BRPI0611866A2 - dispositivo de imunoensaio e método para imobilizar cardiolipina imunorreativa - Google Patents

Abstract

DISPOSITIVO DE IMUNOENSAIO E MéTODO PARA IMOBILIZAR CARDIOLIPINA IMUNORREATIVA. A presente invenção refere-se a composições, métodos e dispositivos para a detecção de anticorpos antilipoidais e o diagnóstico de doença, por exemplo, sífilis que são descritos. Em particular, é descrito um método para imobilizar um antígeno lipoidal, compreendendo cardiolipina, lecitina, e colesterol, sobre um suporte sólido (tal como uma membrana de nitrocelulose). A capacidade para imobilizar um antígeno lipoidal sobre uma membrana satisfaz a necessidade há muito tempo existente de teste à base de membrana para a detecção de anticorpos antilipoidais. Também são descritos dispositivos de imunoensaio para realizar simultaneamente testes treponemais e não treponemais para sífilis.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "DISPOSITIVODE IMUNOENSAIO E MÉTODO PARA IMOBILIZAR CARDIOLIPINA IMUNORREATIVA".

REFERÊNCIA CRUZADA COM REFERÊNCIAS RELACIONADAS

Este requerimento reivindica o benefício do Requerimento dePatente Provisório dos Estados Unidos N2 60/693.120, arquivado em 21 dejunho de 2005, cuja aplicação é por este incorporada por meio de referênciaem sua totalidade.

RECONHECIMENTO DE SUPORTE DO GOVERNO

Esta invenção foi feita pelo National Center for HIV, STD, and TBPrevention, Division of AIDS, STD, and TB Laboratory Research, LaboratoryReference and Research Branch, Centers for Disease Control and Prevention,uma agência do Governo dos Estados Unidos.

CAMPO

Esta descrição refere-se a métodos para imobilizar um antígenolipoidal a um suporte sólido e imunoensaios e dispositivos de imunoensaiorelacionados (tais como, tiras de teste, dispositivos de fluxo direto, oudispositivos de fluxo lateral), cujas provas e dispositivos são úteis, por exemplo,para detecção de anticorpos antilipoidais e/ou diagnóstioo de doença (tal como, sífilis).

ANTECEDENTES

A sífilis é uma doença sexualmente transmitida (DST) causadapelo espiroqueta da bactéria Treponema pallidum. Mais de 100.000 casos desífilis em adultos são reportados em todo o mundo a cada ano. Além disso, adoença é transmitida congenitamente e afeta 3.000 ou mais criançasanualmente. O curso da infecção por sífilis dura muitos anos e pode levar auma variedade de apresentações clínicas, as quais são caracterizadas porquatro estágios.

O estágio primário de infecção por sífilis ocorre 10 a 100 diasdepois da infecção bacteriana, e se caracteriza pelo aparecimento de um oumais cancros (úlceras indolores, vermelhas, exangues, tipicamente de menosde 1 cm de diâmetro). Os cancros podem aparecer sobre a genitália ouem outra parte sobre o corpo. Um cancro dura 3 a 6 semanas e se cura semtratamento, deixando uma pequena cicatriz. As pessoas infectadas são con-tagiosas durante este estágio.

O estágio secundário de infecção por sífilis se caracteriza porlesões de pele semelhantes a rash que podem cobrir parte do corpo ou todoo corpo. As lesões de pele são geralmente indolores e aparecem 1 a 6 me-ses depois do início do um ou mais cancros iniciais. As lesões de pele po-dem se assemelhar a verrugas, pústulas, ou úlceras. Caso não tratadas, e-las se curam em 2 a 12 semanas sem cicatrização. Também pode ocorrerfebre, dor de garganta, astenia, perda de peso, dilatação dos linfonodos, eperda dos cílios e/ou parte das sobrancelhas durante este estágio de infec-ção. Além disso, os sintomas podem progredir para sífilis meningovascular,a qual se caracteriza por inflamação do revestimento do cérebro e da medu-la espinhal e/ou alterações na vasculatura do cérebro. As pessoas infecta-das também são contagiosas na fase secundária.

O estágio seguinte desta doença é sífilis latente ou o estágioocultos. Durante este estágio, a pessoa infectada parece ter se recuperado eestá assintomática. Este estágio dura toda a vida em aproximadamente doisterços das pessoas que não são tratadas para sífilis. Durante o primeiro anode latência, podem ocorrer recaídas dos sintomas do estágio secundário.Exceto durante uma recaídas, as pessoas infectadas não são contagiosasdurante este estágio latente; no entanto, as crianças nascidas de mães Ia-tentemente infectadas dentro de quatro anos do aparecimetno do cancroprimário podem contrair sífilis congênita.

A sífilis tardia ou terciária é o estágio final da infecção não trata-da. Este estágio pode ocorrer tão cedo quanto um ano depois de infecção oua qualquer momento depois disso com 10 a 20 anos sendo o mais comum. Asífilis benigna, caracterizada por lesões denominadas gomas, pode ocorrernos ossos, na pele, e nos órgãos internos. A morte é rara, mas pode ocorrerdor e desfiguramento severo. A sífilis cardiovascular se caracteriza por aneu-rismas aórticos bem como outros problemas cardiovasculares e freqüente-mente resulta em morte. Pode ocorrer envolvimento neurológico nos está-gios iniciais da sífilis bem como se manifestar como sintomas de estágiosfinais. No último estágio da doença, a neurossífilis pode ser assintomática ouo paciente pode ter graves problemas neurológicos tais como possível de-mência, insanidade, debilitação da mobilidade, cegueira, surdez, ou mesmomorte.

A reação imune na sífilis envolve a produção de (i) anticorpostreponemais, os quais são específicos para antígenos de T. pallidum, e (i-i) anticorpos antilipoidais, os quais reconhecem material Iipoidal liberado pe-las células hospedeiras danificadas, material semelhante a lipoproteína epossivelmente cardiolipina liberada pelos treponemas. O esteio da triagem edo diagnóstico da sífilis é experimentação sorológica para um ou outro ouambos tipos de anticorpos.

Os testes para anticorpos antilipoidais (freqüentemente denomi-nados "testes não treponemais") são tipicamente baseados em um antígenocomposto de cardiolipina, colesterol e Ieticina naturais. Os testes não trepo-nemais amplamente usados (por exemplo, teste VDRL (Venereal DiseaseResearch Laboratory) e teste RPR (Rapid Plasma Reagin )) monitoram, oumicroscopicamente (por exemplo, teste VDRL) ou macroscopicamente (porexemplo, teste RPR), a formação de um floculento consistindo em comple-xos antígeno-anticorpo. Os testes não treponemais têm a vantagem de esta-rem amplamente disponíveis, serem econômicos e convenientes para reali-zar em grandes números de amostras. Além disso, como os títulos de anti-corpos antilipoidais diminuem com o tratamento para sífilis bem-sucedido,eventualmente desaparecendo na maioria dos pacientes, enquanto os títulosde anticorpos treponemais permanecem elevados por anos ou mesmo portoda a vida, os testes não treponemais são considerados a melhor escolhapara monitoração do tratamento ou experimentação para reinfecção.

Os testes treponemais se baseiam em antígenos derivados deT. pallidum e incluem a aglutinação de partículas de T. pallidum (TP-PA), oteste de anticorpo treponemal fluorescente absorvido (FTA-ABS) e imunoen-saios enzimáticos. Os testes treponemais são usados essencialmente paraverificar a reatividade em testes não treponemais. O teste treponemal tam-bém pode ser usado para confirmar uma impressão clínica de sífilis na qualo teste não treponemal é não reativo. Os testes treponemais são tecnica-mente mais difíceis, consomem tempo, e são caros de realizar e não podemser usados para monitorar tratamento porque o teste permanecerá reativopor anos ou por toda a vida em aproximadamente 85% das pessoas tratadaspara sífilis com sucesso.

Cada um dos testes de anticorpos descritos acima é realizadousando uma amostra de soro que é obtida em uma situação clínica e envia-do a um laboratório para análise. Portanto, os resultados dos testes tipica-mente não estão disponíveis por vários dias depois da amostra ser coletada.

Devido à freqüente dificuldade para rastrear pacientes com DSTs, o desen-volvimento de um teste rápido de ponto de atendimento é necessário paraajudar o clínico a fazer um parecer, preferencialmente no dia da prova.

Dispositivos de imunoensaio (tais como tiras de teste, dispositi-vos de fluxo direto, ou dispositivos de fluxo lateral), os quais oferecem resul-tados locais rápidos, estão disponíveis para testar qualitativametne níveisséricos de anticorpos treponemais (por exemplo, DiaSys Corporation; ACONLaboratories, Inc.; Biokit, S.A.; Genix Technology; Standard Diagnostics;Cortez Diagnostics, Inc.; e Phoenix Bio-Tech Corp). No entanto, testes aná-Iogos para anticorpos antilipoidais têm sido mais difíceis de desenvolver nomínimo em parte porque os antígenos hidrofóbicos dos anticorpos antilipoi-dais (por exemplo, antígenos de VDRL, USR ou RPR, ou cardiolipina) resis-tem a fixação a suportes sólidos, os quais são um elemento de um dispositi-vo de imunoensaio.

De acordo com alguns especialistas, a detecção da sífilis seriaadicionalmente auxiliada por uma combinação de um teste não treponemal eum teste treponemal para fins de triagem e diagnóstico. Esta é uma aborda-gem defendida pela Organização Mundial de Saúde, Treponemal Infections,Technical Report Series 674, Geneva: WHO, 1982. Um teste fácila de usar,rápido de ponto de atendimento capaz de detectar simultaneamente tantoanticorpos treponemais quanto não treponemais ajudaria a tratar desta ne-cessidade há muito tempo existente.SUMARIO

Esforços para desenvolver imunoensaios não solução para testenão treponemal (ou teste combinado treponemal e não treponemal) têm sidofrustrados pela dificuldade de fixar antígenos especificamente reconhecidospor anticorpos antilipoidais (referidos como "antígenos lipoidais"), tais comocardiolipina, antígeno de VDRL1 antígeno de USR e semelhantes, a umsubstrato sólido, tal como uma tira de nitrocelulose. Por exemplo, o tamanhomuito pequeno da molécula de cardiolipina resultou em localização insignifi-cante desta molécula sobre um substrato sólido. Embora o tamanho da mo-lécula de cardiolipina possa ser aumentado conjugando cardiolipina a molé-culas maiores (tais como proteínas), as conjugações referidas resultaram naperda de antigenicidade da cardiolipina. Mais geralmente, o alto grau de hi-drofobicidade dos antígenos lipoidais torna difícila ligar os antígenos referi-dos a muitas superfícies sólidas, tais como nitrocelulose e outras membra-nas microporosas.

A presente descoberta proporciona uma abordagem para fixarcom segurança antígenos lipoidais (os quais são compostos de, no mínimo,cardiolipina, fosfatidilcolina (também referida como "lecitina"), e colesterol) aum sólido substrato (tal como, uma membrana microporosa) ao mesmo tem-po que mantendo a antigenicidade e a especificidade do antígeno para anti-corpos antilipoidais. Usando métodos descritos aqui, neste requerimento depatente, atualmente é possível fixar antígeno Iipoidal a uma variedade desuportes sólidos. A capacidade para fixar o antígeno Iipoidal nesta maneirapossibilita que este seja usado, por exemplo, em dispositivos de imunoen-saio para teste rápido local de anticorpos não treponemais. Em algumasmodalidades, dispositivos de imunoensaio descritos também incorporam an-tígenos de T. pallidum que são reconhecidos por anticorpos treponemais, detal modo que o dispositivo convenientemente e simultaneamente detectatanto anticorpos não treponemais (isto é, antilipoidais) quanto treponemais(isto é, anti-T. pallidum).

Em um exemplo em particular, um antígeno Iipoidal compreen-dendo cardiolipina, lecitina e colesterol é contactado com uma população defragmentos Fab específicos para o antígeno Iipoidal para proporcionar umcomplexo de antígeno lipoidal-Fab, cujo complexo é prontamente fixável aum suporte sólido, tal como um substrato permeável de um fluxo direto oudispositivo de fluxo lateral.

Os precedentes e outras características e vantagens se tornarãomais evidentes a partir da seguinte descrição detalhada de várias modalida-des, a qual prossegue com referência aos desenhos the anexados.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

A FIGURA 1 é um rastreamento da absorvência a 280 nm doeluente de uma coluna de Proteína A carregada com IgG purificada digeridapor papaína. Foi usado um Detector de Absorvência/Fluorescência ISCOUA-5 ajustado para sensibilidade 2 e velocidade de diagrama 1.5 para cole-tar os dados. Tampão de elutriação de glicina foi adicionado à coluna quan-do a absorvência a 280 nm do eluente retornou à linha basal depois de elu-triação do Pico I.

A FIGURA 2 mostra uma imagem digital de um gradiente de gelSDS. Alamedas (1) padrões de peso molecular (a partir do topo: 203, 135,83, 41, 31, 17, e 7 kD); (2) precipitado de sulfato de amônio de soro sifilíticohumano; (3) proteínas precipitadas por sulfato de amônio não retidas porProteína A (pico I); (4) IgG purificada por Proteína A precipitado de sulfato deamônio (pico II); (5) IgG purificada por Proteína A antes de digestão por pa-paína; (6) IgG purificada por Proteína A depois de digestão por papaína;(7) proteínas da digestão de IgG por papaína que não foram retidas por Pro-teína A (pico I) (predominantemente fragmentos Fab); (8) proteínas retidaspor Proteína A de digestão de IgG por papaína (incluindo fragmentos Fe); e(9) padrões de peso molecular (a partir do topo: 207, 116, 98, 55, 37, 30, 20e 7 kD).

A FIGURA 3 mostra uma série de hastes graduadas de nitroce-lulose preparadas conforme descrito no Exemplo 7. As hastes graduadasforam pintadas com IgG ou fragmentos Fab ou Fc conforme indicado, e pos-teriormente mergulhadas em uma solução contendo Proteína A conjugada aouro.A FIGURA 4 mostra uma série de hastes graduadas de nitroce-Iulose preparadas conforme descrito no Exemplo 8. As hastes graduadasforam pintadas com um antígeno de USR revestido com a quantidade indi-cada de fragmento Fab, e posteriormente mergulhadas em uma soluçãocontendo Proteína A conjugada a ouro e soro reativo para sífilis (R) ou soronão reativo para sífilis (NR).

A FIGURA 5 é um gráfico da OD58O para misturas de IgG an-ti-humana de coelho (Fc) com ouro coloidal como uma função do pH. Con-forme descrito no Exemplo 9, um pH útila no qual obter um conjugado deouro estável para estes reagentes é o pH correspondente à menor OD580.

A FIGURA 6 é um gráfico da OD580 para misturas de IgG an-ti-humana de coelho (Fc) com ouro coloidal como uma função da concentra-ção da IgG anti-humana de coelho (Fc) . Conforme descrito no Exemplo 10,a concentração de proteína que produz a menor OD580 representa uma con-centração útila de IgG anti-humana de coelho (Fc) para associada com par-tículas de ouro.

A FIGURA 7 mostra uma imagem digital de cinco diferentesmodalidades físicas de dispositivos de fluxo lateral que podem ser usadoscom os métodos descritos. As modalidades de dispositivos mostrados em(A), (B) e (E) são configuradas de modo que cada uma pode ser mergulha-da, ou parcialmente submersa, na amostra ou em uma solução contendoamostra. As modalidades de dispositivos mostrados em (C) e (D) são confi-guradas de modo a receber um volume da amostra (ou uma solução conten-do amostra) gota a gota em uma porta de introdução de amostra.

A FIGURA 8 é uma vista em perspectiva de uma modalidade fí-sica de um dispositivo de fluxo lateral, com uma porção do estojo desprendi-da para mostrar os componentes básicos do dispositivo e sua relação unscom os outros.

A FIGURA 9 é uma representação esquemática de uma modali-dade de um antígeno Iipoidal imobilizado e a captura de um analite de anti-corpo antilipoidal.

FIGURA 10 proporciona uma ilustração de um dispositivo de flu-xo direto típico para detecção simultânea de anticorpos treponemais e nãotreponemais na sífilis. O dispositivo é configurado para receber um volumeda amostra gota a gota em uma porta de introdução da amostra (localizadano centro do dispositivo).

DESCRIÇÃO DETALHADA

I. Introdução

São descritos aqui, neste requerimento de patente, dispositivosde imunoensaio para determinar a presença e/ou quantidade de um anticor-po antilipoidal em uma amostra de fluido, tal como soro humano. Os disposi-tivos referidos incluem um substrato microporoso (tal como nitrocelulose,náilon, fluoreto de polivinilideno (PVDF), polietersulfona, policarbonato, poli-éster, acetato de celulose, ésteres celulósicos mistos, ou combinações dosmesmos). O substrato inclui, entre outras coisas, uma área de captura antili-poidal na qual é imobilizado um complexo de antígeno lipoidal-anticorpo ân-cora. O complexo referido tem um componente de anticorpo âncora, o qual éimobilizado sobre o substrato, e um componente de antígeno lipoidal, o qualé especificamente ligado por o anticorpo âncora e é deste modo ancoradoao substrato. O componente de antígeno lipoidal inclui cardiolipina, Iecitina ecolesterol e pode ser especificamente ligado por anticorpos antilipoidais (taiscomo anticorpos de reagina presentes em sujeitos infectados com T. pallidum).

Outras modalidades de dispositivo adicionais incluem uma áreade aplicação da amostra e um caminho de fluxo da área de aplicação daamostra para a área de captura antilipoidal. A área de aplicação da amostraestá em contato contínuo do fluido com a área de captura antilipoidal de talmodo que uma amostra de fluido disposta na área de aplicação da amostrapode fluir através de ou ao longo da membrana (por exemplo, por ação capi-lar ou fluxo cromatográfico) para a área de captura de anticorpo antilipoidal.A presença e/ou quantidade de um anticorpo antilipoidal na amostra de flui-do pode ser detectada por formação de um complexo entre o anticorpo anti-lipoidal e o complexo de antígeno lipoidal imobilizado-anticorpo âncora. AL-guns dispositivos descritos também incluem um bloco absorvente, o qualestá em contato com a membrana e serve como um reservatório para a a-mostra depois de entrar em contato com a uma ou mais áreas de captura.

Em exemplos particulares, um dispositivo revelado é um dispositivo de fluxolateral ou um dispositivo de fluxo direto.

Em algumas modalidades, o anticorpo âncora é um fragmentoFab específico para cardiolipina. Em outros casos, uma pluralidade de frag-mentos Fab produzidos a partir de imunoglobulinas isolado de um ou maissujeitos infectados com T. pallidum servem como anticorpos âncora. Algu-mas modalidades de dispositivo incluem um antígeno Iipoidal que é um antí-geno de USR, um antígeno de VDRL, ou um antígeno de VDRL sintético.

Em alguns casos (por exemplo, para um dispositivo de fluxo direto), umsubstrato (tal como uma membrana de nitrocelulose) tem um tamanho deporo de cerca de 0,2 μιτι a cerca de 8 μιτι. Em outros casos (por exemplo,para um dispositivo de fluxo lateral), um substrato (tal como uma membranade nitrocelulose) tem um tamanho de poro até cerca de 12μηι. Em aindaoutras modalidades de dispositivo, a área de captura de anticorpo antilipoidalcompreende uma ou mais linhas, as quais, em alguns exemplos, podem teruma largura de cerca de 8 mm a cerca de 15 mm.

Em dispositivos típicos, o complexo de antígeno Iipoidal-anticorpo âncora é imobilizado sobre a membrana por um método envolven-do (a) contactar o antígeno Iipoidal com um ou mais anticorpos âncora espe-cíficos para no mínimo um entre cardiolipina, lecitina, ou colesterol para for-mar o complexo de antígeno lipoidal-anticorpo âncora; e (b) aplicar o com-plexo de antígeno lipoidal-anticorpo âncora à membrana. Em exemplos maisespecíficos, o complexo de antígeno lipoidal-anticorpo âncora é imobilizadosobre a membrana por um método envolvendo (i) imobilizar um anticorpoâncora específico para no mínimo um entre cardiolipina, lecitina, ou coleste-rol sobre a membrana; (ii) bloquear sítios de ligação não específicos sobre amembrana; (iii) contactar o anticorpo âncora imobilizado com antígeno Iipoi-dal para formar um complexo de antígeno lipoidal-anticorpo âncora; e(iv) lavar a membrana para remover qualquer antígeno Iipoidal não ligado.

Exemplos descritos do dispositivo proporcionam um anticorpoâncora ligado a um epítope que ocorre naturalmente em um componente doantígeno Iipoidal (por exemplo, cardiolipina ou colesterol) e não a um grupoderivado introduzido no antígeno para os fins de proporcionar um sítio deligação para o anticorpo âncora. Por exemplo, o anticorpo âncora não liga aum componente do antígeno Iipoidal biotinilado (tal como Iecitina ou cardioli-pina biotinilada).

Em algumas modalidades, um dispositivo de imunoensaio reve-lado inclui adicionalmente uma área de captura treponemal tendo ou (a) umantígeno treponemal imobilizado capaz de ser especificamente ligado porum anticorpo anti-r. pallidum, ou (b) um anticorpo anti-T. pallidum imobiliza-do que liga especificamente um antígeno treponemal móvel. Nestas modali-dades, uma amostra de fluido aplicada na área de aplicação da amostra po-de fluir através de ou ao longo da membrana para a área de captura de anti-corpo antilipoidal e para a área de captura treponemal.

Também descritos aqui, neste requerimento de patente, sãodispositivos de fluxo lateral para determinar a presença e/ou quantidade deum anticorpo antilipoidal em uma amostra de fluido. Estes dispositivos tipi-camente incluem uma área de aplicação da amostra e uma: área de capturade anticorpo antilipoidal isolada na qual é proporcionado um complexo deanticorpo âncora imobilizado-antígeno Iipoidal cujo complexo tem uma afini-dade de ligação específica para um anticorpo antilipoidal de fase móvel.Qualquer líquido (tais como uma amostra biológica de fluido) aplicado naárea de aplicação da amostra flui ao longo de um caminho de fluxo da áreade aplicação da amostra para a área de captura de anticorpo antilipoidal. Ocaminho de fluxo pode continuar para um bloco absorvente a jusante asso-ciado com o dispositivo de fluxo lateral, o qual age, no mínimo em parte, co-mo um reservatório líquido. A formação de um complexo entre o anticorpoantilipoidal e o complexo de antígeno Iipoidal imobilizado pode ser detectadapara determinar a presença e/ou quantidade de o anticorpo antilipoidal emuma amostra de fluido.

Em algumas modalidades do dispositivo de fluxo lateral, um blo-co de conjugado é colocado no caminho de fluxo da área de aplicação daamostra para a área de captura de anticorpo antilipoidal. O bloco de conju-gado inclui um reagente detector móvel ou mobilizável para um anticorpoantilipoidal, de tal modo que o fluxo de líquido através do bloco move o rea-gente detector para a área de captura de anticorpo antilipoidal. A formaçãode um complexo entre o reagente detector, anticorpo antilipoidal, e o com-plexo de anticorpo âncora-antígeno Iipoidal proporciona um indicador visívelou detectável de modo diverso da presença do anticorpo antilipoidal em umaamostra biológica. Em modalidades alternativas, o reagente detector não ésuprido em um bloco de conjugado, mas ao invés é aplicado à membranamicroporosa, por exemplo de um frasco de revelador.

