KR20180058646A - 생화학-면역 하이브리드 바이오센서 및 이를 포함하는 센서시스템 - Google Patents

생화학-면역 하이브리드 바이오센서 및 이를 포함하는 센서시스템 Download PDF

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Abstract

본 발명은 생화학-면역 하이브리드 바이오센서 및 이를 포함하는 센서시스템에 관한 것으로, 본 발명에 따른 생화학-면역 하이브리드 바이오센서는 모세관 현상에 따라 시료(1)를 이동시키는 세공성 멤브레인으로 형성된 반응스트립(100)을 포함하되, 상기 반응스트립(100)은, 소정의 길이를 갖고, 일단으로부터 타단 방향으로 시료(1)를 이송시키는 시료이송패드(10), 외부에서 주입된 시료(1)를 흡수하는 시료첨가패드(20), 시료(1) 내의 단백질 마커(2)와 특이적으로 결합하는 탐지항체(41) 및 단백질 마커(2)에 따라 면역반응 발색신호를 발생시키는 신호표지자(43)를 포함하고, 시료이송패드(10)의 일단과 시료첨가패드(20)를 서로 연결하는 중합체패드(40), 단백질 마커(2)와 특이적으로 결합하는 포획항체(51)를 포함하고, 시료이송패드(10) 상(on)에 적어도 하나 이상 형성되는 면역반응부(50), 생화학반응 발색신호를 발생시키는 발색기질 및 시료(1) 내의 생화학 마커(3)로부터 발색기질과 반응하는 반응물을 생성하는 적어도 하나 이상의 효소를 포함하고, 시료이송패드(10)와 공간적으로 분리되며, 중합체패드(40)로부터 시료(1)를 공급받아, 면역반응부(50)에서의 반응과 독립적으로 반응하는 생화학반응부(60), 및 시료이송패드(10)의 타단에 배치되고, 시료이송패드(10)를 따라 이송된 시료(1)를 흡수하는 시료흡수패드(30)를 포함한다.

Description

생화학-면역 하이브리드 바이오센서 및 이를 포함하는 센서시스템{Biochemical-immunological hybrid biosensor and sensor system including the same}
본 발명은 바이오센서 및 이를 포함하는 센서시스템에 관한 것으로서, 상세하게는 멤브레인 크로마토그래피 분석 기술을 통한 진단검사분야에서 생화학적 및 면역학적 분석방법에 의해 탐지되는 이종(heterogeneous) 다중 바이오마커를 동시에 독립적으로 측정할 수 있는 바이오센서 및 이를 포함하는 센서시스템에 관한 것이다.
멤브레인 크로마토그래피 분석은 의료 현장검사(Point-of-care-testing; POCT) 분야에서 기존의 전문 체외진단(in vitro diagnostics) 기술에 비해 신속성과 단순성 그리고 실용성의 장점을 제공한다(Clin. Biochem., 2009, 42, pp 549-561). 특히 면역분석 기반 POCT 기술 중의 하나인 멤브레인 스트립 기반의 측방흐름 면역 크로마토그래피 분석(lateral flow immuno-chromatographic assay, LF-ICA) 기술은 고가의 장비 없이도 단시간 내에 샘플 내에 존재하는 분석물질의 존재 유무 및 그 농도를 검출할 수 있기 때문에 가장 실용적이고 널리 사용되고 있다.
이러한 LF-ICA 기술은 하기 선행기술문헌의 특허문헌에 개시된 바와 같이, 면역 바이오센서에 적용되어 현장검사용으로 활용된다. 여기서, 골드 콜로이드와 같은 나노 사이즈의 흡광계수(extinction coefficient)가 큰 물질을 사용하여 발생된 색은 육안으로 쉽게 인식할 수 있고, 모든 분석공정이 15분 이내에 완료되는 장점이 있다.
그러나 나노 골드입자 기반 LF-ICA의 감도는 샘플(예를 들어, 혈액)에 존재하는 매우 적은 양의 물질을 탐지하기에는 부족하기 때문에, 신호 발생의 감도를 개선할 필요가 있다. 따라서, 효소 또는 형광 염료 등의 민감한 신호체가 도입되기도 한다.
이와 같이 제작된 종래 현장검사용 면역 바이오센서는 단일 단백질 바이오마커 뿐만 아니라, 다중 바이오마커 측정에도 이용되어 고감도 분석성능을 나타내지만, 특정 질환의 임상적 판단에 필요한 생화학 마커에 대한 정보를 취득할 수 없는 문제가 있다. 예를 들어, 폐혈증을 진단하기 위해서는 항원-항체 반응을 통한 단백질 마커에 대한 정보와, 젖산과 같은 생화학 마커에 대한 정보가 필요하지만, 종래 현장검사용 면역 바이오센서에 의해서는 효소반응을 통한 생화학 분석이 불가능하다. 따라서, 이종 바이오마커의 측정은 각각 다른 분석시스템을 이용할 수 밖에 없다.
결국, 생화학-단백질 이종 바이오마커의 측정이 서로 다른 시스템을 통해 이루어지므로, 분석에 많은 시간이 소요되고, 분석 조건 및 환경 차이로 인해 진단 신뢰성이 저하된다. 또한, 빈번한 혈액샘플 채취로 인한 노약자 및 영유아 등의 통증에 대한 신체적 스트레스가 증가하고, 혈액과 같은 한정된 샘플의 효율적인 사용도 불가능하다. 나아가 대형 병원 내의 응급실과 같은 급박한 상황에서 여러 명의 환자에 대한 질환 관련 다중 바이오마커를 동시에 측정하기도 어렵다.
이에 종래 면역 바이오센서의 문제점을 해결하기 위한 방안이 절실히 요구되고 있는 상황이다.
KR 2010-0009347 A
본 발명은 상술한 종래기술의 문제점을 해결하기 위한 것으로, 본 발명의 일 측면은 멤브레인 크로마토그래피 분석 기술을 기반으로 생화학적 및 면역학적 분석을 통해 이종(heterogeneous) 다중 바이오마커를 동시에 독립적으로 측정하여 특정 질환을 진단할 수 있는 바이오센서를 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 다른 측면은 스마트기기를 통해 바이오센서의 발색신호를 이미지화하고 이를 디지털 데이터로 변환하는 센서시스템을 제공하는 것이다.
본 발명의 실시예에 따른 생화학-면역 하이브리드 바이오센서는 모세관 현상에 따라 시료를 이동시키는 세공성 멤브레인으로 형성된 반응스트립을 포함하되, 상기 반응스트립은, 소정의 길이를 갖고, 일단으로부터 타단 방향으로 상기 시료를 이송시키는 시료이송패드; 외부에서 주입된 상기 시료를 흡수하는 시료첨가패드; 상기 시료 내의 단백질 마커와 특이적으로 결합하는 탐지항체 및 상기 단백질 마커에 따라 면역반응 발색신호를 발생시키는 신호표지자를 포함하고, 상기 시료이송패드의 일단과 상기 시료첨가패드를 서로 연결하는 중합체패드; 상기 단백질 마커와 특이적으로 결합하는 포획항체를 포함하고, 상기 시료이송패드 상(on)에 적어도 하나 이상 형성되는 면역반응부; 생화학반응 발색신호를 발생시키는 발색기질 및 상기 시료 내의 생화학 마커로부터 상기 발색기질과 반응하는 반응물을 생성하는 적어도 하나 이상의 효소를 포함하고, 상기 시료이송패드와 공간적으로 분리되며, 상기 시료이송패드, 상기 시료첨가패드, 및 상기 중합체패드 중 적어도 어느 하나 이상으로부터 상기 시료를 공급받아, 상기 면역반응부에서의 반응과 독립적으로 반응하는 생화학반응부; 및 상기 시료이송패드의 타단에 배치되고, 상기 시료이송패드를 따라 이송된 상기 시료를 흡수하는 시료흡수패드;를 포함한다.
