JPH0259667A - 酵素抗体法を利用した梅毒抗体検査法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野］ 本発明は、梅毒の病原体であるトレポネマ・パリダム（
ＴＰ）に対する抗体を構成する免疫グロブリン（Ｉｇ）
を検出する酵素抗体法を利用した梅毒抗体検査法に関す
る。

［従来の技術］ 従来、他の感染症と同様に梅毒感染に対する確認方法と
しては、臨床症状による判断に加えて、血中抗体の測定
が大きな地位を占めている。特に梅毒の場合には、近年
、臨床症状を伴なわない、所謂不潔症梅毒が増加する傾
向にあり、その診断は、後者に負うところが大きい。梅
毒感染を判定する手段としては、非常に多くの方法が実
用化されている。歴史的には、リン脂質の一種であるカ
ルジオビリンを用いる方法があるが、その代表的検査法
として有名であるワラセルマン反応は、その反応系の複
雑さなどの理由から近年はあまり実施されなくなり、代
わってガラス板法＜ＶＤＲＬ法）やＲＰＲ法などが利用
されている。この２つの方法は、手法の簡便さ、迅速性
や結果の再現性がすぐれていること等から、長い歴史を
もってきたにも拘らず、現在でも、その有用性は失われ
ていない。しかし一方では、抗体検出感度が低い点や、
全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）をはじめとする若干
の疾患との交差性があるため、必ずしも梅毒に特異的な
反応であるとは言い難いといった欠点を有する。これ等
の欠点をなくすため、梅毒の病原体であるトレポネマ・
パリダム（ＴＰ）を抗原として使用する方法が幾つか案
出された。

すなわち、蛍光抗体法を応用したＰＴＡ−ＡＢＳ法、な
らびに間接赤血球凝集反応を利用したＴＰＨＡ法などで
ある。

［発明が解決しようとする課題］ 前記ＰＴＡ−ＡＢＳ法は、後に述べる種々のクラスの抗
体の測定には有効であるが、結果の再現性にやや難があ
ること、また判定に際して検査担当者の個人差が生じ易
い等の欠点があり、近年その利用度は減少する傾向に、
ある。一方、ＴＰＨＡ法は梅毒感染の有無を知る上で、
非常に簡便、かつ有効な手段であり、先に述べたガラス
板法やＲＰＲ法と共に、現在世界的にも広く用いられて
いる方法である。しかし、Ｔ　Ｐ　ＨＡ法の普及に伴な
い、幾つかの問題点が生じた。

その最も重要な問題点は、ＴＰＨＡ法は免疫グロブリン
のうちＴＫＧ抗体に対しては感度が高いが、感染初期に
産生される抗体であるＩｇＭ抗体に対しては感度が低い
ことである。

現在のところ梅毒の血清学的検査法としては、「本質又
は機作の異なる二種以上の術式により実施されることｊ
という規定により、カルジオピリンを抗原とするＳＴＳ
法と、トレポネマ抗原を用いる方法の組合わせを多くの
検査室が実施しているわけであるが、上述したＴ　Ｐ　
ＨＡ法の抗体に対する感度に差異があることは、臨床的
に２つの混乱を与えることになる。第１に、梅毒感染初
期に生ずるＩｇＭ抗体をＴＰＨＡ法が捕捉出来ず、ガラ
ス板法のみが陽性結果を示すという場合が生じて、二法
の不一致は臨床診断の上で戸惑いを与える。

第２に、ＩｇＧ抗体は治療を加えてもほとんど低下しな
いという現実があり、従って梅毒患者が充分な治療を受
け、臨床症状が消失した後でもＴ　Ｐ　ＨＡ法は陽性結
果を示し続けることである。

最近Ｔ　Ｐ　Ｈ，Ａ法が改良され、これに類似した構法
ら若干市販されているが、ＩｇＭ抗体に対する感度は上
昇したものの、加療にｆＰなう抗体価の減少については
、これらの方法でも観察される割合は少ない。

