CN101556282A - 烟草复合病毒田间快速检测试纸条及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种烟草复合病毒田间快速检测试纸条，该试纸条是将胶体金层析检测试纸固定在PVC板适当的位置上，将引水材料连接在的胶体金层析检测试纸下端即成吸水纸层，吸水材料连接在胶体金层析检测试纸的上端，胶体金抗体结合物玻璃纤维素膜置于引水材料下与胶体金层析检测试纸衔接，用切割机将组装后的PVC板纵向切成5－7mm宽的测试条，将其装入板壳即样品垫即可，本发明还公开了这种试纸条的制备方法，本发明检测适温15～35℃，检样量0.1～0.3g的样品，相当于叶面积大约3～5cm2；将烟叶在装有缓冲液的塑料袋中研磨后，将试纸条浸入，30min出结果；假阳性率低于1％。可见本发明使用方便，特别适用于田间快速检测，并且可靠性很高。
Description
技术领域
本实用发明涉及一种烟草病毒检测领域，尤其是涉及一种烟划复合病毒的快速检测试约条，还涉及这种试纸条的制备方法。
背景技术
20世纪90年代以来，烟草病毒病在我国烟区频频发生，造成了严重的经济损失，已成为烟草生产上威胁最大的一类灾害，2003年我国烟草因烟草病毒病经济损失高达50419.459万元。当前，烟草病毒病还呈现出病毒病种类不断增加和多种病毒复合感染的新特点。常见的复合感染病毒有烟草普通花叶病(TMV)、黄瓜花叶病(CMV)、马铃薯Y病毒病(PVY)。由于烟草病毒病迄今尚无有效的防治措施，因此，烟草病毒病的防治应突出早检测、早预报、早防治。
目前烟草病毒的检测方法有电镜法和血清学法两种。电镜法是检测病毒最可靠最有效，主要有负染法和组织超薄切片法，可以直接观察到病毒的形态特征、内部结构及病毒混合感染的情况。血清学法需要制备完整病毒的抗血清，用各种血清反应方法进行检测。但这两种方法都需要将样品中病毒或核酸提取和纯化，需要超高速离心机以及电子显微镜等设备，虽然血清学法特异性比较强，但在病毒浓度较低时，制备的抗血清效价不高，检测效果不理想。
在我国烟草病毒的检测方法主要是采用酶联免疫吸附法(ELISA)、PCR检测法和核酸点杂交法等。这些方法仅适宜于实验室检测，不能用于田间快速检测。而且目前烟草病毒的检测试纸条，每种试纸条只能检测一种烟草病毒，功能单一。
发明内容
本发明的目的就在于提供一种可快速简便地进行检测且可靠性高的烟草复合病毒田间快速检测试纸条，以及这种试纸条的制备方法。
本发明的目的可通过以下措施来实现：
烟草复合病毒田间快速检测试纸条，该试纸条是在PVC层上设胶体金层析检测试纸，胶体金层析检测试纸的一端搭接引水层，另一端搭接吸水层，胶体金抗体结合物硝酸纤维素膜设在引水层下与胶体金层析检测试纸衔接，胶体金层析检测试纸上设检测线和质控线，检测线由羊多克隆抗体点样形成的，质控线是由兔多克隆抗体点样形成的。
上述烟草复合病毒田间快速检测试纸条的制备方法，由以下步骤：
a.烟草复合病毒抗原的制备：
①分别取感染烟草花叶病毒、烟草黄瓜花叶病毒和马铃薯Y病毒的发病烟草叶片，加两倍体积内含0.1％的巯基乙醇的0.1mol/LPBSpH7.2，研碎，过滤；
②在步骤①所得滤液中加7-9％正丁醇，搅拌12-18min；
③取步骤②所得滤液10000g离心30min，弃沉淀，得上清液；
④将步骤③所得上清液中加入3-5％PEG、2-4％NaCl搅拌至溶解，4℃冰箱内过夜；
⑤取步骤④所得溶液10000g离心12-18min，弃上清液；