또한, 본 발명의 실시예에 따른 생화학-면역 하이브리드 바이오센서에 있어서, 상기 생화학반응부는 적어도 하나 이상 형성된다.
또한, 본 발명의 실시예에 따른 생화학-면역 하이브리드 바이오센서에 있어서, 상기 반응스트립은 상기 시료이송패드, 상기 시료첨가패드, 및 상기 중합체패드 중 적어도 어느 하나 이상으로부터 외측으로 연장되고, 일면에 상기 생화학반응부가 배치되는 적어도 하나 이상의 생화학반응패드;를 더 포함한다.
또한, 본 발명의 실시예에 따른 생화학-면역 하이브리드 바이오센서에 있어서, 상기 중합체패드는 상기 시료이송패드의 일단 상에 적층되고, 상기 시료첨가패드는 상기 중합체패드 상에 적층되며, 상기 시료흡수패드는 상기 시료이송패드의 타단 상에 적층된다.
또한, 본 발명의 실시예에 따른 생화학-면역 하이브리드 바이오센서에 있어서, 상기 면역반응부는 다수 개이고, 각각은 서로 다른 상기 단백질 마커와 일대일로 결합되도록, 서로 다른 상기 포획항체를 포함한다.
또한, 본 발명의 실시예에 따른 생화학-면역 하이브리드 바이오센서에 있어서, 상기 단백질 마커는 C 반응성 단백질(C-reactive protein, CRP), 및 프로칼시토닌(procalcitonin, PRT)이고, 상기 생화학 마커는 젖산이며, 상기 효소는 락데이트 옥시다아제(lactate oxidase, LOX), 및 겨자무과산화효소(horseradish peroxidase, HRP)이고, 상기 발색기질은 아이오딘화칼륨(potassium iodide)이며, 폐혈증을 진단한다.
또한, 본 발명의 실시예에 따른 생화학-면역 하이브리드 바이오센서에 있어서, 상기 시료이송패드의 일측에 인접하고, 외부에서 주입된 기질을 흡수하는 기질첨가패드; 및 상기 시료이송패드의 타측에 인접하여, 상기 시료이송패드를 가로질러 이송되는 상기 기질을 흡수하는 기질흡수패드;를 더 포함한다.
또한, 본 발명의 실시예에 따른 생화학-면역 하이브리드 바이오센서에 있어서, 내부에 상기 반응스트립이 배치되는 수용공간, 상기 면역반응부 및 상기 생화학반응부가 노출되도록 천공된 탐지창, 및 상기 시료첨가패드에 상기 시료를 주입할수록 천공된 시료주입구를 구비하는 카트리지;를 더 포함한다.
한편, 본 발명의 실시예에 따른 센서시스템은 생화학-면역 하이브리드 바이오센서; 상기 면역반응부 또는 생화학반응부의 발색신호 이미지를 캡쳐할 수 있는 카메라가 내장된 스마트기기; 및 상기 생화학-면역 하이브리드 바이오센서가 삽입되는 슬롯을 구비하고, 상기 스마트기기를 거치하는 스마트기기 홀더;를 포함한다.
또한, 본 발명의 실시예에 따른 센서시스템에 있어서, 상기 스마트기기 홀더에 배치되어 광을 조사하는 광원;을 더 포함한다.
또한, 본 발명의 실시예에 따른 센서시스템에 있어서, 이미지로 캡쳐된 상기 발색신호는 상기 스마트기기의 어플리케이션에 의해 디지털 데이터로 변환된다.
또한, 본 발명의 실시예에 따른 센서시스템에 있어서, 상기 카메라와 상기 면역반응부 또는 생화학반응부 사이에 배치되어, 상기 카메라의 초점 거리를 조절하는 초점조절렌즈;를 더 포함한다.
본 발명의 특징 및 이점들은 첨부도면에 의거한 다음의 상세한 설명으로 더욱 명백해질 것이다.
이에 앞서 본 명세서 및 청구범위에 사용된 용어나 단어는 통상적이고 사전적인 의미로 해석되어서는 아니 되며, 발명자가 그 자신의 발명을 가장 최선의 방법으로 설명하기 위해 용어의 개념을 적절하게 정의할 수 있다는 원칙에 입각하여 본 발명의 기술적 사상에 부합하는 의미와 개념으로 해석되어야만 한다.
본 발명에 따르면, 항원-항체 반응을 통해 단백질 마커에 대한 정보를 취득하는 면역반응부와 효소-기질의 생화학 반응을 통해 생화학 마커에 대한 정보를 취득하는 생화학반응부가 동일 스트립 상에 독립적으로 배치됨으로써, 단일 시료 내의 이종의 다중 바이오마커를 동시에 독립적으로 측정·분석하여, 정확한 진단 및 신속한 분석을 가능하게 한다.
또한, 본 발명에 따르면, 스마트기기를 기반으로 하는 측정 및 분석 시스템을 구축하여, 편리하고 경제적으로 현장에서 특정 질환의 진단 및 정량분석에 운용될 수 있다.
도 1은 본 발명의 실시예에 따른 생화학-면역 하이브리드 바이오센서를 도시한 분해 사시도이다.
도 2는 본 발명의 실시예에 따른 생화학-면역 하이브리드 바이오센서의 작동원리를 도시한 단면도이다.
도 3은 도 1의 반응스트립을 상세하게 도시한 사시도이다.
도 4는 본 발명의 다른 실시예에 따른 생화학-면역 하이브리드 바이오센서를 도시한 분해 사시도이다.
도 5는 본 발명의 또 다른 실시예에 따른 생화학-면역 하이브리드 바이오센서의 반응스트립을 도시한 사시도이다.
도 6은 본 발명의 실시예에 따른 생화학-면역 하이브리드 바이오센서를 포함하는 센서시스템을 도시한 사시도이다.
도 7은 포획항체의 종류에 따른 반응 특이성을 나타내는 그래프이다.
도 8은 sandwich ELISA 신호발생원으로 SA-HRP 다발 중합체및 SA-HRP 단일 중합체를 사용한 경우의 PCT 농도에 따른 신호 세기를 나타내는 그래프이다.
도 9는 본 발명에 따른 생화학-면역 분석용 멤브레인 반응스트립을 제조하는 과정을 나타낸 공정도이다.
도 10은 본 발명에 따른 생화학-면역 하이브리드 바이오센서의 발색기질 농도 별 젖산 농도응답 그래프이다.
