WO2006004039A1 - 免疫測定装置及び方法 - Google Patents

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Osamu Takehiro
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Sanwa Kagaku Kenkyusho Co., Ltd.
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    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/558—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor using diffusion or migration of antigen or antibody
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    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
    • G01N33/54366—Apparatus specially adapted for solid-phase testing
    • G01N33/54386—Analytical elements
    • G01N33/54387—Immunochromatographic test strips

Definitions

  • the present invention relates to an immunoassay device used in the field of clinical tests and the like, and more particularly to an immunoassay device capable of quantitatively measuring a measurement object in a sample with ease, speed and sensitivity.
  • Patent Document 1 JP-A-8-334511
  • Patent Document 2 JP 2000-266751
  • Patent Document 3 JP 2001-337065
  • Patent Document 4 US5705338
  • Patent Document 5 Japanese Patent Laid-Open No. 4-16745
  • Patent Document 6 Japanese Patent Laid-Open No. 2003-262636
  • Patent Document 7 JP-A-7-151757
  • the present invention has been made in view of the above-described problems, and an object of the present invention is to provide advantages of a simple immunoassay device, that is, a simple method of use, one-step operation, and measurement in a short time. It is an object of the present invention to provide a simple immunoassay device for quantification that has properties such as performance as it is and can be used for various antigens.
  • an immunoassay device capable of measuring the amount of antigen by measuring the label of the conjugate, comprising the following three parts (1) to (3) in one device:
  • the first antibody that is labeled is the F (ab,) fragment and the F (ab,) fragment is bound to the labeled substance.
  • the ratio is between 1: 1 and 1: n, where n is an integer, and the second antibody is an anti-idiotypic antibody to the first antibody and cannot bind to the binding between the antigen and the first antibody.
  • a site for adding a solution obtained by reacting a sample with a labeled first antibody capable of specifically binding to an antigen, or a labeled first antibody is contained in such a form that the antibody can be dissolved and moved in the sample.
  • the second site which is a site where the second antibody that can specifically bind to the first antibody is contained in such a form that it cannot move to the third site
  • the third site which is a site for detecting the labeled product of the first antibody, including a reagent for detecting the labeled product contained in the first antibody or a part thereof
  • the present invention also reacts an antigen that is a measurement target in a sample with a labeled antibody that specifically binds to the antigen, and captures the unreacted labeled antibody with an anti-idiotypic antibody against the antibody.
  • An immunoassay method for detecting a bound product between an uncaptured antigen and a labeled antibody, wherein the antibody portion of the labeled antibody is an F (ab ′) fragment and an F (ab ′) fragment and a labeled product An immunoassay, wherein the binding ratio is any of 1: 1 to 1: n (n is an integer), and the anti-idiotype antibody is a kind of anti-idiotype antibody that cannot bind to a conjugate of an antigen and a labeled antibody. It can also be expressed as a method.
  • the immunoassay device provided in the present invention enables quantitative measurement with rapid and high sensitivity by a remarkably simple operation. Therefore, it can be used for emergency examinations and bedside examinations, and is extremely useful in the medical field. Moreover, it can be easily applied to various antigens to be measured and is highly versatile.
  • the device 4 is composed of a first part 1, a second part 2, and a third part 3.
  • the sample solution provided to the first part is sequentially developed or delivered, passes through the second part, and reaches the third part.
  • Each of the first part 1, the second part 2 and the third part 3 can be composed of various materials and morphological forces.
  • a glass fiber membrane, a porous membrane, filter paper, nylon, etc. It is preferably composed of a porous carrier such as a membrane.
  • each part can be formed on one porous carrier, but an optimum carrier can be selected and used for each part.
  • FIG. 2 shows an example of such an arrangement in which each part is preferably arranged on a support 5 that is made of plastic sheet or the like.
  • a first part 1, a second part 2, and a third part 3 are arranged on a support 5, and these constitute a device 4.
  • the sample solution is added directly to the first part, and (2) the sample solution and the labeled first antibody (hereinafter labeled antibody) are reacted in a separate container in advance.
  • labeled antibody the labeled first antibody
  • it is added to the first site after it has been applied.
  • the first site contains a labeled antibody.
  • no labeled antibody is contained in the first site.
  • the labeled antibody and the conjugate of the antigen and the labeled antibody move to the second site without being retained.
  • the anti-idiotype antibody is present in the state of (1) a card that is directly immobilized on a carrier or device, or (2) that is immobilized on a particle such as a bead or latex. is doing.
  • the anti-idiotype antibody contained in the second site exists in the form of a V ⁇ that cannot move to the third site!
  • a known method can be used for immobilization of the anti-idiotype antibody, and a physical adsorption method or a covalent bond method is appropriately selected.
  • anti-idiotype antibody is immobilized on particles such as beads or latex, take measures such as making the pore size of the carrier at the second or third site smaller than the particle or narrowing the width of the flow path. It is necessary to take.
  • At the second site only unreacted labeled antibody is captured, and the antigen and labeled antibody are bound. The object moves to the third site without being captured.
  • the measurement of the label contained in the conjugate of the transferred antigen and the labeled antibody is performed.
  • a known detection method can be used according to the label, and necessary reagents can be included in the site. All of these reagents can be included in the third part, and some of the reagents should be included in the second part, the first part, or another part. Is also possible.
  • the detection is performed using a general device such as a reflectometer, a spectrophotometer, and a fluorescence detector.
  • the measurement target in the present invention refers to a test target in a general clinical test or the like. Specifically, various components contained in blood, urine, saliva, secretory fluid, etc., tissues, stool, etc. These are various components contained in the extract from the solid product.
  • a single high molecular weight substance capable of binding a plurality of monoclonal antibodies can bind only a single monoclonal antibody (also called a hapten). Substances) can also be measured.
  • the labeled first antibody in the present invention is an F (ab ') fragment of a monoclonal antibody against an antigen that is a measurement object in a sample, and is used in various immunoassay methods. This is a combination of a label. Furthermore, the optimal binding ratio between the F (ab ') fragment of the antibody and the labeled product is that the antibody is bound at a ratio of 1: 1 to 1:11 (11 is an integer, preferably 1 to 5). is there. A known method can be used for F (ab ′) fragmentation of the monoclonal antibody and binding of the label to the F (ab ′) fragment.