Exemplos de um reagente detector incluem uma Proteína Amarcada, Proteína G, ou anticorpo anti-humano, em que a etiqueta é uma oumais de uma enzima, partícula de ouro coloidal, partícula de látex colorida,partícula de prata adsorvida a proteína, partícula de ferro adsorvido a proteí-na, partícula de cobre adsorvido a proteína, partícula de selênio adsorvido aproteína, partícula de enxofre adsorvido a proteína, partícula de telúrio ad-sorvido a proteína, partícula de carbono adsorvido a proteína, ou saco decorante acoplado a proteína.

Algumas modalidades do dispositivo de fluxo lateral também in-cluem uma área de captura treponemal no caminho de fluxo da área de apli-cação da amostra. A área de captura treponemal referida pode incluir, porexemplo, um antígeno treponemal imobilizado tendo uma afinidade de liga-ção para um anticorpo anti-T. pallidum móvel ou um anticorpo an-ti-7". pallidum imobilizado tendo uma afinidade de ligação para um organismode T. pallidum móvel ou antígeno de T. pallidum. O dispositivo de fluxo late-ral também pode ter um reagente detector móvel ou mobilizável específicopara o anticorpo treponemal no bloco do conjugado. O reagente detectorpara o anticorpo treponemal pode estar no mesmo ou em um bloco diferentedo reagente detector para o anticorpo antilipoidal. Em modalidades particula-res, um reagente detector específico para um anticorpo anti-T. pallidumcompreende Proteína A conjugada a ouro, Proteína G Fc-específica conju-gada a ouro, ou anticorpo anti-humano conjugado de ouro (porção Fe). Emoutras modalidades, uma área de captura treponemal pode incluir um anti-corpo anti-treponemal para captura de um antígeno treponemal móvel pre-sente em uma amostra de fluido. Em tais modalidades, um reagente detectorpara o antígeno treponemal móvel pode ser um anticorpo anti-antígeno tre-ponemal marcado com ouro.

Os dispositivos de imunoensaio descritos (por exemplo, disposi-tivo de fluxo direto ou de fluxo lateral) podem ser usados em métodos paradetectar anticorpos antilipoidais e/ou diagnosticar sífilis em um sujeito apli-cando uma amostra biológica (tal como, sangue, soro, exudado de úlcera depele, urina, saliva, ou escarro) de um sujeito a um dispositivo revelado e de-tectando a formação de um complexo entre o anticorpo antilipoidal, o com-plexo de anticorpo âncora-antígeno lipoidal, e um reagente detector de anti-corpo antilipoidal na área de captura. A detecção da formação do complexona área de captura detecta um anticorpo antilipoidal associado com infecçãopor T. pallidum ou a doença sífilis. Nestas modalidades nas quais o disposi-tivo inclui um bloco de conjugado no caminho de fluxo da área de aplicaçãoda amostra para a área de captura de cardiolipina, o complexo detectadoinclui o detector móvel ou mobilizável. Em outras modalidades nas quais oreagente detector é aplicado ao dispositivo a partir de uma fonte externa, ocomplexo detectado inclui o detector aplicado externamente. Em algumasmodalidades, um reagente detector é Proteína A marcada, Proteína G Fc-específica, ou anticorpo anti-humano.

Em modalidades particularmente vantajosas do método, o dis-positivo revelado é capaz de detectar tanto os anticorpos antilipoidais (osquais, por exemplo, são um indicador de infecção ativa) quanto anticorposanti-treponemais (os quais, por exemplo, verificam a reatividade do teste nãotreponemal). Nestas modalidades do dispositivo as quais incluem o antígenotreponemal, o método inclui detectar a formação de um complexo entre oanticorpo anti-7". pallidum, o antígeno treponemal imobilizado, e um reagentedetector na área de captura. Conforme com o reagente detector usado paraanticorpos antilipoidais, o reagente detector para os anticorpos treponemaispodem ser proporcionados sobre o dispositivo ou aplicados a partir de umafonte externa.

Também são descritos aqui, neste requerimento de patente, mé-todos para imobilizar cardiolipina imunorreativa sobre um suporte sólido (talcomo, nitrocelulose). Os métodos referidos envolvem (a) contactar um antí-geno lipoidal, compreendendo cardiolipina imunorreativa, com um ou maisanticorpos específicos a no mínimo um componente do antígeno lipoidal pa-ra formar um complexo de antígeno lipoidal-anticorpo; e (b) aplicar o com-plexo de antígeno lipoidal-anticorpo a um suporte sólido; em que a aplicaçãodo complexo de antígeno lipoidal-anticorpo ao suporte sólido imobiliza a car-diolipina imunorreativa sobre o suporte sólido. Em exemplos particulares, oantígeno lipoidal é um antígeno de USR, um antígeno de VDRL, ou um antí-geno de VDRL sintético. Em outros exemplos, o anticorpo é um fragmentode anticorpo que não reagirá substancialmente com Proteína A, Proteína GFc-específica, ou anticorpo anti-humano (porção Fc) (tal como, um fragmen-to Fab). Em ainda outros exemplos, o anticorpo é isolado do soro de um su-jeito infectado com T. pallidum ou inoculado com T. pallidum.

Outros métodos típicos para imobilizar cardiolipina imunorreativasobre um suporte sólido, envolvem (a) imobilizar um ou mais anticorpos es-pecíficos para cardiolipina, Iecitina e/ou colesterol sobre um suporte sólido;(b) bloquear sítios de ligação não específicos sobre o suporte sólido; (c) apli-car um antígeno lipoidal, compreendendo cardiolipina imunorreativa, Iecitinae/ou colesterol, ao suporte sólido para formar complexos de antígeno lipoi-dal-anticorpo imobilizado; e (d) lavar o suporte sólido para remover qualquerantígeno lipoidal que é não ligado especificamente por um ou mais anticor-pos imobilizados.

Também descritos aqui, neste requerimento de patente, são kitspara o diagnóstico de sífilis. Estes kits incluem um dispositivo revelado (talcomo um dispositivo de fluxo direto ou de fluxo lateral) e instruções para a-plicar a amostra biológica à área de aplicação da amostra ou do dispositivo.

O kit também pode incluir instruções para interpretar resultados do teste.

Os dispositivos descritos também podem ser usados em méto-dos para diagnosticar lúpus em um sujeito analisando uma amostra biológicado sujeito, aplicando a amostra biológica ao dispositivo e detectando a for-mação de um complexo entre o anticorpo antilipoidal, o complexo de anti-corpo âncora-antígeno lipoidal, e um reagente detector na área de captura. Adetecção da formação do complexo na área de captura detecta um anticorpoantilipoidal associado com lúpus. Em alguns casos, um ou mais co-fatores(tais como P2-glicoproteína I) estão presentes (tal como, adicionados a umaamostra) para a detecção de lúpus.

II. Abreviações e Termos

Ab anticorpo

HPLC cromatografia líquida de alta pressão

LFD Dispositivode fluxo lateral

PEG polietileno glicol

PVA álcool polivinílico

PVDF fluoreto de polivinilideno

PVP polivinila pirrolidona

SDS dodecila sulfato de sódio

USR recuperação de soro não aquecido

A menos que mencionado de modo diverso, os termos técnicossão usados de acordo com a utilização convencional. Definições de termoscomuns em biologia molecular podem ser encontradas em Benjamin Lewin,Genes V, publicado pela Oxford University Press, 1994 (ISBN 0-19-854287-9); Kendrew et al. (eds.), The Encyclopedia of Molecular Biology, publicadopela Blackwell Science Ltd., 1994 (ISBN 0-632-02182-9); e Robert A. Meyers(ed.), Molecular Biology e Biotechnology: a Comprehensive Desk fíeference,publicado pela VCH Publishers, Inc., 1995 (ISBN 1 -56081 -569-8).

De modo a facilitar a revisão das várias modalidades da invenção, são pro-procionadas as seguintes explicações de termos específicos:Analite: Um alvo, tal como um átomo, molécula, grupo de moléculas oucomposto de origem natural ou sintética (por exemplo, fármaco, hormônio,enzima, antígeno de fator de crescimento, anticorpo, hapteno, lectina, apo-proteína, ou cofator) que deve ser detectado ou medido que é capaz de ligarespecificamente a antígenos Iipoidais imobilizados descritos aqui, neste re-querimento de patente. Analites podem incluir, mas não estão limitados aanalites biológicos, anticorpos, fármacos, hormônios, antígenos, haptenos,lectinas, apoproteínas, ou cofatores. Em algumas modalidades, o analiteinclui anticorpos, tais como anticorpos antilipoidais (por exemplo, anticorposanti-cardiolipina), produzidos em resposta a infecção por T. pallidum. Emoutras modalidades, o analite inclui anticorpos antilipoidais produzidos emresposta a qualquer de (i) uma doença autoimune, tal como lúpus, (ii) váriosdistúrbios trombóticos venosos e arteriais, inclusive enfarte cerebral, (μ-ι) trombose venosa profunda, (iv) trombocitopenia

Anticorpo: Uma proteína consistindo em um ou mais polipeptídeos subs-tancialmente codificados por genes de imunoglobulina ou fragmentos de ge-nes de imunoglobulina. Os genes de imunoglobulina reconhecidos incluemos genes das regiões constantes kappa, lâmbda, alfa, gama, delta, épsilon emu, bem como a miríade de genes de regiões variáveis de imunoglobulina.

Cadeias leves são classificadas como ou kappa ou lâmbda. Cadeias pesa-das são classificadas como gama, mu, alfa, delta, ou épsilon, as quais porsua vez definem as classes de imunoglobulinas, IgG, IgM, IgA, IgD e IgE,respectivamente.

A unidade estrutural de imunoglobulina básica (anticorpo) geral-mente é um tetrâmero. Cada tetrâmero é composto de dois pares idênticosde cadeias de polipeptídeos, cada par tendo uma cadeia "leve" (cerca de 25kD) e uma "pesada" (cerca de 50-70 kD). O N-término de cada cadeia defineuma região variável de cerca de 100 a 110 ou mais aminoácidos essencial-mente responsáveis por reconhecimento antigênico. Os termos "cadeia levevariável" (Vl) e "cadeia pesada variável" (Vh) se referem, respectivamente, aestas cadeias leves e pesadas.

Anticorpos são produzidos naturalmente em plantas e animaisem resposta a antígenos apresentados ao sistema imune. Anticorpos produ-zidos naturalmente podem ser encontrados, por exemplo, no soro de umanimal. Por exemplo, uma pessoa infectada com T. pallidum tipicamenteproduzirá anticorpos no mínimo contra antígenos de T. pallidum e anticorposcontra material Iipoidal que resulta da infecção treponemal (por exemplo,anticorpos antilipoidais), por exemplo, de células hospedeiras danificadaspela infecção.

Anticorpos podem existir como imunoglobulinas intactas ou co-mo uma série de fragmentos bem caracterizados produzidos por digestãocom várias peptidases ou por métodos de DNA recombinante. Fragmentosde anticorpos típicos incluem, por exemplo, Fab1 Fab', F(ab')2, Fv, Fd, dAb,regiões determinantes de complementaridade (CDR), e anticorpos de cadeiaúnica (scFv). Um fragmento Fab é um fragmento monovalente consistindonos domínios VL, VH, CL e CH1; um fragmento F(ab')2 é um fragmento biva-lente compreendendo dois fragmentos Fab encadeados por uma ponte dis-sulfeto na região de articulação; um fragmento Fd consiste nos domínios VHe CH1; um fragmento Fv consiste dos domínios VL e VH de um único braçode um anticorpo; e um fragmento dAb consiste em um domínio VH (vide, porexemplo, Ward et ai, Nature, 341: 544-546, 1989; Fundamental Immuno-logy, W. E. Paul, ed., Raven Press, N.Y., 1993).

Apesar de alguns fragmentos de anticorpos serem definidos emtermos da digestão de um anticorpo intacto, será reconhecido que fragmen-tos Fab ou outros fragmentos de anticorpos podem ser sintetizados de novoou quimicamente ou utilizando metodologia de DNA recombinante. Portanto,o termo anticorpo conforme usado aqui, neste requerimento de patente,também inclui fragmentos de anticorpos ou produzidos pela modificação deanticorpos inteiros ou sintetizados de novo usando metodologias de DNArecombinante.

Antígeno: Um composto químico ou bioquímico, composição, estrutura, de-terminante, antígeno Ou porção do mesmo que pode estimular a produçãode anticorpos ou uma resposta de células T em um animal, incluindo compo-sições que são injetadas ou ábsorvidas em um animal. Um antígeno reagecom os produtos de imunidade humoral ou celular específice, incluindo asinduzidas por imunogênios heterólogos. O termo "antígeno" inclui todos osepítopes antigênicos relacionados.

Soro hiperimune [Antígeno-específico] : Anti-soro policlonal tendo especi-ficidade para um antígeno em particular (tal como, um antígeno Iipoidal e/oucardiolipina), cujo anti-soro é produzido em um sujeito em resposta a ataquerepetido (por exemplo, por injeção, infecção ou outra via) com o antígeno deinteresse (ou um organismo ou outra composição contendo ou produzindo oantígeno de interesse).

Anticorpo antilipoidal: Um anticorpo (tal como IgM ou IgG) tendo especifi-cidade para um antígeno Iipoidal (vide abaixo). Em alguns casos, anticorposantilipoidais são produzidos pelo sistema imune de um sujeito (tal como umser humano) em resposta a um estado de doença, tal como uma infecçãomicrobiana (por exemplo, bacteriana). Por exemplo, este termo contemplaanticorpos antilipoidais produzidos em conseqüência de infecção porT. pallidum. Embora não limitado pela teoria, imagina-se que anticorpos anti-lipoidais em sujeitos infectados com T. pallidum são produzidos em conse-qüência de lipídeos liberados de células hospedeiras e/ou material seme-lhante a lipoproteínas e possivelmente cardiolipina liberada por treponemas.Anticorpos antilipoidais também podem ser produzidos em resposta a doen-ças nãoís, incluindo, por exemplo (i) uma doença autoimune, tal como lúpus(Harris et ai, Clin. Rheum. Dis., 11:591-609, 1985), (ii) vários distúrbiostrombóticos venosos e arteriais, incluindo enfarte cerebral (Harris et ai, Clin.Exp. Rheumatol., 2:47-51, 1984), (iii) trombose venosa profunda (Mueh etai, Ann. Intern. Med., 92:156-159, 1980), (iv) trombocitopenia (Harris et ai,Clin. Rheum. Dis., 11:591-609, 1985), (v) embolismo pulmonar (Anderson eAli, Ann. Rheum. Dis., 43:760-763, 1984), ou (vi) perda fetal recorrente comenfarte placentário (Derue et ai, J. Obstet. Gynaecol., 5:207-209, 1985). An-ticorpos antilipoidais encontrados em doenças não treponemais podem ligarespecificamente um antígeno Iipoidal na presença de um ou mais co-fatores(tais como p2-glicoproteína I).

Anticorpos antilipoidais para uso em algumas modalidades dosmétodos e composições (por exemplo, dispositivos) descritos aqui, nesterequerimento de patente, pode ser de qualquer origem, mas freqüentementeserão encontrados no soro de um sujeito.

Afinidade de ligação: Um termo que se refere à força de ligação de umamolécula a outra em um sítio sobre a molécula. Se uma molécula em parti-cular ligará a ou especificamente associará com outra molécula em particu-lar, diz-se que estas duas moléculas apresentam afinidade de ligação umapela outra. A afinidade de ligação está relacionada com a constante de as-sociação e constante de dissociação por um par de moléculas, mas não écrucial para a invenção que estas constantes sejam medidas ou determina-das. Ao invés, afinidades conforme usado aqui, neste requerimento de pa-tente, para descrever interações entre moléculas dos métodos e dispositivosdescritos são geralmente afinidades aparentes (a menos que especificadode modo diverso) observadas em estudos empíricos, os quais podem serusados para comparar a força relativa com a qual uma molécula (por exem-plo, um anticorpo ou outro parceiro de ligação específico) ligará duas outrasmoléculas (por exemplo, um analite e um conjugado analite-traçador). Osconceitos de afinidade de ligação, constante de associação e constante dedissociação são de conhecimento geral.

Amostra Biológica: Qualquer amostra que pode ser obtida diretamente ouindiretamente de um sujeito, inclusive sangue total, plasma, soro, lágrimas,muco, saliva, urina, fluido pleural, fluido espinal, fluido gástrico, suor, sêmen,secreção vaginal, escarro, fluido de úlceras e/ou outras erupções superficiais(tais como bolhas, ou abscessos), fluido amniótico, fluido sinovial, fluido ce-rebroespinal, e/ou extratos de tecidos, células ou órgãos. A amostra biológi-ca também pode ser uma amostra de pesquisa laboratorial tal como um so-brenadante da cultura celular. A amostra é coletada ou obtida usando méto-dos de conhecimento geral daqueles versados na técnica.

Área de Captura: Uma região de um dispositivo de imunoensaio (tal comoum dispositivo de fluxo direto ou um dispositivo de fluxo lateral) onde um re-ágente de captura (tal como um complexo de anticorpo âncora-antígeno Ii-poidal) é imobilizado. Um dispositivo de imunoensaio pode ter mais de umaárea de captura, por exemplo, uma "área de captura primária," uma "áreade captura secundária," e assim por diante. Freqüentemente um reagentede captura diferente será imobilizado nas áreas de captura primária, secun-dária, ou diversa. Múltiplas áreas de captura pode ter qualquer orientaçãocom respeito umas às outras sobre o substrato; por exemplo, uma área decaptura primária pode ser distai ou proximal a uma área de captura secundá-ria (ou diversa) e vice-versa. Alternativamente, uma área de captura primáriae uma área de captura secundária (ou diversa) podem ser orientadas per-pendicularmente uma à outra de tal modo que as duas (ou mais) áreas decaptura formam uma cruz ou um sinal de mais ou outro símbolo.

Área de Captura de Anticorpo Antilipoidal: Uma área de captura em queum antígeno capaz de ser especificamente ligado por um anticorpo antilipoi-dal (tal como um complexo de antígeno lipoidal-anticorpo âncora) é imobili-zado como o reagente de captura.

Conjugado: Quando usado na forma de verbo, o termo "conjugado" significaa ligação de uma molécula (por exemplo, Proteína A, Proteína G, ou anticor-po de IgG anti-humana (Fc)) a outra molécula (por exemplo, ouro coloidal). Aligação referida pode envolver interações covalentes ou não covalentes (taiscomo eletrostáticas ou diversas) entre os componentes do conjugado. A Ii-gação referida pode ser realizada por meios químicos, quer com ou sem ouso de um grupo de ligação. Quando usado na forma de substantivo, o ter-mo "conjugado" significa um complexo molecular acoplado formado por con-jugação.

Detectar ou Detecção: Refere-se a determinar quantitativamente ou quanti-tativamente a presença do um ou mais analites sob investigação (por exem-plo, anticorpos antilipoidais e/ou anticorpos anti-T. pallidum ou antígenostreponemais). "Detectar a Formação de um Complexo" se refere a detec-tar um complexo compreendendo um reagente detector por qualquer métodoadequado para observar a etiqueta particular associada com o reagente de-tector; por exemplo, observação visual de uma etiqueta colorida (ou visívelde modo diverso), medição ou detecção visual de uma etiqueta fluorescente,quimiluminescente ou radioativa.

Reagente Detector (ou Agente de Detecção): Um reagente (ou série dereagentes) que permite a detecção específico de um complexo entre um a-nalite (tal como um anticorpo antilipoidal) e um reagente de captura (tal co-mo complexos de anticorpo âncora-antígeno lipoidal). Descrição adicional dereagentes detectores e reagentes detectores típicos específicos são propor-cionados abaixo.

Emulsão: Uma mistura de dois fluidos imiscíveis nos quais uma fase estápresente como uma dispersão coloidal na outra fase, a qual é referida comoa fase contínua, dispersante ou solvente. Algumas emulsões prontamente sesepararão quando forem deixadas em repouso impassível. Outras emulsõespodem permanecer misturadas por extensões de tempo consideráveis.

Epítope (ou determinante antigênico): Um local sobre a superfície de ummolécula de antígeno à qual uma molécula de anticorpo liga; geralmente umantígeno tem vários ou muitos diferentes determinantes antigênicos e reagecom anticorpos de muitras especificidades diferentes. Um "epítope exóge-no" é um epítope que não é encontrado naturalmente em molécula de antí-geno de interesse e o qual é tipicamente adicionado à molécula de antígenopara servir como um sítio de ligação para um anticorpo específico para (ououtro parceiro de ligação específico de) o epítope exógeno. Uma moléculade antígeno pode ser modificada quimicamente ou de modo diverso paraincluir um epítope exógeno. Por exemplo, uma molécula de antígeno podeser biotinilada (isto é, derivada com biotina) deste modo produzindo um epí-tope de biotina exógeno que pode ser ligado especificamente por um anti-corpo anti-biotina ou outro parceiro de ligação biotina-específico (tal como,avidina ou estrepavidina). Em algunas casos, um epítope exógeno é uma"etiqueta de epítope." Etiquetas de epítopes incluem seqüências de peptí-deos (tipicamente menos de cerca de 15 aminoácidos, mas podem sermesmo seqüências de proteína de extensão total) às quais um anticorpopode ligar especificamente. Etiquetas de epítopes comumente conhecidasincluem hexa-His, octa-His, FLAG, HA, e numerosas outras.

Imunogenicidade: A propriedade de ser capaz de provocar uma respostaimune dentro de um organismo. Por exemplo, cardiolipina retém imunogeni-cidade quando um anticorpo antilipoidal tem a capacidade de ligar um epíto-pe presente na cardiolipina.

Etiqueta: Qualquer molécula ou composição ligada a um analite, análogo deanalite, reagente detector, ou parceira de ligação que é detectável por meiosespectroscópicos, fotoquímicos, bioquímicos, imunoquímicos, elétricos, óti-cos ou químicos. Foram descritos exemplos de etiquetas, incluindo enzimas,partículas de ouro coloidal, partículas de látex coloridas (Patentes dos Esta-dos Unidos Nos. 4.275.149; 4.313.734; 4.373.932; e 4.954.452, cada umaincorporada por meio de referência aqui, neste requerimento de patente).

Exemplos adicionais de etiquetas úteis incluem, sem limitação, isótopos ra-dioativos, co-fatores, aglutinantes, agentes quimiluminescentes ou fluores-centes, partículas de prata adsorvidas a proteína, partículas de ferro adsor-vidas a proteína, partículas de cobre adsorvidas a proteína, partículas deselênio adsorvidas a proteína, partículas de enxofre adsorvidas a proteína,partículas de telúrio adsorvidas a proteína, partículas de carbono adsorvidasa proteína, e sacos de corante acoplados a proteína. A fixação de um com-posto (por exemplo, um reagente detector) a uma etiqueta pode ser atravésde ligações covalentes, processos de adsorção, ligações hidrofóbicas e/oueletrostáticas, como em quelatos e semelhantes, ou combinações destasligações e interações e/ou pode envolver um grupo de ligação.

Antígeno Lipoidal: Um antígeno incluindo (mas não limitado a) cardiolipina,Iecitina e colesterol que é capaz de ser especificamente ligado por anticor-pos antilipoidais. A natureza da cardiolipina, da Iecitina e do colesterol con-forme contemplado pelo termo "antígeno lipoidal" é discutida em detalhesalhures no relatório descritivo.

