CN108614108A - 一种检测血液中阿米卡星含量的试剂盒及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种检测血液中阿米卡星含量的试剂盒,由试剂R1和试剂R2按体积比1﹕1组成。所述试剂R1:20~150mmol/L缓冲液、3~20g/L共轭物、3~20g/L稳定剂、5~20g/L电解质、3~20g/L增敏剂、0.5~10g/L表面活性剂、0.2~1g/L防腐剂、纯化水,pH值7.0~9.5。R2:1.5g/L~3.5g/L偶联抗人阿米卡星单克隆抗体的胶乳微球、20mmol/L~150mmol/L的缓冲液、3g/L~20g/L的稳定剂,5g/L~20g/L的电解质,0.5g/L的防腐剂,以及纯化水,pH值7.0~9.5。本发明准确、快速,有较好的临床应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及检测试剂,具体涉及检测血液中阿米卡星含量的试剂盒及其制备方法,尤其涉及一种能特异性用于临床检测血液中阿米卡星含量的胶乳增强免疫比浊试剂及其制备方法。
背景技术
阿米卡星(Amikacin),又称丁胺卡那霉素,是一种氨基糖苷类抗生素(Aminoglycosides),对多数肠杆菌科细菌,如大肠埃希菌、克雷伯菌属、肠杆菌属、变形杆菌属、志贺菌属、沙门菌属、枸橼酸杆菌属、沙雷菌属等均具良好作用,对铜绿假单胞菌及其他假单胞菌、不动杆菌属、产碱杆菌属等亦有良好作用;对脑膜炎奈瑟菌、淋病奈瑟菌、流感嗜血杆菌、耶尔森菌属、胎儿弯曲菌、结核杆菌及某些非结核分枝杆菌属亦具较好抗菌作用;其结构式如下:
由于抗生素使用过量,临床上需要严格监控血药浓度。目前,阿米卡星药物代谢评估只能采用物理分析方法,如高效液相色谱法或液相色谱-串联质谱法。但是由于这些方法检测设备价格昂贵,检测过程耗时长,样本前处理麻烦,而且需要专职的技术人员,因此非常不利于临床应用和推广。需要寻找胶乳免疫比浊法在生化分析仪上使用检测血液中阿米卡星含量的试剂盒。
发明内容
本发明所要解决的在于克服上述不足之处,研究设计胶乳增强免疫比浊法在全自动生化分析仪上使用的检测阿米卡星含量的试剂盒,实现准确、快速、简便的样本检测。
本发明提供一种检测血液中阿米卡星含量的试剂盒,具体提供一种胶乳增强免疫比浊法检测血液中阿米卡星含量的试剂盒。
本发明的原理:采用胶乳免疫比浊法检测人血浆中阿米卡星的含量。由于阿米卡星是小分子化合物,不能同常规的检测蛋白的胶乳增强免疫比浊法一样形成交联的空间结构,因而,在本发明体系中引入共轭药物作为载体,将单克隆抗体交联到纳米胶乳颗粒的表面,试剂中的共轭物会与样本中的阿米卡星竞争结合纳米颗粒表面的抗体。当样本中没有游离的阿米卡星分子时,反应产生大量的聚集物,溶液表现为吸光度增加。当样本中含游离的阿米卡星分子时,游离的阿米卡星分子与偶联单克隆抗体的胶乳颗粒结合,凝聚反应被部分抑制,键合到样本中药物分子的抗体不能形成纳米颗粒聚集物,从而溶液吸光度下降。通过在600nm处测定溶液吸光度的变化,即可计算得出阿米卡星的浓度水平。
本发明人发现由于壳聚糖与阿米卡星两种分子的结构中不存在实现偶联的活性官能团,因此单纯以壳聚糖和阿米卡星为底物难以实现化学偶联反应。为此,本发明人通过对壳聚糖或阿米卡星进行结构改造,引入“桥梁结构”,从而实现二者的偶联化反应。实验中所采用的“桥梁结构”为丁二酸等带有羧基结构的化合物。壳聚糖分子与丁二酸酐反应形成有活性官能团的中间体(引入羧基基团),再在活化剂EDC存在的条件下与阿米卡星分子(结构中有很多氨基)通过化学偶联形成共轭药物。
壳聚糖(chitosan),葡糖氨基葡聚糖(Glycosaminoglycans)等可以偶联一定比例的阿米卡星分子用来作为共轭物。
壳聚糖结构式如下:
本发明的试剂盒由试剂R1和试剂R2按体积比1﹕1的比例混合组成。