以上の各検査方法は、梅毒感染の有無を知るためのいわ
ゆるスクリーニング法である。

ところで、血中抗体を測定する目的はこのスクリーニン
グ法に加え、一部上述した如く血中抗体の経時的変動を
調べることにより治療効果を判定することにある。この
点に関しては、ｌＯ年程前から梅毒感染によって生ずる
抗体のうち、ＩｇＭ抗体がその指標となり得ると報告さ
れるようになっており、ガラス板法、ＲＰＲ法およびＩ
ｇＭ抗体検出を目的としたＰＴＡ−ＡＢＳ法等がその目
的に合致する。しかし前述した如く、これらの諸法は疾
患に対する特異性、検体検出感度、結果の再現性あるい
は手技の複雑さ等の理由により、必ずしも全幅の信頼を
置くことが出来ない現状である。その後、分画ＴＰＨＡ
法が案出されたが、これには血清中のＩｇＭ抗体とＩｇ
Ｇ抗体とを予め分離しておくという手段を必要とするた
め、検査室での日常業務として行なうには手法が複雑で
あり、かつ特殊な装置も設置せねばならず、そのために
ごく−部の検査センタで実施されているにすぎない。か
つ、いわゆるリアルタイムに近い状態での測定が不可能
であるため、その応用範囲は、主として研究的な目的に
限られている。

この欠点をカバーするなめ、酵素抗体法を利用した免疫
グロブリン（Ｉｇ）のうちのＩｇＭ抗体測定法が開発さ
れた。この方法は、非常に新しい方法であるため、その
評価は完全には決定されていないが、後述する如く（第
１９頁下部記載参照）　、ＩｇＭ抗体が加療に並行した
動向を示すとはいっても。

全ての症例において加療によるＴｇＭ抗体の減少が認め
られるわけではない。特に、無症状で感染時期の不鮮明
な晩期症例には■ｇＭ抗体が減少しないケースが多く観
察されている。他方ＩｇＧ抗体は、主としてＴＰＨＡ法
を用いて検討されてきたわけであるが、加療してもほと
んど減少せず、充分な駆梅療法を実施しても、陰転しな
い抗体として収り扱われてきた。

実際に加療後の患者から経時的に採取した血清を、ゲル
濾過法などの手段によりＩｇＭ画分とＩｇＧ画分とに分
離して、夫々の両分の抗体価を調べてみると、ＩｇＭ画
分のＴＰＨＡ抗体価は減少するがＩ　２ｃ画分のそれは
変動しない。しかし、梅毒抗体測定法のひとつであるＴ
ＰＩＡ法（免疫粘着反応）を利用して測定してみると、
ＩｇＭ、画分の抗体価と共にＩｇＧ画分の抗体価も低下
していることが観察された。このことは、ＩｇＧを構成
する亜を（サブクラス）のｒｇＧ１〜４のいずれか、も
しくは複数に加療に伴なう減少が存在していることを示
唆するものである。

［課題を解決するための手段］ 本発明は、前記課題を解決するために開発したもので、
本発明の酵素抗体法を利用した梅毒抗体検査法は梅毒の
病原体であるトレポネマ・パリダムの菌体もしくはその
破砕物である構成成分又はヒト免疫グロブリンに対する
抗体をマイクロプレート等の固相上に吸着、埋込みまた
は化学的に結合させ、酵素抗体法を利用して免疫グロブ
リンＩｇＡまたはＩｇＧ１〜４の各梅毒抗体を検出する
ものである。

本発明は、方法論的には酵素抗体法を用いるが、原理的
には固相に抗原であるトレポネマ・パリダムを結合させ
る場合と、上記各クラスの抗体を結合させる場合とがあ
る。更に両者とも酵素を抗原もしくは抗体に直接結合さ
せるか、あるいは、ビオチン・アビジンを仲介させる方
法とがあり、多岐に亘る。

１作用］ 本発明は、以上のように、梅毒の病原体であるトレポネ
マ・パリダムの菌体もしくはその破砕物である構成成分
又はヒト免疫グロブリン抗体をマイクロプレート等の固
相上に吸着、埋込みまたは化学的に結合させ、酵素抗体
法を利用して免疫クロプリンＩｇＡまたはＩｇＧ１〜４
の各梅毒１ｇ抗体を検出するので、被検血清の梅毒抗体
を発色度によって検査することができる。

［実施例］ 本発明の実施例を以下に列記する。

なお、以下の操作中、洗浄に用いるメディウムは０．０
５％濃度のｔｗｅｅｎ２０を含む、リン酸緩衝液−生理
食塩水、（ＰＢＳ−ｔｗｅｅｎ）を、また、抗体、血清
、トレポネマ・パリダム抗原などの試薬の希釈には、血
清アルブミンなどの種々の蛋白質、種々の動物血清もし
くは脱脂粉乳などを含むＰＢＳ−ｔｗｅｅｎを用いる。