Membrana microporosa: Uma película ou estrutura fina tendo poros de ta-manho microscópico. Membranas microporosas no mínimo permitem quefluidos e analites solúveis passem ao longo ou através da membrana, porexemplo, por ação capilar. As membranas são feitas de uma ampla varieda-de de materiais ou compostos de materiais, incluindo, por exemplo, polieter-sulfona, náilon, policarbonato, poliéster, acetato de celulose, ésteres celuló-sicos mistos, fluoreto de polivinilideno, e/ou nitrocelulose. Tamanhos de po-ros adequados não Iimitantes podem ser até cerca de 0,22 mícron, de cercade 0,22 mícron a cerca de 0,45 mícron, de cerca de 0,22 mícron a cerca de0,65 mícron, de cerca de 0,22 micro a cerca de 0,8 mícron, de cerca de 0,22mícron a cerca de 1,2 mícron, de cerca de 0,65 mícron a cerca de 3 micra,de cerca de 0,65 mícron a cerca de 5 mícron, de cerca de 0,65 mícron a cer-ca de 8 micra, de cerca de 5 micra a cerca de 10 micra, ou de cerca de 5micra a cerca de 20 micra. Em casos particulares, o tamanho de poro podeser cerca de 0,22 mícron, cerca de 0,45 mícron, cerca de 0,65 mícron, cercade 0,8 mícron, cerca de 1,2 mícron, cerca de 3 micra, cerca de 5 micra, cer-ca de 8 micra, cerca de 10 micra, ou cerca de 20 micra. Qualquer membranaconhecida por aqueles versados na técnica adequada para dispositivos defluxo lateral ou de fluxo direto é prevista como estando dentro do escopo dotermo "membrana microporosa."

Proteína A e Proteína G: Proteína A é uma proteína isolada do Staphylo-coccus aureus. Proteína G é uma proteína isolada de uma Streptococcusspecies. Ambas as proteínas têm sítios de ligação para a porção Fc da IgGde mamífero. A Proteína G nativa também contém sítios de ligação para al-bumina, a região Fab de lgs, e regiões de ligação de membrana, as quaispodem levar a ligação não específica; no entanto, Proteína G recombinantefoi produzida para eliminar a albumina, Fab, e sítios de ligação de membranaao mesmo tempo que retendo o sítio de ligação de Fc, o que o torna especí-fico para a porção Fc de IgG. Conforme usado aqui, neste requerimento depatente, "Proteína G" se refere à forma recombinante Fc-específica de Pro-teína G (também referida como "Proteína G Fc-específica").

Parceiro de ligação específico (ou parceiro de ligação): Uma moléculaou composição capaz de reconhecer e ligar a um aspecto estrutural especí-fico de outra molécula ou composição. Pares típicos de parceiros de ligaçãoespecíficos incluem antígeno/anticorpo, hapteno/anticorpo, hormô-nio/receptor, filamento de ácido nucléico/filamento de ácido nucléico com-plementar, substrato/enzima, inibidor/enzima, carboodrato/lectina, bioti-na/(estrept)avidina, e vírus/receptor celular.

A expressão "liga especificamente a" se refere à capacidade de uma primei-ra espécie molecular (tal como um anticorpo) para ligar preferencialmente auma segunda espécie molecular (tal como um antígeno reconhecido peloanticorpo) em comparação com outra espécie molecular não específica. Porconseguinte, a expressão "capaz de ser especificamente ligada por" se refe-re à capacidade de uma primeira espécie molecular (tal como um antígeno)para ser preferencialmente reconhecida e ligada por uma segunda espéciemolecular (tal como um anticorpo específico para o antígeno) em compara-ção com outra espécie molecular não específica.

Sujeito: Organismos multi-celulares vivos, incluindo organismos vertebra-dos, uma categoria que inclui tanto mamíferos humanos quanto não humanos.

A menos que explicado de modo diverso, todos os termos técni-cos e científicos usados aqui, neste requerimento de patente, têm o mesmosignificado conforme entendido comumente por uma pessoa de conhecimen-to regular da técnica à qual pertence esta invenção. Os termos singulares"um," "uma," e "o", "a" incluem referentes plurais a menos que o contextoindique claramente de modo diverso. Similarmente/a palavra "ou" pretendeincluir "e" a menos que o contexto indique claramente de modo diverso. Por-tanto "compreendendo A ou B" significa "incluindo A ou B," ou "incluindo A eB." Adicionalmente deve ser entendido que todos os valores de peso mole-cular ou massa molecular são aproximados e são proporcionados somentepara descrição. Métodos e materiais adequados usados na prática ou naexperimentação do assunto em questão revelado são descritos abaixo; noentanto, os materiais e métodos referidos são somente ilustrativos e não pre-tendeem ser limitantes. Também podem ser usados métodos e materiaissimilares ou equivalentes aos descritos aqui, neste requerimento de patente.

Todas as publicações, requerimentos de patente, patentes, e outras referên-cias mencionadas aqui, neste requerimento de patente, são incorporadaspor meio de referência em sua totalidade na extensão permitida pelos regu-lamentos aplicáveis. No caso de conflito, a presente especificação, incluindoexplicações de termos, controlará.

III. Antígeno Lipoidal

Um antígeno Iipoidal é qualquer antígeno contendo (sem limita-ção) cardiolipina, Iecitina e colesterol, cujo antígeno é capaz de ligar especi-ficamente um anticorpo antilipoidal. Em alguns exemplos, um antígeno Iipoi-dal liga especificamente um anticorpo antilipoidal (por exemplo, um anticorpoanti-cardiolipina) presente em um sujeito infectado com T. pallidum (tal co-mo, um ser humano). Antígenos Iipoidais compreendendo cardiolipina (CL),Iecitina (L) e colesterol (Ch) forem usados por muito tempo em provas desolução para detectar anticorpos antilipoidais no soro (vide, por exemplo, adiscussão anterior de "testes não treponemais" para diagnóstico de sífilis).

Antígenos Iipoidais contendo CL/L/Ch específicos típicos previamente usa-dos em provas de solução incluem os antígeno de VDRL, RPR, e USRs co-mumente conhecidos (por exemplo, Teste de Lâmina de VDRL (VenerealDisease Research Laboratory), em: Larsen et al. (ed.), A Manual of Tests forSyphilis, 9th Edition, Washington D.C.:American Public Health Association,1998, pp. 157-178; Pettit et ai, "Unheated serum reagin [USR] test as aquantitative test for syphilis," J. Clin. Microbiol., 15(2): 238-242, 1982), euma forma sintética do antígeno de VDRL ("VDRL sintético") descrita porCastro etal. (Clin. Diagn. Lab. Immunol., 7(4):658-661, 2000). Infelizmente, anatureza Iipoidal de semelhantes antígenos tornou difícila fixar de modo con-fiável quaisquer destes antígenos a um suporte sólido, tal como uma mem-brana bíbula (pór exemplo, microporosa), como nitrocelulose ou outras. Porconseguinte, tem havido uma necessidade existente há muito tempo (maspreviamente não satisfeita) de proporcionar provas à base de membrana (talcomo, dispositivos de fluxo direto ou de fluxo lateral de imunoensaio) paradetecção de anticorpos antilipoidais, por exemplo, em amostras biológicas.

Os dispositivos de imunoensaio referidos revolucionariam, por exemplo, odiagnóstico de ponto de atendimento de sífilis e outras doenças caracteriza-das pela presença de anticorpos antilipoidais. Esta descoberta descreve,entre outras coisas, um método para imobilizar antígenos lipoidais, tais comoos antígenos de VDRL, USR, ou VDRL Sintético, a suportes membranosos;portanto, proporcionando um meio para satisfazer uma necessidade existen-te há muito tempo na técnica.

Conforme discutido acima, métodos e composições descritosaqui, neste requerimento de patente, contemplam um antígeno Iipoidal queinclui (por exemplo, compreende ou consiste essencialmente de) cardiolipi-na, colesterol e lecitina. Estes componentes típicos de um antígeno Iipoidalsão descritos em mais detalhes abaixo.Α. Cardiolipina

Cardiolipina é difosfatidila glicerol (especificamente,1,3-difosfatidilglicerol), na qual tem uma cadeia principal 1,3-difosfatidilglicerol), na qual tem uma cadeia principal consistindo em trÊs mo-léculas de glicerol unidas por duas pontes de fosfodiéster. Os quatro hidroxi-Ia das porções de gliceros cardiolipina externa são cada uma esterificadacom uma cadeia de ácido graxo saturado ou insaturado (tipicamente de 14a 18carbonos de extensão). Conforme usado aqui, neste requerimento depatente, o termo "cardiolipina" contempla 1,3-difosfatidilglicerol tendo qual-quer distribuição de cadeias laterais de ácido graxo. Portanto, as quatro ca-deias laterais de ácido graxo de cardiolipina pode variar independentementeda extensão (por exemplo, a partir de cerca de 14 a cerca de 25 carbonos,de cerca de 14 a cerca de 22 carbonos, de cerca de 14 a cerca de 20 carbo-nos, de cerca de 14 a cerca de 18 carbonos, ou de cerca de 14 a cerca de16 carbonos) e/ou grau de saturação (por exemplo, a partir de completamen-te saturado até tendo cerca de 6 ligações duplas, a partir de completamentesaturado até tendo cerca de 4 ligações duplas, ou a partir de completamentesaturado até tendo cerca de 2 ligações duplas). Cadeias laterais de ácidograxo típicas de cardiolipina, conforme contemplado aqui, neste requerimen-to de patente, incluem de modo independente miristoila (14:0); palmitoila(16:0); estearoila (18:0); oleoila (18:1); miristoleoila (14:1); palmitoleoila(16:1); petroselinoila (18:1); Iinoleoila (18:2); Iinolenoila (18:3); eicosenoila(20:1); araquidonoila (20:4); erucoila (22:1); DHA (22:6); ou nervonoila(24:1).

Em algumas modalidades, cardiolipina é uma forma de cardioli-pina que ocorre naturalmente. A composição de ácido graxo de cardiolipinaque ocorre naturalmente é geralmente distribuída de acordo com uma amplavariedade de ácidos graxos que ocorrem naturalmente tais como palmitoila(16:0); estearoila (18:0); oleoila (18:1); e Iinoleoila (18:2). A espécie molecu-lar de ácido graxo mais abundante em formas de cardiolipina que ocorremnaturalmente são ácido linoléico a 90%, seguido por ácido oléico a 5%, eácido palmítrico a 1%. Em outras modalidades, cardiolipina é uma forma quenão ocorre naturalmente (também referida como "cardiolipina sintética"). E-xemplos não Iimitantes de cardiolipina sintética incluem, por exemplo, tetra-miristoila cardiolipina, tetraoleoila cardiolipina, ácido tetramiristoila-bis-(L-a-glicerila) fosfórico, sal dissódico de éter benzílico de bis (dipalmitoila D,L-a-glicerilfosforila)-1,3 glicerol, sal dissódico de bis (dipalmitoila D,L-a-glicerilfosforila)-l,5 pentanodiol, sal dissódico de bis (dipalmitoila D,L-a-glicerilfosforila)-1,3 propanodiol, sal dissódico de bis (dipalmitoila D,L-a-glicerilfosforila)-1,4 butanodiol, sal dissódico de bis (dipalmitoila D,L-a-glicerilfosforila)-1,2 etanodiol, sal dissódico de bis (dipalmitoila D,L-a-glicerilfosforila)-metanodiol, sal dissódico de bis (dipalmitoila D,L-a-gliceriIfosfo ri Ia)-1,3 glicerol, sal dissódico de bis (benzilfosforila)-l,3-propanodiol, ou ácido D,L-a-dipalmitoila bis-fosfatídico.

"Cardiolipina imunorreativa" é qualquer forma de cardiolipina (porexemplo, cardiolipina que ocorre naturalmente ou sintética) que reage espe-cificamente com anticorpos antilipoidais, tais como anticorpos antilipoidaispresentes em um sujeito tendo sífilis ou infectado com T. pallidum.

B. Leticina

Lecitina é o nome comum para fosfatidilcolina. Fosfatidilcolina [eum glicerofosfolipídeo, o qual é geralmente o fosfolipídeo mais abundanteem plantas e animais. É um bloco de construção chave de bicamadas demembrana, e é também o principal fosfolipídeo circulante no plasma. Fosfa-tidilcolina contém duas cadeias laterais de ácido graxo. Conforme usado a-qui, neste requerimento de patente, o termo "lecitina" contempla fosfatidilco-lina tendo qualquer distribuição de cadeias laterais de ácido graxo. Portanto,as duas cadeias laterais de ácido graxo de cardiolipina pode variar indepen-dentemente da extensão (por exemplo, a partir de cerca de 14 a cerca de 25carbonos, de cerca de 14 a cerca de 22 carbonos, de cerca de 14 a cerca de20 carbonos, de cerca de 14 a cerca de 18 carbonos, ou de cerca de 14 acerca de 16 carbonos) e/ou grau de saturação (por exemplo, a partir decompletamente saturado até tendo cerca de 6 ligações duplas, a partir decompletamente saturado até tendo cerca de 4 ligações duplas, ou a partir decompletamente saturado até tendo cerca de 2 ligações duplas). Cadeias Ia-terais típicas de ácido graxo de lecitina, conforme contemplado aqui, nesterequerimento de patente, incluem de modo independente miristoila (14:0);palmitoila (16:0); stearoila (18:0); oleoila (18:1); miristoleoila (14:1); palmito-Ieoila (16:1); petroselinoila (18:1); Iinoleoila (18:2); Iinolenoila (18:3); eicose-noila (20:1); araquidonoila (20:4); erucoila (22:1); DHA (22:6); ou nervonoila(24:1).

Em algumas modalidades, lecitina é uma forma de lecitina queocorre naturalmente. A composição de ácido graxo de lecitina que ocorrenaturalmente inclui palmitoila (16:0), palmitoleoila (16:1), Iinoleoila (18:2),estearoila (18:0), araquidonoila (20:4), miristoila (14:0), oleoila (18:1), e Iino-Ienoila (18:3). As percentagens relativas de ácidos graxos em lecitina queocorre naturalmente variam dependendo da fonte da lecitina (por exemplo,Balint et ai, J. Lipid Res., 6(1):96, 1965). Por exemplo, lecitina na bile davesícula biliar humana é reportada como sendo cerca de 45% 16:0, 4% 16:1,4% 18:0, 16% 18:1, 23% 18:2, 4% 20:4 com traços de 18:3 e 14:0; e lecitinano plasma humano é reportado como sendo cerca de 35% 16:0, 1% 16:1,14% 18:0, 17% 18:1, 17% 18:2, 14% 20:4 com traços de 18:3 e 14:0. Emoutras modalidades, lecitina é uma forma que não ocorre naturalmente (tam-bém referida como "lecitina sintética").

Exemplos não Iimitantes de lecitina incluem, por exemplo:

<table>table see original document page 28</column></row><table><table>table see original document page 29</column></row><table>

18:0-18:0Outros exemplos de Iecitina em particular incluem, sem limita-ção, DL-a-dimiristoila lecitina, L-a-dimiristoila cefalina, L-a-dipalmitoila Ieciti-na, sal de monocolina de ácido dipalmitoila L-a-glicerofosfórico, L-a-dimiristoila lecitina, D-a-dimiristoila lecitina, L-a-distearoila lecitina, estearoilaglicollecitina, 1,2-dioleoila-sn-glicero-3-fosfocolina (18:1), 1,2-dilinoleoila-sn-glicero-3-fosfocolina (18:2), 1,2-dimiristoi1-sn-glicero-3-fosfocolina (14:0),1,2-dipentadecanoila-sn-glicero-3-fosfocolina (15:0), 1,2-difitanoila-sn-glicero-3-fosfocolina (16:0), 1,2-dipalmitoila-sn-glicero-3-fosfocolina(16:0), e 1-palmitoila-2-oleoila-sn-glicero-3-fosfocolina.

C. Colesterol

Colesterol é um esteróide tendo, em uma modalidade, a seguinte estrutura:

<formula>formula see original document page 30</formula>

Sabe-se que o colesterol interage com fosfolipídeos (tais como,cardiolipina e lecitina) em membranas ou estruturas semelhantes a membra-na (tais como Iipossomas ou micelas). Nestas circunstâncias, acredita-seque a molécula de colesterol seja orientada paralela às cadeias de ácidosgraxos dos fosfolipídeos, e o grupo oxidrila do colesterol interage com osgrupos de cabeça dos fosfolipídeos.

Na formação dos antígenos Iipoidais descritas aqui, neste reque-rimento de patente, acredita-se que o colesterol estabilize a emulsão (porexemplo, micela). Portanto, para os fins desta descoberta, o termo "coleste-rol" inclui qualquer forma de colesterol ou outro derivado do colesterol quetenha a capacidade de estabilizar uma emulsão a qual contenha um antíge-no lipoidal. Em alguns exemplos, estabilizar uma emulsão contendo antígenoIipoidal se refere a prolongar o tempo que um antígeno lipoidal emulsificadopermanece em solução. Por exemplo, a adição de colesterol a um antígenolipoidal pode prolongar o tempo que um antígeno semelhante permanecedispersado em uma fase contínua de uma emulsão (tal como, em uma solu-ção etanólica) por 5%, 10%, 15% ou 25% conforme comparado com um an-tígeno comparável contendo relativamente menos ou nenhum colesterol.

Exemplos não Iimitantes de derivados de colesterol incluem éter colest-5-en-3 beta-ila-6-aminohexílico (AH-Chol; Zimmer et ai, Eur. J. Pharm. Bio-pharm., 47(2):175-8, 1999); éteres poli(etileno glicol) colesterílicos(PEG(n)-Chols; Baba et ai, Traffic, 2(7):501-12, 2001; Ishiwata et ai, Bio-chim. Biophys. Acta, 1359(2):123-35, 1997); um derivado de colesterol catiô-nico com um grupo de cabeça hidroxietila amino descrito por Nakanishi eNoguchi (Adv. Drug Deliv. Rev., 52(3): 197-207, 2001); hemissuccinato decolesterol (Meuillet et ai, Eur. J. Pharmacol., 377(2-3):241-52, 1999; deidro-ergosterol (DHE), o qual difere do colesterol por ter três ligações duplas adi-cionais e um grupo metila extra (Mukherjee, Biophys. J., 75(4):1915-1925,1998); derivados catiônicos de colesterol os quais contêm um grupo de ca-beça amino terciário com um braço espaçador diferente (Takeuchi et al.,FEBS Lett., 397(2-3):207-9, 1996); colesterila-3-beta-carboxiamidoetilenodimetilamina (Noguchi et al., FEBS Lett.,433(1-2):169-173, 1998); e N-[tris [(beta-D-galactopiranosilóxi)metila]metila]-N-alfa-[4-(5-colesten-3 beta-ilóxi)succinila]glicinamida (Kempen et al., J. Me-dicin. Chem., 27:1306-1312, 1984). Exemplos adicionais de derivados decolesterol úteis na formação de membrana e estruturas semelhantes amembrana (por exemplo, lipossômicas ou micelares) (como um antígenoIipoidal revelado) são descritos nas Patentes dos Estados Unidos Nos.5.888.821; 5.043.164; 4.900.549; 4.442.037; 4.157.391; e 4.544.545, e naPatente Européia No. EP0606613.

D. Preparação de Antígeno Lipoidal

Em modalidades de antígenos Iipoidais CL/L/Ch, cardiolipina,Iecitina e colesterol podem ser combinados em qualquer proporção que for-ma um antígeno capaz de ser ligado especificamente por um anticorpo anti-Iipoidal (tal como, anticorpo anti-cardiolipina). Em alguns casos, o antígenoIipoidal tomará a forma de uma micela, lipossoma, monte de membrana, ououtra estrutura semelhante a membrana. Nestas estruturas, interações hidro-fóbicas fazem com que os componentes não polares (tais como as cadeiasde ácidos graxos) agreguem e excluam moléculas de água do "núcleo." Con-forme uma pessoa versada na técnica reconhecerá, uma micela é uma es-trutura não-bicamada substancialmente esférica (ou fechada de modo diver-so) tendo um interior hidrofóbico composto de cadeias de ácidos graxos (enão incluindo um centro aquoso). Em comparação, um lipossoma é uma es-trutura bicamada substancialmente esfericamente disposta que é maior doque uma micela e encerra um centro aquoso. O tipo de estrutura formadapor uma mistura CL/L/Ch dependerá, por exemplo, da extensão e do grau desaturação das cadeias de ácidos graxos de cardiolipina e Iecitina1 da tempe-ratura, da composição iônica do meio aquoso, e do modo de dispersão dosfosfolipídeos na solução. Em modalidades particulares, um antígeno IipoidalCL/I_/Ch (tal como, um antígeno de VDRL, RPR, USR, ou VDRL sintético)forma uma micela em uma solução aquosa (tal como uma solução etanóli-ca). Em modalidades mais particulares, um antígeno Iipoidal forma uma mi-cela e não forma um Iipossoma em uma solução aquosa (tais como uma so-lução etanólica).

Um antígeno Iipoidal para uso em uma composição ou métododescritos pode ser obtido comercialmente (por exemplo, Fisher (Cat. No.B40765), Fisher (Cat. No. 22-415-132), Fisher (Cat. No. 23-038010), Tru-e-Medix, IPX Overseas Corporation (Miami, FL1 USA), Cenogenics Corpora-tion (Morganville, NJ, USA), Nova Century Scientific (Niágara Falls, NY, U-SA) bem como outros fornecedores) ou pode ser produzido por qualquermétodo comumente conhecido na técnica. Em uma modalidade, um antíge-no Iipoidal é produzido conforme descrito no Exemplo 1.

Em algumas modalidades, uma solução não aquosa contendo cardiolipina,Iecitina e colesterol (CL/L/Ch) é misturada com uma solução aquosa paraformar uma emulsão. Pode ser usada qualquer solução não aquosa na qualcardiolipina, Iecitina e colesterol são cada um solúveis (ou parcialmente so-lúveis), incluindo, por exemplo, etanol (tal como etanol absoluto, etanol a95%, ou etanol a 70%), clorofórmio, hexano : etanol (por exemplo, a 9:1),tolueno (por exemplo, 95%), diclorometano, ou benzeno. Em um exemplo,uma CUL/Ch é preparada em etanol absoluto.

Em algumas modalidades, uma solução CL/L/Ch útila para pre-parar um antígeno Iipoidal pode incluir a partir de cerca de 0,001% a cercade 0,1% cardiolipina (tais como de cerca de 0,005% a cerca de 0,07%, decerca de 0,008% a cerca de 0,05%, de cerca de 0,01% a cerca de 0,04%, oua partir de cerca de 0,025% a cerca de 0,035%); de cerca de 0,05% a cercade 0,5% Iecitina (tal como a partir de cerca de 0,07% a cerca de 0,4%, decerca de 0,09% a cerca de 0,3%, de cerca de 0,1% a cerca de 0,25%, ou apartir de cerca de 0,14% a cerca de 0,21%); e/ou a partir de cerca de 0,2% acerca de 5% colesterol (tal como a partir de cerca de 0,4% a cerca de 3%,de cerca de 0,7% a cerca de 2%, de cerca de 0,8% a cerca de 1%). Em e-xemplos particulares, uma solução CL/L/Ch útila para preparar um antígenolipoidal inclui cerca de 0,03% de cardiolipina (tal como, cardiolipina que ocor-re naturalmente), cerca de 0,21% de Iecitina (tal como, Iecitina que ocorrenaturalmente), e cerca de 0,9% de colesterol. Em outro exemplo, umaCLA/Ch solução útila para preparar um antígeno Iipoidal inclui cerca de0,03% de tetramiristoila cardiolipina, cerca de 0,14% de 1-palmitoila-2-oleoila-s/>glicero-3-fosfocolina e cerca de 0,9% de colesterol.