本发明试剂盒所述试剂R1由下列配比的成分组成:
20~150mmol/L缓冲液、3~20g/L共轭物、3~20g/L稳定剂、5~20g/L电解质、3~20g/L增敏剂、0.5~10g/L表面活性剂、0.2~1g/L防腐剂;pH值为7.0~9.5。
所述共轭物选自葡聚糖、壳聚糖中的一种或几种,其能与阿米卡星进行化学偶联。
所述稳定剂选自牛血清白蛋白、乙二胺四乙酸二钠、氯化胆碱、蔗糖、海藻糖或山梨醇中的一种或几种。
所述增敏剂选自PEG(聚乙二醇)2000、PEG4000、PEG6000、PEG8000或PEG20000中的一种或几种;
所述电解质选自氯化钠、氯化锂、氯化钙、硫酸钠或氯化钾中的一种或几种;
所述表面活性剂选自吐温-20、曲拉通X-100、曲拉通X-405或35中的一种或几种。
所述防腐剂选自叠氮钠(NaN3)、Proclin-300(商品名,主要成分为2-甲基-4-异噻唑啉-3-酮、5-氯-2-甲基-4-异噻唑啉-3-酮)或亚硝酸钠(NaNO2)中的一种或几种。
所述pH调节剂为12mol/L浓盐酸或10mol/L NaOH溶液。
本发明试剂R1有利于阿米卡星分子与抗体充分结合。
本发明所述试剂R2由下列配比的成分组成:1.5g/L~3.5g/L偶联抗人阿米卡星单克隆抗体的胶乳微球、20mmol/L~150mmol/L的缓冲液、3g/L~20g/L的稳定剂,5g/L~20g/L的电解质,0.5g/L的防腐剂,pH值为7.0~9.5。
所述偶联抗人阿米卡星单克隆抗体的胶乳微球是指将抗体分子通过化学偶联的方法连接至胶乳微球上,其为R2中的主要成分;所述微球的粒径范围为:50nm~300nm,其中羧基含量为0.080mmol/g~0.470mmol/g。
所述抗人阿米卡星单克隆抗体选自鼠抗人阿米卡星单克隆抗体或兔抗人阿米卡星单克隆抗体中的一种或几种。
本发明所述试剂R1和试剂R2的缓冲液选自三羟甲基氨基甲烷(Tris)、2-(N-吗啡啉)乙磺酸(MES)、3-(环已胺)-2-羟基-1-丙磺酸(CAPSO)、3-吗啉丙磺酸(MOPS)、N-三(羟甲基)甲基-3-氨基丙烷磺酸(TAPS)、4-羟乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)、硼酸(H3BO3)或氯化铵(NH4Cl)中的一种或几种。
本发明另一目的是提供了所述检测阿米卡星的试剂盒制备方法,该方法包括下列步骤:
二、制备共轭物:
50mmol~200mmol壳聚糖溶于10ml~30ml水中,随后反应体系升温至37~45℃;缓慢滴加溶于水中的丁二酸50mmol~200mmol,阿米卡星和丁二酸的摩尔比1:1,反应体系升温至65℃,反应2~6h,反应结束后,用调节pH至6.0~7.5。在活化剂EDC的作用下,将上述制备物与阿米卡星分子进行化学偶联,即得制备好的共轭物;
二、制备试剂R1:
组成:40mmol/L~150mmol/L缓冲液、3g/L~20g/L偶联阿米卡星分子的共轭物、3g/L~20g/L稳定剂、5g/L~20g/L电解质、1.5g/L~35g/L增敏剂、0.5g/L~17g/L表面活性剂、0.2g/L~1.5g/L防腐剂以及纯化水,pH值为7.0~9.5。
制备:取纯化水于烧杯中,置于磁力搅拌器上,依次加入缓冲剂、稳定剂、电解质、增敏剂、表面活性剂以及防腐剂于烧杯中,每次添加物料需完全溶解后才能继续添加下一种物料,待所有物料完全溶解后,用12mol/L浓盐酸或10mol/L NaOH调节pH至7.0~9.5,用0.22um滤膜过滤,以去除不溶性的杂质,即为试剂R1;
四、制备试剂R2
组成:1.5g/L~3.5g/L偶联抗人阿米卡星单克隆抗体的胶乳微球、20mmol/L~150mmol/L的缓冲液、3g/L~20g/L的稳定剂,5g/L~20g/L的电解质,0.5g/L的防腐剂,pH值为7.0~9.5;