⑥将步骤⑤所得沉淀物溶于0.01mol/L PBSpH7.2缓冲液中，缓冲液加入量是步骤④制得溶液每100ml加20ml的量，取10000g溶液离心12-18min，取上清；
⑦将步骤⑥所得上清液按每10ml加入0.4g NaCl及0.4g PEG，随加随搅拌至溶解，然后放置于4℃冰箱内过夜；
⑧取步骤⑦所得溶液10000g离心12-18min，弃上清液，按步骤⑦所得溶液每100ml用2ml的量的0.01mol/L PBS将沉淀物溶解；
⑨取步骤⑧所得溶液10000g离心12-18min，弃沉淀得上清液，上清液即为粗提纯病毒液，分别将提纯的病毒液体保存在4℃冰箱内即可；
⑩蔗糖梯度是用0.1mol/L PBSpH7.2缓冲液进行配制，配制成10％-40％的蔗糖浓度梯度，按等量小心依次从高浓度到低浓度加入到离心管中，在4℃下放置过夜，形成连续的密度梯度，将1.6ml病毒液加入梯度柱上，超速离心25000rpm，1.5h，弃上清，离心后将上清液中形成的条带从离心管中用注射器抽提出来，使用透析袋进行脱糖，脱糖后超速离心40000rpm，1.5h，弃上清，用1ml0.1mol/L pH7.2PBS缓冲液溶解所得的沉淀物，即为精提纯病毒液，作为纯化的烟草病毒抗原用；
b.兔多克隆抗体的制备：抗原注射量为0.1～0.2mg/kg，每次注射抗原用量0.03～0.1mg，选用2～3Kg的兔子，采取静脉注射方式注射，分三次完成，间隔时间为10d，用无菌生理盐水将抗原即纯化的烟草普通花叶病(TMV)、黄瓜花叶病(CMV)、马铃薯Y病毒病(PVY)稀释为2mg/ml，第一次注射加等量的完全Freund’s佐剂F5881(Sigma公司)，然混合均匀，注射便可，第二次注射是加等量的不完全佐剂F5506(Sigma公司)，混合均匀注射，第三次同第二次相同，末次注射10d后进行放血，放血前动物禁食12h，采用耳静脉放血40-60ml，收集后离心除去血细胞，纯化得兔多克隆抗体，将制得的兔多克隆抗体在-20℃保存，再将制得的烟草花叶病毒、烟草黄瓜花叶病毒和马铃薯Y病毒的兔多克隆抗体按重量比1∶1∶1混合得纯化的烟草复合病毒抗体，将制得的烟草复合病毒抗体在-20℃保存；
c.羊多克隆抗体：市场购买得到，本发明用的是北京瑞泽康科技有限公司，编号：JA27名称：羊抗兔IgG 规格：0.5ml；
d.胶体金的制备：取0.01％HAuCl4100ml，加入1％柠檬酸三钠水溶液2ml，加热煮沸15-30min，直至颜色变红，冷却至常温加入0.1M/L K2CO3溶液0.2-1ml，混匀即可，调pH至7.2-7.5，得胶体金溶液，然后用0.22μm滤膜进行过滤制得20-30nm胶体金颗粒；
e.胶体金抗体结合物的制备：取步骤b制得的1mg纯化的烟草复合病毒抗体，边搅拌边注入到30-60ml步骤d制得的胶体金溶液中，15-30度下搅拌1h，然后加入10％牛血清蛋白2-5ml，15-30度下搅拌5min，12000-15000rpm离心50min，沉淀溶于4-10ml TBS缓冲液中，所述缓冲液的成分及含量如下：四硼酸钠0.1g，BSA 0.25g，用6mol/L HCl调pH至7.4，补水至250mL，用0.45μ，用0.45μm滤膜过滤即可得到胶体金抗体结合物，4℃保存；