Uma solução CL/L/Ch útila para preparar um antígeno Iipoidal émisturada com uma solução aquosa para formar uma emulsão de antígenolipoidal. A solução aquosa pode incluir qualquer solução na qual uma solu-ção CL/L/Ch é imiscível, tal como uma solução salina (por exemplo, incluin-do 0,1-1,0 M de NaCI, tal como cerca de 0,55 M de NaCI). Uma solução a-quosa típica inclui 0,55 M de NaCI, 0,05% (v/v) de formaldeído, 0,26 mM,0,35 mM a 0,66 mM de fosfato de hidrogênio dissódico (para o dodecaidrato(12-H20), heptaidrato (7-H20), ou formas anídricas, respectivamente), e1,2 mM de potássio.

A proporção de solução CL/L/Ch para solução aquosa pode serqualquer proporção que resultará na formação de uma emulsão de antígenolipoidal (tal como, micelas contendo CL/L/Ch). Em alguns exemplos, a pro-porção de solução CL/L/Ch para proporção de solução aquosa é cerca de1:10, cerca de 1:15, cerca de 2:33, ou cerca de 1:20. Em outros exemplos, apercentagem de solução CL/L/Ch em uma emulsão é cerca de 3% (v/v), cer-ca de 5% (v/v), cerca de 8% (v/v), cerca de 10% (v/v), ou cerca de 12% (v/v).

IV. , Métodos de Imobilização de Antígeno Lipoidal

É sabido que anticorpos antilipoidais (por exemplo, reagina) nosoro humano reagirá com antígenos lipídicos contendo cardiolipina, Iecitina ecolesterol (tais como, os antígenos de RPR, VDRL, USR, ou VDRL sintéti-cos). Conforme discutido acima, este conhecimento formou a base para tes-tes séricos, não treponemais à base de solução. Apesar de uma necessida-de há muito tempo existente de provas à base de membrana para testar sífi-lis, ninguém reconheceu previamente que um antígeno Iipoidal contendoCL/L/Ch pode ser imobilizado sobre uma membrana (ou outro suporte sóli-do) usando, como um exemplo, os anticorpos antilipoidais o antígeno foi es-pecificamente designado para detectar. Diferentemente de muitos outrosantígenos, os quais têm somente um sítio de ligação para o anticorpo a serdetectado, o antígeno Iipoidal tem muitos sítios de ligação para anticorposantilipoidais. Portanto, conforme revelado aqui, neste requerimento de paten-te, uma quantidade de anticorpo antilipoidal não saturante ou outro anticorpoque pode ligar especificamente um antígeno Iipoidal (ou, em particular e-xemplos, fragmentos de semelhantes anticorpos, tais como fragmentos Fab)pode ser usada para ancorar um antígeno Iipoidal a um suporte sólido, talcomo uma superfície membranosa (incluindo, nitrocelulose, náilon e outras)sem afetar de modo adverso a capacidade do antígeno Iipoidal imobilizadopara ligar especificamente e adicionalmente anticorpos antilipoidais presen-tes em uma fase móvel (tal como uma amostra biológica).

A. Anticorpo Âncora

Anticorpos úteis para imobilizar um antígeno Iipoidal em um su-porte sólido (tal como uma membrana microporosa) nas composições e mé-todos descritos incluem qualquer anticorpo que tem a capacidade de ligarespecificamente um antígeno lipoidal, incluindo, por exemplo, anticorpos an-tilipoidais de um sujeito infectado com T. pallidum ou inoculado comT. pallidum (tal como, um ser humano ou um coelho), anticorpos an-ti-colesterol, anticorpos anti-cardiolipina, ou anticorpos anti-lecitina. Confor-me discutido em mais detalhes abaixo, fragmentos de ligação de antígeno(tais como, fragmentos Fab) de anticorpos tendo as especificidades prece-dentes também podem servir como um anticorpo âncora nas composições emétodos descritos. Anticorpos âncora podem ser monoclonais ou policlonais.Em modalidades específicas, anticorpos âncora são policlonais (tais comoos anticorpos isolados de soro hipermune de seres humanos ou coelhos in-fectados com T. pallidum).

Anticorpos antilipoidais policlonais de sujeitos infectados comΤ. pallidum ou inoculados com Τ. pallidum podem ser obtidos, por exemplo,isolando os anticorpos referidos a partir de soro disponível comercialmenteou produzindo e isolando os anticorpos policlonais referidos usando métodoscomumente conhecidos na técnica. Fornecedores comerciais de produtossangüíneos (tais como, soro) de seres humanos infectados com T. pallidumincluem New York Blood Center (New York, NY, EUA); Biomedical Resour-ces (Hatboro, PA, EUA); Life Diagnostics, uma division of Life Therapeutics(formerly Serologicals) (Clarkston, GA, EUA); e Teragenix (formerly Millenni-um Biotech, lnc) (Ft. Lauderdale, FL, EUA). Em outras modalidades, anti-soros policlonais contendo anticorpos antilipoidais podem ser produzidosimunizando animais hospedeiros (tais como coelhos, camundongos, cavalos,cabras e outros) com T. pallidum e/ou um antígeno Iipoidal (tal como um an-tígeno de VDRL). Procedimentos detalhados para produção de anticorposmonoclonais ou policlonais são descritos em Harlow e Lane (Antibodies, ALaboratory Manual, CSHL, New York, 1988). Procedimentos não Iimitantesespecíficos para produzir anticorpos em um animal hospedeiro usando umimunogênio contendo CL/L/Ch foram descritos, por exemplo, por Inoue eNojima (Biochim. Biophys. Acta, 144(2):409-414, 1967). Protocolos não Iimi-tantes específicos estão disponíveis para produzir anticorpos antilipoidaispor infecção de um animal hospedeiro com T. pallidum (vide, por exemplo,Perine et ai, lnfect. Immun., 8(5):787-790, 1973). Além disso, serviços deprodução de anticorpos customizados estão disponíveis comercialmente (vi-de, por exemplo, Spring Valley Laboratories (Woodbine, MD, EUA); MaineBiotechnology Services (Portland, ME, EUA); CovaIAb UK (Cambridge, Rei-no Unido); 21 st Century Biochemicals (Marlboro, MA, EUA) e numerosasoutras). Os serviçoes comerciais referidos podem ser usados para produziranticorpos policlonais ou monoclonais específicos para antígenos lipoidais.

Em modalidades envolvendo anti-soro contendo anticorpos anti-lipoidais, uma fração de anticorpo pode ser isolada do soro usando métodosde conhecimento geral. Kits disponíveis comercialmente são adequados pa-ra uso no isolamento de anticorpos (incluindo anticorpos antilipoidais) dosoro. Os kits referidos estão disponíveis, por exemplo, na Millipore (Billerica,MA1 EUA), Pierce (Rockford, IL1 EUA); BioRad (Hercules, CA, EUA), e mui-tas outras. Um método não Iimitante específico para isolar anticorpos antili-poidais do soro é descrito no Exemplos 2-3.

Outros anticorpos âncora típicos que podem ser usados nascomposições e métodos descritos, incluem anticorpos anti-colesterol e anti-corpos anti-cardiolipina. Anticorpos anti-colesterol estão presentes em soroshumanos e podem ser isolados conforme descrito acima para anticorpos an-tilipoidais. Anticorpos anti-colesterol específicos e/ou protocolos para produ-zir e/ou isolar anticorpos anti-colesterol podem ser encontrados em Kruth etal. (J. Lipid Res., 42:1492-1500, 2001), Alving et ai. (Biochem. Soe. Trans.,17:637-639, 1989), Swartz et al. (Proc. NatL Acad. Sei. USA, 85:1902, 1988),Stollar et al. (Mol. Immunol., 26(1):73-79, 1989), e Publicação de PatentesInternacionais PCT Nos. WO 00/06200, WO 97/21099, e WO 02/083100.

Anticorpos anti-cardiolipina purificados estão disponíveis comercialmente,por exemplo, na United States Biological (Swampscott, MA, EUA; por exem-plo, Cat. No. C1375).

Um anticorpo âncora para uso nas presentes composições emétodos preferencialmente (i) não aglutinam com outros anticorpos âncoraligados a antígeno, e (ii) não ligam substancialmente a (ou reagem com) umreagente (ou série dereagentes) usados para detectar um analite de inte-resse (tal como, um anticorpo antilipoidal presente na amostra).

Aglutinação é um processo por meio do qual anticorpos multiva-Ientes formam uma rede reticulada ligada por seus antígenos corresponden-tes, os quais devem no mínimo dois sítios de ligação para o anticorpo deinteresse (referido como um "antígeno multivalente"). Sob estas circunstân-cias, um único anticorpo pode ligar a dois antígenos diferentes e dois anti-corpos diferentes podem ligar ao mesmo antígeno. Ocorre aglutinação emalgumas concentrações de anticorpo multivalente com antígeno multivalente.

Um modo exemplar para evitar aglutinação de um anticorpo âncora com an-tígenos Iipoidais (os quais são multivalentes por natureza), é usar fragmen-tos de anticorpos Fab (ou outros monovalentes) para ancorar um antígenolipoidal. Um fragmento de anticorpo monovalente não pode ligar dois antíge-nos e, portanto, não pode servir para reticular dois antígenos diferentes. Mé-todos para preparar fragmentos de anticorpos monovalentes são de conhe-cimento geral na técnica. Um método não Iimitante para preparar e isolarfragmentos Fab é proporcionado no Exemplo 5.

Um método não Iimitante alternativo para evitar aglutinação éaplicar anticorpos âncora (independente da valência) a uma superfície sólida(tal como, uma membrana de um dispositivo de imunoensaio à base demembrana) na ausência de antígeno Iipoida!; em seguida, ligar o antígenoIipoidal ao anticorpo imobilizado. Neste método alternativo, os anticorpos eantígenos são fisicamente restritos de substancial reticulação.

B. Suporte Sólido

Um suporte sólido (ou substrato) é qualquer material o qual éinsolúvel, ou pode ser tornado insolúvel por uma reação subseqüente. Osmétodos para imobilizar um antígeno Iipoidal descritos aqui, neste requeri-mento de patente, podem ser usados com qualquer suporte sólido ao qualum anticorpo âncora fixará em uma maneira que resiste substancialmente adeprendimento quando lavado com uma solução aquosa, tal como quandocontactado com uma amostra de fluido (tal como uma amostra biológica).

Modalidades preferenciais de suporte sólido para dispositivos de imunoen-saio descritos envolvem membranas microporosas, tais como nitrocelulose,náilon, fluoreto de polivinilideno (PVDF), polietersulfona, policarbonato, poli-éster, acetato de celulose, ésteres celulósicos mistos, ou combinações dasmesmas.

A superfície de um suporte sólido pode ser ativada por proces-sos químicos que causam ligação covalente de um agente (por exemplo, umanticorpo âncora ou complexo de anticorpo âncora-antígeno lipoidal) ao su-porte. No entanto, qualquer outro método adequado pode ser usado paraimobilizar um agente (por exemplo, um anticorpo âncora ou complexo deanticorpo âncora-antígeno lipoidal) a um suporte sólido incluindo, sem Iimita-ção, interações iônicas, interações hidrofóbicas, interações covalentes e se-melhantes. As forças particulares que resultam em imobilização de um agen-te sobre uma fase sólida não são determinativas para os métodos e disposi-tivos descritos aqui, neste requerimento de patente.

Uma fase sólida pode ser escolhida por sua capacidade intrínse-ca para atrair e imobilizar um agente, tal como um reagente de captura. Al-ternativamente, a fase sólida pode possuir um fator que tem a capacidade deatrair e imobilizar um agente, tal como um anticorpo âncora ou complexo deanticorpo âncora-antígeno lipoidal. O fator pode incluir uma substância car-regada que é carregada opostamente com respeito a, por exemplo, um anti-corpo âncora ou complexo de anticorpo âncora-antígeno lipoidal ou a umasubstância carregada conjugada ao anticorpo âncora ou complexo de anti-corpo âncora-antígeno lipoidal.

Numerosos e variados suportes sólidos são conhecidos daque-les na técnica e incluem, sem limitação, membranas bíbulas ou microporo-sas (tais como, nitrocelulose, náilon ou PVDF), as paredes das cavidades deuma bandeja de reação, tubos de teste, contas de poliestireno, contas mag-néticas, e micropartículas (tais como partículas de látex). Com respeito aalgumas modalidades de membranas, a estrutura porosa de nitrocelulosetem excelentes qualidades de absorção e adsorção por uma ampla varieda-de de reagentes, por exemplo, anticorpos âncora ou complexos de anticorpoâncora-antígeno lipoidal. Náilon possui características similares e também éadequado. Estruturas microporosas são úteis, como são materiais com es-trutura de gel no estado hidratado.

Exemplos adicionais de suportes sólidos úteis incluem: carboi-dratos poliméricos naturais e seus derivados sinteticamente modificados,reticulados ou substituídos, tais como ágar, ágarose, ácido algínico reticula-do, gomas guar substituídas e reticuladas, ésteres celulósicos, especialmen-te com ácido nítrico e ácidos carboxílicos, ésteres celulósicos mistos, e éte-res celulósicos; polímeros naturais contendo nitrogênio, tais como proteínase derivados, inclusive gelatinas reticuladas ou modificadas; polímeros dehidrocarbonetos naturais, tais como látex e borracha; polímeros sintéticos osquais podem ser preparados com estruturas convenientemente porosas, taiscomo vinila polímeros, inclusive polietileno, polipropileno, poliestireno, polivi-nilcloreto, polivinilacetato e seus derivados parcialmente hidrolisados, polia-crilamidas, polimetacrilatos, copolímeros e terpolímeros dos policondensa-dos acima, tais como poliésteres, poliamidas, e outros polímeros, tais comopoliuretanos ou poliepóxidos; materiais inorgânicos porosos tais como sulfa-tos ou carbonatos de metais terrosos alcalinos e magnésio, inclusive sulfatode bário, sulfato de cálcio, carbonato de cálcio, silicatos de metais terrososalcalinos e de álcali, alumínio e magnésio; e óxidos ou hidratos de alumínioou silício, tais como argilas, alumina, talco, caulim, zeólito, sílica-gel, ou vidro(estes materiais podem ser usados como filtros cpm os materiais poliméricosacima); e misturas ou copolímeros das classes acima, tais como copolíme-ros de enxerto obtidos inicializando a polimerização de polímeros sintéticossobre um polímero natural preexistente.

Exceto conforme fisicamente restrito de outro modo, um suportesólido pode ser usado em qualquer formato adequado, tal como filmes, cha-pas, tiras, ou placas, ou pode ser revestido sobre ou colado ou laminado aveículos inertes apropriados, tais como papel, vidro, filmes plásticos, ou tecidos.

C. Complexos de Anticorpo Âncora -Antígeno Lipoidal Imobiliza ntes

Em algumas modalidades, antígenos Iipoidais são imobilizadosobre um suporte sólido contactando em solução o antígeno Iipoidal comanticorpos âncora específicos para o antígeno Iipoidal (por exem-plo, anticorpos antilipoidais, anticorpos anti-colesterol, anticorpos an-ti-lecitina, e/ou anticorpos anti-cardiolipina, e/ou fragmentos de ligação anti-gênica de quaisquer dos precedentes) para formar um complexo de antígenolipoidal-anticorpo âncora (ou complexo). Em modalidades particulares, antí-geno Iipoidal é contactado em solução com um fragmento Fab específicopara o antígeno Iipoidal (por exemplo, um fragmento Fab isolado de imuno-globulinas em soro humano sifilítico ou soro de outros sujeitos infectados ouinoculados com T. pallidum).

Um complexo de antígeno lipoidal-anticorpo âncora tem umcomponente de polipeptídeo (isto é, um anticorpo âncora) e um componentelipídico (isto é, um antígeno lipoidal). Em contraste com lipídeos, é de co-nhecimento geral na técnica que polipeptídeos (por exemplo, proteínas) ade-rirão fortemente (através de interações incompletamente caracterizadas) amuitos tipos de suportes sólidos e, em particular, a suportes membranosos(como nitrocelulose, náilon ou PVDF) (vide, por exemplo, Harvey, Optimiza-tion of Nitrocellulose Membrane Based Immunoassays, Keene, NH: Schlei-cher and Schuell, 1991; Wallis et al., Ann. Rev. Microbiol., 33:413-437,1979; Presswood1 Membrane Filtration: Applications and Problems, NewYork, NY: Mareei Dekker, 1981; Farrah et al., Proc. Natl. Aead. Sei. USA,78:1229-1232, 1981; Batteiger et al., J. Immunol. Meth., 55:297-307, 1982;Tijssen, Practice and Theory of Immunoassays, 8th ed, AmsterdanrThe Ne-therlands Elsevier, 1993). Portanto, através de sua associação com umcomponente de polipeptídeo (por exemplo, anticorpo âncora) também é pos-sível agora aderir fortemente (por exemplo, imobilizar) um antígeno Iipoidal aum suporte sólido (tal como, nitrocelulose, náilon, ou PVDF). Por conseguin-te, os métodos descritos (e métodos para preparar as composições revela-das) contemplam contactar um suporte sólido (tal como uma membrana mi-croporosa) com uma solução de complexo de antígeno-anticorpo em que,através de semelhante contato, o complexo de antígeno-anticorpo se tornasubstancialmente imobilizado sobre o suporte sólido. Em alguns exemplos,um complexo de anticorpo âncora-antígeno Iipoidal é substancialmente imo-bilizado sobre um suporte sólido quando não mais de cerca de 1%, não maisde cerca de 2%, não mais de cerca de 5%, não mais de cerca de 10%, ounão mais de cerca de 25% do complexo de antígeno-anticorpo se torna des-tacado do suporte sólido quando o suporte é contactado com uma amostrade fluido por um tempo suficiente para a amostra de fluido umedecer o su-porte sólido (por exemplo, por um tempo suficiente para uma amostra defluido migrar ao longo de uma tira membranosa e contatar uma área ondeum antígeno Iipoidal é imobilizado).

Para imobilizar um antígeno Iipoidal a uma superfície sólida,também é contemplado que uma superfície sólida (tal como, nitrocelulose,náilon ou PVDF) pode ser contactada com anticorpo âncora (por exemplo,em solução) na ausência de antígeno lipoidal. O anticorpo âncora polipeptí-dico adere fortemente à superfície sólida, conforme discutido acima, e é i-mobilizado. Portanto, o anticorpo âncora imobilizado é contactado com antí-geno lipoidal (por exemplo, em solução). A ligação específica do antígenolipoidal pelo anticorpo âncora imobilizado serve também para imobilizar oantígeno. Conforme discutido acima, esta técnica de imobilização de antíge-no pode ser usada para evitar aglutinação em circunstâncias onde o anticor-po âncora é multivalente e capaz de mediar a aglutinação na presença deum antígeno multivalente.

Sob circunstâncias onde é desejável detectar um analite de Ιο-gação de antígeno Iipoidal (tal como, anti-antígenos lipoidais) usando umantígeno Iipoidal imobilizado, é vantajoso para o antígeno imobilizado tersítios de ligação expostos para o analite. Por conseguinte, nas situaçõesprecedentes, quantidades de anticorpo âncora que não saturarão (por e-xemplo, bloquearão) a maioria (ou predominantemente todos) os sítios deligação de analite sobre um antígeno Iipoidal são usadas para formar umcomplexo de anticorpo âncora-antígeno lipoidal. Uma quantidade de anticor-po âncora não saturante em um complexo de anticorpo âncora-antígeno li-poidal é qualquer quantidade de semelhante anticorpo que permitirá que umanalite (por exemplo, anticorpos antilipoidais em uma fase móvel) ligue demodo detectável o componente de antígeno lipoidal do complexo. Em algunsexemplos, não mais de cerca de 1%, não mais de cerca de 5%, não mais decerca de 10%, não mais de cerca de 25%, não mais de cerca de 30% dossítios de ligação de anticorpo antilipoidal disponíveis são bloqueados peloanticorpo âncora. Em outros exemplos, a partir de 10 ng a cerca de 1000 ngde anticorpo âncora em um volume de 1 μΙ são reagidos com um volumeigual de antígeno lipoidal preparado, por exemplo, conforme descrito no E-xemplo 1. Em exemplos particulares, a partir de 25 ng a cerca de 750 ng, apartir de 50 ng a cerca de 600 ng, de cerca de 100 ng a cerca de 500 ng, oua partir de cerca de 150 ng a cerca de 400 ng de âncora anticorpo são usa-dos para preparar um complexo de anticorpo âncora-antígeno lipoidal.

A FIGURA 9 ilustra uma modalidade particular de um antígenolipoidal (por exemplo, um antígeno de USR) fixado a um suporte sólido (porexemplo, uma membrana de nitrocelulose) através de um anticorpo âncora(por exemplo, um Fab antilipoidal). A figura ilustra adicionalmente a capturapelo antígeno Iipoidal imobilizado de um anticorpo antilipoidal de uma amos-tra típica (tal como, uma amostra de soro) e uma relação entre um detector,o anticorpo antilipoidal capturado, o antígeno, e o anticorpo âncora.

Exemplos particulares excluem ancorar um antígeno Iipoidal aum substrato usando um anticorpo âncora específico para um grupo deriva-do (tal como, biotina, hexa-His, FLAG, ou outra etiqueta de epítope) o qualtenha sido adicionado a um componente de antígeno Iipoidal com a finalida-de de servir como um epítope para um anticorpo âncora. Os exemplos refe-ridos não excluem inclusive cardiolipina derivada, Iecitina derivada e/ou co-Iesterol derivado como componentes de um antígeno lipoidal; no entanto, emsemelhantes exemplos, os grupos derivado de semelhantes componentesderivados não servem como epítopes para um anticorpo âncora.

1. Aplicação de Complexo de Anticorpo Âncora-Antígeno Lipoidal aMembranas Microporosas

Alguns métodos e composições descritos contemplam um com-plexo de anticorpo âncora-antígeno lipoidal (também referido como um "rea-gente de captura") a ser fixado a uma membrana microporosa (tal como ni-trocelulose, náilon ou PVDF). A membrana serve para imobilizar o reagentede captura e proporcionar uma superfície sobre a qual ou através da qualuma amostra aplicada escoará ou passará. Nitrocelulose (quer pura ou mo-dificada em qualquer maneira conhecida na técnica) é uma membrana prefe-rencial para os dispositivos e métodos descritos. Imagina-se que nitrocelulo-se liga proteínas por ligação de hidrogênio, interações hidrofóbicas, e pormecanismos eletrostáticos (vide, por exemplo, Millipore Corporation, A ShortGuide Developing Immunochromatographic Test Strips, 2nd Edition,pp. 1-40, 1999, disponível a pedido em (800) 645-5476).

Para reagentes de captura contendo proteína, tais como umcomplexo de anticorpo âncora-antígeno lipoidal, acredita-se que o dipolo doéster de nitrato de nitrocelulose interaja com o dipolo forte das ligações depeptídeo da proteína. Sais em altas concentrações, detergentes, e água emuma solução para aplicação podem enfraquecer e desestabilizar interaçõeseletrostáticas entre uma membrana de nitrocelulose e uma proteína a seraplicada na membrana. Portanto, é preferencial, em bora não necessário,usar um tampão de baixa molaridade, por exemplo, 2 a 10 mM de tampõesde fosfato, borato ou carbonato, para solubilizar reagentes de captura con-tendo proteína para imobilização sobre nitrocelulose.