  • the use of such a labeled antibody in the present apparatus is very advantageous for improvement of sensitivity and improvement of quantitativeness.
  • IgG is generally used. Since a labeled antibody using IgG as it is usually has a bivalent binding property, when reacted with an antigen as a measurement target, the binding ratio of the labeled antibody to the antigen is 1: 1 or 1: The combination of 2 will be mixed. This is because the antigen does not always bind to the binding site contained in one molecule of IgG antibody. When a conjugate with a mixed binding ratio passes through the second site, in addition to the unreacted one, a 1: 1 conjugate will also be captured, leading to a decrease in sensitivity and quantification.
  • a monovalent binding F (ab ′) fragment is used, and therefore the binding ratio of labeled antibody to antigen is 1: 1 with the exception of unreacted fragments. Only the compound is present, and the sensitivity and quantitativeness can be improved.
  • Labels that can be used for general immunoassays such as enzymes, colored particles, fluorescent substances, luminescent substances, and fucose can be used.
  • the enzyme can be appropriately selected according to the required measurement sensitivity, but it is preferable to use an enzyme that is not easily affected by the matrix.
  • the enzyme those which are hardly present in the living body or in the sample are preferable.
  • peroxidase, glucose oxidase and the like are preferable.
  • an antibody against the enzyme may be included in the first site or the second site to remove the human-derived enzyme, or the enzyme It is also possible to take advantage of the specificity for the substrate or coenzyme.
  • the reagent for detecting the labeled product is appropriately selected according to the labeled product.
  • an enzyme for labeling NAD or NADP or its derivatives
  • enzyme substrate or reagents for secondary generation of enzyme substrate chromogenic substrate, diaphorase, and baroxidase medium strength are usually selected.
  • One or more reagents A specific example is described below.
  • 2, 2, 1-azinobis-3 ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid can be used.
  • ABTS 2, 2, 1-azinobis-3 ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid
  • glucose and darcose oxidase can be used as a reagent for secondary generation of peroxyhydrogen.
  • a chromogenic substrate glucose and peroxidase are required, and the same chromogenic substrate as that when the label is peroxidase can be used.
  • dalcose 6-phosphate dehydrogenase as a labeling substance, dalcose 6-phosphate and NAD or a derivative thereof are required.
  • diaphorase and a chromogenic substrate are also required. Become. In this case, a reducing coloring agent such as nitro blue tetrazolium (NBT) can be used as the coloring substrate.
  • NBT nitro blue tetrazolium
  • auxiliary reagents such as reagent stabilizers and surfactants can also be added. Not too long.
  • the reagents are dispersed in the first site, the second site, or even another site. It is also possible to keep it.
  • the second antibody in the present invention is a monoclonal antibody that recognizes the specific structure of the antigen-binding site of the antibody portion of the labeled antibody, and is generally called an anti-idiotype antibody.
  • Anti-idiotype antibodies are known to exist in types that can and cannot inhibit binding to the target antibody by the antigen.
  • the anti-idiotype antibody that can be used in the present invention refers to an antibody that can inhibit its binding by an antigen, that is, a type that cannot bind to a conjugate of an antigen and a labeled antibody.
  • This anti-idiotype antibody can be easily prepared according to a usual method. For example, when an anti-idiotypic antibody of a mouse-derived monoclonal antibody is produced, if the monoclonal antibody that serves as the antigen is administered to the mouse as a KLH complex, it can be produced according to a conventional method for producing a monoclonal antibody. Therefore, the anti-idiotype antibody that can be used in the present invention can be easily produced in a large amount in the same manner as a normal monoclonal antibody.
  • the amount of the anti-idiotype antibody used for the second site needs to capture the unreacted labeled antibody almost completely. Specifically, it is preferable to use an amount of 10 times or more in terms of mole.
  • an antigen can be used instead of an anti-idiotype antibody.
  • the antigen is limited to a stable antigen and an antigen that can be prepared in large quantities at low cost. Because of this limitation, no antigen is used in the device of the present invention.
  • the amount of labeled antibody used in the present invention should be more than the upper limit of the range in which antigen is desired to be measured. More preferably, the upper limit of the antigen amount in terms of mole is 2 to about LOO times.
  • Fig. 3 shows the measurement principle of the present invention in a concise manner.
  • the upper part (A) in the figure shows the entire device 4 in a perspective view.
  • the arrow X in the figure indicates the direction of sample flow.
  • the immunoassay method of the present invention can be easily carried out using the immunoassay apparatus of the present invention, and therefore further explanation is omitted.
  • the present invention will be described in more detail with reference to examples of the present invention. However, the present invention is not limited to these examples.
  • a 0.5 mg ZmL solution of the above immunogen (1 mL) and complete Freund's adjuvant (1 mL) were mixed and emulsified, and 200 L was intraperitoneally administered to 8-week-old BALB / c mice. Thereafter, 200 L of the above immunogen-incomplete Freund's adjuvant mixed emulsion was intraperitoneally administered three times every two weeks. Furthermore, 100 weeks of the above-mentioned 0.5 mgZmL immunogen was intravenously injected 2 weeks after the third administration.
  • mice-powered spleen was removed, and the spleen cells were suspended in DMEM medium and washed.
  • the mouse myeloma cell line P3X63Ag8 (Dainippon Pharmaceutical Co., Ltd.) was cultured in the logarithmic growth phase in accordance with cell fusion and collected by centrifugation. Cell fusion was performed using the PEG method (PE G4000).
  • 13D was expanded and anti-idiotypic antibodies were collected.
  • the culture supernatant was purified using a protein A column (manufactured by Amersham 'Japan).
  • the body used the same commercial item as described above.
  • F (ab ') fragment solution was diluted with 0.1M phosphate buffer containing 5mM EDTA by ultrafiltration membrane.
  • a double-sided adhesive tape with a width of 25 mm from the upper end was attached to a plastic plate (60 mm X 5 mm) as a support.
  • the upper end of this plastic plate was left about 5 mm, and the membrane (2) was pasted and fixed.
  • the filter paper of (3) was affixed and fixed so as to overlap the upper end of the membrane of (2) by about 2 mm.
  • the filter paper of (1) was stuck and fixed so that the lower end of the membrane of (2) overlapped by about 2 mm.
  • FIG. 1 is a diagram schematically showing an example of an apparatus of the present invention.
  • FIG. 2 is a diagram schematically showing another example of the apparatus of the present invention.
  • FIG. 3 is a diagram showing the measurement principle of the apparatus of the present invention.
  • FIG. 4 is a calibration curve showing the relationship between the reflectance obtained in Example 4 and the concentration of human CRP. Explanation of symbols

