体形态观察：用光学显微镜革兰氏染色观察。挑选革兰氏阳性、无芽孢菌株。将满足鉴定条件的菌株挑出甘油管保藏。 

以2％接种量取-70℃甘油贮存液接种于MRS培养基中，37℃静置培养。取37℃静置培养20h(对数中后期)的发酵液，离心10min(3200×g，4℃)收集菌体，再用磷酸盐缓冲液(pH 7.0)洗涤离心2次，调整菌浓在10⁹CFU mL^-1左右。将获得的菌体重悬于含MC-LR浓度为1000μgL^-1的磷酸盐缓冲液(pH 7.0)中，置于37℃摇床(150r min^-1)避光培养。培养24h后取样，离心10min(12000×g，4℃)，取上清液用HPLC检测MC-LR残存浓度。 

通过HPLC检测，筛选到一株具有较强藻毒素清除能力的菌株，通过16SrDNA序列分析(见核苷酸序列表中SEQ ID NO：1所示)可知该菌株为干酪乳杆菌，于2010年6月28日保藏于菌种保藏中心，保藏编号为CCTCC M 2010163。 

实施例2： 

MC-LR初始浓度为100μgL^-1

以2％接种量取-70℃甘油贮存液接种于MRS培养基中，37℃静置培养。取37℃静置培养20h(对数中后期)的发酵液，离心10min(3200×g，4℃)收集菌体，再用磷酸盐缓冲液(pH 7.0)洗涤离心2次，调整菌浓在10⁹CFU mL^-1左右。将获得的菌体重悬于含MC-LR浓度为100μg L^-1的磷酸盐缓冲液(pH 7.0)中，置于37℃摇床(150r min^-1)避光培养。培养24h后取样，离心10min(12000×g，4℃)，取上清液用HPLC检测MC-LR残存浓度。计算获得菌株对MC-LR的清除率为82％。 

所述微囊藻毒素的检测采用高效液相的方法： 

色谱柱：Agilent ZORBAX Eclipse XDB-C18(4.6×150mm，5.0μm) 

流动相：乙腈∶H₂O(0.05％TFA)＝40∶60(v/v) 

进样量：20μl；流速：1mL/min；柱温：40℃ 

检测器：DAD 238nm；MC-LR保留时间：3.48min 

实施例3： 

MC-LR初始浓度为500μgL^-1

以2％接种量取-70℃甘油贮存液接种于MRS培养基中，37℃静置培养。取37℃静置培养20h(对数中后期)的发酵液，离心10min(3200×g，4℃)收集菌体，再用磷酸盐缓冲液(pH 7.0)洗涤离心2次，调整菌浓在10⁹CFU mL^-1左右。将获得的菌体重悬于含MC-LR浓度为500μgL^-1的磷酸盐缓冲液(pH 7.0)中，置于37℃摇床(150r min^-1)避光培养。培养24h后取样，离心10min(12000×g，4℃)，取上清液用HPLC检测MC-LR残存浓度。计算获得菌株对MC-LR的清除率为52％。 

实施例4： 

MC-LR初始浓度为1000μg L^-1

以2％接种量取-70℃甘油贮存液接种于MRS培养基中，37℃静置培养。取37℃静置培养20h(对数中后期)的发酵液，离心10min(3200×g，4℃)收集菌体，再用磷酸盐缓冲液(pH 7.0)洗涤离心2次，调整菌浓在10⁹CFU m L^-1左右。将获得的菌体重悬于含MC-LR浓度为1000μg L^-1的磷酸盐缓冲液(pH 7.0)中，置于37℃摇床(150r min^-1)避光培养。培养24h后取样，离心10min(12000×g，4℃)，取上清液用HPLC检测MC-LR残存浓度。计算获得菌株对MC-LR的清除率为20％。 

实施例5：干酪乳杆菌降解胆固醇应用 

(一)含胆固醇MRS液体培养基 

先用无水乙醇配制浓度为10g L^-1的胆固醇溶液，用孔径为0.45μm的微孔滤膜过滤除菌后，加入到含0.30％牛胆酸钠的灭菌MRS中，使胆固醇最终浓度为100mg L^-1。 