도 11은 본 발명에 따른 생화학-면역 하이브리드 바이오센서의 반응시간별 젖산 농도응답 그래프이다.
도 12는 본 발명에 따른 생화학-면역 하이브리드 바이오센서의 최적조건 하에서의 젖산 농도응답 그래프 및 젖산 농도응답 곡선이다.
도 13은 본 발명에 따른 생화학-면역 하이브리드 바이오센서의 최적조건 하에서의 CRP 농도응답 그래프 및 CRP 농도응답 곡선이다.
도 14는 본 발명에 따른 생화학-면역 하이브리드 바이오센서의 최적조건 하에서의 PCT 농도응답 그래프 및 PCT 농도응답 곡선이다.
도 15는 본 발명에 따른 생화학-면역 하이브리드 바이오센서를 이용한 PCT, CRP, 및 젖산에 대한 분석을 동시에 수행한 결과 그래프이다.
본 발명의 목적, 특정한 장점들 및 신규한 특징들은 첨부된 도면들과 연관되어지는 이하의 상세한 설명과 바람직한 실시예들로부터 더욱 명백해질 것이다. 본 명세서에서 각 도면의 구성요소들에 참조번호를 부가함에 있어서, 동일한 구성 요소들에 한해서는 비록 다른 도면상에 표시되더라도 가능한 한 동일한 번호를 가지도록 하고 있음에 유의하여야 한다. 또한, "제1", "제2" 등의 용어는 하나의 구성요소를 다른 구성요소로부터 구별하기 위해 사용되는 것으로, 구성요소가 상기 용어들에 의해 제한되는 것은 아니다. 이하, 본 발명을 설명함에 있어서, 본 발명의 요지를 불필요하게 흐릴 수 있는 관련된 공지 기술에 대한 상세한 설명은 생략한다.
이하, 첨부된 도면을 참조하여 본 발명의 바람직한 실시형태를 상세히 설명하기로 한다.
도 1은 본 발명의 실시예에 따른 생화학-면역 하이브리드 바이오센서를 도시한 분해 사시도이고, 도 2는 본 발명의 실시예에 따른 생화학-면역 하이브리드 바이오센서의 작동원리를 도시한 단면도이며, 도 3은 도 1의 반응스트립을 상세하게 도시한 사시도이다.
도 1 내지 도 2에 도시된 바와 같이, 본 발명에 따른 생화학-면역 하이브리드 바이오센서는 모세관 현상에 따라 시료(1)를 이동시키는 세공성 멤브레인으로 형성된 반응스트립(100)을 포함하되, 상기 반응스트립(100)은, 소정의 길이를 갖고, 일단으로부터 타단 방향으로 시료(1)를 이송시키는 시료이송패드(10), 외부에서 주입된 시료(1)를 흡수하는 시료첨가패드(20), 시료(1) 내의 단백질 마커(2)와 특이적으로 결합하는 탐지항체(41) 및 단백질 마커(2)에 따라 면역반응 발색신호를 발생시키는 신호표지자(43)를 포함하고, 시료이송패드(10)의 일단과 시료첨가패드(20)를 서로 연결하는 중합체패드(40), 단백질 마커(2)와 특이적으로 결합하는 포획항체(51)를 포함하고, 시료이송패드(10) 상(on)에 적어도 하나 이상 형성되는 면역반응부(50), 생화학반응 발색신호를 발생시키는 발색기질 및 시료(1) 내의 생화학 마커(3)로부터 발색기질과 반응하는 반응물을 생성하는 적어도 하나 이상의 효소를 포함하고, 시료이송패드(10)와 공간적으로 분리되며, 시료이송패드(10), 시료첨가패드(10), 및 중합체패드(40) 중 적어도 어느 하나 이상으로부터 시료(1)를 공급받아, 면역반응부(50)에서의 반응과 독립적으로 반응하는 생화학반응부(60), 및 시료이송패드(10)의 타단에 배치되고, 시료이송패드(10)를 따라 이송된 시료(1)를 흡수하는 시료흡수패드(30)를 포함한다.
멤브레인 스트립 기반의 측방흐름 면역 크로마토그래피 분석(lateral flow immuno-chromatographic assay, LF-ICA) 기술은 면역분석 기반의 의료 현장검사(Point-of-care-testing; POCT) 기술 중 하나이다. 여기서, 면역 크로마토그래피는 면역측량법의 샌드위치법을 기반으로, 항원에 대한 항체의 특이적인 면역적 반응성과 골드입자(colloidal gold)의 발색 특성 및 유동성, 멤브레인의 모세관 현상에 의한 분자의 이동을 응용한 검사방법이다. 이러한 LF-ICA는 고가의 장비 없이도 단시간 내에 샘플 내에 존재하는 분석물질의 존재 유무 및 그 농도를 검출할 수 있는 장점이 있어서, POCT 분야에서 가장 실용적이고 널리 사용되고 있다. 이때 면역 크로마토그래피 기술을 응용한 면역 바이오센서에서의 발색은 육안으로 인식 가능하고, 매우 짧은 시간 내에 분석을 완료할 수 있으며, 나아가 단일 단백질 바이오마커 뿐만 아니라 다중 바이오마커 측정에도 이용될 수 있는 장점이 있다. 그러나 종래 현장검사용 면역 바이오센서는 특정 질환의 임상적 판단에 필요한 생화학 마커에 대한 정보를 단백질 마커와 동시에 취득할 수 없다. 따라서, 이종(heterogeneous) 바이오마커를 측정하기 위해서는 각각 다른 분석시스템을 이용해야 하는 문제가 있다. 이에, 이러한 면역 바이오센서의 문제점을 개선하고자 본 발명에 따른 생화학-면역 하이브리드 바이오센서가 안출되었다.
본 발명에 따른 생화학-면역 하이브리드 바이오센서는 반응스트립(100)을 포함한다. 여기서, 반응스트립(100)은 세공성 멤브레인으로 형성된다. 따라서, 반응스트립(100)에 흡수된 시료(1)는 모세관 현상에 따라 이동한다. 이때, 반응스트립(100) 상에서 생화학적 및 면역학적 방법으로 시료(1) 내의 이종 바이오마커가 독립적으로 탐지된다. 여기서, 이종 바이오마커는 신체 내의 변화를 알아낼 수 있는 지표로서, 항원-항체 반응을 통해 측정할 수 있는 단백질 마커(2)와 효소-기질 반응을 통해 측정 가능한 생화학 마커(3)가 있다. 이때, 단백질 마커(2)는 2개 이상을 포함할 수 있으므로, 반응스트립(100)은 동종의 다중 바이오마커도 탐지 가능하다.
이렇게 반응스트립(100)에서 탐지되는 이종 다중 바이오마커는 POCT 분야에서 특정 질환을 진단하기 위한 임상학적 판단자료로 활용된다. 예를 들어, 패혈증을 진단하기 위해서는 단백질 마커(2)로서 C 반응성 단백질(C-reactive protein, CRP), 및 프로칼시토닌(procalcitonin, PCT)과, 생화학 마커(3)로서 젖산을 측정한다. 또한, 심혈관 질환 진단에서는 단백질 마커(2)로서 미오글로빈 및 심장 트로포닌 Ⅰ와 생화학 마커(3)로서 콜레스테롤을 측정하고, 당뇨병 합병증 진단을 위해서는 단백질 마커(2)로서 뇨 알브민과 생화학 마커(3)로서 포도당을 측정한다.