制备方法:
(1)取0.7g~1.5g 120nm~240nm胶乳微球,加入10ml pH5.5~7.0的缓冲液、2ml新鲜配制的EDC(1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐)溶液10mg/ml-30mg/ml,加入纯化水至体积100ml,充分混匀,室温20℃-30℃混合15min~40min;
(2)将微球:抗体质量比为12:1~20:1的抗人阿米卡星抗体6.2mg/ml,加入步骤(1)的体系中进行抗体偶联,室温20℃~30℃混合1h;
(3)将步骤(2)中反应完全的体系于10000rpm~16000rpm离心20min~50min,各加入100ml pH值7.0~9.5、50mM的缓冲液,超声重悬;(4)在步骤(3)重悬后的体系中,加入5ml~15ml 20%BSA(牛血清白蛋白)溶液,室温(20℃~30℃)混合0.5~3h;
(5)用pH7.0~9.0、50mM的缓冲液(含0.2~1.5%BSA,0.3~2%NaCl,0.1~1.0%蔗糖,0.05%NaN3)稀释步骤(4)胶乳微球溶液,至形成的胶乳微球溶液终浓度为0.15%~0.35%,稀释后的体积为1000ml;即得试剂R2。
本发明能实现对血液中阿米卡星含量的样本检测,可以在生化分析仪上准确、快速、简便的检测,本试剂盒采用了纳米微球技术,该技术优于传统的免疫比浊法,显著增强检测信号,提高检测灵敏度,有较好的临床应用前景。
具体实施方式
以下实施例所用原料和药用辅料通过市售得到。
以下结合实施例对本发明作进一步具体描述,但不仅限于此。
实施例1:阿米卡星免疫原以及抗阿米卡星单克隆抗体的制备
称取阿米卡星5.1mg及BSA 55.0mg溶解在10mL PBS(磷酸盐缓冲液)(pH7.2)中,搅拌均匀,逐滴加入溶解在纯化水中的20.0mg EDC,在室温下搅拌反应6小时,然后将反应液转入透析袋中,在PBS(pH7.2)中4℃透析4天,离心后冷冻干燥。置-20℃保存备用。参照杨汉春《动物免疫学》出版时间2003年8月,以阿米卡星-BSA(阿米卡星-牛血清白蛋白)作为免疫原免疫Balb/C小鼠。按照文献方法(朱立平,陈学清.免疫学常用实验方法.北京:人民军医出版社,2000),纯化获得单克隆抗体。采用购自ROCKLAND公司的鼠源单抗亚型鉴定试剂盒(Mouse Mab Isotyping Test Kit)对本发明所得到的单克隆抗体进行亚型鉴定,结果为小鼠IgG1亚型。
实施例2:壳聚糖与阿米卡星偶联共轭物的制备
70mmol壳聚糖溶于10ml~30ml水中,随后反应体系升温至37~45℃;缓慢滴加溶于水中的丁二酸70mmol,反应体系升温至65℃,反应4h,反应结束后,用调节pH至7.0。在活化剂EDC(碳二亚胺)的作用下,将上述制备物与阿米卡星分子进行化学偶联,即得制备好的共轭物;
实施例3:阿米卡星检测试剂盒的制备
1.本发明的试剂盒涉及试剂的主要原材料如下:
抗人阿米卡星抗体
胶乳微球:采用直径为215nm带羧基基团的聚苯乙烯胶乳颗粒(安捷伦)
2.本实施例的主要试剂的配制如下:
试剂R1:50mM PBS缓冲液,加入0.1%共轭物、0.4%PEG6000(聚乙二醇6000),0.05%NaN3,0.3%BSA,0.8%NaCl,0.2%吐温-20,pH值7.2,总制备量1L,该试剂为无色或微黄色透明溶液。
试剂R2:50mM Tris缓冲液,含0.2%阿米卡星抗体包被的胶乳微球、0.8%BSA,0.9%NaCl,0.05%NaN3,pH值7.4,该试剂为乳白色溶液。具体制备步骤如下:
(1)1.2g 215nm胶乳微球,加入16ml pH6.1的MES溶液、2.5ml新鲜配制的EDC溶液(20mg/ml),纯化水补足体积至140ml,充分混匀,20~30℃混合30min;