O pH de uma solução para aplicação pode ser ajustado, masnão precisa, para aumentar a ligação do reagente de captura a uma mem-brana de nitrocelulose. Por exemplo, a solubilidade de um reagente de cap-tura contendo proteína em uma solução para aplicação está em um mínimoquando o pH da solução para aplicação está dentro de cerca de +/-1 unidade de pH do pl do reagente de captura contendo proteína.

Opcionalmente, 1 a 5% de metanol, etanol ou isopropanol podeser adicionado a uma solução para aplicação. Uma solução para aplicaçãopode ser aplicada a uma membrana manualmente ou em uma maneira au-tomatizada. Por exemplo, um módulo de dispensação de reagente (por e-xemplo, Matrix 1600, Kinematic Automation, Twain Harte, CA) pode ser usa-do para aplicar reagente de captura a uma membrana microporosa (tal co-mo, nitrocelulose).

Tipicamente, não é necessário bloqueio de uma membrana mi-croporosa nos métodos e dispositivos descritos. Por exemplo, proteínas queestão presentes na amostra e outros agentes de bloqueio, os quais podemser adicionados, por exemplo, a um bloco de amostra ou bloco de conjugadode um dispositivo de fluxo lateral, são geralmente suficientes para evitar queum analite seja adsorvido não especificamente sobre a membrana. Se fordesejado bloqueio opcional de uma membrana para uma aplicação em parti-cular, agentes de bloqueio úteis incluem, por exemplo, gelatina(0,1%-0,5%), leite em pó sem gordura (0,5% - 2%), caseína (1%-2%),BSA (1% - 2%), IgG (1% - 2%), PVP 8-10 kD (0,5% - 1,0%), e PVA 8-10 kD(0,5% - 1,0%).

V. Dispositivos de imunoensaio

A descoberta aqui, neste requerimento de patente, de um méto-do para imobilizar um antígeno Iipoidal (tal como, um antígeno de VDRL e/ouUSR) a um suporte sólido (tal como, uma membrana microporosa, como ni-trocelulose, náilon ou PVDF) possibilita a produção de dispositivos de imu-noensaio para a detecção de analites de ligação de antígeno Iipoidal (taiscomo, anticorpos antilipoidais em amostras biológicas de sujeitos infectadoscom T. pallidum). Em alguns exemplos, um dispositivo de imunoensaio reve-lado permite a detecção da presença (ou ausência) de anticorpos antilipoi-dais em uma amostra biológica para diagnóstico de sífilis.

A. Formatos de Dispositivos de imunoensaio Representativose Informações Relacionadas

Dispositivos de imunoensaio permitem o desempenho de provasà base de membrana relativamente econômicos e descartáveis, para a iden-tificação visual da presença (ou ausência) de um analite em uma amostra delíquido. Os dispositivos referidos geralmente são formatados como hastesgraduadas livres (por exemplo, tiras de teste) ou como dispositivos tendoalgum tipo de estojo. Tipicamente, um dispositivo de imunoensaio pode serusado com tão pouco quanto cerca de 200 μΙ de amostra de líquido, e a de-tecção de um analite na amostra pode (mas não precisa) estar completadentro de 2 a 5 minutos. Em testes clínicos, a amostra pode ser urina, san-gue, soro, saliva, ou outros fluidos corporais. Em testes não clínicos, a a-mostra pode ser um pequeno volume de solução preparada partir de terra,pó, plantas, ou alimento, e aplicados de modo similar diretamente à tira deteste da membrana. Na maioria dos casos, não é necessária instrumentaçãoancilar para realizar os testes referidos, e os dispositivos referidos podemser facilmente usados em clínicas, laboratórios, localizações de campo, e emcasa mesmo por pessoas inexperientes.

Foram desenvolvidos dispositivos de imunoensaio para a identi-ficação ou monitoração de rotina de condições fisiológicas e patológicas (porexemplo, doenças infecciosas, gravidez, câncer, distúrbios endócrinos) u-sando amostras biológicas diferentes (por exemplo, urina, soro, plasma,sangue, saliva), e para análise de amostras ambientais (por exemplo, fluidosnaturais e efluentes de plantas industriais), por exemplo, para contaminação.Muitos destes testes se baseiam nas interações altamente específicas entrepares de ligação específica. Exemplos de semelhantes pares de ligação in-cluem antígeno/anticorpo, hapteno/anticorpo, lectina/carboidrato, apoproteí-na/cofator e biotina/(estrept)avidina. Além disso, muitos destes testes envol-vem dispositivos (por exemplo, fase sólida, tiras de teste de fluxo lateral, tes-tes de fluxo direto) com um ou mais dos membros de um par de ligação fixa-dos a um material de fase sólida móvel ou imóvel tal como contas de látex,fibras de vidro, contas de vidro, tiras de celulose ou membranas de nitrocelu-Iose (Patentes dos Estados Unidos Nos. 4.703.017; 4.743.560; e 5.073.484).

Uma categoria principal de imunoensaio é o ensaio "sanduíche".

Em geral, procedimentos de imunoensaio sanduíche exigem misturar umaamostra, a qual pode conter um analite de interesse (por exemplo, anticorpoantilipoidal), com um reagente detector que especificamente reconhece oanalite, por exemplo, Proteína A conjugada a ouro, Proteína G conjugada aouro, ou anticorpo secundário conjugado a ouro específico para anticorpoantilipoidal (por exemplo, anticorpo secundário anti-humano Ab ou an-ti-humano Ab(Fc)). O reagente detector é móvel e tipicamente é ligado auma etiqueta ou outro reagente de sinalização, tal como látex tingido, um solde metal coloidal, ou um radioisótopo. Esta mistura é em seguida aplicada aum meio cromatográfico (tal como uma membrana microporosa ou bíbula,como nitrocelulose, náilon ou PVDF) contendo uma banda ou zona de antí-genos imobilizados reconhecidos pelo anticorpo de interesse do analite. Θmeio cromatográfico freqüentemente está sob a forma de uma tira que seassemelha a uma haste graduada ou a qual pode ser incorporada em uraestojo, tal como em um dispositivo de fluxo lateral ou um dispositivo de fluxodireto. Quando o complexo da molécula a ser testado e o reagente detectoratingem a zona dos antígenos imobilizados sobre o meio cromatográfico,ocorre ligação e o complexo de reagente detector é localizado na zona. Istoindica a presença da molécula a ser testada. Esta técnica pode ser usadapara obter resultados quantitativos ou semi-quantitativos. Exemplos de imu-noensaios sanduíche realizados sobre tiras de teste são descritos, por e-xemplo, nas Patentes dos Estados Unidos Nos. 4.168.146 e 4.366.241.Em outras formas comuns de imunoensaios à base de membra-na, conforme tipificado por alguns kits domésticos de detecção de gravidez eovulação, uma tira de teste (ou haste graduada) é "mergulhada" em umaamostra suspeita de conter o analite do sujeito. Reagente detector marcadocom enzima é em seguida adicionado, quer simultaneamente ou depois deum período de incubação. O dispositivo em seguida é lavado e em seguidainserido em uma segunda solução contendo um substrato para a enzima. Aetiqueta da enzima, caso presente, interage com o substrato, causando aformação de produtos coloridos, os quais ou depositam como um precipitadosobre a fase sólida ou produzem uma alteração de cor visível na solução dosubstrato. O requerimento de patente européia No. EP-A 0 125 118 descre-ve um imunoensaio de haste graduada do tipo sanduíche semelhante. Orequerimento de patente européia No. EP-A 0 282 192 descreve um disposi-tivo de haste graduada para uso em testes do tipo de competição.

Dispositivos de imunoensaio do tipo de fluxo direto foram desig-nados, em parte, para prevenir a necessidade de etapas de incubação e la-vagem associadas com testes de haste graduada. Dispositivos de imunoen-saio de fluxo direto envolvem um reagente de captura (tal como um comple-xo de anticorpo âncora-antígeno lipoidal) ligado a uma membrana porosa oufiltro ao qual uma amostra de líquido é adicionada. À medida que o liquidoescoa através da membrana, o analite alvo (tal como anticorpo antilipoidal)liga ao reagente de captura. A adição de amostra é seguida por adição dereagente detector (tal como, Proteína A conjugada a ouro ou IgG anti-humana conjugada a ouro (Fc)). Alternativamente, o reagente detector podeser colocado sobre a membrana em uma maneira que permite ao detectormisturar com a amostra e deste modo marcar o analite. A detecção visual dereagente detector proporciona uma indicação da presença de analite alvo naamostra. Dispositivos de fluxo direto de imunoensaio típicos são descritosnas Patentes dos Estados Unidos Nos. 4.246.339; 4.277.560; 4.632.901;4.812.293; 4.920.046; e 5.279.935; e nos Requerimentos de Patente U.S.Nos. 20030049857e20040241876.Dispositivos de teste de migração geralmente incorporam dentrodos mesmos reagentes que foram fixados a etiquetas coloridas, deste modopermitindo detecção visível dos resultados de teste sem adição de substân-cias. Vide, por exemplo, a Patente U.S. No. 4.770.853; a Publicação de Pa-tente Mundial PCT No. WO 88/08534 e o requerimento de Patente EuropéiaNo. EP-A 0 299 428.

Há uma série de testes do tipo de fluxo lateral disponíveis co-mercialmente e patentes descrevendo métodos para a detecção de grandesanalites (peso molecular maior do que 1.000 Daltons). Patente U.S. No.5.229.073 descreve um método de fluxo lateral de imunoensaio competitivosemiquantitativo para medir os níveis de lipoproteína plasmática. Este méto-do utiliza uma pluralidade de zonas de captura ou linhas contendo anticorposimobilizados para ligar tanto a lipoproteína marcada quanto livre para dar umresultado semi-quantitativo.

A Patente U.S. No. 5.591.645 proporciona uma tira de testecromatográfico com no mínimo duas porções. A primeira porção inclui umtraçador móvel e a segunda porção inclui um aglutinante imobilizado capazde ligar ao analite. Exemplos adicionais de testes de fluxo lateral para gran-des analites são descritos nos seguintes documentos de patente: Patentesdos Estados Unidos Nos. 4.168.146;. 4.366.241; 4.855.240; 4.861.711;. e5.120.643; Patente Européia No. 0296724; publicações de Patente Interna-cional Nos. WO 97/06439; e WO 98/36278.

Também há testes do tipo de fluxo lateral para a detecção depequenos analites (peso molecular 100 a 1.000 Daltons). Geralmente, estestestes de pequenos analites envolvem inibição competitiva "típica" para pro-duzir resultados de relatórios negativos ou indiretos (isto é, redução de sinalcom concentração de analite crescente), conforme exemplificado pela Paten-te U.S. No. 4.703.017. No entanto, foram desenvolvidas várias abordagenspara detectar pequenos analites usando testes de fluxo lateral que produzemresultados de relatórios positivos ou diretos (isto é, aumento em sinal comconcentração de analite crescente). Estes incluem, por exemplo, as Patentesdos Estados Unidos Nos. 5.451.504; 5.451.507; 5.798.273; e 6.001.658.A Patente U.S. No. 5.451.504 proporciona um método com trêszonas específicas (mobilização, captura e detecção) cada uma contendo umconjugado de látex diferente para produzir um sinal positivo. A zona de mobi-lização contém anticorpo marcado para ligar o analite na amostra. Na zonade captura, anticorpo marcado e não ligado é em seguida capturado poranálogo de analite imobilizado. A zona de detecção captura o complexo deanalite marcado-anticorpo.

A Patente U.S. No. 5.451.507 descreve um método de imunoen-saio desconectado de duas zonas. A primeira zona tem reagente ligado nãodifusivamente que liga com um componente, por exemplo, um analite análo-go ligado a, ou capaz de ser ligado a, um membro de um sistema produtorde sinal. A segunda zona liga ao componente somente quando o analite aser testado está presente. A distância que o componente migra para dentroda segunda zona está diretamente relacionada com a concentração de analite.

A Patente U.S. No. 5.798.273 descreve um dispositivo de fluxolateral que inclui uma zona de captura com analite imobilizado análogo euma ou mais zonas de leitura para ligar analite marcado análogo.

A Patente U.S. No. 6.001.658 revela um dispositivo de tira deteste com um parceiro de ligação marcado difundível que liga com-analite,um analite imobilizado, e uma área de detecção contendo um anticorpo imo-bilizado.

Os dispositivoss descritos aquj, neste requerimento de patente,geralmente incluem uma tira de material absorvente (tal como uma membra-na microporosa), a qual, em alguns casos, pode ser feita de diferentes subs-tâncias cada uma ligada à outra em zonas, as quais podem ser limitadase/ou sobrepostas. Em alguns exemplos, a tira de absorvente pode ser fixadasobre um material não interativo de suporte (tal como poliéster não tecido),por exemplo, para proporcionar aumentada rigidez para a tira. Zonas dentrode cada tira podem conter diferencialmente um ou mais parceiros de ligaçãoespecíficos e/ou outros reagentes requeridos para a detecção e/ou quantifi-cação do analite em particular sendo testado para, por exemplo, um anticor-po antilipoidal. Portanto estas zonas podem ser visualizadas como setoresfuncionais ou regiões funcionais dentro do dispositivo de teste.

Em geral, uma amostra de fluido (ou uma amostra suspendidaem um fluido) é introduzida para a tira na extremidade proximal da tira, porexemplo, mergulhando ou pintando. Uma amostra é coletada ou obtida u-sando métodos de conhecimento geral daqueles versados na técnica. A a-mostra contendo os anticorpos antilipoidais a serem detectados pode serobtida de qualquer fonte biológica. Exemplos de fontes biológicas incluemsoro sangüíneo, plasma sangüíneo, urina, fluido espinal, saliva, fluido defermentação, fluido linfático, fluido de cultura de tecido e fluido de ascite deum ser humano ou animal. A amostra pode ser diluída, purificada, concen-trada, filtrada, dissolvida, suspendida ou manipulada de modo diverso antesde imunoensaio para otimizar os resultados do imunoensaio. O fluido migradistalmente através de todas as regiões funcionais da tira. A distribuição finaldo fluido nas regiões funcionais individuais depende da capacidade adsortivae das dimensões dos materiais usados.

Em algumas modalidades, suportes sólidos porosos, tais comonitrocelulose, descritos acima preferencialmente estão sob a forma de cha-pas ou tiras. A espessura de semelhantes chapas ou tiras pode variar dentrode amplos limites, por exemplo, a.partir de cerca de 0,01 a 0,5 mm, de cerca.de 0,02 a 0,45 mm, de cerca de 0,05 a 0,3 mm, de cerca de 0,075 a 0,25mm, de cerca de 0,1 a 0,2 mm, ou de cerca de 0,11 a 0,15 mm. O tamanhode poro de semelhantes chapas ou tiras pode variar de modo similar dentrode amplos limites, por exemplo, a partir de cerca de 0,025 a 15 micra, oumais especificamente de cerca de 0,1 a 3 micra; no entanto, não se pretgen-de que o tamanho de poro seja um fator Iimitante na seleção do suporte sóli-do. O índice de fluxo de um suporte sólido, onde aplicável, também podevariar dentro de amplos limites, por exemplo, de cerca de 12,5 a 90 s/cm(isto é., 50 a 300 s/4 cm), cerca de 22,5 a 62,5 s/cm (isto é, 90 a 250s/4 cm), cerca de 25 a 62,5 s/cm (isto é, 100 to 250 s/4 cm), cerca de 37,5 a62,5 s/cm (isto é, 150 a 250 s/4 cm), ou cerca de 50 a 62,5 s/cm (isto é, 200a 250 s/4 cm). Em modalidades específicas de dispositivos descritos aqui,neste requerimento de patente, o índice de fluxo é cerca de 62,5 s/cm (istoé, 250 s/4 cm). Em outras modalidades específicas de dispositivos descritosaqui, neste requerimento de patente, o índice de fluxo é de cerca de 37,5s/cm (isto é, 150 s/4 cm).

Outra característica comum a ser considerada no uso de dispo-sitivos de imunoensaio é um meio para detectar a formação de um complexoentre um analite (tal como um anticorpo antilipoidal) e um reagente de captu-ra (tal como complexos de anticorpo âncora-antígeno lipoidal). Um detector(também referido como reagente detector) serve esta finalidade. Um detectorpode ser integrado em um dispositivo de imunoensaio (por exemplo, incluídoem um bloco de conjugado, conforme descrito abaixo), ou pode ser aplicadoao dispositivo a partir de uma fonte externa.

Um detector pode ser um único reagente ou uma série de rea-gentes que servem coletivamente a finalidade de detecção. Em alguns ca-sos, um reagente detector é um parceiro de ligação marcado específico parao analite (tal como, Proteína A conjugada a ouro para um analite de anticor-po, ou Ab anti-humano marcado com ouro (Fc) para um analite de anticorpohumano). Em outros casos, um reagente detector inclui coletivamente umprimeiro parceiro de ligação não marcado específico para o analite e um se-gundo parceiro de ligação marcado específico para o primeiro parceiro deligação e assim por diante. Em cada caso, um reagente detector especifica-mente detecta analite ligado de um complexo de analite-reagente de capturae, portanto, um reagente detector preferencialmente não substancialmenteliga a ou reage com o reagente de captura ou outros !componentes Iocaliza-dos na área de captura do analite. A ligação ou reação não específica referi-da de um detector pode proporcionar um resultado falso positivo. Opcional-mente, um reagente detector pode reconhecer especificamente uma molécu-la de controle positivo (tal como uma IgG humana não específica para umdetector de Proteína A marcada, ou um detector de Proteína G marcada, ouum Ab anti-humano marcado (Fc)) que está presente em uma área de captu-ra secundária.Preferencialmente, um reagente detector para uso nos métodosou dispositivos descritos não substancialmente liga a ou reage com umcomplexo de anticorpo âncora imobilizado-antígeno lipoidal. Uma pessoa deconhecimento regular da técnica pode facilmente determinar combinaçõesde reagentes detectores particulares e complexos de anticorpo âncora-antígeno lipoidal particulares que satisfarão esta preferência para a detecçãode analites particulares. Por exemplo, para a detecção de anticorpos antili-poidais humanos, algumas combinacoes tipicas nao limitantes incluem:

<table>table see original document page 51</column></row><table><table>table see original document page 52</column></row><table>

Β. Construção e Desenho de Dispositivo de Fluxo Direto

Um dispositivo de fluxo direto envolve um reagente de captura(tal como um complexo de anticorpo âncora-antígeno lipoidal) imobilizadosobre um suporte sólido, tipicamente, uma membrana (tal como, nitrocelulo-se, náilon, ou PVDF). Características de membrana úteis foram descritaspreviamente; no entanto, é útila observar que em um teste de fluxo diretoaumento capilar não é uma característica particularmente importante de umamembrana uma vez que a amostra se move verticalmente através da mem-brana ao invés de sobre esta como em um teste de fluxo lateral. Em umsimples formato representativo, a membrana de um dispositivo de fluxo dire-to é colocada em contato funcional ou físico com uma camada absorvente(vide, por exemplo, descrição de "bloco absorvente" abaixo), a qual age co-mo um reservatório para extrair uma amostra de fluido através da membra-na. Opcionalmente, depois de imobilização de um reagente de captura,quaisquer sítios de ligação de proteína remanescentes sobre a membranapodem ser bloqueados (ou antes ou simultaneamente com a administraçãoda amostra) para minimizar interações não específicas. Uma modalidadefísica típica de um dispositivo de fluxo direto é mostrada na FIGURA 10.

Na operação de um dispositivo de fluxo direto, uma amostra defluido (tal como uma amostra de fluido corporal) é colocada em contato coma membrana. Tipicamente, um dispositivo de fluxo direto também inclui umaárea de aplicação da amostra (ou reservatório) para receber e reter tempora-riamente uma amostra de fluido de um volume desejado. A amostra passaatravés da matriz da membrana. Neste processo, um analite na amostra (talcomo um anticorpo antilipoidal) pode ligar especificamente ao reagente decaptura imobilizado (tal como complexo de anticorpo âncora-antígeno Iipoi-dal). Onde se deseja a detecção de um complexo de analite-reagente decaptura, um reagente detector (tal como Proteína A marcada, Proteína Gmarcada, ou IgG anti-humana marcada (Fc)) pode ser adicionado com aamostra ou uma solução contendo um reagente detector pode ser adiciona-do subseqüente à aplicação da amostra. Se um analite for especificamenteligado por reagente de captura, um visual típico atribuível ao reagente detec-tor em particular pode ser observado sobre a superfície da membrana. Eta-pas de lavagem opcionais podem ser adicionadas em qualquer momento doprocesso, por exemplo, depois de aplicação da amostra, e/ou depois de apli-cação de um reagente detector.

C. Construção e Desenho de Dispositivo de Fluxo Lateral

Dispositivos de fluxo lateral são comumente conhecidos na téc-nica. Em resumo, um dispositivo de fluxo lateral é um dispositivo analíticotendo como sua essência uma tira de teste, através da qual flui um fluido deamostra de teste que é suspeito de conter um analite de interesse. O fluidode teste e qualquer analite suspendido pode escoar ao longo da tira parauma zona de detecção na qual o analite (caso presente) interage com umagente de captura e um agente de detecção para indicar uma presença, au-sência e/ou quantidade do analite.

-....... Foram descritos.numerosos dispositivos analíticos de fluxo late-ral, e incluem aqueles mostrados nas Patentes dos Estados Unidos Nos.4.313.734; 4.435.504; 4.775.636; 4.703.017; 4.740.468; 4.806.311;:4.806.312; 4.861.71_1j_ 4.855.240; 4.857.453; 4.943.522; J.945.042j_4.496.654; 5.001.049; 5.075.078; 5.126.241; 5.451.504; 5.424.193;5.712.172; 6.555.390; e 6.368.876; na Patente Européia No. EP 0810436; enas publicações de Patentes Internacionais Nos. WO 92/12428;WO 94/01775; WO 95/16207; e WO 97/06439, cada uma das quais é incor-porada por meio de referência.

Muitos dispositivos de fluxo lateral são testes de fluxo lateral deuma etapa nos quais um fluido biológico é colocado em uma área da amos-tra sobre uma tira bíbula (embora possam ser usados materiais não bíbulos,e tornados bíbulos aplicando um tensoativo ao material), e deixado para mi-grar ao longo da tira até o líquido entrar em contato com um parceiro de liga-ção específico que interage com um analite no líquido. Uma vez que o anali-te interage com o parceiro de ligação, um sinal (tal como um corante fluores-cente ou visível de modo diverso) indica que ocorreu a interação. Múltiplosparceiros de ligação distintos podem ser colocados sobre a tira (por exem-plo, em linhas paralelas) para detectar múltiplos analites no líquido. As tirasde teste também podem incorporar indicadores de controle, os quais propor-cionam um sinal de que o teste foi realizado adequadamente, mesmo se umsinal positivo indicando a presença (ou ausência) de um analite não for vistasobre a tira.

A construção e o desenho de dispositivos de fluxo lateral é deconhecimento geral na técnica, conforme descrito, por exemplo, em MilliporeCorporation, A Short Guide Developing Immunochromatographic Test Strips,2nd Edition, pp. 1-40, 1999, disponível a pedido em (800) 645-5476; e Schle-icher & Schuell, Easy to Work with BioScience, Products e Protocols 2003,pp. 73-98, 2003, 2003, disponível a pedido em Schleicher & Schuell BioSci-ence, Inc., 10 Optical Avenue, Keene, NH 03431, (603) 352-3810; ambos osquais são incorporados aqui, neste requerimento de patente, por meio dereferência em suas totalidades.