상술한 바와 같이, 단백질 마커(2)와 생화학 마커(3)에 대한 동시 검사가 필요한 질환은 다양하지만, 이하에서는 대상 질환을 폐혈증으로 한정하여 본 발명에 따른 생화학-면역 하이브리드 바이오센서를 설명한다. 다만, 이러한 질환의 한정은 본 발명을 설명하기 위한 것이고, 이에 의해서 발명의 효과나 그 적용 및 권리범위가 제한되는 것은 아니다.
구체적으로, 생화학적 및 면역학적 방법으로 시료(1) 내의 이종의 다중 바이오마커를 탐지하기 위해서, 반응스트립(100)은 시료이송패드(10), 시료첨가패드(20), 중합체패드(40), 면역반응부(50), 생화학반응부(60), 및 시료흡수패드(30)를 포함한다.
여기서, 시료이송패드(10)는 소정의 길이를 갖고, 모세관력에 의해 시료(1)를 시료이송패드(10)의 길이방향을 따라 그 일단에서부터 타단 쪽으로 이송시킨다. 이때, 길이방향에 따른 시료(1)의 흐름을 수직흐름(세로흐름)으로 정의한다. 한편, 시료(1)는 단백질 마커(2)와 생화학 마커(3)를 함유하는 혈액, 소변 등의 샘플로서, 외부에서부터 주입된다.
이때, 주입된 시료(1)는 시료첨가패드(20)에 흡수되고, 시료첨가패드(20)는 중합체패드(40)에 의해 시료이송패드(10)의 일단과 연결된다. 여기서, 시료이송패드(10)의 일단 상(on)에 중합체패드(40)가 적층되고, 그 중합체패드(40) 상에 시료첨가패드(20)가 적층되는 구조로 이루어질 수 있다. 다만, 반드시 이러한 구조에 한해 권리범위가 한정되어야 하는 것은 아니고, 시료(1)가 시료첨가패드(20), 중합체패드(40), 시료이송패드(10)를 순차적으로 거쳐 이동할 수 있는 한 그 연결구조는 다양하게 변형 가능하다. 따라서, 시료첨가패드(20)에 흡수된 시료(1)는 모세관 현상에 따라 중합체패드(40)를 거쳐 시료이송패드(10) 방향으로 이동한다.
이때, 중합체패드(40)는 탐지항체(41), 및 신호표지자(43)를 포함한다. 구체적으로는, 건조상태로 축적된 신호표지자-탐지항체 중합체를 포함한다. 여기서, 탐지항체(41)는 시료(1) 내의 단백질 마커(2)와 특이적으로 결합하고, 신호표지자(43)는 탐지항체(41)에 결합되어 단백질 마커(2)의 농도에 따라 발색신호를 발생시킨다. 이때, 신호표지자(43)는 저비용으로 제조 가능한 골드입자(colloidal gold)을 사용할 수 있다. 다만, 신호표지자(43)가 반드시 골드입자에 한정되는 것은 아니고 단백질 마커(2)의 농도에 따라 발색신호를 발할 수 있는 한 모든 공지의 소재를 사용할 수 있다.
한편, 건조상태의 상기 중합체는 이동하는 시료(1)에 의해 용해되어, 탐지항체(41)가 시료(1) 내의 단백질 마커(2)의 특정 부위(제1 부위)에 특이적으로 결합된다. 이러한 1차 반응 후, 중합체와 결합한 단백질 마커(2)는 시료이송패드(10)를 따라 이동하게 되고, 면역반응부(50)에서 발색신호를 발생시킨다.
면역반응부(50)는 시료이송패드(10)에 형성되는데, 단백질 마커(2)와 특이적으로 결합하는 포획항체(51)를 포함하므로, 항원-항체 반응에 의해 포획항체(51)가 중합체와 결합된 단백질 마커(2)의 다른 부위(제2 부위)에 특이적으로 결합한다. 이때, 신호표지자(43)가 단백질 마커(2)의 농도에 따라 소정의 색깔로 발색신호를 발생시키므로, 단백질 마커(2)의 종류와 농도를 분석할 수 있다. 골드입자를 신호표지자(43)로 사용하는 경우에는 붉은색 신호가 발생한다.
한편, 면역반응부(50)는 특정 질환을 진단하기 위해서, 2개 이상의 단백질 마커(2)의 분석이 필요할 수도 있으므로, 적어도 하나 이상 형성된다. 예를 들어, 폐혈증 진단을 위해, 단백질 마커(2)인 PCT(2a) 및 CRP(2b)를 분석하는 경우에, 면역반응부(50)는 다수 개로, 서로 다른 단백질 마커(2a, 2b)와 일대일로 결합되도록, 어느 하나에는 항-PCT 포획항체(51a)가, 다른 하나에는 항-CRP 포획항체(51b)가 별개로 존재한다. 이때, 각각 중합체와 결합한 PCT(2a)와 CRP(2b)가 서로 다른 포획항체(51a, 51b)에 결합되어, 서로 다른 면역반응부(50a, 50b)에서 각각 발색신호를 발생시킨다. 여기서, 항-PCT 포획항체(51a)를 포함하는 제1 면역반응부(50a)와 항-CRP 포획항체(51b)를 포함하는 제2 면역반응부(50b)가 서로 다른 위치에 배치되므로, 그 위치에서의 발색신호 발생 여부에 따라 PCT(2a)와 CRP(2b)의 존부를 구별할 수 있다.
한편, 생화학 마커(3)의 분석은 면역반응부(50)와 공간적으로 분리된 생화학반응부(60)에서 독립적인 효소-기질의 생화학 반응을 통해 이루어지는바, 생화학반응부(60)는 발색기질 및 효소를 포함한다. 여기서, 발색기질은 생화학반응에 따른 발색신호를 발생시키고, 효소는 시료(1) 내의 생화학 마커(3)로부터 발색기질과 반응하는 반응물을 생성한다. 이때, 효소는 적어도 하나 이상으로, 2개의 효소가 혼합된 효소 복합체를 구성할 수도 있다. 또한, 효소 및 발색기질은 건조상태로 축적되었다가, 시료(1)에 의해 용해되어 생화학 마커(3)와 반응한다.
구체적으로, 폐혈증 진단에 필요한 젖산을 분석하기 위해서, 효소 복합체는 락데이트 옥시다아제(lactate oxidase, LOX), 및 겨자무과산화효소(horseradish peroxidase, HRP)를 포함하고, 발색기질은 아이오딘화칼륨(potassium iodide)일 수 있다. 이때, 시료(1)가 생화학반응부(60)에 도달하면, LOX의 촉매 반응에 의해 젖산 농도에 비례하여 과산화수소(제1 반응물)이 생성되고, 과산화수소는 HRP 촉매 반응에 의해 활성 산소(제2 반응물)로 변화되며, 그 활성 산소가 무색의 아이오딘화칼륨과 반응해 산화와 동시에 아이오딘(iodine)으로 변화되어 갈색의 발색신호를 나타낸다. 여기서, 발색신호는 젖산의 농도에 비례하여 발생하므로, 젖산의 존부, 및 그 농도를 분석할 수 있다.