また、標識のための酵素には、ペルオキシダーゼ又は、
アルカリフォスファターゼなどを、また基質として過酸
化水素を含む、フェニレンジアミン溶液もしくは、アミ
ノサリチル酸などを°用いる。

実施例Ａ。

１、至適濃度のトレポネマ・パリダム抗原を、プレート
等の固相に固着させる。抗原には一定の加熱処理と超音
波処理をしたトレボネマを用い、アルカリ性のｐＨ下で
、一定時間反応させ、固相に吸着させる。

２、メディウム（ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ）で洗浄後、血清
アルブミンなどの蛋白質を含む溶液をアルカリ性のｐＨ
下で一定温度で一定時間反応させ、トレポネマ抗原で覆
われていないプレート部分を埋める。（この操作によっ
て、反応系の非特異反応を抑えることが可能となる。） ３、メディウムで洗浄後、至適濃度に希釈した被検直情
を加え、一定温度で一定時間反応させる。

４　メディウムで洗浄し、３で用いた溶液で至適濃度に
希釈した抗ヒトＩｇＧ１〜４、もしくはＩｇＡの各抗体
くポリクローナル、あるいはモノクローナル抗体）を加
えて、一定温度で一定時間反応させる、 ５、再びメディウムで洗浄後、３で用いた溶液で至適濃
度にした酵素標識抗体（ポリクローナル抗体を用いた系
では、その抗体由来の動物１ｇに対応する抗体を用い、
モノクローナル抗体を用いた系では、マウスＩｇに対す
る抗体を使用する）を一定温度で一定時間反応させる。

６、プレートをメディウムで洗浄し、５で使用した酵素
に対応した基質溶液を加えて、一定温度で一定時間反応
させ、発色させた後、反応停止液を加えてその発色度を
測定する。

なお、実施例Ａの前記４の操作工程において、抗ヒトＩ
ｇＧ１〜４、抗ヒトＩｇＡの各抗体くモノクローナルあ
るいはポリクローナル抗体）に代えて酵素標識した抗ヒ
トＩ［Ｇｌ〜４　、ＩｇＡ等の抗血清処理を実施すれば
、二次抗体を使用することなく、基質を加えるステップ
へと進む。

実施例Ｂ。

１、至適濃度の抗ヒトＩｇＧ１〜４各サブクラス抗体、
又は抗ヒトＩｇＡ抗体を、アルカリ性のｐｉｔ下でプレ
ートに固着させる。

２、メディウムで洗浄後、動物血清アルブミン等の蛋白
質を含む溶液を、アルカリ性のｐｉ下で一定温度で一定
時間反応させ、抗体で覆われていないプレートの露出部
分を覆う。

３、メディウムで洗浄し、動物の血清アルブミン等の蛋
白質を加えたメディウムで至適濃度に希釈した被検血清
を加えて、一定温度で一定時間反応させる。

４、メディウムで洗浄後、至適温度のトレボネマ抗原液
を加えて一定温度で一定時間反応させる。

５、メディウムで洗浄後、酵素標識した抗トレポネマ抗
体（抗体のＦｃ部分を除去したいわゆるＦ（ａｂ）２の
形にしたものも含む）と、一定温度で一定時間反応させ
る。

６、メディウムで洗浄後、酵素に対応した基質溶液を加
えて、一定温度で一定時間反応させ、その発色度を測定
する。

実施例Ｃ１ １〜３；Ｂに同じ、 ４；メディウムで洗浄後、至適濃度の酵素標識をしたト
レボマネ抗原液を加えて一定温度で一定時間反応させる
、 ５；メディウムで洗浄後、酵素に対応した基質溶液を加
えて、一定温度で一定時間反応させ、その発色度を測定
する。