f.胶体金层析检测试纸制备：将步骤e制得的胶体金抗体结合物3ml和3ml稀释液混匀，所述稀释液的成分及含量如下：Na2HPO4·12H2O 6.1g，NaCl 8.5g，PVP405g，硼酸2.1g，PEG 1g，10％BSA 50mL，用6mol/L HCl调pH至7.0～7.5，加水使终体积为1L，将玻璃纤维素纸放入混匀后的溶液中浸泡5-15min，取出在25-41℃烘箱中烤干，热合封口，得胶体金抗体结合物玻璃纤维素纸，4℃保存备用；然后将步骤b制得的烟草复合病毒兔多克隆抗体用PBS PH7.4缓冲液稀释成3mg/ml，取1μl稀释后的烟草复合病毒兔多克隆抗体点样在NC膜上，即成检测线，所述的NC膜是硝酸纤维素膜，将步骤c的烟草复合病毒羊多克隆抗体用固相溶液稀释成1mg/ml，取1μl稀释后的烟草复合病毒羊多克隆抗体点样在NC膜上，即成质控线，这样带检测线和质控线的NC膜便是固相抗体NC膜，固相抗体NC膜在0.5％BSA封闭液中，37℃下孵育1h后，在0.02mol/L PBpH7.0洗涤液中洗2次，室温下风干即得胶体金层析检测试纸，4-8℃保存；
g.烟草复合病毒田间快速检测试纸条的制备：取一块洁净的PVC板，将步骤f制得的胶体金层析检测试纸固定在PVC板适当的位置上，将引水材料连接在的胶体金层析检测试纸下端即成吸水纸层，吸水材料连接在胶体金层析检测试纸的上端，胶体金抗体结合物玻璃纤维素膜置于引水材料下与胶体金层析检测试纸衔接，用切割机将组装后的PVC板纵向切成5-7mm宽的测试条，将其装入板壳即样品垫即可。
上述烟草复合病毒田间快速检测试纸条的制备方法，所述步骤a②在滤液中加8％正丁醇，搅拌15min，④在上清液中加入4％PEG、3％NaCl搅拌至溶解，4℃冰箱内过夜，⑤离心15min，⑧离心15min，⑨取步骤⑧所得溶液10000g离心15min，步骤d.胶体金的制备中加热煮沸23min，直至颜色变红，PH值调至7.4，步骤e.胶体金抗体结合物的制备：取步骤b制得的1mg纯化的烟草复合病毒抗体，边搅拌边注入到45ml胶体金溶液中，23度下搅拌1h，然后加入10％牛血清蛋白3.5ml，23度下搅拌5min，13500rpm离心50min，沉淀溶于7mlTBS缓冲液中，用0.45μm滤膜过滤即可得到胶体金-抗体结合物，4℃保存，步骤f.胶体金层析检测试纸制备：将步骤e制得的胶体金抗体结合物3ml和3ml TBS缓冲液混匀，滴加入玻璃纤维浸泡10min，取出在33℃烘箱中烤干，热合封口，4℃保存备用；步骤g.烟草复合病毒田间快速检测试纸条的制备：用切割机将组装后的PVC板纵向切成6mm宽的测试条，将其装入板壳即样品垫即可。
上述烟草复合病毒田间快速检测试纸条的制备方法：所述步骤b、c和d可以同时进行也可以分别进行。
上述步骤中，PVP是聚乙烯吡咯烷酮，PVP40是聚乙烯吡咯烷酮40000，PEG是聚乙二醇，PVP和PVP40是常规的生化试剂，BSA是牛血清蛋白，TrtonX是聚乙二醇辛基苯基醚，PB是聚丁烯。
本发明的优点：
本发明检测适温15-35℃，检样量0.1-0.3g的样品，相当于叶面积大约3-5cm2；将烟叶在装有缓冲液的塑料袋中研磨后，将试纸条浸入，30min出结果；假阳性率低于1％。可见本发明使用方便，特别适用于田间快速检测，并且可靠性很高，而且本发明能检测多种烟草病毒，适合烟草复合病毒的检测，功能较全面。
附图说明
图1是本发明的结构图；
图2是本发明的结构示意图。
具体实施方式
实施例列表如表1：
表1是本发明的实施例列表
表1
试纸条的使用步骤：取0.1-0.3g的烟叶样品，叶面积大约3-5cm2，在装有缓冲液的塑料袋中研磨后，将试纸条引水端插入检测样中，样品向试纸的另一端爬行。若试纸条上只有质控线出现红色而检测线未显色，结果为阴性；若试纸条上质控线和检测线均出现红色，结果为阳性；若试纸条上质控线和检测线均未显色，则说明次试纸条已经失效，结果无效。