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Abstract

　使用方法が簡便、１段階操作、短時間に測定可能で、様々な抗原に対応可能である、定量用の簡便な免疫測定装置を提供することを目的とする。本発明は、（１）試料と抗原に特異的に結合する標識第１抗体との反応液添加部位、又は、標識第１抗体を含み該抗体が試料で溶解されて移動可能な試料添加部位である第１の部位、（２）第１抗体に特異的に結合する第２抗体を第３の部位に移動できない形態で含む第２の部位、及び、（３）第１抗体の標識物を検出する試薬を含む、検出部位である第３の部位　の３つの部位を有し、それぞれの部位を順に溶液が移動でき、標識第１抗体は抗体部分がＦ（ａｂ’）フラグメントでかつ標識物との結合比が１：１乃至１：ｎ（ｎは整数）のいずれかで、第２抗体が第１抗体に対する抗イディオタイプ抗体でかつ抗原と第１抗体との結合物には結合できない抗イディオタイプ抗体である、免疫測定装置によって、目的が達成される。

Description

明 細 書
免疫測定装置及び方法
技術分野
[0001] 本発明は、臨床検査等の分野で利用される免疫測定装置に関するものであり、簡 便、迅速かつ高感度に、検体中の測定対象物を定量的に測定できる免疫測定装置 に関する。
背景技術
[0002] 血液、尿などの生体試料中に含まれる物質を測定する方法として、使用方法が簡 便で短時間で測定できる簡易型の免疫測定装置が開発されている。この装置は、緊 急検査、ベッドサイド等での検査などに広く使用されるようになって、その重要性、有 用性が増大してきた。
[0003] 簡易型の免疫測定装置としては、ィムノクロマト法、フロースルー法、免疫センサ法 等を原理とした測定装置が知られている。これらの装置に用いられている方法は、試 料を添加後、抗原抗体反応を行 、つつ溶液が担体上を上下或いは左右に移動して 、最終的に測定対象物量に相当するシグナルが得られるという原理に基づいており 、その構造も比較的簡単である。シグナルの検出法は、抗体に金コロイドや着色ラテ ッタスに代表される着色粒子を標識して、検出ラインや検出面の呈色を読みとる方法 が一般的に用いられている。この他にも、測定操作が複雑になるが、酵素反応による 呈色等も利用されている。
[0004] これらの簡易型の免疫測定装置は、基本的に測定対象物の有無を判定するため の定性用として利用されている。しかし、近年には、より有益な診断を実施するために 、これらの装置を利用した定量ィ匕の試みがなされている。これらの試みは、測定後の 検出ラインの色調が、測定対象物の量 (濃度）に依存して変化することに基づいてい る。具体的には、検出ラインの色調を判読する方法として、反射率計で測定する方法 、 CCDイメージセンサで画像解析する方法 (特開平 8— 334511、特開 2000— 266 751)、電気伝導度による方法 (特開 2001— 337065)などが開発されている。
[0005] また、同様の免疫測定装置において、全標識抗体のうち、未反応の標識抗体を捕 捉し、捕捉されなカゝつた標識抗体 (すなわち、反応した標識抗体)を測定するという方 法に関する装置を開示する先行技術がある。例えば、 US5705338,特開平 4—16 745,特開 2003— 262636である。し力し、これらの測定装置は、十分な定量性を 備えていない。更に、同様の先行技術で、抗イディォタイプ抗体の使用については、 特開平 7— 151757に開示されている。
[0006] 特許文献 1 :特開平 8— 334511
特許文献 2 :特開 2000— 266751
特許文献 3：特開 2001— 337065
特許文献 4:US5705338
特許文献 5：特開平 4 - 16745
特許文献 6：特開 2003 - 262636
特許文献 7：特開平 7 - 151757
発明の開示
発明が解決しょうとする課題
[0007] 上述した定量ィ匕の試みは、定性用の装置力 得られた検出結果を機器で測定して 定量ィ匕しょうと応用検討したものである。そのため、呈色の色調又は強度差が微妙で あり、定量範囲が狭ぐ十分な定量性が確保されているとは言い難い。又、検出方法 に酵素反応を利用した場合は、定量ィ匕ゃ高感度化に対して有効であるが、洗浄操 作や試液の添加等の操作が必要になり、ノックグラウンド上昇等の課題もある。
[0008] 本発明は上記した問題点に鑑みてなされたものであり、本発明の目的は、簡易型 の免疫測定装置の長所、すなわち、使用方法が簡便、 1段階操作、短時間に測定可 能等の性質をそのまま有すると共に、様々な抗原に対応可能であり、かつ定量用の 簡便な免疫測定装置を提供することにある。
課題を解決するための手段
[0009] 本発明者は、鋭意研究を重ねた結果、装置内に 3つの異なる部位を有した装置とし て構成することによって、定量用の簡便な免疫測定を行うことができることに想到し、 本発明を完成させた。