実施例り。

１、至適濃度のトレポネマ・パリダム抗原（Ｔ　Ｉ）抗
原）をプレート等の固相に固定させる。

２、同相上のＴＰ抗原に対し、希釈した被検血清を加え
、一定温度で一定時間反応させる。

３、メディウムでよく洗浄後、至適濃度の抗体くビオチ
ンで標識した抗ヒトＩｇＧ１〜４又はＩｇＡ抗木）を、
一定温度で一定時間反応させる。（但し、この段階での
二次抗体は、抗体そのまま、もしくは抗体を酵素処理し
てＦＣ部位を除きＦ（ａｂ）２の形にしたものをも用い
得る。） ４、これをメディウムで良く洗浄後、アビジンを標識し
たペルオキシダーゼやアルカリフォスファターゼなどの
酵素の一定量を、一定温度で一定時間反応させる。

５、メディウムで良く洗浄後、基質溶液を加え、発色の
程度を測定する。なお、固相への固定方法としては、次
記の■〜■のいずれかの操作を行なった後に■の操作を
行なうものである。

■　至適濃度のＴＰ抗原を、中性もしくはアルカリ性の
ｐＦＩ下で固相に吸着させる（吸着）■　クロロホルム
等の有機溶媒に懸濁したＴＰ抗原を固相に滴下後、風乾
する（埋込み）■　クロロホルムや水などの有機溶媒や
緩衝液に、グルタルアルデヒドやカルボジイミドなどの
架橋剤を溶かし、固相上に加えて風乾後、ＴＰ抗原を中
性またはアルカリ性のＰＨ下で反応させる（結合）■　
ポリリジンなどの合成ポリマー、ウシ血清アルブミンな
どの天然蛋白、種々のアミノ酸などの低分子化合物で架
橋剤と反応し得る官能基を持つ物質を固相上に吸着、も
しくは■などの手法で固相に埋め込み、これに架橋剤を
用いてＴＰ抗原を結合させる（間接結合） ■　以上の操作の後、血清アルブミンや免疫グロブリン
などを用い、アルカリ性のｐＨ下で残存露出する固相を
埋めることにより、反応の特異性を高める。

本実施例り中の酵素抗体法は、図面に示す如く、二次抗
体くヒト免疫グロブリンに対する抗体）に対してビオチ
ンを結合させ、酵素にはアビジンを結合させたものを用
いる、いわゆるビオチン・アビジン系を利用している。

このビオチン・アビジン系を利用する方法は、通常鋭敏
性や特異性に優れているとされているが、梅毒抗体検出
に関する限りは、非特異反応が強く、実用化には適さな
いものであった。

しかし、種々の改良を加えた結果、非特異反応を最小限
に抑えられるようになり、充分に実用化可能なものとな
った。

つまり、従来の検査や研究で用いられているビオチン・
アビジン法で強く出現した非特異反応は。

次の二点によって低下させ得なものである。

■　血清アルブミンなどの蛋白質で、ＴＰ抗原に覆われ
ていない同相表面を埋めてしまう、■　蛋白、もしくは
糖などの生体構成４分に加え、界面活性剤を含む緩衝液
のイオン強度ならびにｐＨを低くする。