Claims (4)
1、一种烟草复合病毒田间快速检测试纸条，其特征在于：该试纸条是在PVC层(7)上设胶体金层析检测试纸(1)，胶体金层析检测试纸(1)的一端搭接引水层(4)，另一端搭接吸水层(5)，胶体金抗体结合物玻璃纤维素纸(6)设在引水层(4)下与胶体金层析检测试纸(1)衔接，胶体金层析检测试纸(1)上设检测线(2)和质控线(3)，检测线(2)由兔多克隆抗体点样形成的，质控线(3)是由羊多克隆抗体点样形成的。
2、如权利要求1所述的烟草复合病毒田间快速检测试纸条的制备方法，其特征在于：由以下步骤：
a.烟草复合病毒抗原的制备：
①分别取感染烟草花叶病毒、烟草黄瓜花叶病毒和马铃薯Y病毒的发病烟草叶片，加两倍体积内含0.1％的巯基乙醇的0.1mol/LPBSpH7.2，研碎，过滤；
②在步骤①所得滤液中加7-9％正丁醇，搅拌12-18min；
③取步骤②所得滤液10000g离心30min，弃沉淀，得上清液；
④将步骤③所得上清液中加入3-5％PEG、2-4％NaCl搅拌至溶解，4℃冰箱内过夜；
⑤取步骤④所得溶液10000g离心12-18min，弃上清液；
⑥将步骤⑤所得沉淀物溶于0.01mol/L PBSpH7.2缓冲液中，缓冲液加入量是步骤④制得溶液每100ml加20ml的量，取10000g溶液离心12-18min，取上清；
⑦将步骤⑥所得上清液按每10ml加入0.4g NaCl及0.4g PEG，随加随搅拌至溶解，然后放置于4℃冰箱内过夜；
⑧取步骤⑦所得溶液10000g离心12-18min，弃上清液，按步骤⑦所得溶液每100ml用2ml的量的0.01mol/L PBS将沉淀物溶解；
⑨取步骤⑧所得溶液10000g离心12-18min，弃沉淀得上清液，上清液即为粗提纯病毒液，分别将粗提纯的病毒液体保存在4℃冰箱内即可；
⑩蔗糖梯度是用0.1mol/L PBSpH7.2缓冲液进行配制，配制成10％-40％的蔗糖浓度梯度，按等量小心依次从高浓度到低浓度加入到离心管中，在4℃下放置过夜，形成连续的密度梯度，将1.6ml病毒液加入梯度柱上，超速离心25000rpm，1.5h，弃上清，离心后将上清液中形成的条带从离心管中用注射器抽提出来，使用透析袋进行脱糖，脱糖后超速离心40000rpm，1.5h，弃上清，用1ml0.1mol/L pH7.2PBS缓冲液溶解所得的沉淀物，即为精提纯病毒液，作为纯化的烟草病毒抗原用；
b.兔多克隆抗体的制备：抗原注射量为0.1～0.2mg/kg，每次注射抗原用量0.03～0.1mg，选用2～3Kg的兔子，采取静脉注射方式注射，分三次完成，间隔时间为10d，用无菌生理盐水将抗原即纯化的烟草普通花叶病(TMV)、黄瓜花叶病(CMV)、马铃薯Y病毒病(PVY)稀释为2mg/ml，第一次注射加等量的完全Freund’s佐剂F5881(Sigma公司)，然混合均匀，注射便可，第二次注射是加等量的不完全佐剂F5506(Sigma公司)，混合均匀注射，第三次注射步骤同第二次相同，末次注射10d后进行放血，放血前动物禁食12h，采用耳静脉放血40-60ml，收集后离心除去血细胞，纯化得兔多克隆抗体，将制得的兔多克隆抗体在-20℃保存，再将制得的烟草花叶病毒、烟草黄瓜花叶病毒和马铃薯Y病毒的兔多克隆抗体按重量比1∶1∶1混合得纯化的烟草复合病毒抗体，将制得的烟草复合病毒抗体在-20℃保存；
c.羊多克隆抗体：从市场购买羊多克隆抗体；