Dispositivos de fluxo lateral têm uma ampla variedade de forma-tos físicos que são igualmente dê conhecimento geral na técnica. Qualquerformato físico que suporte e/ou encerre os componentes básicos de um dis-positivo de fluxo lateral na relação de função apropriada é contemplado poresta descoberta. A FIGURA 7 mostra vários exemplos de dispositivos defluxo lateral. Estes exemplos demonstram algumas das modalidades físicasque podem ser úteis na construção de um dispositivo de fluxo lateral.

Os componentes básicos de uma modalidade particular de umdispositivo de fluxo lateral são ilustrados na FIGURA 8, a qual mostra umamodalidade particular na qual um estojo alongado 10 contém uma tira defluxo lateral bíbula 12 que prolonga substancialmente toda a extensão doestojo 10. A tira de fluxo lateral 12 é dividida em um bloco de aplicação deamostra proximal 14 posicionado abaixo de uma porta de introdução de a-mostra 15, uma membrana do resultado do teste intermediário 16, e um blo-co absorvente distai 18. A tira de fluxo 12 é interrompida por um bloco deconjugado 20 que contém conjugado marcado (tal como Proteína A conju-gada a ouro, Proteína G conjugada a ouro, Ab anti-humano conjugado a ou-ro). Uma tira ao longo do caminho de fluxo 12 passa do bloco proximal 14,através do bloco de conjugado 20, para a membrana do resultado do teste16, para acumulação eventual no bloco absorvente 18. Agentes de ligaçãoseletiva (tais como um complexo de anticorpo âncora-antígeno lipoidal) sãoposicionados sobre uma linha de teste proximal 22 na membrana do resulta-do do teste 16. Uma linha controle 24 é proporcionado na membrana do re-sultado do teste 16 ligeiramente distai à linha de teste 22.

Na operação da modalidade particular de um dispositivo de fluxolateral ilustrado na FIGURA 8, uma amostra de fluido contendo um analite deinteresse, tal como um anticorpo antilipoidal, é aplicada ao bloco de amostra14 através da porta de introdução de amostra 15. Em alguns exemplos, aamostra pode ser aplicada à porta de introdução de amostra 15 gota a gotaou, menos preferencialmente, mergulhando a extremidade do dispositivocontendo a porta de introdução de amostra 15 dentro da amostra. Em outrosexemplos onde uma amostra é sangue total, um fluido revelador opcional éadicionado à amostra de sangue para causar hemólise das hemácias e, emalguns casos, para fazer uma diluição apropriada da amostra de sangue to-tal. A partir do bloco de amostra 14, a amostra passa, por exemplo, por açãocapilar, para o bloco de conjugado 20. No bloco de conjugado 20, o analitede interesse pode ligar (ou ser ligado por) um reagente detector mobilizadoou mobilizável. Por exemplo, um analite de anticorpo antilipoidal pode ligar aum reagente detector de Proteína A conjugada a ouro contido no bloco deconjugado. O analite em complexo com o reagente detector pode em segui-da escoar para a membrana do resultado do teste 16 onde o complexo podeinteragir adicionalmente com um parceiro de ligação analite-específico (talcomo um complexo de anticorpo âncora-antígeno lipoidal), o qual é imobili-zado na linha de teste proximal 22. Em alguns exemplos, um anticorpo anti-lipoidal em complexo com um reagente detector (tal como, Proteína A conju-gada a ouro, Proteína G conjugada a ouro, ou Ab anti-humano conjugado aouro) pode ligar adicionalmente a complexos de anticorpo âncora-antígenoIipoidal imobilizado não marcados na linha de teste proximal 22. A formaçãodo imunocomplexo entre anticorpo antilipoidal, reagente detector marcado(por exemplo, conjugado a ouro) , e complexo de anticorpo âncora imobiliza-do-antígeno Iipoidal pode ser detectada pelo aparecimento de uma linha vi-sível na linha de teste proximal 22, a qual resulta da acumulação do marca-dor (por exemplo, ouro) na região localizada da linha de teste proximal 22. Alinha controle 24 pode conter um parceiro de ligação de reagente detec-tor-específico imobilizado, o qual pode ligar o reagente detector na presençaou ausência do analite. A ligação referida na linha controle 24 indica desem-penho apropriado do teste, mesmo na ausência do analite de interesse.

Em outra modalidade de um dispositivo de fluxo lateral, podehaver uma segunda linha de teste localizada paralela ou perpendicular (ouem qualquer outra relação espacial) à linha de teste 22 na membrana doresultado do teste 16. A operação desta modalidade em particular é similar àdescrita no parágrago imediatamente precedente com as considerações adi-cionais que (i) um segundo reagente detector específico para um segundoanalite, tal como um anticorpo anti-7". pallidum, também pode estar contidono bloco, de conjugado, e (ii) a segunda linha de teste conterá um segundoparceiro de ligação específico tendo afinidade para um segundo analite naamostra. Por exemplo, a segunda linha de teste pode conter antígenos tre-ponemais imobilizados que especificamente ligarão anticorpos anti-T. palli-dum presentes na amostra.

Alguns dos materiais que podem ser úteis para os componentesde um dispositivo de fluxo lateral são mostrados na Tabela 1. No entanto,uma pessoa versada na técnica reconhecerá que os materiais particularesusados em um dispositivo de fluxo lateral particular dependerá de uma sériede variáveis, incluindo, por exemplo, o analite a ser detectado, o volume daamostra, o índice de fluxo desejado e outros, e pode selecionar rotineira-mente os materiais úteis por conseguinte.Tabela 1.

<table>table see original document page 57</column></row><table>

1. Bloco da Amostra

O bloco da amostra (tal como o bloco da amostra 14 na FIGURA 8) é um componente opcional de um dispositivo de fluxo lateral que inicial-mente recebe a amostra, e pode servir para remover particulados da amos-tra. Entre os vários materiais que podem ser usados para construir um blocoda amostra (vide a Tabela 1), um bloco da amostra de celulose pode ser be-néfico se um grande volume de leito (por exemplo, 250 μΙ/cm2) for um fatorem uma aplicação particular. Blocos de amostra podem ser tratados com umou mais agentes de liberação, tais como tampões, sais, proteínas, detergen-tes, e tensoativos. Os agentes de liberação referidos podem ser úteis, porexemplo, para promover ressolubilização de constituintes de bloco do conju-gado, e bloquear sítios de ligação não específicos em outros componentesde um dispositivo de fluxo lateral, tais como uma membrana de nitrocelulose.Agentes de liberação típicos incluem, por exemplo, trealose ou glucose(1% - 5%), PVP ou PVA (0,5% - 2%), Tween 20 ou Triton X-100 (0,1% -1%),caseína (1% - 2%), SDS (0,02% - 5%), e PEG (0,02% - 5%).

2. Membrana e Solução de Aplicação:

Os tipos de membranas úteis em um dispositivo de fluxo lateral (tais comonitrocelulose, náilon e PVDF), e considerações para aplicar um reagente decaptura a membranas semelhantes foram discutidos previamente.

3. Bloco do Conjugado

O bloco de conjugado (tal como bloco de conjugado 20 na FI-GURA 8) serve para, entre outras coisas, encerrar um reagente detector. Emalgumas modalidades, um reagente detector pode ser aplicado externamen-te, por exemplo, de um frasco de revelador, em cujo caso um dispositivo defluxo lateral não precisa conter um bloco de conjugado (vide, por exemplo, aPatente U.S. No. 4.740.468).

Um ou mais reagentes detectores contidos em um bloco de con-jugado é liberado em solução na aplicação da amostra de teste. Um bloco deconjugado pode ser tratado com várias substâncias para influenciar a libera-ção do reagente detector em solução. Por exemplo, o bloco de conjugadopode ser tratado com PVA ou PVP (0,5% a 2%) e/ou Triton X-100 (0,5%).Outros agentes de liberação incluem, sem limitação, hidroxipropilmetila celu-lose, SDS, Brij e β-lactose. Uma mistura de dois ou mais agentes de libera-ção podem ser usados em qualquer dada aplicação. Na modalidade descitaem particular, o reagente detector no bloco de conjugado 20 é Proteína Amarcada, Proteína G, ou IgG anti-humana (Fc).

4. Bloco Absorvente

O uso de um bloco absorvente 18 em um dispositivo de fluxolateral é opcional. O bloco absorvente age aumentando o volume total deamostra que penetra no dispositivo. Este volume aumentado pode ser útila,por exemplo, para lavar o analite não ligado da membrana. Qualquer um deuma variedade de materiais é útila para preparar um bloco absorvente, vide,por exemplo, a Tabela 1. Em algumas modalidades de dispositivos, um blo-co absorvente pode ser papel (isto é, fibras celulósicas). Uma pessoa versa-da na técnica pode selecionar um bloco de papel absorvente com base em,por exemplo, sua espessura, compressibilidade, manufaturabilidade, e uni-formidade do volume do leito. O volume de captação de um absorvente pre-parado pode ser ajustado alterando as dimensões (geralmente a extensão)de um bloco absorvente.

D. Dispositivos de Combinação

Cada um dos dispositivos de imunoensaio discutidos acima (porexemplo, haste graduada, dispositivo de fluxo direto ou dispositivo dé fluxolateral) pode ser, em algumas modalidades, formatado para detectar múlti-plos analites pela adição de áreas de captura secundárias, terciárias ou maiscontendo reagentes de captura específicos para os outros analites de inte-resse. Em particular, esta descoberta contempla dispositivos de imunoensaioque detectam simultaneamente anticorpo antilipoidal e treponemas ou anti-corpos anti-treponemais em amostras de fluido (tal como, soro humano). Osdispositivos de combinação referidos adicionalmente incluem uma área decaptura treponemal envolvendo (a) um antígeno treponemal imobilizado ca-paz de ser especificamente ligado por um anticorpo anti-T. pallidum, ou (b)um anticorpo anti-7". pallidum imobilizado que liga especificamente um antí-geno treponemal móvel. Conforme usado aqui, neste requerimento de paten-te, um "antígeno treponemal" é um antígeno contendo no mínimo um deter-minante antigênico que liga especificamente anticorpos anti-T. pallidum. Fo-ram descritos na técnica numerosos antígenos treponemais; vide, por exem-plo, as Patentes dos Estados Unidos Nos. 6.479.248; 6.248.331; 5.681.934;5.578.456; 4.868.118; e 4.740.467. Por exemplo, polipeptídeos de no míni-mo os seguintes pesos moleculares aparentes foram descritos como antíge-nos de T. pallidum: 16-20 kDa, 18 kDa, 18-23 kDa, 25 kDa, 35 kDa, 37 kDa,37-46 kDa, 38 kDa, 39 kDa, 41 kDa, 43 kDa, 44 kDa, 46 kDa, 47 kDa, 58kDa, 150 kDa; e 180 kDa (para detalhes mais particulares, vide a PatenteU.S. No. 4.846.118).

Antígenos treponemais e anticorpos anti-7". pallidum são polipep-tídeos; portanto, quando usados como reagentes de captura, estas molécu-las podem ser diretamente aderidas a um suporte sólido (tal como, nitrocelu-lose, náilon ou PVDF). Não obstante, é contemplado que antígenos trepo-nemais ou anticorpos anti-T. pallidum podem ser imobilizados (diretamenteor indiretamente) sobre um suporte sólido por qualquer método disponível.

Um reagente detector pode ser usado para detectar a formaçãode um complexo entre um reagente de captura treponemal e analite trepo-nema-específico (tal como, um treponema, um antígeno treponemal, ou umanticorpo anti-treponemal). Em algumas modalidades, um reagente detector(tal como um Ab anti-humano (Fc)) pode detectar especificamente um anali-te treponema-específico ligado (por exemplo, um anticorpo anti-treponemalhumano) e um analite de anticorpo antilipoidal ligado (por exemplo, um anti-corpo antilipoidal humano). Em outros casos, são previstos dois reagentesdetectores separados para detecção específica de um analite trepone-ma-específico ligado (por exemplo, anticorpo anti-treponemal ou antígenotreponemal) ou um analite de anticorpo antilipoidal ligado.

A operação de um dispositivo de imunoensaio útila para realizartestes treponemais e não treponemais simultâneos é substancialmente simi-lar aos dispositivos descritos alhures nesta especificação. Uma característicaparticular de um dispositivo de combinação é que uma amostra de fluido a-plicada a uma área de aplicação da amostra é capaz de contatar, (por exem-plo, fluir para ou fluir através de) cada uma de uma área de captura de anti-corpo antilipoidal e para uma área de captura treponemal.

São descritos aqui, neste requerimento de patente, kits para usona detecção de anticorpos antilipoidais em uma amostra (tal como, uma a-mostra biológica). Os kits referidos também podem ser usados, por exemplo,no diagnóstico de doenças nas quais a presença de anticorpos antilipoidaisé sintomática da doença (tal como, sífilis ou lúpus). Algumas modalidadesdos kits descritos são geralmente portáveis e proporcionam um modo sim-pies, rápido, e/ou de custo eficaz para detectar anticorpos antilipoidais e/oudiagnosticar doença (tal como sífilis) sem a necessidade de instalações labo-ratoriais, tal como em uma instalação de ponto de atendimento.Os kits incluem um ou mais dispositivos de imunoensaio confor-me revelado aqui, neste requerimento de patente, e um meio de veículo, talcomo uma caixa, uma bolsa, uma sacola, caixa plástica (tal como plásticomldado ou outra embalagem transparente), empacotador (tal como, umplástico selado ou selável, papel, ou empacotador metálico), ou outro recipi-ente. Em alguns exemplos, os componentes dos kits serão contidas em umaúnica unidade de embalagem, tal como uma caixa ou outro recipiente, cujaunidade de embalagempode ter compartimentos nos quais um ou mais com-v ponentes do kit podem ser dispostos. Em outros exemplos, um kit inclui umou mais recipientes, por exemplo, frascos, tubos, e semelhantes que podemreter, por exemplo, uma ou mais amostras biológicas a serem testadas, a-mostras de controle positivo e/ou negativo ou soluções (tais como, um sorocontrole positivo contendo anticorpos antilipoidais ou treponemais), diluentes(tais como, tampões de fosfato, ou tampões de salina), reagentes detectores(por exemplo, para aplicação externa a um dispositivo do kit), reagentes desubstrato para visualização de enzimas reagentes detectores (tal como, 5-bromo-4-cloro-3-indolila fosfato, nitrobíue tetrazóíio em dimetila formamida),e/ou soluções de lavagem (tais como, tampões Tris, tampão de salina, ouágua destilada).

Outras modalidades . de kits incluem seringas, dispositivos de-picada digital, esfregaços de álcool, compressas de gaze, bolas de algodão,bandagens, luvas de látex, bandejas de incubação com números variáveisde depósitos, seladores de placa adesivas, chapas de relatórios de dados,as quais podem ser úteis para manusear, coletar e/ou processar uma amos-tra biológica. Os kits também podem conter opcionalmente implementos ú-teis para introduzir amostras em uma câmara de amostra de um dispositivode imunoensaio, incluindo, por exemplo, conta-gotas, Dispo-pipetas, tuboscapilares, bulbos de borracha (por exemplo, para tubos capilares), e seme-lhantes. Ainda outras modalidades de kits podem incluir meios para descartepara descartar um dispositivo de imunoensaio usado e/ou outros itens usa-dos com o dispositivo (tais como amostras de pacientes, e etc.). Os meiospara descarte podem incluir, sem limitação, recipientes que são capazes deconter vazamento a partir de materiais descartados, tais como plástico, me-tal ou outras bolsas, caixas ou recipientes impermeáveis.

Em alguns exemplos, um kit revelado incluirá instruções para ouso de um dispositivo de imunoensaio. As instruções podem proporiconarorientação sobre como aplicar amostra ao dispositivo de teste, a quantidadede tempo necessária ou aconselhável para esperar pelo desenvolvimentodos resultados, e detalhes sobre como ler e interpretar os resultados do tes-te. As instruções referidas também podem incluir padrões, tais como tabelas,gráficos, ou figuras padrões para comparação dos resultados de um teste.

Estes padrões podem incluir opcionalmente a informação necessária paraquantificar o analite usando o dispositivo de teste, tal como uma curva pa-drão relacionando a intensidade de sinal ou número de linhas de sinal a umaquantidade de analite presente portanto na amostra.

EXEMPLOS

Os exemplos seguintes são proporcionados para ilustrar algu-mas características e/ou modalidades particulares. Estes exemplos não de-vem ser considerados para limitar a invenção às características ou modali-dades particulares descritas.

EXEMPLO 1

Preparação de um Antígeno Lipoidal de USR

Este Exemplo descreve a preparação de um antígeno Iipoidalexemplar, um antígeno de USR, o qual pode ser fixado a um suporte sólido,tal como nitrocelulose, usando os métodos descritos. Cerca de 100 ml de umantígeno de USR pode ser preparado conforme descrito neste Exemplo; noentanto, aqueles de conhecimento regular da técnica reconhecerão que esteprotocolo descrito pode ser escalada para cima ou para baixo para produzirmais ou menos, respectivamente, antígeno de USR. Além disso, a menosque determinado expressamente de modo diverso, todas as etapas do mé-todo, reações, e etc. neste e nos exemplos seguintes foram realizados emtemperatura ambiente (por exemplo, de cerca de 20°C a cerca de 25°C).

Oito (8) ml de salina tamponada com VDRL (10 gramas de NaCI, 0,5 mL de formaldeído, 0,093 gramas de dissódio hidrogênio fosfato, e 0,170gramas de diidrogênio fosfato de potássio em 1 litro de água destilada) foiadicionado a um frasco redondo com rolha de vidro de 250 mL. Durante umperíodo de 40 a 60 segundos, 10 mL de antígeno de VDRL (0,9% de coles-terol, 0,03% de cardiolipina de coração bovino, e cerca de 0,21% de Ieticinaem etanol) foi adicionado diretamente sobre a salina tamponada com contí-nua rotação do frasco. A rotação do frasco foi continuada por aproximada-mente 10 segundos depois da adição do antígeno de VDRL. Em seguida, 82mL de salina tamponada de VDRL foi adicionado à mistura da reação. Como topo posiciomado no frasco, o frasco foi agitado de baixo para cima e devolta aproximadamente 30 vezes em 10 segundos. Alíquotas de cerca de 19mL da mistura agitada foram centrifugadas em tubos de aço inoxidável emuma centrífuga angular (Sorvall SS-3) em temperatura ambiente em umaforça centrífuga relativa de aproximadamente 2000 χ g por 15 minutos (me-dida quanto a centrífuga atingiu a velocidade desejada). O fluido do sobre-nadante foi cuidadosamente decantado invertendo o tubo para longe do ladocontendo o material sedimentado. Depois de remover o sobrenadante, o tu-bo da centrífuga foi invertido e esfregado com gaze de algodão sem agitar osedimento. O sedimento foi em seguida ressuspendido com suave agitaçãoém um volume de solução de ressuspensão (3,72% de EDTA, 40% de clore-to de colina (v/v), salina tamponada com fosfato pH 6.9 ± 0.1) igual ao dasuspensão de antígeno centrifugada (neste caso, 19 ml). Todos os sedimen-tos ressuspendidos foram recombinados em um frasco com rolha de vidro esuavemente torvelinhados para^misturar para formar a preparação de antí-geno. A preparação de antígeno foi em seguida colocada dentro de um refri-gerador (a partir de cerca de 2°C a cerca de 8°C) por aproximadamente umasemana para estabilizar.

EXEMPLO 2

Fracionamento por Sulfato de Amônio de Soro Humano Infectado por T. pallidum

Este Exemplo descreve um método para separar uma fraçãocontendo imunoglobulina do soro. O método deste Exemplo (bem como ou-tros métodos de isolamento de imunoglobulina que são comumente conhe-Cidos na técnica) pode ser usado para purificar parcialmente imunoglobuli-nas a partir de qualquer fonte de soro sangüíneo, inclusive soro de sujeitosnão humanos (tais como coelhos).

Soro de pacientes humanos infectados com T. pallidum (referi-dos do início ao fim deste e nos exemplos seguintes como "anti-soro hiperi-mune") foi obtido da Biomedical Resources (Hatboro, PA). Um volume dese-jado de anti-soro hiperimune foi colocado em um recipiente que encerra maisde duas vezes o volume de soro. Com agitação, uma quantidade de 70% desulfato de amônio saturado igual ao volume de soro foi lentamente adiciona-do gota a gota ao soro. Esta mistura foi agitada por aproximadamente 4 ho-ras em temperatura ambiente antes de centrifugação a aproximadamente3000 rcf por 30 minutos. Depois de centrifugação, o sobrenadante foi des-cartado e a fração contendo imunoglobulina precipitada foi ressuspendidaem um volume de água destilada igual ao volume original de soro. Em se-guida, uma quantidade igual de solução de sulfato de amônio saturado a70% foi adicionada gota a gota à fração contendo imunoglobulina ressus-pendida com agitação, a mistura foi centrifugada, o sobrenadante foi decan-tado, e o precipitado foi ressuspendido como acima. Este procedimento foiem seguida repetido uma vez mais. O precipitado contendo imunoglobulinafinal foi ressuspendido com água destilada para um décimo do volume desoro original. A fração contendo imunoglobulina ressuspendida foi dialisadacontra três volumes de ΐΟΟχ 0,85% de cloreto de sódio pH 8.0 de um diapara o outro a 2-8°C. A concentração de proteína total no retentado da diáli-se foi determinada pelo Teste de Proteína de Bradford Bio-Rad® de acordocom as instruções do fabricante.

EXEMPLO 3

Purificação de IgG Usando uma Coluna de Afinidade de Proteína A

IgGs foram isoladas da fração contendo imunoglobulina do Exemplo 2 usan-do cromatografia por ágarose de Proteína A. Conforme é de conhecimentona técnica, a Proteína A liga especificamente à região Fc da IgG de uma va-riedade de espécies de mamíferos.

Um reservatório de tampão contendo 1000 ml_ de tampão defosfato de sódio a 20 mM, pH 7.4 ("tampão de fosfato") foi conectado a umacoluna de 10 mL de Proteína A Sepharose CL-4B (Pharmacia). A coluna foilavada com 200 mL do tampão de fosfato, e foi medido o pH do eluente. Acoluna não foi carregada com a amostra contendo imunoglobulina até o pHdo eluente estar na faixa de 7,3 ± 0,2.

Depois de desconectar o reservatório do tampão, o retentado dadiálise contendo imunoglobulina do Exemplo 2 foi aplicado à coluna tomandocuidado para não perturbar a superfície da matriz da coluna. Em seguida, 20mL de tampão de fosfato foi adicionado à coluna, o reservatório de tampãofoi refixado à coluna, e frações foram coletadas usando uma coletor de fra-ção carregado com tubos de 80-12 χ 125 mm diâmetro. A absorvência a280 nm do eluente da coluna foi monitorada. Quando a absorvência a280 nm do eluente retornou à linha basal (indicando a elutriação substanci-almente completa de proteína não específica), um segundo reservatório detampão contendo 500 mL de glicina a 100 mM pH 2.7 foi conectado à colu-na. Novamente, as frações foram coletadas ao mesmo tempo que monito-rando a absorvência do eluente a 280 nm. Todas as frações elutrizada notampão de glicina tendo uma abso Ivdncia28Onm de 0,1 ou mais foram combi-nadas. As frações referidas incluíram proteínas especificamente ligadas porProteína A, isto é, IgGs, que estavam presentes-no soro humano infectadopor T. pallidu. O pH da solução combinada foi ajustado para 7,2 ± 0,2 usan-do 2,0 M de tampão Tris, e a concentração de proteína total foi determinadaconforme descrito previamente.