実施例Ｅ。

１〜３までは実施例Ｂに同じ。

４、メディウムで洗浄後、ビオチン化したトレボネマ抗
原溶液を加えて、一定温度で一定時間反応させる。

５、メディウムで洗浄後、アビジン処理をした酵素溶液
を加えて一定温度で一定時間反応させる。

６、実施例Ｂに同じ。

実施例Ｆ。

１〜４までは実施例Ｂに同じ。

５、メディウムで洗浄後、抗トレボネマ抗体溶液Ｆ（ａ
ｂ’）ｆ）形にしたものも含む）を加えて、一定温度で
一定時間反応させる。

６、メディウムで洗浄後、酵素を結合させたウサギＩｇ
に対する抗血清を加え、一定温度で一定時間反応させる
。

７、メディウムで洗浄後、使用した酵素に対応した基質
溶液と反応させ、その発色度を測定する。

実施例Ｇ。

１〜４までは実施例Ｂに同じ。

５、メディウムで洗浄後、ビオチン化した抗トレボネマ
抗体Ｆ（ａｂ’）ｆ）形にしたものも含む）溶液を加え
て一定温度で一定時間反応させる。

６、メディウムで洗浄後、アビジン処理をした酵素溶液
を加えて、一定温度で一定時間反応させる。

７、使用した酵素に対応した基質溶液を加えて反応させ
、その発色度を測定する。

［発明の効果］ 臨床的に梅毒と断定する場合、勿論臨床症状に依存する
わけであるが、これに加えて血清学的診断、つまりトレ
ポネマ・パリダムに対する血中抗体の存否をもって行な
う。しかし、現在治療の対象となっている患者の大半は
、臨床症状を伴なわないケースであり、従って一最の感
染症とは異なり、血清学的診断の占める割合が非常に大
きく、血清学的診断が陽性であれば即梅毒であるとの診
断が下されることになる。また梅毒と診断された患者は
当然治療を受けるわけであるが、この時の治療効果判定
手段としては臨床症状の消退と共に、血中抗体量の減少
程度を測定してその目安としている。つまり臨床症状が
消退した後でも、血中抗体量の減少が認められない場合
には、完治しなとの診断が困難となり、治療打ち切りの
時期が把握しにくい。それ故、血中抗体量の測定は、梅
毒治療効果判定において、非常に重要な役割を占めてい
ることになる。

現状では、治療効果判定のマーカーとして、血中抗体の
測定は必須といって良い状態にある。本発明は、この点
に関係しており、その効果としては、 ｌ）梅毒感染の有無が、より高い特異性と感度で測定が
可能である。

２）梅毒患者加療後の１ｇＧ各サブクラスもしくはＩｇ
Ａ抗体の血中レベルについての変化を追跡することによ
り、治療効果に対する情報が得られる。なおこのとき、
ＩｇＧ各サブクラスに加えてＩｇＡ抗体の変化を併せて
追跡することにより、９割以上の患者についての治療効
果をフォロー出来るなどの点を挙げることが出来る。

ところで、免疫学的手法による疾患の診断法は、抗原抗
体反応の特異性に大きく依存する。しがし、細菌などの
ように、多数の抗原部位を持っているような物質に対す
る抗体は、近縁種に対して反応するばかりでなく、他種
のものとも反応する場合が存在し、後者の場合には、こ
れを分別するための操作を行なう必要が生じ、そのため
に測定上でも、また得られた成績を解釈する上に於ても
より複雑になってくる。それ故、他の疾患との交差性が
低い、換言すれば特異性の高い測定方法であることが望
ましいことになってくる。従って本発明の方法が確実に
梅毒に対して特異性を満たした反応であるか否かを検討
することは非常に重要なことになってくる。この問題点
の対象となる疾患としては、特に全身性エリテマトーデ
ス（ＳＬＥ）や、関節リウマチなどが挙げられるが、こ
れらの疾患について検討したところ、以下の様なことが
判明した。

即ち、ＳＬＥの患者に対してカルジオライビン抗原とす
るＳＴＳ法ではかなりの陽性反応を示したが１ｇＭ抗体
測定法および本発明の方法では、全て陰性結果を示した
。しかしながら関節リウマチ患者血清は、ＩｇＭ抗体測
定法では非特異反応を示す例が生じ、ｔｇ＾抗体測定法
で観察された非特異反応よりも高い割合で生じた。一方
１ｇＧサブクラス抗対測定では、この様な非特異反応は
一例も出現せず、疾患に対する特異性が優れていること
が明らかになった。

ＩｇＭ抗体測定法に比べ、水沫にはもうひとつの利点が
ある。

即ち、梅毒患者を治療した場合、それによって、血中１
ｇＭ抗体量が減少する例は９割であり、残りの１割は変
化せず、加療効果が不明となる。しかし、水沫では、抗
体減少が９，２割の患者に認められ、ＩｇＭ抗体をマー
カーとする場合よりもより改善される（但し、ＩＢＭ抗
体測定法と併用すると、９．５割となり、より高い情報
が得られる）。

【図面の簡単な説明】

図面は、本発明の実施例Ｃにおけるビオチンを結合させ
た抗体およびアビジンを結合させた酵素を用いた梅毒抗
体の検査法に関する説明図である。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. 梅毒の病原体であるトレポネマ・パリダムの菌体もしく
   はその構成成分又はヒト免疫グロブリン（Ｉｇ）に対す
   る抗体をマイクロプレート等の固相上に吸着、埋込みま
   たは化学的に結合させ、酵素抗体法を利用して免疫グロ
   ブリンＩｇＡまたはＩｇＧ１〜４の各梅毒抗体を検出す
   る酵素抗体法を利用した梅毒抗体検査法。