이러한 생화학반응부(60)의 반응에 사용되는 시료(1)는 시료이송패드(10), 시료첨가패드(20), 및 중합체패드(40) 중 적어도 어느 하나 이상으로부터 공급받고, 그 반응은 면역반응부(50)에서의 반응과 독립적으로 이루어진다. 독립적 반응을 유도하기 위해서, 생화학반응부(60)는 면역반응부(50)가 형성되는 시료이송패드(10)와 공간적으로 분리되도록 형성된다.
여기서, 시료이송패드(10), 시료첨가패드(20), 및 중합체패드(40) 중 적어도 어느 하나 이상과 생화학반응부(60)를 서로 연결하고, 생화학반응부(60)를 지지하는 생화학반응패드(70)가 사용될 수 있다. 생화학반응패드(70)는 세공성 멤브레인으로 형성된다. 도면에서는 생화학반응패드(70)가 중합체패드(40)로부터 외측으로, 시료이송패드(10)의 타단을 향하도록 연장되었지만, 반드시 중합체패드(40)에 연결되어야 하는 것은 아니고, 시료이송패드(10), 및/또는 시료첨가패드(20)와 연결되어도 무방하다. 생화학반응패드(70)의 일면에는 생화학반응부(60)가 배치된다. 한편, 생화학반응패드(70)는 시료이송패드(10), 시료첨가패드(20), 및/또는 중합체패드(40)의 내부 및/또는 외부에 적어도 하나 이상, 즉 단수 또는 복수로 형성될 수 있다.
이렇게 생화학반응부(60)가 생화학반응패드(70) 상에 배치되는 경우, 시료이송패드(10)의 외면과 이격되도록 배치되어, 시료(1)가 유입되는 생화학반응패드(70)의 일단을 제외하고는 시료이송패드(10)와 공간적으로 분리될 수 있다. 그 일례로서, 도 3을 참고로, 시료이송패드(10)에 그 두께방향을 따라 관통된 수용부(E)를 형성하고, 그 수용부(E)에 생화학반응패드(70)가 배치되어 구현될 수 있다. 이때, 수용부(E)의 내면과 생화학반응패드(70)의 가장자리가 서로 맞닿지 않도록, 그 사이에 유격(G)이 생김으로써, 시료이송패드(10)와 생화학반응부(60)는 공간적으로 분리된다. 생화학반응패드(70)가 시료이송패드(10)의 중간에 배치되더라도(도시되지 않음), 시료(1)가 유입되는 생화학반응패드(70)의 일단을 제외하고 두 패드(10, 70) 사이에 유격이 생김으로, 시료(1) 주입 후 시료이송패드(10)와 생화학반응부(60)는 공간적으로 분리된다. 따라서, 시료(1) 분석 시, 생화학반응부(60)에서의 반응은 모세관 현상에 의한 수직흐름 및 수평흐름으로부터 영향을 받지 않고 독립적으로 수행될 수 있다.
여기서, 수용부(E)는 시료이송패드(10)를 식각하여, 그 형태가 생화학반응패드(70)의 형태에 대응되되 소정의 유격(G)을 갖도록 형성될 수 있는데, 수용부(E)의 형성 방법 및 그 형태가 반드시 이에 한정되는 것은 아니다. 따라서, 수용부(E)의 내면과 생화학반응패드(70)의 외면이 소정의 영역에 걸쳐 이격 분리되는 한, 수용부(E)가 반드시 관통된 형태로 형성될 필요는 없고, 시료이송패드(10)의 외면으로부터 오목하게 함몰된 구조를 가져도 무방하다. 또한, 공간적 분리를 위해서, 반드시 수용부(E)가 형성되어야 하는 것은 아니고, 시료이송패드(10)의 외면으로부터 생화학반응패드(70)가 소정의 간격으로 이격 배치되어도 된다.
전술한 구조와 같이, 생화학반응패드(70)가 시료이송패드(10), 시료첨가패드(20), 및 중합체패드(40) 중 적어도 어느 하나 이상으로 로부터 외측으로 연장되고, 면연반응부(50)가 형성된 시료이송패드(10)가 중합체패드(40)와는 연결되되 생화학반응부(60)와는 소정의 영역에 걸쳐 공간적으로 분리되므로, 모세관 현상에 의해 이동하는 시료(1)가 단일한 유체 흐름에 따라 생화학반응과 면역반응을 독립적으로 거치면서 각각의 발색신호를 발생하게 된다. 이하 이러한 구조의 반응스트립(100)을 '단일 유체흐름 스트립'이라고 정의한다. 이렇게 이동하면서 생화학반응 및 면역반응을 하고 난 시료(1)는 시료흡수패드(30)에서 흡수된다.
시료흡수패드(30)는 시료이송패드(10)의 타단에 배치되므로, 생화학반응 및 면역반응을 거친 시료(1)는 최종적으로 시료흡수패드(30)에 흡수된다. 이때, 시료흡수패드(30)는 시료이송패드(10)의 타단 상에 적층되는 구조로 배치될 수 있다. 다만, 반드시 이러한 구조로만 배치되어야 하는 것은 아니다.
종합적으로, 본 발명에 따른 생화학-면역 바이오센서에 따르면, 항원-항체 반응을 통해 단백질 마커(2)에 대한 정보를 취득하는 면역반응부(50)와 효소-기질의 생화학 반응을 통해 생화학 마커(3)에 대한 정보를 취득하는 생화학반응부(60)가 동일 스트립 상에 배치됨으로써, 한번의 혈액 등의 샘플 채취로서 질환 진단이 가능하여 환자의 통증에 대한 스트레스를 감경하고, 한정된 샘플을 효율적으로 사용할 수 있다. 또한, 단일 시료 내의 이종의 다중 바이오마커를 동시에 독립적으로 측정·분석하여, 정확한 진단 및 신속한 분석을 가능하게 하고, 별도의 분석기 작동을 위한 준비시간이 필요 없어서 혈액 샘플의 변질을 차단할 수 있다. 나아가, 병원 내의 급박한 상황에서도 여러 명의 환자에 대한 질환 관련 다중 바이오마커를 동시에 측정할 수 있고, 소득 수준이 낮은 개발도상국이나 서민층에서도 경제적인 부담 없이 다중 바이오마커에 대한 분석을 실행할 수 있다.
한편, 본 발명에 따른 생화학-면역 하이브리드 바이오센서는 반응스트립(100)을 수용하는 카트리지(400)를 더 포함할 수 있다. 여기서, 카트리지(400)는 내부에 수용공간(410)을 구비하므로, 그 수용공간(410)에 반응스트립(100)을 수용한다. 또한, 그 수용공간(410)과 외부를 소통시키도록 천공된 시료주입구(430)가 구비되어 시료(1)를 반응스트립(100)에 주입할 수 있고, 면역반응부(50) 및 생화학반응부(60)가 노출되도록 탐지창(420)이 천공되어 각각의 반응부(50, 60)에서의 발색신호를 외부에서 관찰할 수 있다.