EXEMPLO 4

Ligação Específica de IgG Purificada em Proteína A a Antígeno de USRem Solução

Foi determinado o título de desfecho das IgGs purificadas comProteína A obtidas conforme descrito no Exemplo 3. Foram feitas diluiçõesseriais da amostra de IgG (a partir de 1:2 até 1:512) em 0,9% de salina. Cin-qüenta (50) μΙ de cada diluição foi colocado em cada um de 10 círculos(14 mm) sobre uma lâmina de video de 5,08 χ 7,62 cm (2 χ 3 polegadas).

O antígeno de USR, preparado conforme descrito no Exemplo 1,foi suavemente ressuspendido e colhido em uma agulha de administração eseringa em uma posição vertical. Várias gotas foram dispensadas e descar-tadas para limpar a agulha de ar. Em seguida, 1 gota em queda livre (apro-ximadamente 22 pL) de suspensão de antígeno foi adicionada a cada círculocontendo IgG. A lâmina foi colocada sobre o rotor mecânico por 4 minutos a180 + 2 rpm. Ao realizar este teste em um clima seco onde a evaporaçãopode ser um problema, pode ser vantajoso colocar as lâminas sob uma co-bertura umidificante de umidade durante a etapa de rotação. Imediatamentedepois de rotação, a lâmina foi visualizada microscopicamente usando ocu-lares de 10x e uma objetiva de 10x para determinar em quais reações ocor-reu floculação. O título de IgG foi determinado para serem a maior diluiçãoque dá uma reação fraca (ou fracamente) positiva.

Um volume original de amostra de IgG purificada em Proteína Afoi diluída em um primeiro volume de diluição de salina tamponada com fos-fato pH 7,2 ± 0,2 ("PBS") para um título de anticorpo eficaz de 1:2048. Por-tanto, em uma situação onde o título de desfecho da amostra foi 1:32, umvolume de amostra foi diluído com 64 volumes de salina tamponada comfosfato pH 7.2 ±0.2 ("PBS") (Em outros exemplos, um soro tendo um títulode desfecho de 1:16 será diluído com 128 volumes de PBS, e um soro tendoum título de desfecho de 1:64 será diluído com 32 volumes de PBS, e etc.).

Em seguida, um volume de micela de USR (preparado conforme descrito noExemplo 1) igual ao volume original de IgG purified foi adicionado à amostrade IgG diluída com suave misturação. A mistura foi deixada para sedimentara 2-8°C por vários dias até o sobrenadante clarear. Em seguida, o sobrena-dante foi removido e substituído com um volume de PBS igual ao primeirovolume de diluição (por exemplo, 64 volumes de PBS na situação descritaacima). As etapas precedentes foram repetidas até o sobrenadante ser cla-reado. Depois de remover o sobrenadante final, o volume de material preci-pitado (contendo complexos de micela de USR -anticorpo (IgG); tambémreferido como micelas revestidas com IgG) foi medido com um cilindro, e aconcentração de proteína das revestidas com IgG foi determinada pelo mé-todo de Bradford.EXEMPLO 5

Preparação e Isolamento de Fragmentos Fab

IgG purificada em Proteína A (preparado conforme descrito noExemplo 3) foi concentrada para aproximadamente 20 mg/ml usando umfiltro centrífugo Centricon® (MiIIipore) e dialisado contra 2x1000 mL deTampão de Amostra (20 mM de fosfato de sódio, 10 mM de EDTA, pH 7.0).

Papaína imobilizada sobre 6% de contas reticuladas ágarose emuma pasta fluida a 50% em 50% de glicerol, 0,1 M de acetato de sódio(pH 4.4) e 0,05% de azida de sódio (Pierce) foi misturado por inversão ousuave agitação para obter uma suspensão uniforme. Em seguida, 2,5 mL dapasta fluida foi adicionado a um tubo de teste de vidro ou outro recipiente dereação adequado. Para equilibrar o gel, 20 mL de Tampão de Digestão re-cém-preparado (20 mM de fosfato de sódio, 10 mM de EDTA, 20 mM de cis-teína-HCI, pH 7.0) foi adicionado à pasta fluida. Em seguida, o gel foi sepa-rado do tampão por centrifugação, e este procedimento foi repetido com ou-tros 20 mL de Tampão de Digestão. O gel equilibrado foi ressuspendido em2,5 mL de Tampão de Digestão.

IgG purificada em Proteína A (2,5 m1 de uma solução de10 mg/ml) foi diluída com 2,5 mL de Tampão de Digestão. A solução de IgGfoi adicionada ao tubo ou recipiente contendo a papaína imobilizada, e amistura foi incubada a partir de cinco horas até de um dia para o outro emum banho-maria em shaker a 37°C em alta velocidade. Uma misturaçãoconstante do gel foi mantida durante a incubação.

Depois da incubação, 7,5 mL de 10 mM de Tris-HCI, pH 7.5 foiadicionado à mistura da reação, e a mistura foi separada por centrifugação a300 rpm por 25 minutos. O sobrenadante (o qual contém fragmentos de i-munoglobulina) foi removido da papaína imobilizada sedimentada.

O sobrenadante foi passado sobre coluna de uma Proteína A conforme des-crito no Exemplo 3. Conforme mostrado na FIGURA 1, foram recuperadosdois picos protéicos. O Plco I, o qual não ligou especificamente Proteína A,foi a fração Fab de fragmentos de imunoglobulina, e o Plco II, o qual ligouespecificamente Proteína A, foi a fração Fe. As concentrações protéicas dasfrações Fab e Fc foram determinadas conforme previamente descrito.

EXEMPLO 6

Análise por Gradiente de Gel de Poliacrilamida SDS de Amostras Con-tendo Imunoglobulina

Este Exemplo ilustra o teor de proteína de várias amostras pro-duzidas nos Exemplos 2, 3 e 5. Um gradiente de gel poliacrilamida linear a10-20% pré-fundido Bio-Rad® com 4% de gel de empilhamento foi usadopara separar, por tamanho, as bandas de proteína presentes na fração deimunoglobulina de sulfato de amônio (vide o Exemplo 2), Proteína A picos I eIl (vide o Exemplo 3), IgG purificada em Proteína A antes e depois de diges-tão por papaína (vide o Exemplo 5), e IgG picos I (Fab fração) e Il (Fc fra-ção) depois de digestão por papaína (vide o Exemplo 5).

As amostras (2,5 Mg/μΙ) foram diluídas a 1:1 em amostra tampãode Laemmli (62,5 mM de Tris-HCI, 2% de SDS, pH 6.8, 2% de SDS e 25 %de glicerol (sem β-mercaptoetanol)). As amostras foram aquecidas e carre-gadas nas cavidades respectivas. O tampão do reservatório foiTris-glicina-SDS (25 mM de Tris-HCI, pH 8.3, 192 mM de glicina, 0,1% deSDS). O gel foi passado por 45 minutos a 200 volts. Depois de três lavagenscom H2O, os géis foram corados por 30 minutos com Pierce Gel Code Blué®e em seguida clareados por lavagem repetida com água.

Conforme mostrado na FIGURA 2, a fração de soro (alameda 2)hiperimune humano (sifilítico) precipitada com sulfato de amônio continhauma mistura de bandas de proteína de predominantemente alto peso mole-cular. Conforme mostrado na FIGURA 2, alameda 4, uma fração de IgG rela-tivamente pura foi ligada por e elutriada de uma coluna de Proteína A. Diges-tão por papaína da IgG purificada em Proteína A produziu uma mistura deproteínas (alameda 6), as quais foram separáveis em duas populações deproteínas por fracionamento sobre uma coluna de Proteína A. A FIGURA 2,alameda 7 mostra que um fragmento de IgG digerido por papaína predomi-nante de aproximadamente 54 kD não foi retido pela coluna de Proteína A.

Este peso molecular aparente é o tamanho esperado de fragmentos Fab.

Não houve substancialmente bandas de proteína de maior peso molecular(representando, por exemplo, fragmentos Fab2 ou Fc ou IgG não digerida)observadas na alameda 7. Proteínas tendo os pesos moleculares esperadosde fragmentos Fc e IgG não digerida foram retidas pela coluna de Proteína A(alameda 8).

EXEMPLO 7

Conjugado de Ouro Coloidal e Proteína A Não Detecta Fragmentos Fab

Um (1) μl das frações de digestão por papaína de IgG (prepara-do conforme descrito no Exemplo 5) foi pintado sobre uma membrana denitrocelulose de 5 mm χ 4 cm e secados de um dia para o outro! Cem(100) μl de caseína a 1% em 10 mM de tampão de fosfato com 0,25 M decloreto de sódio, pH 7.4 foram colocados dentro das cavidades correspon-dentes de uma lâmina de microtítulo. Dois (2) μΙ de Proteína A conjugada aouro coloidal foram misturados dentro de cada cavidade e as tiras corres-pondentes foram colcoadas dentro de cada cavidade.

Conforme mostrado na FIGURA 3, conjugado de ouro coloidal eProteína A detectaram as frações de IgG e Fc mas não as frações Fab.

EXEMPLO 8

Determinação de uma Quantidade Útila de Fab para Fixar a Micela deUSR

Fragmentos Fab preparados conforme descrito no Exemplo 5foram diluídos em PBS para 1000 μς/μΙ, 100 Mg/μΙ, 10 Mg/μΙ, 1 Mg/μΙ,100 ng/μl e 10 ng/μΙ. Cada diluição de fração Fab foi misturada com um vo-lume igual de uma solução de micelas de USR preparada conforme descritono Exemplo 1. Um (1) μΙ desta mistura de Fab-micelas de USR foi pintadosobre uma membrana de nitrocelulose de 5 mm χ 4 cm e secado de um diapara o outro em temperatura ambiente.

Um anti-soro humano (o qual foi reativo no teste de RPR emuma diluição a 1:64) foi diluído a 1:400 em um tampão consistindo em 1% decaseína, 10 mM de fosfato, 0,25 M de cloreto de sódio pH 7.4. Um soro hu-mano RPR-não-reativo diluído de modo similar foi usado como um controlenegativo. Cem (100) μΙ de anti-soro (ou soro não-reativo) e 2 μΙ de ouro co-loidal Proteína A foram combinados em cada uma de várias cavidades deuma lâmina de microtítulo. Uma única tira de nitrocelulose contendo antíge-no Iipoidal reagido com Fab secado foi colocada dentro de cada cavidadeem temperatura ambiente por um tempo suficiente para os componentesdispostos dentro das cavidades migrarem ao longo da membrana para a Io-calização onde a mistura de Fab-micelas de USR foi pintada.

Conforme mostrado na FIGURA 4, tiras de nitrocelulose tendo1000, 10 ou 0,1 pg de Fab ligado ao antígeno de USR deu uma reação posi-tiva com soro humano RPR-reativo (R). Não foi observada reação paraquaisquer das amostras contendo soro RPR-não-reativo (NR).

Este Exemplo demonstra que, no mínimo, fragmentos Fab de apartir de cerca de 100 ng a cerca de 1 mg (tal como de cerca de 100 ng acerca de 450 ng) podem ser reagidos com uma preparação de antígeno deUSR (vide o Exemplo 1) para facilitar a fixação do antígeno Iipoidal a umamembrana de nitrocelulose sem efeito adverso substancial sobre a reativi-dade do antígeno de USR com anticorpos antilipoidais séricos em uma provade imunoensaio (tal como, tiras de teste, e dispositivos de fluxo direto e/oufluxo lateral). Uma quantidade de fragmento Fab útila e não Iimitante parausar conforme descrito neste Exemplo é cerca de 10 pg.

EXEMPLO 9

Determinação de um pH Útila para Conjugação de IgG Anti-Humana deCoelho (Fc) Purificada por Afinidade a Ouro Coloidal

Este Exemplo ilustra um método representativo para determinarum pH útila para conjugação por afinidade de IgG anti-humana de coelhopurificada (Fc) (Rockland, Gilbertsville, Pa.) com ouro coloidal. A IgG anti-humana de coelho (Fc) especificamente liga somente a porção Fc de IgGhumana, e não liga às regiões Fab ou outras regiões não-Fc de uma IgGhumana. Anticorpos com esta especificidade também podem ser referidoscomo "Fc anti-humano." Preparações de ouro coloidal tais como as descritasneste e em outros exemplos podem ser usadas como reagentes detectoresem imunoensaios descritos (incluindo, por exemplo, tiras de teste, e disposi-tivos de fluxo direto e/ou fluxo lateral).

Cerca de 25 mL de tampão de fosfato a 10 mM foi colocado den-tro de um béquer de 50 mL, e ajustado para pH 5.0 com 0,2 M de ácido fos-fórico. Duas alíquotas de 0,5 mL do tampão em pH 5.0 foram transferidaspara os dois tubos de teste de 12 χ 75 mm, um marcado "teste" e o outromarcado "controle." Em seguida, o pH do tampão de fosfato remanescentedentro do béquer foi seqüencialmente ajustado para 5.5, 6.0, 6.5, 7.0, 7.5,8.0, 8.5, 9.0, 9.5, e 10.0 usando 0,2 M de carbonato de potássio. Em cadapH, duas alíquotas de 0,5 mL foram transferidas para um tubo de teste de"teste" e de "controle" conforme descrito para a amostra de pH 5.0. Em se-guida, 30 pg de IgG anti-humana de coelho purificada por afinidade (Fc) foiadicionado a cada um dos tubos de "teste" e "controle", e os conteúdos dostubos foram bem misturados. Cerca de 25 mL de 40 nm de ouro coloidal (so-lução a 1%) (British Biocell International, Londres, Inglaterra) foi colocadodentro de um béquer separado de 50 mL, e foi produzida uma série de a-mostras de ouro coloidal de "controle" e de "teste" em pH 5.0, 5.5, 6.0, 6.5,7.0, 7.5, 8.0, 8.5, 9.0, 9.5, e 10.0 conforme descrito acima.

Unr (1) mL de ouro coloidal em cada pH foi adicionado às solu-ções de "teste" e de "controle" tendo o pH correspondente. As soluções deouro/lgG anti-humana de coelho (Fc) foram bem misturadas, e incubadaspor 20 minutos em temperatura ambiente. Em seguida, 200 μΙ de NaCI a 2M foi adicionado à série de tubos marcados "teste" e 200 μΙ de água destila-da foi adicionado à série de tubos marcados "controle." Os conteúdos deambas as séries de tubos foram deixados para incubar por 30 minutos emtemperatura ambiente.

A densidade ótica a 580 nm (OD580) de cada amostra de "teste"foi lida contra a amostra de "controle" correspondente. O pH da amostra coma menor OD58O foi determinado como sendo um pH favorável para a forma-ção de uma preparação de conjugado de ouro. Partículas de ouro coloidaltêm uma superfície carregada negativamente devido à camada de íons ne-gativos adsorvidos sobre a superfície das partículas de ouro durante o pro-cesso de fabricação. Proteínas, tais como IgG serão atraídas para partículasde ouro carregadas negativamente através de interações iônicas, hidrofóbi-cas, e dativas. Acredita-se que estas interações fundamentem a formaçãode conjugados de ouro coloidal-proteína. No pl de uma proteína conjugada auma partícula de ouro (isto é, o pH onde a proteína tem uma carga zero lí-quida), o conjugado será o mais estável.

A adição de NaCI a partículas de ouro coloidal não conjugadasromperá a camada de íons negativamente carregados adsorvidos à superfí-cie do ouro. Em conseqüência, a partícula de ouro dissociará e finalmenteliberará íons de ouro (isto é, Au+) em solução. Os íons de ouro livres podemser medidos em OD58O- Em contraste, um conjugado de proteína-ouro é re-sistente a disrupção por NaCI no pl do componente da proteína do conjuga-do. Por conseguinte, o pH da amostra com a menor OD58O é um pH útila noqual realizar reações de conjugação de ouro para obter um conjugado deouro estável,

Conforme mostrado na FIGURA 5, um pH útila para conjugaçãode 30 pg de IgG anti-humana de coelho (Fc) com até 10 pg de ouro coloidal(isto é, 1 mL de uma solução a 1%) é aproximadamente pH 9.5. O métododescrito neste Exemplo é amplamente aplicável a qualquer número de ou-tras proteínas que podem ser conjugadas a ouro para uso em um imunoen-saio revelado (tal como, Proteína A ou Proteína G). Além disso, acredita-seque as reações descritas são escaláveis para outras quantidades de conju-gado de ouro e proteína.

EXEMPLO 10

Determinação de uma Concentração de Proteína Útila para Conjugaçãode Ouro Coloidal

Este Exemplo ilustra um método exemplar para determinar umaconcentração de proteína útila para reações de conjugação com ouro coloi-dal. Preparações de ouro coloidaltais como as descritas neste e em outrosexemplos podem ser usadas como reagentes detectores em imunoensaiosdescritos (incluindo, por exemplo, tiras de teste, e dispositivos de fluxo diretoe/ou fluxo lateral).

Metade (0,5) mL de 10 mM de tampão de fosfato (ajustado parao pH dando a menor OD58O conforme descrito no Exemplo 9) foi adicionado a2 séries de 5 tubos. Uma série de tubos foi etiquetada "teste" e a outra sériefoi etiquetada "controle." Trinta (30) pg, 20 pg, 10 pg, 5 pg, ou 2,5 pg de IgGanti-humana de coelho (Fc) foi em seguida adicionado a cada uma das sé-ries de tubos, e bem misturados. Um (1) mL de 40 nm de ouro coloidal (solu-ção a 1 % ajustada para o mesmo pH que o tampão de fosfato) foi adiciona-do a cada tubo. As amostras foram incubadas por 20 minutos em temperatu-ra ambiente. Em seguida, 200 μΙ de 2 M de NaCI foi adicionado às amostrasetiquetadas "teste" e 200 μΙ de água destilada foi adicionado às amostrasetiquetadas "controle." Depois de incubação por 30 minutos em temperaturaambiente, a OD58O das amostras de teste foram lidas contra as amostrascontrole correspondentes. A menor concentração de IgG anti-humana decoelho (Fc) produzindo a menor OD58O indica uma concentração útila (ou fai-xa de concentração) para formação de uma preparação de conjugado deproteína-ouro.

Neste Exemplo, a menor concentração de IgG anti-humana decoelho (Fc) produzindo a menor OD580 representa a concentração onde umaquantidade útila de IgG anti-humana de coelho (Fc) foi associada com partí-culas de ouro. Maiores concentrações de IgG anti-humana de coelho (Fc),embora úteis, são menos preferenciais porque o excesso de IgG anti-humana de coelho (Fc) pode formar associações mais fracas com as partí-cuias de ouro, por exemplo, revestindo uma camada de moléculas de IgGanti-humana de coelho (Fc) que associaram previamente com as partículasde ouro.

Conforme mostrado na FIGURA 6, aproximadamente 30 μg éuma quantidade útila de IgG anti-humana de coelho (Fc) para conjugar a10 pg de ouro coloidal (isto é, 1 mL de uma solução a 1%). O método descri-to neste Exemplo é amplamente aplicável a qualquer número de outras pro-teínas que podem ser conjugadas a ouro para uso em um imunoensaio reve-lado (tal como, Proteína A ou Proteína G). Além disso, acredita-se que asreações descritas são escaláveis para outras quantidades de proteína e con-jugado de ouro.

A. Preparação de uma "Mini-preparação" Conjugada a Ouro

Uma mini preparação de conjugado de ouro de Fc anti-humanode coelho foi preparada adicionando 5 mL de tampão de borato a 10 mM auma quantidade de IgG anti-humana de coelho (Fc) necessária para obteruma concentração de proteína útila (tal como, 30 pg) conforme descrito aci-ma. Esta solução de proteína foi em seguinte ajustada para um pH útila (talcomo, pH 9.5) conforme também descrito acima. Dez (10) mL de outo coloi-dal 40 nm (solução a 1 % ajustada para o pH útila) foi adicionado à soluçãode proteína com pH ajustado com completa misturação. A mistura foi incu-bada por 20 minutos em temperatura ambiente. Em seguida, 1,6 mL de ca-seína a 10% foi adicionado para uma concentração final de 1% de caseína,e a incubação foi continuada um adicional de 20 minutos em temperaturaambiente. A mistura da reação foi centrifugada a 6500 χ g por 10 minutos, eo sobrenadante foi removido e descartado. O pélete foi ressuspendido em0,5 mL de tampão de ressuspensão (150 mM de NaCI, 20 mM de baseTrizma, 10% de sucrose, 5% de Trehalose, 0,1% de caseína, 0,05% de azi-da de sódio).

O pélete ressuspendido contendo IgG anti-humana de coelhoconjugada a ouro (Fc) pode ser usado para uma variedade de fins, incluindosem limitação, como um reagente detector para anticorpos antilipoidais hu-manos em um dispositivo de fluxo lateral.

EXEMPLO II

Detecção de Anticorpos Antilipoidais no Soro Humano

Este Exemplo demonstra que anticorpos antilipoidais em sorosifilítico podem ser detectados usando um reagente de captura de complexoantigênico Fab-USR imobilizado com nitrocelulose em combinação com umaIgG anti-humana de coelho móvel (Fc) ou reagente detector conjugado deouro de Proteína A.

Um (1) μΙ do complexo antigênico Fab-USR foi aplicado paraseparar membranas de nitrocelulose e deixado para secar de um dia para ooutro em temperatura ambiente conforme descrito no Exemplo 8. Um conju-gado de ouro coloidal foi preparado conforme descrito no Exemplo 10. Sorossifilíticos humanos reativos e um soro humano não reativo (não sifilítico) fo-ram diluídos a 1:100, 1:200 ou 1:400 em 1% de caseína, 10 mM de fosfato,0,5 M de cloreto de sódio pH 7.4. Cem (100) μΙ de cada diluição de soro foicolocado em um número apropriado de cavidades separadas de uma lâminade microtítulo. Dois (2) μΙ de Proteína A conjugada a ouro (preparado emuma maneira análoga ao Exemplo 10) foi em seguida adicionado a cada ca-vidade. Uma tira de nitrocelulose contendo reagente de captura de complexoantigênico Fab-USR imobilizado foi em seguida colocado dentro de cadacavidade contendo as soluções de anticorpo e reagente detector. A soluçãodentro das cavidades escoou para o alto da tira por ação capilar.

Conforme mostrado na Tabela 2, muitos dos sessenta soros sifi-líticos humanos reativos reagiram com as preparações de antígenoFab-USR imobilizado. Uma reação positiva foi caracterizada por um pontovisível de várias gradações de intensidade de cor, a partir de muito pálido(VF), pálido (F)1 fraco (W) e forte (S). Nenhuma reação visível foi indicadapor "N." Não houve nenhuma reação observada para o soro humano nãoreativo (não sifilítico) em qualquer diluição de soro testada.

Tabela 2. Reatividade de Anticorpo Lipoidal Imobilizado com Soros SifilíticosHumanos

<table>table see original document page 75</column></row><table><table>table see original document page 76</column></row><table><table>table see original document page 77</column></row><table>

a O Título de RPR é a maior diluição de soro sifilítico reativo a qual dá umareação visível no teste de reagiria plasmática rápida padrão (RPR).