[0010] すなわち本発明は、試料中の測定対象物である抗原と標識抗体を特異的に結合さ せて、その結合体の標識物を測定することにより、抗原量を測定することが可能な免 疫測定装置であって、 1つの装置内に下記（1)乃至（3)の 3つの部位を有し、それぞ れの部位を順に溶液が移動できるように構成され、標識された第 1の抗体は抗体部 分が F (ab， )フラグメントでかつ F (ab， )フラグメントと標識物の結合比が 1： 1乃至 1： n (nは整数)のいずれかであり、第 2の抗体が第 1の抗体に対する抗ィディオタィプ抗 体でかつ抗原と第 1の抗体との結合物には結合できない種類の抗ィディオタィプ抗 体である、免疫測定装置である。
(1)試料と、抗原に特異的に結合できる標識された第 1の抗体とを反応させた溶液を 添加するための部位、又は、標識された第 1の抗体を含んでおり、第 1の抗体が試料 で溶解されて移動できるような形態で含まれて 、る、試料を添加するための部位であ る、第 1の部位
(2)第 1の抗体に特異的に結合できる第 2の抗体が、第 3の部位に移動できないよう な形態で含まれている部位である、第 2の部位
(3)第 1の抗体に含まれる標識物を検出するための試薬或いはその一部を含む、第 1の抗体の標識物を検出する部位である、第 3の部位
[0011] 本発明はまた、試料中の測定対象物である抗原と、前記抗原に特異的に結合する 標識抗体とを反応させ、未反応の標識抗体を当該抗体に対する抗ィディオタィプ抗 体で捕捉し、捕捉されなかった抗原と標識抗体との結合物を検出する免疫測定方法 であって、前記標識抗体の抗体部分が、 F (ab' )フラグメントでかつ F (ab' )フラグメン トと標識物の結合比が 1： 1乃至 1 :n (nは整数)のいずれかであり、前記抗ィディオタ イブ抗体が、抗原と標識抗体との結合物には結合できない種類の抗ィディオタイブ 抗体である、免疫測定方法と表現することもできる。
発明の効果
[0012] 本発明で提供される免疫測定装置は、著しく簡便な操作で迅速かつ高感度に定量 的な測定を可能にするものである。従って、緊急検査やベッドサイド検診に利用でき 、医療分野に於ける有用性は極めて高いものである。また、様々な測定対象抗原に 対して、容易に応用でき、汎用性の高いものである。
発明を実施するための最良の形態 [0013] 以下に本発明の実施の形態を説明する。本発明装置の一例を図 1に模式的に示 す。図 1において、装置 4は、第 1の部位 1、第 2の部位 2、第 3の部位 3から構成され ている。第 1の部位に提供された試料溶液は、順次展開或いは送液され、第 2の部 位を通り、第 3の部位に到達する。第 1の部位 1、第 2の部位 2及び第 3の部位 3の各 部位は、多様な材質、形態力 構成することが可能であり、中でも、ガラス繊維膜、多 孔性メンブレン、濾紙、ナイロン膜等の多孔質担体で構成することが好ましい。ここで は、一つの多孔質担体上に各部位を構成することも可能であるが、各部位ごとに最 適な担体を選んで使用することもできる。各部位ごとに材質を変える場合は、各部位 が互 ヽに接触するように配置して、溶液の流れを阻害しな 、ようにする必要がある。 各部位の担体の組み合わせとしては、第 1の部位をガラス繊維膜、第 2の部位をニト ロセルロース膜、第 3の部位を濾紙とするような実施態様が例示できる。また、各部位 は、プラスチック製シート等力 なる支持体 5上に配置するのが好ましぐそのような装 置例を図 2に示す。図 2では、支持体 5の上に、第 1の部位 1、第 2の部位 2、および 第 3の部位 3が配置されており、これらが装置 4を構成している。
[0014] 次に、各部位の説明をする。本発明においては、（1)試料溶液を直接に第 1の部 位に添加する場合と、（2)試料溶液と標識された第 1の抗体 (以下、標識抗体)を予 め別容器で反応させた後に第 1の部位に添加する場合とがある。前者の場合は、第 1の部位は、標識抗体を含有している。一方、後者の場合は、第 1の部位には標識抗 体は含ませない。この部位では、試料溶液添加後、標識抗体及び抗原と標識抗体の 結合物は保持されることなく第 2の部位へ移動する。
[0015] 第 2の部位には、抗イディォタイプ抗体が、（1)担体或いは装置に直接固定化され るカゝ、又は、（2)ビーズやラテックス等の粒子に固定ィ匕された状態で存在している。す なわち、第 2の部位に含まれる抗ィディォタイプ抗体は、第 3の部位には移動できな Vヽ形態で存在して!/ヽる。抗イディォタイプ抗体の固定ィ匕には公知の方法が利用でき 、物理吸着、或いは共有結合による方法が適宜選択される。ビーズやラテックス等の 粒子に抗ィディォタイプ抗体を固定ィ匕した場合は、第 2の部位又は第 3の部位の担 体のポアサイズを粒子より小さくしたり、流路の幅を狭くする等の方策を講じる必要が ある。第 2の部位では、未反応の標識抗体のみが捕捉され、抗原と標識抗体の結合 物は捕捉されることなく第 3の部位へ移動する。