(2)将质量比(微球:抗体)为30:1的抗人阿米卡星抗体加入步骤1的体系中,20~30℃混合2h;
(3)将步骤2中反应完全的体系经14000rpm(eppendorf)离心30min,弃上清,加入160ml pH7.4、50mM的Tris缓冲液,超声破碎仪(宁波新芝生物)重悬;
(4)在步骤3重悬后的体系中,加入10ml 20%BSA(牛血清白蛋白)溶液,20~30℃混合1h;
(5)用pH7.4、50mM的Tris缓冲液(0.4%BSA,0.5%NaCl,0.05%NaN3),稀释步骤4的体系至胶乳微球终浓度为0.15%,得到1000ml 215nm偶联抗人阿米卡星抗体的胶乳微球溶液,即得1000ml试剂R2。
制备试剂盒:试剂盒装量如下所述
R1:2*60ml/每瓶
R2:2*15ml/每瓶
校准品:1ml,120mg/L
3.阿米卡星校准品制备:在20mM pH7.2的PBS溶液(含0.3%BSA、0.05%NaN3)中加入阿米卡星抗原(市售,深圳菲鹏生物),配制成浓度120mg/L,除菌过滤,校准品均为无色透明液体。
连续配制3个批号的试剂盒,配方及步骤一致,
4.阿米卡星的测定
检测工具:AU680型全自动生化分析仪。
分析方法:两点终点法;主波长:600nm,副波长:无;样品量:8.0ul;实施例3制得的试剂R1:95ul;试剂R2:95ul;
校准模式:多点非线性;反应方向:上升;测定温度:37℃;测试时间:10min
血清/血浆样品(复旦大学附属中山医院)与试剂R1混匀后,于5分钟时加入试剂R2,立即读取吸光度A1;于37℃反应5分钟后读取吸光度A2。
反应吸光度的计算为A2与A1的校准差值。
5.检测结果与评价
本发明试剂与市售阿米卡星检测试剂进行样本检测对比,检测结果见表1;
表1,样本检测对比数据
根据表1结果,说明本发明阿米卡星检测试剂的样品检测结果与市售试剂盒的检测结果一致,R2=0.99;本发明检测试剂对样本的检测结果稳定可靠。
Claims (9)
1.一种检测血液中阿米卡星含量的试剂盒,其特征在于,所述试剂盒由试剂R1和试剂R2按体积比1﹕1的比例混合组成。
2.根据权利要求1所述的一种检测血液中阿米卡星含量的试剂盒,其特征在于,所述试剂R1由下列配比的成分组成:
20~150mmol/L缓冲液、3~20g/L共轭物、3~20g/L稳定剂、5~20g/L电解质、3~20g/L增敏剂、0.5~10g/L表面活性剂、0.2~1g/L防腐剂;pH值为7.0~9.5。
3.根据权利要求2所述的一种检测血液中阿米卡星含量的试剂盒,其特征在于,所述共轭物选自葡聚糖、壳聚糖中的一种或几种;所述稳定剂选自牛血清白蛋白、乙二胺四乙酸二钠、氯化胆碱、蔗糖、海藻糖或山梨醇中的一种或几种;所述增敏剂选自PEG2000、PEG4000、PEG6000、PEG8000或PEG20000中的一种或几种;所述电解质选自氯化钠、氯化锂、氯化钙、硫酸钠或氯化钾中的一种或几种;所述表面活性剂选自吐温-20、曲拉通X-100、曲拉通X-405或35中的一种或几种;所述防腐剂选自叠氮钠、Proclin-300或亚硝酸钠中的一种或几种;所述pH调节剂为12mol/L浓盐酸或10mol/L NaOH溶液。
4.根据权利要求1所述的一种检测血液中阿米卡星含量的试剂盒,其特征在于,所述试剂R2由下列配比的成分组成:
1.5g/L~3.5g/L偶联抗人阿米卡星单克隆抗体的胶乳微球、20mmol/L~150mmol/L的缓冲液、3g/L~20g/L的稳定剂,5g/L~20g/L的电解质,0.5g/L的防腐剂,pH值为7.0~9.5。
5.根据权利要求4所述的一种检测血液中阿米卡星含量的试剂盒,其特征在于,所述偶联抗人阿米卡星单克隆抗体的胶乳微球的粒径范围为:50nm~300nm,其中羧基含量为0.080mmol/g~0.470mmol/g。