EXEMPLO 12

Detecção Simultânea de Anticorpos Não Treponemal e Treponemal noSoro ou Plasma Humanos

Este Exemplo demonstra um dispositivo de teste de fluxo diretoque possibilita a detecção simultânea em uma amostra biológica (tal como,soro ou plasma humanos) de anticorpos específicos para antígenos trepo-nemais ou não treponemais (lipoidais). O dispositivo referido é útila, por e-xemplo, no diagnóstico de sífilis em um sujeito.

O dispositivo de teste de fluxo direto usado neste Exemplo inclu-uma membrana pintada com antígeno treponemal recombinante, antígenode VDRL (imobilizado conforme descrito nos Exemplos precedentes) e umcontrole. O dispositivo de protótipo foi proporcionado pela Span DiagnosticsLtd. (173-B, New Industrial Estate, Udhna, Surat -394 210, índia). O antígenotreponemal recombinante, antígeno de VDRL imobilizado, e controle foramdispostos em uma configuração triangular ao longo das bordas da membra-na (vide, por exemplo, a FIGURA 10). Os estudos foram realizados com odispositivo de teste em repouso sobre uma superfície horizontal para asse-gurar distribuição igual dos reagentes durante o teste.

Cem (100) μΙ de tampão de lavagem foi adicionado ao centro dodispositivo de teste e deixado para embeber por no mínimo 30 segundos. Otampão de lavagem era destituído de solventes orgânicos e detergentes.

Cem (100) μΙ de um soro ou plasma humanos foi em seguida adicionado aocentro da membrana do dispositivo de teste e foi deixado para reagir com asuperfície por no mínimo 30 segundos. Se as amostras devessem ser man-tidas por um período de tempo curto, as amostras foram armazenadas a 2-8°C. Para armazenamento mais longo, as amostras foram armazenadas a -20°C ou menos. Antes de testar amostras previamente congeladas, as a-mostras foram completamente degeladas, suavemente misturadas e subme-tidas a centrifugação a 2.000 χ g por 10 minutos. O sobrenadante transpa-rente resultante foi em seguida testado. O dispositivo de teste foi em seguidalavado com tampão de lavagem (150 μΙ por no mínimo 30 segundos, o qualpossibilitou a absorção da solução). Para determinar se anticorpos específi-cos para um ou mais antígenos treponemais e/ou não treponemais (Iipoidais)estavam presentes na amostra, 200 μΙ de SIGNAL REAGENT (Reagente deProteína A de Ouro Coloidal) foi adicionado e deixado para embeber. Para ainterpretação inicial, os resultados foram lidos depois de cerca de 2 minutos.

Para uma interpretação final os resultados foram lidos depois de cerca de10 minutos.

Se um ponto colorido apareceu somente na área de controle,então a amostra foi considerada como sendo não reativo para anticorposespecíficos para quer um ou mais antígenos treponemais e/ou não trepone-mais (lipoidais). A reatividade na área controle somente indicou que o dispo-sitivo estava funcionando adequadamente, e indicou adicionalmente um di-agnóstico negativo para sífilis (ou infecção por T. pallidum) para o sujeito doqual a amostra foi obtida. Se o ponto controle e qualquer um ou ambos ospontos de antígeno treponemal e/ou não treponemal foram reativos (isto é,coraram), foi adicionalmente considerado um diagnóstico positivo de sífilis(ou infecção por T. pallidum) no indivíduo (conforme discutido abaixo emmais detalhes). Se, ao completar o teste, nenhum dos pontos controle, deantígeno treponemal ou de antígeno não treponemal pareceram reativos,então o teste foi considerado inválido.

A Tabela 3 ilustra os resultados obtidos a partir do processa-mento de 150 amostras obtidos de doadores saudáveis que não tinham sidopreviamente infectados com T. pallidum.

Tabela 3

<table>table see original document page 79</column></row><table>

Os testes de VDRL e TPHA são testes à base de solução paradetectar em amostras de indivíduos anticorpos específicos para antígenosnão treponemais (Iipoidais) e antígenos treponemais, respectivamente. Con-forme mostrado na Tabela 3, o teste à base de membrana (de fluxo direto)para a detecção de cada tipo de anticorpo em amostras de pacientes pro-porcionaram o resultado idêntico ao teste à base de solução para o anticorpocorrespondente. Vantajosamente, o teste de fluxo direto de detecção duplapossibilitou que tanto anticorpos anti-treponemais quanto anti-não-treponemais (antilipoidais) fossem detectados em um único ensaio. Somenteduas amostras (1,3%) de um sujeito saudável apresentaram uma reaçãopositiva com o teste de VDRL e o antígeno não treponemal (IipoidaI) do dis-positivo de fluxo direto. Portanto, ambos os testes tiveram incidência baixa eidêntica de resultados falso positivos e nenhuma incidência idêntica de resul-tados falso negativos ao testar soro de sujeitos não infectado comT. pallidum.O dispositivo de teste foi em seguida usado para analisar sorode nove pacientes que se sabia estarem (ou terem sido) infectados comT. pallidum (o soro dos pacientes referidos também é referido como soro sifi-lítico). Conforme demonstrado na Tabela 4A, o teste à base de membrana(de fluxo direto) proporcionou resultados idênticos aos testes à base de so-lução para cada amostra; isto é, cada amostra teve a mesma reatividade noteste de VDRL à base de solução como para o antígeno não treponemal li-gado a membrana, e no teste de TPHA à base de solução como para o antí-geno treponemal ligado a membrana. Conforme descrito acima para as a-mostras de soro de indivíduos "saudáveis", a vantagem do teste de fluxo di-reto foi a capacidade para usar um único teste para testar simultaneamenteo soro de pacientes para reatividade a antígenos treponemais e não trepo-nemais (lipoidais).

Tabela 4A.

<table>table see original document page 80</column></row><table>

Para comparar a sensibilidade dos testes de VDRL e TPHA àbase de solução com o dispositivo de teste de fluxo direto, soro da amostra 6acima foi selecionado, diluído serialmente, e cada dilution foi testado con-forme acima. Conforme demonstrado na Tabela 4B, a sensibilidade do dis-positivo de fluxo direto para detecção simultânea de anticorpos anti-não-treponemais (antilipoidais) e anti-treponemais em soro sifilítico foi similar aoteste de solução de detecção única para cada tipo do anticorpo.Tabela 4B.

<table>table see original document page 81</column></row><table>

Amostras de quarenta e dois (42) pacientes foram tríadas paraanticorpos anti-treponemais e anti-não-treponemais (antilipoidais) usando odispositivo de fluxo direto de detecção dupla e os testes à base de soluçãode TPHA e RPR. Em teste tradicional para sífilis, o soro dos pacientes fre-qüentemetne é primeiro triado para reatividade com um antígeno não trepo-nemal (antígeno lipoidal), por exemplo, usando o teste de RPR. O teste deRPR tipicamente é relizado em um laboratório e pode levar vários dias paracompletar; entrementes, o paciente testado é liberado do local de teste. Se oteste de RPR for positivo, seria recomendado um teste subseqüente paradeterminar a reatividade do soro do paciente com um ou mais antígenos tre-ponemais (tal como, o teste de TPHA) para um diagnóstico positivo de sífilis.Freqüentemetne é difícila fazer um paciente retornar para realizar um testede TPHA subseqüente, cujo testte também é realizado tipicamente em umlaboratório e pode levar dias para completar. Testar amostras de pacientessomente para reatividade a um ou mais antígenos treponemais (por exem-plo, usando o teste TPHA) também tem limitações porque uma vez que umpaciente tenha sido infectado com T. pallidum (isto é, tenha tido sífilis), seutítulo para anticorpos anti-treponemais tipicamente permanece elevadomesmo depois de tratamento bem-sucedido. Portanto, um teste positivo paraantígeno treponemal somente pode não ser totalmente informativo.

As características de performance do dispositivo de fluxo diretocomparado com os testes à base de solução de RPR ou TPHA na experi-mentação de uma população de 42 pacientes são apresentadas na Tabela5Α e 5Β, respectivamente.

Tabela 5A

<table>table see original document page 82</column></row><table>

A sensitibilidade do dispositivo de fluxo direto para detectar anti corpos anti-treponemais foi 95% e a especificidade foi 81%.

<table>table see original document page 82</column></row><table>

A sensitibilidade do dispositivo de fluxo direto para detectar anti-corpos anti-não-treponemais (antilipoidais) foi de 93% e a especificidade foide 100%.

De 42 pacientes triados, 13 pacientes foram considerados comosendo positivos para ponto tanto RPR quanto não treponemal (Tabela 5B,número esquerdo superior), e 20 foram considerados como sendo positivospara ponto tanto TPHA quanto treponemal (Tabela 5A, número esquerdosuperior). Todos os 13 pacientes que foram positivos para ponto tanto RPRquanto não treponemal também foram positivos para ponto TPHA quantotreponemal. Portanto, baseado nos resultados do dispositivo de fluxo diretosomente, estes 13 pacientes teriam sido tratados para sífilis imediatamentesem necessidade de experimentação subseqüente.

No uso do dispositivo de teste de fluxo direto descrito neste E-xemplo, uma série de não Iimitante de recomendações de tratamento clínico são:<table>table see original document page 83</column></row><table>

Apesar desta descoberta ter sido descrita com uma ênfase emmodalidades particulares, será óbvio para aqueles de conhecimento regularda técnica que podem ser usadsa variações das modalidades particulares ese pretende que a descoberta possa ser praticada de modo diverso de con-forme especificamente descrito aqui, neste requerimento de patente. Porconseguinte, esta descoberta inclui todas as modificações englobadas den-tro do espírito e do escopo da descoberta conforme definido pelas seguintesreivindicações.

Claims (44)

1. Dispositivo de imunoensaio, caracterizado pelo fato de quecompreende um substrato microporoso tendo uma área de captura deanticorpo antilipoidal, compreendendo:(a) um anticorpo âncora imobilizado sobre o substrato; e(b) um antígeno lipoidal, compreendendo cardiolipina, lecitina,e colesterol,em que o anticorpo âncora imobilizado é especificamente ligado aum ou mais dos componentes de cardiolipina, lecitina ou colesterol do antígenolipoidal formando deste modo um complexo de anticorpo âncora imobilizado-antígeno lipoidal.

2. Dispositivo de imunoensaio de acordo com a reivindicação 1,caracterizado pelo fato de que o substrato é uma membrana microporosa.

3. Dispositivo de imunoensaio de acordo com a reivindicação 1,caracterizado pelo fato de que o anticorpo âncora não liga especificamente umepítopo exógeno em um ou mais dos componentes de cardiolipina, lecitina oucolesterol do antígeno lipoidal.

4. Dispositivo de imunoensaio de acordo com a reivindicação 1,caracterizado pelo fato de que o antígeno lipoidal compreende uma micela enão um lipossoma.

5. Dispositivo de imunoensaio de acordo com a reivindicação 1,caracterizado pelo fato de que o anticorpo âncora é especificamente ligado aocomponente de cardiolipina do antígeno lipoidal.

6. Dispositivo de imunoensaio de acordo com a reivindicação 1,caracterizado pelo fato de que é para determinar no mínimo uma da presençaou quantidade de um anticorpo antilipoidal em uma amostra de fluido,compreendendo adicionalmente uma área de aplicação da amostra e umcaminho de fluxo da área de aplicação da amostra para a área de captura deanticorpo antilipoidal; em que a no mínimo uma da presença ou quantidade deum anticorpo antilipoidal em uma amostra de fluido pode ser detectada porformação de um complexo entre um anticorpo antilipoidal em uma amostra defluido e o complexo de antígeno Iipoidal imobilizado-anticorpo âncora.

7. Dispositivo de imunoensaio de acordo com a reivindicação 1,caracterizado pelo fato de que compreende adicionalmente uma área decaptura treponemal compreendendo:(a) um antígeno treponemal imobilizado capaz de serespecificamente ligado por um anticorpo anti-T. pallidum, ou(b) um anticorpo anti-T pallidum imobilizado que ligaespecificamente um antígeno treponemal móvel.

8. Dispositivo de imunoensaio de acordo com a reivindicação 1,caracterizado pelo fato de que o substrato compreende nitrocelulose, náilon,fluoreto de polivinilideno (PVDF), polietersulfona, policarbonato, poliéster,acetato de celulose, ésteres celulósicos mistos, ou combinações dosmesmos.

9. Dispositivo de imunoensaio de acordo com a reivindicação 1,caracterizado pelo fato de que o anticorpo âncora é um fragmento Fabespecífico para cardiolipina.

10. Dispositivo de imunoensaio de acordo com a reivindicação 1,caracterizado pelo fato de que o anticorpo âncora é uma pluralidade defragmentos Fab produzidos a partir de uma fração de imunoglobulina de umsujeito infectado com T. pallidum.

11. Dispositivo de imunoensaio de acordo com a reivindicação 1,caracterizado pelo fato de que o antígeno Iipoidal é um antígeno de USR, umantígeno de VDRL, ou um antígeno de VDRL sintético.

12. Dispositivo de imunoensaio de acordo com a reivindicação 1,caracterizado pelo fatarde que a área de captura de anticorpo antilipoidalcompreende uma ou mais linhas.

13. Dispositivo de imunoensaio de acordo com a reivindicação-12, caracterizado pelo fato de que a uma ou mais linhas têm uma largura decerca de 8 mm a cerca de 15 mm.

14. Dispositivo de imunoensaio de acordo com a reivindicação 1ou 7, caracterizado pelo fato de que o dispositivo é um dispositivo de fluxodireto.

15. Dispositivo de imunoensaio de acordo com a reivindicação-14, caracterizado pelo fato de que compreende ainda um bloco absorvente,o qual está em contato com o substrato.

16. Dispositivo de imunoensaio de acordo com a reivindicação-14, caracterizado pelo fato de que o substrato tem um tamanho de poro decerca de 0,2 μιη a cerca de 8 μηι.

17. Dispositivo de imunoensaio de acordo com a reivindicação 1ou 7, caracterizado, pelo fato de que o. dispositivo é um ,dispositivo de fluxolateral.

18. Dispositivo de imunoensaio de acordo com a reivindicação-17, caracterizado pelo fato de que o substrato tem um tamanho de poro deaté cerca de 12 μητι.

19. Dispositivo de imunoensaio de acordo com a reivindicação-17, caracterizado pelo fato de que o dispositivo de fluxo lateral compreendeainda um bloco de conjugado localizado no caminho de fluxo, em que obloco de conjugado compreende um reagente de detector móvel oumobilizável específico para o anticorpo antilipoidal.

20. Dispositivo de imunoensaio de acordo com a reivindicação-19, caracterizado pelo fato de que o reagente de detector compreendeProteína A conjugada a ouro, Proteína G Fc-específica conjugada a ouro, ouanticorpo anti-humano conjugado a ouro (porção Fc).

21. Dispositivo de imunoensaio de acordo com a reivindicação-19, caracterizado pelo fato de que o bloco de conjugado compreende aindaum reagente de detector móvel ou mobilizável específico para o anticorpo— anti-T. pallidum ou o antígeno treponemal móvel.

22. Dispositivo de imunoensaio de acordo com a reivindicação-21, caracterizado pelo fato de que o reagente de detector específico para oanticorpo anti-T. pallidum compreende Proteína A conjugada a ouro,Proteína G Fc-específica conjugada a ouro, ou anticorpo anti-humanoconjugado a ouro (porção Fc), ou o reagente de detector para o antígenotreponemal móvel compreende anticorpo antiantígeno treponemal marcadocom ouro.

23. Dispositivo de imunoensaio de acordo com a reivindicação 1,caracterizado pelo fato de que o complexo de antígeno lipoidal-anticorpoâncora é imobilizado sobre o substrato por um método compreendendo:contactar o antígeno Iipoidal com um ou mais anticorpos âncoraespecíficos para no mínimo um entre cardiolipina, lecitina, ou colesterol paraformar o complexo de antígeno lipoidal-anticorpo âncora; eaplicar o complexo de antígeno lipoidal-anticorpo âncora aosubstrato.

24. Dispositivo de imunoensaio de acordo com a reivindicação 1,caracterizado pelo fato de que o complexo de antígeno lipoidal-anticorpoâncora é imobilizado sobre o substrato por um método, compreendendo:imobilizar um anticorpo âncora específico para no mínimo umentre cardiolipina, lecitina, ou colesterol sobre o substrato;bloquear sítios de ligação não específicos sobre o substrato;contactar o anticorpo âncora imobilizado com um antígenolipoidal para formar um complexo de antígeno lipoidal-anticorpo âncora; elavar o substrato para remover qualquer antígeno Iipoidal nãoligado especificamente pelo anticorpo âncora.

25. Método para detectar anticorpos antilipoidais em um sujeito,caracterizado pelo fato de compreende:aplicar uma amostra biológica de um sujeito ao dispositivo deimunoensaio, como definido na reivindicação 1; edetectar a formação de um complexo entre um anticorpoantilipoidal presente na amostra biológica e o complexo de antígeno Iipoidalimobilizado-anticorpo âncora, em que a detecção da formação do complexodetecta o anticorpo antilipoidal no sujeito.

26. Método de acordo com a reivindicação 25, caracterizadopelo fato de que a detecção do anticorpo antilipoidal é usada paradiagnosticar sífilis no sujeito.

27. Método de acordo com a reivindicação 25, caracterizadopelo fato de que a amostra biológica é sangue, soro, exudado de úlcera depele, urina, saliva, escarro, ou fluido cerebroespinhal.

28. Método de acordo com a reivindicação 25, caracterizadopelo fato de que compreende ainda aplicar ao dispositivo de imunoensaioum reagente de detector específico para o anticorpo antilipoidal.

29. Método de acordo com a reivindicação 25, caracterizadopelo fato de que compreende ainda adicionar um reagente de detectorespecífico para o anticorpo antilipoidal à amostra biológica antes de ousimultaneamente com a aplicação da amostra ao dispositivo deimunoensaio.

30. Método de acordo com a reivindicação 27 ou 28,caracterizado pelo fato de que o reagente de detector é Proteína A marcada,Proteína G Fc-específica, ou anticorpo anti-humano.

31. Método de acordo com a reivindicação 30, caracterizadopelo fato de que a etiqueta é uma enzima, partículas de ouro coloidal,partículas de látex coloridas, um agente quimiluminescente, ou um agentefluorescente.

32. Método para diagnosticar sífilis em um sujeito, caracterizadopelo fato de que compreende:aplicar uma amostra biológica ao dispositivo, como definido nareivindicação 7;detectar na área de captura de anticorpo antilipoidal a formaçãode um primeiro complexo entre um anticorpo antilipoidal presente naamostra biológica e o complexo de antígeno Iipoidal imobilizado-anticorpoâncora; edetectar na área de captura treponemal a formação de umsegundo complexo entre:(a) um anticorpo anti-7". pallidum presente na amostrabiológica e o antígeno treponemal imobilizado, ou(b) um antígeno treponemal presente na amostra biológica eo anticorpo anti-T pallidum imobilizado,em que a detecção da formação do primeiro complexo e osegundo complexo é usada para diagnosticar sífilis no sujeito.

33. Método de acordo com a reivindicação 32, caracterizadopelo fato de que a amostra biológica é uma amostra de sangue humano.

34. Método de acordo com a reivindicação 33, caracterizadopelo fato de que a amostra de sangue humano é sangue total ou soro.

35. Dispositivo de imunoensaio, caracterizado pelo fato de que épara determinar no mínimo uma da presença ou quantidade de um anticorpoantilipoidal em uma amostra de fluido compreendendo:uma membrana microporosa;uma área de aplicação da amostra;uma área de captura de anticorpo antilipoidal compreendendoum complexo de antígeno lipoidal-anticorpo âncora, cujo complexocompreende um anticorpo âncora e um antígeno Iipoidal especificamenteligado pelo anticorpo âncora, e cujo complexo é imobilizado sobre amembrana pelo anticorpo âncora; em que o antígeno Iipoidal compreendecardiolipina, Iecitina e colesterol; eum caminho de fluxo da área de aplicação da amostra para aárea de captura de anticorpo antilipoidal; em que a presença e/ouquantidade de um anticorpo antilipoidal em uma amostra de fluido aplicada àárea de aplicação da amostra pode ser detectada por formação de umcomplexo entre o anticorpo antilipoidal e o complexo de antígeno Iipoidalimobilizado-anticorpo âncora.

36. Método para imobilizar cardiolipina imunorreativa sobre umsubstrato, caracterizado pelo fato de que o método compreende:contactar um antígeno lipoidal, compreendendo cardiolipinaimunorreativa, com um ou mais anticorpos específicos para no mínimo umcomponente do antígeno lipoidal para formar um complexo de antígenolipoidal-anticorpo; eaplicar o complexo de antígeno lipoidal-anticorpo a um substrato,em que a aplicação do complexo de antígeno lipoidal-anticorpo ao substratoimobiliza a cardiolipina imunorreativa sobre o substrato.

37. Método de acordo com a reivindicação 36, caracterizadopelo fato de que o antígeno lipoidal é um antígeno de USR, um antígeno deVDRL, ou um antígeno de VDRL sintético.

38. Método de acordo com a reivindicação 36, caracterizadopelo fato de que o anticorpo é um fragmento de anticorpo que não reagirásubstancialmente com Proteína A, Proteína G Fc-específica, ou anticorpoanti-humano (porção Fc).

39. Método de acordo com a reivindicação 38, caracterizadopelo fato de que o anticorpo é um fragmento Fab.

40. Método de acordo com a reivindicação 36, caracterizadopelo fato de que o anticorpo é isolado do soro de um sujeito infectado com T.pallidum ou inoculado com T. pallidum.

41. Método de acordo com a reivindicação 36, caracterizadopelo fato de que o substrato compreende nitrocelulose.

42. Método de acordo com a reivindicação 36, caracterizadopelo fato de que compreende:contactar um antígeno lipoidal, compreendendo cardiolipinaimunorreativa, lecitina, e colesterol, com um fragmento de anticorpoespecífico para cardiolipina, lecitina, ou colesterol para formar um complexode antígeno lipoidal-anticorpo; em que o fragmento de anticorpo não reagesubstancialmente com Proteína A, Proteína G Fc-específica, ou anticorpoanti-humano(porção Fe); eaplicar o complexo de antígeno lipoidal-anticorpo a um substrato,o qual imobiliza a cardiolipina imunorreativa sobre o substrato.

43. Método de acordo com a reivindicação 42, caracterizadopelo fato de que compreende:contactar um antígeno lipoidal, compreendendo cardiolipina"imunorreativa, com um fragmento Fab específico para cardiolipina, lecitina,ou colesterol para formar um complexo de antígeno lipoidal-Fab; em que oantígeno lipoidal é um antígeno de USR, um antígeno de VDRL, ou umantígeno de VDRL sintético; eaplicar o complexo de antígeno lipoidal-Fab a nitrocelulose, oqual imobiliza a cardiolipina imunorreativa sobre a nitrocelulose.

44. Método para imobilizar cardiolipina imunorreativa sobre umsubstrato, caracterizado pelo fato de que compreende:imobilizar um ou mais anticorpos específicos para no mínimo umentre cardiolipina, Iecitina ou colesterol sobre um substrato;bloquear sítios de ligação não específicos sobre o substrato;aplicar um antígeno lipoidal, compreendendo no mínimo umacardiolipina imunorreativa, Iecitina ou colesterol, ao substrato para formarcomplexos de antígeno lipoidal-anticorpo imobilizado; elavar o substrato para remover qualquer antígeno lipoidal que énão ligado especificamente pelo um ou mais anticorpos imobilizados.