한편, 카트리지(400)는 상판(400a)과 하판(400b)으로 나누어져, 상판(400a)과 하판(400b) 사이에 반응스트립(100)이 배치되고, 상판(400a)과 하판(400b)이 결합되어 내부에 반응스트립(100)이 고정될 수 있다. 다만, 카트리지(400)가 반드시 상판(400a)과 하판(400b)으로 구성되는 것은 아니고, 일체형으로 형성되고, 반응스트립(100)이 내부로 삽입되는 구조이어도 무방하다.
이하에서는 '가지형 유체흐름 스트립'에 대해서 설명한다.
도 4는 본 발명의 다른 실시예에 따른 생화학-면역 하이브리드 바이오센서를 도시한 분해 사시도이다.
도 4에 도시된 바와 같이, 본 발명의 다른 실시예에 따른 반응스트립(100)은 시료첨가패드(20)에서부터 외측으로 연장되는 생화학반응패드(70)를 포함할 수 있다. 여기서, 생화학반응패드(70)는 다수 개로, 시료첨가패드(20)에서부터 여러 갈래로 분기된 형태로 형성될 수도 있다. 이러한 생화학반응패드(70)의 일면에 생화학반응부(60)가 배치되므로, 생화학 마커 분석을 위한 생화학반응부(60)가 공간적으로 제약을 받지 않아서 다중 생화학 마커의 분석이 용이하다.
한편, 항원-항체 반응 후 세척과정이 필요한데, 본 발명에 따른 생화학-면역 하이브리드 바이오센서는 2차원 면역 크로마토그래피 분석 과정을 이용하여 이를 간편하게 수행할 수 있는바, 이하에서 구체적으로 설명한다.
도 5는 본 발명의 또 다른 실시예에 따른 생화학-면역 하이브리드 바이오센서의 반응스트립을 도시한 사시도이다.
도 5에 도시된 바와 같이, 본 발명에 따른 생화학-면역 하이브리드 바이오센서는 기질첨가패드(200), 및 기질흡수패드(300)를 더 포함할 수 있다. 여기서, 기질첨가패드(200)는 외부에서 주입된 기질을 흡수하는 세공성 멤브레인으로 형성되고, 시료이송패드(10)의 일측에 인접 배치된다. 한편, 기질흡수패드(300)는 시료이송패드(10)의 타측에 배치되므로, 기질첨가패드(200)의 기질은 시료이송패드(10)를 가로질러, 즉 시료이송패드(10)의 폭 방향으로 이동하여 기질흡수패드(300)에 흡수된다. 이때의 기질의 이동을 수평흐름(가로흐름)으로 정의한다. 한편, 2차원 면역 크로마토그래피 분석 과정에서 기질흡수패드(300)가 교체되므로, 카트리지(400)는 기질흡수패드(300)가 안착되는 안착부위에서부터 용이하게 탈착되도록 형성될 수 있다.
이하에서 2차원 면역 크로마토그래피 분석 과정에 대해서 설명한다. 특히 패혈증 진단 마커 중 PCT는 CRP에 비해 100배 이상 낮은 농도로 혈액에 존재하므로, 고감도 진단을 위해서 다중분자를 다발 형태로 제조한 효소 신호체를 이용할 수 있다. 이때, 효소 신호체는 HRP일 수 있다. 이를 위해, 시료를 먼저 비오틴(biotin)이 중합된 항-PCT 항체와 혼합한 후, 시료를 시료주입구(430)를 통해 주입하면, 시료는 시료이송패드(10)를 따라 이동하여 면역반응부(50)의 포획항체(51)와 반응하여 면역 복합체를 형성한다. 그리고 난 후에, 카트리지(400)를 관통하여 형성된 기질주입구를 통해, 스트렙타아비닌(streptavidin)이 중합된 효소다발신호체와 HRP가 표지된 항-CRP 항체를 순차적으로 주입하여 1차 수평흐름(cross-flow)을 유도한다. 이때, 그 혼합물은 면역 복합체 성분들과 반응하여 효소 신호체가 포함된 샌드위치 복합체를 형성한다. 그 후에, 기질흡수패드(300)를 새 것으로 교환하고, 기질주입구를 통해 HRP 발색기질을 공급하면 2차 수평흐름이 발행되고, 이에 따라 PCT와 CRP를 측정하는 면역반응부(50)에서부터 효소반응을 통해 각각 발색신호가 나타난다.
이때, 수평흐름 과정에 의해 생화학 반응이 영향을 받지 않도록, 전술한 바와 같이(도 3 참조), 단일 유체흐름 스트립의 생화학반응패드(70)와 시료이송패드(10) 사이에 빈 공간, 즉 유격(G)이 형성되도록 생화학반응패드(70)가 배치된다. 여기서, 생화학반응패드(70)의 가장자리에 생긴 빈 공간이 모세관 현상에 대한 차단벽으로 작용하여, 수평흐름 기질액이 생화학반응부(60)로 흐르는 것을 방지할 수 있다.
한편, 본 발명에 따른 생화학-면역 하이브리드 바이오센서에 의해 탐지된 바이오마커의 정량분석은 스마트기기 기반의 신호 탐지 시스템을 이용해 현장에서 검출과 동시에 분석이 이루어지는바, 그 시스템에 대해 설명한다.
도 6은 본 발명의 실시예에 따른 생화학-면역 하이브리드 바이오센서를 포함하는 센서시스템을 도시한 사시도이다.
도 6에 도시된 바와 같이, 본 발명의 실시예에 따른 센서시스템은 생화학-면역 하이브리드 바이오센서(1000), 면역반응부(50, 도 1 내지 도 5 참조) 및/또는 생화학반응부(60, 도 1 내지 도 5 참조)의 발색신호 이미지를 캡쳐할 수 있는 카메라가 내장된 스마트기기(2000); 및 생화학-면역 하이브리드 바이오센서(1000)가 삽입되는 슬롯(3100)을 구비하고, 스마트기기(2000)를 거치하는 스마트기기 홀더(3000)를 포함한다.
본 발명에 따른 센서스템은 생화학-면역 하이브리드 바이오센서(1000), 스마트기기(2000), 및 스마트기기 홀더(3000)를 포함한다. 여기서, 생화학-면역 하이브리드 바이오센서(1000)는 상술한 바이오센서이므로, 자세한 설명은 생략한다. 스마트기기(2000)는 스마트폰, 태블릿, 노트북 등과 같이, 기능이 제한되지 않고 어플리케이션 등의 응용 프로그램을 통해 상당 부분 기능을 변경하거나 확장할 수 있는 제품을 의미한다. 이때, 스마트기기(2000)에는 카메라가 내장되고, 그 카메라의 렌즈는 면역반응부(50) 및/또는 생화학반응부(60)와 서로 마주보도록 배치되어, 발색신호 이미지를 캡쳐할 수 있다. 이러한 스마트기기(2000)와 생화학-면역 하이브리드 바이오센서(1000)는 스마트기기 홀더(3000)에 의해 고정되므로, 스마트기기 홀더(3000)는 스마트기기(2000)가 거치되는 거치대, 및 생화학-면역 하이브리드 바이오센서(1000)가 삽입되는 슬롯(3100)을 구비한다. 이때, 슬롯(3100) 내에 삽입된 생화학-면역 하이브리드 바이오센서(1000)는 커버(5000)에 의해 고정될 수 있다.