[0016] 第 3の部位では、移動してきた抗原と標識抗体の結合物に含まれる標識物の測定 が行われる。標識物の測定には、標識物に応じて公知の検出方法を用いることがで き、必要な試薬類を当該部位に含ませることができる。これらの試薬類は、第 3の部 位に全て含ませることも可能であるし、一部の試薬を第 2の部位又は第 1の部位若し くは更に別の部位に含ませておくことも可能である。検出は、一般的な機器、例えば 反射率計、分光光度計、蛍光検出器等を用いて実施される。
[0017] 本発明における測定対象物とは、一般的な臨床検査等における検査対象物を指し 、具体的には、血液、尿、唾液、分泌液等に含まれる各種成分や、組織、便等の固 形物からの抽出液等に含まれる各種成分等のことである。本発明では、測定対象物 に対して 1種類の抗体しか必要としないため、複数のモノクローナル抗体が結合でき るような分子量の大きい物質だけでなぐ 1つのモノクローナル抗体しか結合できない 低分子 (ハプテンとも言われる)物質も測定対象物となりうる。
[0018] 本発明における標識された第 1の抗体とは、試料中の測定対象物である抗原に対 するモノクローナル抗体の F (ab' )フラグメントに、通常の免疫測定法に利用されてい る様々な標識物を結合させたものである。さらに、抗体の F (ab' )フラグメントと標識物 の結合比は、 1 : 1乃至1 : 11 (11は整数、ただし、 1〜5が好ましい）のいずれかの比率 で結合した状態が最適である。尚、モノクローナル抗体の F (ab' )フラグメント化や F ( ab' )フラグメントへの標識物の結合は、公知の方法が利用できる。
[0019] 本装置においてこのような標識抗体を用いることは、感度の向上や定量性の向上 に対して非常に有利である。モノクローナル抗体は一般的に IgGが使用される。 IgGを そのまま用いた標識抗体は通常 2価結合性を有して 、るので、測定対象物である抗 原と反応させた場合には、標識抗体と抗原の結合比が 1： 1または 1： 2の結合物が混 在することになる。これは、 IgG抗体 1分子に含まれる結合部位には、常に抗原がす ベて結合するわけではな 、ためである。結合比が混在した結合物が第 2の部位を通 過すると、未反応のものに加えて、 1： 1の結合物も捕捉されることになり、感度や定量 性を低下させる要因となる。これに対し、本発明では、 1価結合性の F (ab' )フラグメ ントを使用しているため、未反応のものを除くと、標識抗体と抗原の結合比が 1： 1結 合物しか存在しないことになり、感度や定量性を向上させることが可能となる。
[0020] 標識物は、酵素、着色粒子、蛍光物質、発光物質、フ 口セン等の一般的な免疫 測定に用いられているものが使用可能である。必要な測定感度等に応じて適宜選択 できるが、マトリックスの影響を受けにくい酵素を使用するのが好ましい。酵素としては 、生体内或いは試料にほとんど存在しないものが好ましぐ例えばパーォキシダーゼ 、グルコースォキシダーゼ等が好ましい。一方、生体内に含まれる酵素を用いる場合 は、第 1の部位或いは第 2の部位に当該酵素に対する抗体等を含ませて、ヒト由来の 酵素を除去するよう構成すれば良いし、或いは、酵素の基質或いは補酵素に対する 特異性を利用することも可能である。例えば、 Leuconostoc mesenteroides由来のグル コース 6—リン酸脱水素酵素で補酵素に NADを用いた場合では、ヒト由来の本酵 素は NADP依存性なので、試料中に存在しても問題はな!/、。
[0021] 標識物を検出するための試薬は、標識物に従って適宜選択される。標識物に酵素 を用いる場合は、通常、 NAD又は NADP或いはその誘導体、酵素基質又は酵素基 質を二次的に生成させるための試薬類、発色基質、ジァホラーゼ、バーオキシダ一 ゼの中力も選択される 1以上の試薬である。具体例として以下に記述する。
[0022] 標識物にパーォキシダーゼを使用する場合は、発色基質、過酸化水素又は過酸 化水素を二次的に生成させるための試薬類が必要となる。この場合、発色基質は、 1
, 2 フエ-レンジァミン（OPD)、 3, 3，， 5, 5，一テトラメチルベンチジン（TMBZ)、
2, 2，一アジノビスー 3 ェチルベンゾチアゾリンー6—スルホン酸 (ABTS)等が使 用できる。また、過酸ィ匕水素を二次的に生成させるための試薬類として、例えば、グ ルコースとダルコースォキシダーゼが使用できる。標識物にダルコースォキシダーゼ を使用する場合は、発色基質とグルコース及びパーォキシダーゼが必要となり、発色 基質は標識物がパーォキシダーゼの場合と同じものが使用できる。また、標識物に ダルコース 6—リン酸脱水素酵素を使用する場合は、ダルコース 6—リン酸と NA D又はその誘導体が必要となり、呈色による検出を行う場合はさらにジァホラーゼと 発色基質が必要となる。この場合の発色基質は、ニトロブルーテトラゾリゥム (NBT) 等の還元系発色剤が使用できる。