d.胶体金的制备：取0.01％HAuCl4 100ml，加入1％柠檬酸三钠水溶液2ml，加热煮沸15-30min，直至颜色变红，冷却至常温加入0.1M/L K2CO3溶液0.2-1ml，混匀即可，调pH至7.2-7.5，得胶体金溶液，然后用0.22μm滤膜进行过滤制得20-30nm胶体金颗粒；
e.胶体金抗体结合物的制备：取步骤b制得的1mg纯化的烟草复合病毒抗体，边搅拌边注入到30-60ml步骤d制得的胶体金溶液中，15-30度下搅拌1h，然后加入10％牛血清蛋白2-5ml，15-30度下搅拌5min，12000-15000rpm离心50min，沉淀溶于4-10mlTBS缓冲液中，用0.45μm滤膜过滤即可得到胶体金抗体结合物，4℃保存；
f.胶体金层析检测试纸制备：将步骤e制得的胶体金抗体结合物3ml和3ml稀释液混匀，所述稀释液成分及含量如下：Na2HPO4·12H2O 6.1g，NaCl 8.5g，PVP405g，硼酸2.1g，PEG 1g，10％BSA 50mL，用6mol/L HCl调pH至7.0～7.5，加水至体积为lL；把玻璃纤维素纸放入混匀后的溶液中浸泡5-15min，取出在25-41℃烘箱中烤干，热合封口，得胶体金抗体结合物玻璃纤维素纸，4℃保存备用；然后将步骤b制得的烟草复合病毒兔多克隆抗体用PBS PH7.4缓冲液稀释成3mg/ml，取1μl稀释后的烟草复合病毒兔多克隆抗体点样在NC膜上，即成检测线，将步骤c的烟草复合病毒羊多克隆抗体用固相溶液稀释成1mg/ml，取1μl稀释后的烟草复合病毒羊多克隆抗体点样在NC膜上，即成质控线，固相抗体NC膜在封闭液中，所述封闭液是0.5％PVP，0.5％Triton X-100，37℃下孵育1h后，在0.02mol/LPB pH7.0的洗涤液中洗2次，室温下风干即得胶体金层析检测试纸，4-8℃保存；
g.烟草复合病毒田间快速检测试纸条的制备：取一块洁净的PVC板，将步骤f制得的胶体金层析检测试纸固定在PVC板适当的位置上，将引水材料连接在的胶体金层析检测试纸下端即成吸水纸层，吸水材料连接在胶体金层析检测试纸的上端，胶体金抗体结合物玻璃纤维素膜置于引水材料下与胶体金层析检测试纸衔接，用切割机将组装后的PVC板纵向切成5-7mm宽的测试条，将其装入板壳即样品垫即可。
3、根据权利要求2所述的烟草复合病毒田间快速检测试纸条的制备方法，其特征在于：所述步骤a②在滤液中加8％正丁醇，搅拌15min，④在上清液中加入4％PEG、3％NaCl搅拌至溶解，4℃冰箱内过夜，⑤离心15min，⑧离心15min，⑨取步骤⑧所得溶液10000g离心15min，步骤d.胶体金的制备中加热煮沸23min，直至颜色变红，PH值调至7.4，步骤e.胶体金抗体结合物的制备：取步骤b制得的1mg纯化的烟草复合病毒抗体，边搅拌边注入到45ml胶体金溶液中，23度下搅拌1h，然后加入10％牛血清蛋白3.5ml，23度下搅拌5min，13500rpm离心50min，沉淀溶于7ml TBS缓冲液中，用0.45μm滤膜过滤即可得到胶体金-抗体结合物，4℃保存，步骤f.胶体金层析检测试纸制备：将步骤e制得的胶体金抗体结合物3ml和3ml TBS缓冲液混匀，滴加入玻璃纤维浸泡10min，取出在33℃烘箱中烤干，热合封口，4℃保存备用；步骤g.烟草复合病毒田间快速检测试纸条的制备：用切割机将组装后的PVC板纵向切成6mm宽的测试条，将其装入板壳即样品垫即可。
4、根据权利要求2或3所述的烟草复合病毒田间快速检测试纸条的制备方法：其特征在于：所述步骤b、c和d可以同时进行也可以分别进行。
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