이때, 본 발명에 따른 센서시스템은 초점조절렌즈(4000)를 더 포함할 수 있다. 여기서, 초점조절렌즈(4000)는 카메라의 초점 거리를 조절하므로, 카메라와 면역반응부(50) 및/또는 생화학반응부(60) 사이에 배치되어, 발색신호 이미지의 해상도를 향상시킬 수 있다.
한편, 스마트기기 홀더(3000)에는 광원이 배치될 수 있다. 여기서, 광원은 예를 들어 LED 전구를 사용할 수 있고, 스마트기기(2000)가 거치대에 거치되면 자동으로 점등된다. 이때, 생화학반응 및 면역반응에 의해 발색신호를 나타내는 생화학-면역 하이브리드 바이오센서(1000)가 슬롯(3100)에 삽입되고, 카메라를 통해 발색신호를 이미지로 캡쳐한다.
여기서, 캡쳐된 이미지는 디지털 데이터로 변화하여, 정량분석을 위한 자료로 활용될 수 있다. 이때, 디지털 데이터로의 변환은 스마트기기(2000)의 어플리케이션에 의해 이루어질 수 있다.
종합적으로, 본 발명에 따른 센서시스템에 의하면, 스마트기기(2000)를 기반으로 하는 측정 및 분석 시스템을 구축하여, 편리하고 경제적으로 현장에서 특정 질환의 진단 및 정량분석에 운용될 수 있다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하기로 한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 예시하기 위한 것이므로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것은 아니다.
도 7은 포획항체의 종류에 따른 반응 특이성을 나타내는 그래프, 도 8은 sandwich ELISA 신호발생원으로 SA-HRP 다발 중합체및 SA-HRP 단일 중합체를 사용한 경우의 PCT 농도에 따른 신호 세기를 나타내는 그래프이고, 도 9는 본 발명에 따른 생화학-면역 분석용 멤브레인 반응스트립을 제조하는 과정을 나타낸 공정도이며, 도 10은 본 발명에 따른 생화학-면역 하이브리드 바이오센서의 발색기질 농도 별 젖산 농도응답 그래프이다. 또한, 도 11은 본 발명에 따른 생화학-면역 하이브리드 바이오센서의 반응시간별 젖산 농도응답 그래프, 도 12는 본 발명에 따른 생화학-면역 하이브리드 바이오센서의 최적조건 하에서의 젖산 농도응답 그래프 및 젖산 농도응답 곡선이고, 도 13은 본 발명에 따른 생화학-면역 하이브리드 바이오센서의 최적조건 하에서의 CRP 농도응답 그래프 및 CRP 농도응답 곡선이며, 도 14는 본 발명에 따른 생화학-면역 하이브리드 바이오센서의 최적조건 하에서의 PCT 농도응답 그래프 및 PCT 농도응답 곡선이다.
도 15는 본 발명에 따른 생화학-면역 하이브리드 바이오센서를 이용한 PCT, CRP, 및 젖산에 대한 분석을 동시에 수행한 결과 그래프이다.
실험 재료
본 발명의 실시예를 위해 사용된 재료 및 구입처는 다음과 같다. 인간 프로칼시토닌 표준 시료 (Human PCT standard sample), 항-인간 PCT 단일클론항체 (클론 16B5및 42) 및 항-인간 CRP 단일클론항체 (클론 C2 및 C6)은 Hytest 사(핀란드)에서 구입하였다. 인간 CRP 표준 시료는 Cliniqa 사(미국)로 부터 구입하였다. 염소 항-마우스 IgG 항체, sulfosuccinimidyl-6-[biotinamido]-6-hexanamido hexanoate (NHS-LC-LC biotin) 및 dithiothreitol (DTT)는 ThermoFisher Scientific 사(미국)로부터 구입하였다. 나트륨, L-젖산, pediococcus 종의 젖산 분해효소(LOX), potassium iodide, casein, 인산 나트륨 일 염기, 인산 나트륨, Tween20, 나트륨 아세테이트, 염화 나트륨, 과산화수소, tetramethyl benzidine(TMB)은 Sigma 사(미국)로부터 구입하였다. 셀룰로오스 맴브레인(17 CHR Chromatography grade) 및 셀룰로스 크로마토 그래피 페이퍼 (grade1Chr)는 Whatman 사(영국) 로부터 구입하였다. 글래스 멤브레인 (PT-R5) 및 샘플 애플리케이션 패드 (등급 319)는 MDI (Gurgaon, India)으로부터 구입하였다. Horseradish peroxidase (HRP), 맴브레인용-TMB (TMBM), streptavidin-poly HRP20 및 니트로 셀룰로오스 맴브레인 (HiFlowPlus HFB13504)는 Calbiochem(미국), Moss(미국), Fitzgerald(미국) 및 Millipore(미국)으로부터 각각 구입하였다. 그 외 모든 시약들은 분석용 급으로 사용하였다.
실시예 1. 항체의 특이 반응성 특성화
교차 반응성 테스트를 하기 위해, CRP 혹은 PCT 표준 물질을 10 mM phosphate buffered saline(10 mM PBS)용액을 사용하여 5 νg/mL의 농도로 각각 희석하였다. 그 후 5 μg/mL의 농도로 각각 희석된 CRP 혹은 PCT 표준 물질을 microwell에 100 μL 씩 분주하여 37℃에서 2시간 동안 코팅하였다. 반응하지 않은 표준 물질은 탈이온수(deionized water, DIW)로 3회 씻어주었다. 그 후 표준 물질이 코팅되지 않은 microwell의 잔여 표면을 코팅하기 위해 10 mM PBS로 희석된 0.5% casein 용액을 microwell에 200 μL 분주하여 37℃에서 2시간 동안 처리하였다. 잔여 casein은 DIW로 3회 씻어냈다. CRP 혹은 PCT 표준 물질에 대한 단일클론 항체는 0.5% casein PBS 용액에 0.1% tween 20의 농도가 되도록 첨가한 버퍼(casein PBS-TW)로 희석하여 microwell에 1 μg/mL의 농도로 100 μL씩 각각 분주하였다. 그 후 항원-항체 반응이 일어나도록 37 ℃에서 1시간 동안 반응시켜 주었다. 반응하지 않은 CRP 및 PCT 표준 물질에 대한 단일 클론 항체를 DIW로 3회 씻어 냈다. 그 후 0.5 μg/mL 농도의 HRP가 결합된 염소 항-생쥐 항체를 casein PBS-TW용액으로 희석하여 microwell에 100 μL 씩 분주하였고 37℃에서 1시간 동안 반응시켰다. 반응하지 않은 HRP가 결합된 염소 항-생쥐 항체는 DIW로 3회 씻어냈다. 신호발생을 위해 효소기질(50 mM sodium acetate: 1%(w/v) TMB: 3%(w/v) hydrogen peroxide = 1000: 10: 1)을 microwell에 200 μL씩 분주하였고, 15분 동안 발색을 유도하였다. 그 후 각각의 microwell에 2 M 황산용액을 50 μL 씩 첨가하였고, micro plate reader(SynergyTM H4, BioTek Inc; Winooski, VT)를 사용하여 450 nm의 파장에서 광학 밀도를 측정하였다.