[0023] 尚、他に試薬類の安定化剤や界面活性剤等の補助試薬類も添加できることは言う までもない。また、検出するための試薬を混在させたときに、それらの試薬の安定性 に問題が生じる場合は、それらの試薬を第 1の部位や第 2の部位、又は更に別の部 位に分散させておくことも可能である。
[0024] 本発明における第 2の抗体は、標識抗体の抗体部分が有する抗原結合部位の固 有の構造を認識するモノクローナル抗体のことで、一般的に抗イディォタイプ抗体と 呼ばれるものである。抗イディォタイプ抗体は、抗原により目的とする抗体への結合 が阻害できるタイプと阻害できな 、タイプが存在することが知られて 、る。本発明に使 用できる抗ィディオタイブ抗体とは、抗原によりその結合が阻害できるもの、すなわち 抗原と標識抗体の結合物には結合できないタイプのものを指す。
[0025] この抗ィディォタイプ抗体は、通常の方法に従って容易に作製することができる。例 えば、マウス由来のモノクローナル抗体の抗イディォタイプ抗体を作る場合、抗原とな るモノクローナル抗体を KLH複合体としてマウスに投与すれば、あとは通常のモノク ローナル抗体の作製方法に従って製造することができる。従って、本発明に使用でき る抗イディォタイプ抗体は、通常のモノクローナル抗体と同様に、容易かつ大量に作 製することができる。
[0026] 本発明にお 、て、第 2の部位に用いる抗イディォタイプ抗体の量は、未反応の標識 抗体をほぼ完全に捕捉する必要があるため、標識抗体の量に対して過剰量必要で、 具体的には、モル換算で 10倍以上の量を使用するのが好ましい。ここで、抗イディォ タイプ抗体の代わりに抗原を使用することもできるが、この場合、実用的な見地から、 安定性の良い抗原、低コストに大量に用意できる抗原に限られ、測定対象物が限定 されてしまうので、本発明装置においては、抗原は使用しない。また、本発明におい て使用する標識抗体の量は、抗原の測定したい範囲の上限以上を用いればよぐ好 ましくは、モル換算で抗原量の上限の 2〜： LOO倍程度を用いる。
[0027] 以上、本発明の免疫測定装置について説明した。図 3には、本発明の測定原理を 簡潔に図示した。図中の上段 (A)は、装置 4の全体を斜視図で示したものである。図 中の矢印 Xは、試料の流れる方向を示している。また、図中の下段 (B)は、装置中で 起こる反応の様子を経時的に示したものである。すなわち、 T=tOでは、抗原 6と標 識抗体 7とが、第 1の部位 1に添加された状態を示している。適当な時間が経過し、 T =tlになると、試料が第 2の部位 2および第 3の部位 3を通過する。このとき、抗原 6と 反応しな力つた標識抗体 7は、第 2の抗体 8に結合され、第 2の部位 2から第 3の部位 3に移動することができない。一方、抗原 6と反応した標識抗体 7は、第 2の部位 2を 通過し、第 3の部位 3に至る。こうして、第 3の部位 3では、抗原 6と反応した標識抗体 7のみが検出される。
[0028] 一方、本発明の免疫測定方法については、本発明の免疫測定装置を使用して容 易に実施することができるので、更なる説明は割愛する。以下に、本発明の実施例を 挙げて、本発明について更に詳細に説明する。し力しながら、本発明は、これら実施 例に限定されるものではない。
実施例
[0029] 実施例 1 抗ヒト CRPマウスモノクローナル抗体に対する抗イディォタイプ抗体の作製
(1)免疫源の作製
市販の抗ヒト CRPマウスモノクローナル抗体（オリエンタル酵母製） 5mgと KLH (Cal biochem製) 4mgを含む 0.1Mリン酸緩衝液 (pH6.7) 2mLにグルタルアルデヒド（70 %) 3 /z L添加して、室温で 1時間反応させた。反応後、 PBS緩衝液で透析して免疫 源とした。
[0030] (2)免疫化
上記免疫原の 0.5mgZmL溶液 lmLと完全フロイントアジュバント lmLとを混合し て乳化したものを 8週令の BALB/cマウスに 200 L腹腔内投与した。その後 2週間 おきに 3回、上記免疫原—不完全フロイントアジュバント等量混合乳化液 200 Lを 腹腔内投与した。更に、 3回目の投与から 2週間後に、上記 0.5mgZmLの免疫原 1 00 Lを静脈注射した。
[0031] (3)脾細胞の細胞融合
3日後、上記マウス力 脾臓を摘出し、脾細胞を DMEM培地に懸濁し、洗浄を行 つた。一方、マウスミエローマ細胞株 P3X63Ag8 (大日本製薬）を、細胞融合に合わせ て対数増殖期になるように培養し、遠心分離により集めた。細胞融合は PEG法 (PE G4000)を用いて実施した。
[0032] (4)ハイプリドーマの作製とスクリーニング ノヽイブリドーマは、 10%FCS入り DMEM培地と HAT培地により培養し、以下の方 法によりスクリーニングした。ハイプリドーマ培養上清の一次スクリーニングは、固相抗 原として抗ヒト CRPマウスモノクローナル抗体力 ペプシン消化して得た精製 F (ab， ) フラグメント、二次抗体として市販の HRP標識ャギ抗マウス IgG (Fc)抗体 (ICN社