(二)发酵液的制备 

在MRS中连传3代，第3代培养物5000r min^-1离心10min，弃上清液，用灭菌生理盐水离心洗菌3遍，调菌悬液浓度为3×10⁹CFU mL^-1。按2％的接种量接种到含胆固醇的MRS液体培养基中，37℃厌氧培养24h。同时保留未接菌的含胆固醇MRS培养基，5℃保存，作为空白对照。 

(三)邻苯二甲醛工作液的配制 

50mg邻苯二甲醛溶于100mL冰醋酸中，搅拌至完全溶解，制成0.5g L^-1的工作液。该 溶液须使用当天配制。 

(四)胆固醇含量测定 

发酵液5000r min^-1离心10min，保留发酵上清。沉淀菌体用与原发酵液等量的生理盐水离心洗涤3遍，洗涤液保留。发酵上清液和菌体洗涤液中胆固醇含量均用改良的O-phthalaldehyde法进行测定。 

具体方法如下：移取0.5mL样品于一洁净试管中，加入3mL 95％的乙醇和2mL 50％的KOH。振荡混匀，60℃水浴中皂化10min。冷却至室温后，加入5mL正己烷，完全混匀，萃取1min。再加入3mL蒸馏水混匀，室温下静置15min。待各项分离后，从己烷层准确吸取2.5mL至另一干净试管中。60℃水浴挥干正己烷，加入4mL新配制的邻苯二甲醛工作液，室温下显色10min。再加入2mL浓硫酸，立即完全混匀，室温静置10min。在90min内测定550nm处的吸光值。 

胆固醇脱除率可由以下公式得出： 

脱除率＝(1-发酵上清液吸光值/未接菌培养基吸光值)×100％ 

计算得到菌降解胆固醇的脱除率为55.19％ 

实施例6：干酪乳杆菌高产胆盐水解酶 

(一)茚三酮显色液 

将茚三酮按1％的比例溶解于0.5M柠檬酸缓冲液(pH5.5)中，取0.5mL上述混合液加入1.2mL甘油和0.2mL 0.5M的柠檬酸缓冲液(pH5.5)。 

(二)酶活测定方法 

以2％接种量取-70℃甘油贮存液接种于MRS培养基中，37℃静置培养。取37℃静置培养20h(对数中后期)的发酵液，离心10min(10000×g，4℃)收集菌体，再用0.1M磷酸盐缓冲液(pH 6.5)洗涤离心2次，调整菌浓在600nm下吸光度为1。取5mL上述细胞悬浊液，超声破碎3min(工作时间∶间歇时间＝1∶3)，随即离心10min(10,000×g，4℃)去除细胞碎片，得到无细胞提取物(cell free extract，CFE)。取0.1mL上清液加入1.8mL 0.1M磷酸盐缓冲液(pH 6.5)和0.1mL结合胆盐(200mM)中混合，并置于37℃孵育30min，取0.5mL上述反应液加入0.5mL三氯乙酸(15％，w/t)终止反应，混合均匀，离心10min(10,000×g，4℃)取上清。将0.1mL上清液与1.9mL茚三酮显色液混合，震荡混匀，沸水浴14min。冷却3min后测定570nm下的吸收值。 

测得胆盐水解酶的比酶活为320.18μmol(min mg)^-1

BSH比酶活(specific activity，SA)定义为：单位时间内、单位质量的总蛋白中的粗 酶使结合型胆盐水解产生氨基酸的物质的量，单位μmol(min mg)^-1。 

可以理解的是，对本领域普通技术人员来说，可以根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，而所有这些改变或替换都应属于本发明所附的权利要求的保护范围。 

Claims (6)

1.一种干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)BBE10-212，保藏编号CCTCC M 2010163。

2.一种培养权利要求1所述干酪乳杆菌的方法，是在MRS培养基中静置培养干酪乳杆菌。

3.如权利要求2所述的培养方法，其特征在于优选pH 5.5；优选培养温度37℃。

4.权利要求1所述干酪乳杆菌的应用，是将培养好的干酪乳杆菌用于微囊藻毒素的清除。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于藻毒素浓度范围为100μg L^-1-1000μg L^-1的液体中，加入10⁸CFU mL^-1-10¹⁰CFU mL^-1干酪乳杆菌。

6.权利要求1所述干酪乳杆菌的应用，是将培养好的干酪乳杆菌用于胆固醇的降解。

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