6.根据权利要求4所述的一种检测血液中阿米卡星含量的试剂盒,其特征在于,所述抗人阿米卡星单克隆抗体选自鼠抗人阿米卡星单克隆抗体或兔抗人阿米卡星单克隆抗体中的一种或几种。
7.根据权利要求2或4所述的一种检测血液中阿米卡星含量的试剂盒,其特征在于,所述试剂R1或试剂R2的缓冲液选自三羟甲基氨基甲烷、2-(N-吗啡啉)乙磺酸、3-(环已胺)-2-羟基-1-丙磺酸、3-吗啉丙磺酸、N-三(羟甲基)甲基-3-氨基丙烷磺酸、4-羟乙基哌嗪乙磺酸、硼酸或氯化铵中的一种或几种。
8.如权利要求1所述的一种检测血液中阿米卡星含量的试剂盒制备方法,其特征在于,该方法包括下列步骤:
一、制备共轭物:
50mmol~200mmol壳聚糖溶于10ml~30ml水中,随后反应体系升温至37~45℃;缓慢滴加溶于水中的丁二酸50mmol~200mmol,阿米卡星和丁二酸的摩尔比1:1,反应体系升温至65℃,反应2~6h,反应结束后,用调节pH至6.0~7.5;在活化剂EDC的作用下,将上述制备物与阿米卡星分子进行化学偶联,即得制备好的共轭物;
二、制备试剂R1:
组成:40mmol/L~150mmol/L缓冲液、3g/L~20g/L偶联阿米卡星分子的共轭物、3g/L~20g/L稳定剂、5g/L~20g/L电解质、1.5g/L~35g/L增敏剂、0.5g/L~17g/L表面活性剂、0.2g/L~1.5g/L防腐剂以及纯化水,pH值为7.0~9.5;
制备:取纯化水于烧杯中,置于磁力搅拌器上,依次加入缓冲剂、稳定剂、电解质、增敏剂、表面活性剂以及防腐剂于烧杯中,每次添加物料需完全溶解后才能继续添加下一种物料,待所有物料完全溶解后,用12mol/L浓盐酸或10mol/L NaOH调节pH至7.0~9.5,用0.22um滤膜过滤,以去除不溶性的杂质,即为试剂R1;
三、制备试剂R2
组成:1.5g/L~3.5g/L偶联抗人阿米卡星单克隆抗体的胶乳微球、20mmol/L~150mmol/L的缓冲液、3g/L~20g/L的稳定剂,5g/L~20g/L的电解质,0.5g/L的防腐剂,pH值为7.0~9.5;
制备方法:
(1)取0.7g~1.5g 120nm~240nm胶乳微球,加入10ml pH5.5~7.0的缓冲液、2ml新鲜配制的EDC溶液10mg/ml-30mg/ml,加入纯化水至体积100ml,充分混匀,室温20℃-30℃混合15min~40min;
(2)将微球:抗体质量比为12:1~20:1的抗人阿米卡星抗体6.2mg/ml,加入步骤(1)的体系中进行抗体偶联,室温20℃~30℃混合1h;
(3)将步骤(2)中反应完全的体系于10000rpm~16000rpm离心20min~50min,各加入100ml pH值7.0~9.5、50mM的缓冲液,超声重悬;
(4)在步骤(3)重悬后的体系中,加入5ml~15ml 20%BSA溶液,室温20℃~30℃混合0.5~3h;
(5)用pH7.0~9.0、50mM的缓冲液稀释步骤(4)胶乳微球溶液,至形成的胶乳微球溶液终浓度为0.15%~0.35%,稀释后的体积为1000ml;即得试剂R2。
9.根据权利要求8所述的一种检测血液中阿米卡星含量的试剂盒制备方法,其特征在于,所述步骤三(5)的缓冲液含0.2~1.5%BSA,0.3~2%NaCl,0.1~1.0%蔗糖,0.05%NaN3。
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- 2016-12-12 CN CN201611139213.8A patent/CN108614108A/zh active Pending
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