2
製)を用いたサンドイッチ ELISA法により実施した。さらに、二次スクリーニングとして 上記固相抗原に CRPをあら力じめ反応させて同様に操作することにより、 CRPにより 結合阻害を起こすタイプかどうか判定した。陽性ゥエルのクロー-ングとスクリーニン グの結果、抗ヒト CRPモノクローナル抗体を特異的に認識し、さらに CRPにより結合 阻害を起こす抗体を産生するハイプリドーマとして、 13Dと 14Aの 2クローンを得た。
[0033] (5)抗体の調製
上記で得られたノ、イブリドーマ細胞株のうち、 13Dを拡大培養して抗ィディオタイブ 抗体の採取を行った。培養上清の精製は、プロテイン Aカラム (アマシャム'ジャパン 製）により実施した。
[0034] 実施例 2 HRP標識抗ヒト CRP抗体の作製
(1)ペプシン消化
0.1M酢酸緩衝液（pH4.0) lmLに抗ヒト CRPマウスモノクローナル抗体 5mgとぺ プシン (シグマ製) 0.3mgを混合し、 37°Cで 24時間反応させた。反応後、ゲル濾過 にて精製し、 F (ab' ) フラグメントを 1.8mg得た。抗ヒト CRPマウスモノクローナル抗
2
体は、前記同様の市販品を使用した。
[0035] (2)還元
F (ab' ) フラグメント溶液は、限外濾過膜により 5mM EDTAを含む 0.1Mリン酸緩
2
衝液 (PH6.5)に置換した。この抗体液に 0.1Mシステアミン溶液を加えて 37°Cで 2時 間反応させた。反応後、ゲル濾過にて精製し、 F (ab' )フラグメントを l.Omg得た。
[0036] (3) HRPのマレイミドィ匕
パーォキシダーゼ（HRP :ロシュ製） 5mgを 0.1Mリン酸緩衝液（pH7.0) 750 μ に 溶解した。 DMF120 μ Lに Ν—ヒドロキシスクシンイミドエステル（ジーベンケミカル東 京） 2mgを溶解し、 HRP溶液〖こ カロえて、 30°Cで 1時間反応させた。反応後、 ゲル濾過にて精製し、マレイミド化 HRPを 2.6mg得た。 [0037] (4)コンジュゲートの調製
F(ab，）フラグメント 1. Omgとマレイミドィ匕 HRP1. Omgを混合し、冷蔵で 24時間反 応させた。反応後、ゲル濾過にて精製し濃縮操作後、 1.2mgZmLの HRP標識抗ヒ ト CRP抗体液を得た。
[0038] 実施例 3 CRP測定装置 (試験片)の作製
(1)標識エリア用濾紙 (第 1の部位)の調製
PBS緩衝液 10mLで BSA10mg、グルコース 1 Omgを溶解させた。次に、この溶液 で実施例 2で作製した HRP標識抗ヒト CRP抗体を 5000倍希釈した。さらにこの溶液 に濾紙 (ワットマン製)を含浸させて乾燥後、 12mm X 5mmに裁断した。
[0039] (2)捕捉エリア用メンブレン (第 2の部位)の調製
10mm X 5mmに裁断したノヽィフローメンブレン（ミリポア製）に、実施例 1で作製し た抗イディォタイプ抗体液 lmgZmL溶液を 5 L添加した。室温で乾燥後、 3mg/ mLカゼイン溶液に入れて 30分放置後、取り出して乾燥させた。
[0040] (3)検出エリア用濾紙 (第 3の部位)の調製
TMBZ 5mg、ビラノースォキシダーゼ 30単位を PBS緩衝液 lmLに溶解した。この 溶液に濾紙 (ワットマン製 3hr)を含浸させて乾燥後、 7mm X 5mmに裁断した。
[0041] (4)試験片の組み立て
支持体であるプラスチック板（60mm X 5mm)に上端から 25mm幅で両面粘着テ ープを貼った。次に、このプラスチック版の上端を 5mmほど空けて上記（2)のメンブ レンを貼り付けて固定した。次に、（2)のメンブレンの上端と 2mmほど重なり合うよう に（3)の濾紙を貼り付けて固定した。さらに、（2)のメンブレンの下端が 2mmほど重 なり合うように（1)の濾紙を貼り付けて固定した。
[0042] 実施例 4 CRPの定量測定
0、 3.25、 7.5、 15、 30、 60、 120ngZmLの CRPを含有する溶液を検体として用 いた。検体は、試料添加位置である標識エリア用濾紙に 30 L添加して反応を開始 し、 5分後に色差計により検出エリアの 690nmにおける反射率を測定した。得られた 反射率とヒト CRPの濃度との関係を示す検量線を図 4に示した。これによれば、低濃 度から良好な検量線を示しており、 CRPが定量可能であることが判明した。 図面の簡単な説明
[0043] [図 1]本発明の装置の一例を模式的に示す図である。
[図 2]本発明の装置の別の一例を模式的に示す図である。
[図 3]本発明の装置の測定原理を示す図である。
[図 4]実施例 4で得られた反射率とヒト CRPの濃度との関係を示す検量線である。 符号の説明
[0044] 1…第 1の部位、 2…第 2の部位、 3…第 3の部位、 4…装置、 5…支持体、 6…抗原、 7…標識抗体、 8· ··第 2の抗体

Claims

請求の範囲 [1] 試料中の測定対象物である抗原と標識抗体を特異的に結合させて、その結合体の 標識物を測定することにより抗原量を測定することが可能な免疫測定装置であって、1つの装置内に下記（1)乃至（3)の 3つの部位を有し、それぞれの部位を順に溶液 が移動できるように構成され、標識された第 1の抗体は、抗体部分が F (ab' )フラグメ ントでかつ F (ab ' )フラグメントと標識物の結合比が 1： 1乃至 1： n (nは整数)の 、ずれ かであり、第 2の抗体は、第 1の抗体に対する抗ィディオタイブ抗体でかつ抗原と第 1 の抗体との結合物には結合できな 、種類の抗ィディォタイプ抗体である、免疫測定 装置。
(1)試料と、抗原に特異的に結合できる標識された第 1の抗体とを反応させた溶液を 添加するための部位、又は、標識された第 1の抗体を含んでおり、第 1の抗体が試料 で溶解されて移動できるような形態で含まれて 、る、試料を添加するための部位であ る、第 1の部位
(2)第 1の抗体に特異的に結合できる第 2の抗体が、第 3の部位に移動できないよう な形態で含まれている部位である、第 2の部位
(3)第 1の抗体に含まれる標識物を検出するための試薬又はその一部を含む、第 1 の抗体の標識物を検出する部位である、第 3の部位
[2] 第 2の部位において、第 2の抗体が担体或いは粒子に固定ィ匕されている、請求項 1 に記載の装置。
[3] 第 1の抗体が酵素で標識されている、請求項 1又は 2に記載の装置。
[4] 第 1の抗体に含まれる標識物を検出するための試薬力 NAD又は NADP或いはそ の誘導体、酵素基質又は酵素基質を二次的に生成させるための試薬類、発色基質 、ジァホラーゼ、パーォキシダーゼの中力 選択される 1以上の試薬である、請求項 3 に記載の装置。
[5] 3つの部位が、それぞれガラス繊維膜、多孔性メンブレン、濾紙、ナイロン膜のうちの いずれかの材質で構成される、請求項 1〜4のいずれかに記載の装置。
[6] 試料中の測定対象物である抗原と、前記抗原に特異的に結合する標識抗体とを反 応させ、未反応の標識抗体を当該抗体に対する抗ィディオタイブ抗体で捕捉し、捕 捉されな力 た抗原と標識抗体との結合物を検出する免疫測定方法であって、前記 標識抗体の抗体部分が、 F (ab' )フラグメントでかつ F (ab ' )フラグメントと標識物の結 合比が 1： 1乃至 1 :n (nは整数)のいずれかであり、前記抗ィディオタイブ抗体が、抗 原と標識抗体との結合物には結合できな 、種類の抗ィディオタイブ抗体である、免 疫測定方法。
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2007072922A1 (ja) * 2005-12-22 2007-06-28 Rohm Co., Ltd. 免疫測定装置及び方法

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2002040024A (ja) * 2000-03-31 2002-02-06 Ortho-Clinical Diagnostics Inc Ｃ反応性蛋白についての免疫測定

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE69119312T2 (de) * 1990-07-18 1997-01-16 Abbott Lab Analyt-Austauschreagenz zur Verwendung in spezifischen Bindungstests, -vorrichtungen und -sätzen
CA2217210A1 (en) * 1995-05-09 1996-11-14 Smithkline Diagnostics, Inc. Devices and methods for separating cellular components of blood from liquid portion of blood

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2002040024A (ja) * 2000-03-31 2002-02-06 Ortho-Clinical Diagnostics Inc Ｃ反応性蛋白についての免疫測定

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
ISHIKAWA EIJI.: "Cho Kokando Koso Men'eki Sokuteiho.", 1983, JAPAN SCIENTIFIC SOCIETY PRESS., pages: 41 - 66 *

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2007072922A1 (ja) * 2005-12-22 2007-06-28 Rohm Co., Ltd. 免疫測定装置及び方法
JPWO2007072922A1 (ja) * 2005-12-22 2009-06-04 ローム株式会社 免疫測定装置及び方法
JP5097557B2 (ja) * 2005-12-22 2012-12-12 ローム株式会社 免疫測定装置及び方法

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