위의 분석과정 따라 indirect ELISA 방법을 이용해서 면역에서 가장 중요한 요소 중 하나인 특이도 테스트를 진행하였고, 각각의 CRP 및 PCT 항원을 microwell 표면에 코팅하고 캡쳐 항체(항-CRP 혹은 항-PCT), HRP가 중합된 탐지항체(항-생쥐)를 순차적으로 반응시켜 주었다. 그 결과 CRP 분석을 위한 두 항체 (clone; C2, C6)와 PCT 분석을 위한 두 항체(clone; 16B5, 42)를 사용했을 때, 분석물질인 CRP 및 PCT에 대한 특이도가 매우 높았고 항원에 대한 다른 항체의 배경 신호가 발생하지 않는 것으로 보아 교차 반응 또한 존재하지 않음을 확인할 수 있었다(도6 참조). 따라서, CRP 및 PCT 표준 물질에 대한 면역 분석을 동시에 수행할 때 교차 반응이 존재하지 않을 것이라고 판단하였다.
실시예 2. 항-PCT 항체-biotin linker의 중합
Biotin linker(NHS-LC-LC biotin)의 succinimidyl 잔기는 항체에 존재하는 일차 아민과 반응하여, biotin이 중합된 안정한 항체 중합체를 형성할 수 있다. 10 mM PBS로 희석된 항-PCT 단일클론 항체 400 μg을 20배 몰량의 NHS-LC-LC biotin과 혼합하여 상온에서 2시간 동안 반응시켰다. 반응하지 않은 잔여 NHS-LC-LC biotin은 Sephadex G-15 column(volume 10 mL)을 이용한 size exclusion gel chromatography로 제거하였다. 그 후 항체-biotin 중합체를 10 mM PBS로 두 번 희석하였고, VivaspinTM을사용하여 원심분리를 통한 농축을 하였다. 이렇게 생성된 항체-biotin 중합체(1.5 mg/mL)는 사용할 때까지 4℃에서 보관하였다.
실시예 3. Streptavidin-효소(HRP)의 중합
Streptavidin을 30배 몰량의 DMSO에 녹아져 있는 SMCC linker와 상온에서 2시간 동안 반응시켜 중합시켰다. 과량으로 사용된 SMCC linker는 size exclusion gel chromatography(Sephadex G-15)로 제거하였다. HRP는 25배 몰량의 sulfo-LC-SPDP 링커와 반응시켰고, DTT 환원(최종 10 mM)을 통해 활성화 시켰다. 잔여한 링커와 DTT는 Sephadex G-15 컬럼을 통해 분리하였다. 그 후 SMCC 링커와 중합된 streptavidin을 10배 몰량의 활성화된 HRP와 상온에서 4시간 동안 반응시켰다. 이렇게 중합된 중합체는 최종 농도로 50% glycerol과 혼합하여 -20℃에서 보관하였다.
실시예 4. 항-CRP 항체-효소(HRP)의 중합
생쥐 유래 항-CRP 단일클론 항체 (clone C2)와 HRP의 중합은 위에서 언급한 방법과 동일하게 수행하였다. 항-CRP 항체를 30배 몰량의 DMSO에 녹아져 있는 SMCC linker와 상온에서 2시간 동안 반응시켜 중합시켰다. 과량으로 사용된 SMCC linker는 size exclusion gel chromatography(Sephadex G-15)로 제거하였다. HRP는 25배몰량의 sulfo-LC-SPDP 링커와 반응시켰고, DTT 환원(최종 10 mM)을 통해 활성화 시켰다. 잔여한 링커와 DTT는 Sephadex G-15 컬럼을 통해 분리하였다. 그 후 SMCC 링커와 중합된 항-CRP 항체를 10배 몰량의 활성화된 HRP와 상온에서 4시간 동안 반응시켰다. 이렇게 중합된 중합체는 최종 농도로 50% glycerol과 혼합하여 -20℃에서 보관하였다.
실시예 5. 생화학-면역 분석용 멤브레인 반응스트립의 준비
하이브리드 바이오센서는 항원-항체 반응 기반의 면역분석 및 효소반응 기반의 생화학 분석을 동시에 수행할 수 있는 다섯 가지의 기능성 멤브레인으로 구성되어 있다(도 1 및 도 4 참조). Glassfiber 멤브레인(4 x 17 mm, grade 319), polyester 멤브레인(4 mm × 10, PT-R5), 니트로 셀룰로오스 멤브레인(4 × 25mm; HF13504) 및 셀룰로스 멤브레인(4 × 15 mm, 17 CHR)이 시료첨가패드, 중합체패드, 시료이송패드 그리고 시료흡수패드로 각각 사용했다.
도 9를 참고로, 생화학반응패드는 셀룰로오스 크로마토그래피 페이퍼(2 × 3 mm + R = 1.5 mm, grade 1 Chr)를 성형하여 제조하였는데, 이때 셀룰로오스 크로마토그래피 멤브레인을 AutoCAD 프로그램을 사용하여 일정 모양으로 패턴닝한 후, CO2 laser(VLS 2.30 universal laser)로 절단하여 생화학반응패드를 제작하였다(pixel per inch: 500, laser power: 10% and head speed: 50%).
단일 유체흐름 스트립의 경우, 생화학반응패드가 시료이송패드의 수용부 내에 배치되는바, 동일한 프로그램을 이용하여, 수용부가 형성되는 시료이송패드의 일단쪽 영역을 소정의 패턴으로 디자인하였다. 이때, 생화학반응패드의 가장자리와 수용부의 내면 사이에 유격이 형성되도록, 수용부의 패턴은 생화학반응패드보다 0.25㎜ 정도 크게 디자인했다. 그 디자인 패턴에 따라 CO2 laser로 에칭하여 패턴부분의 니트로 셀룰로우즈를 제거함으로써, 플라스틱 지지판을 돌출시켜 수용부를 형성한 후, 생화학반응패드를 시료이송패드의 일단에 맞추어 수용부 내에 위치시키고, 플라스틱 지지판에 양면 테이프로 붙였다. 이때, 시료이송패드의 수용부의 내면과 생화학반응패드 사이에 약 0.25㎜ 간격의 빈 공간이 형성되었다.
CRP 및 PCT에 대한 각각의 포획항체를 고정화하기 위해, 항-PCT 항체(1 mg/mL)와 항-CRP 항체(0.5 mg/mL)를 3% trehalose가 포함된 100 mM PB 버퍼로 희석하여 micro-dispenser(BioJet 3000, Biodot, Irvine, CA)를 이용하여 니트로 셀룰로오스 맴브레인 위에 독립적으로 도포 하였다(1.5 μL/cm). 염소 유래 항-생쥐 항체 (0.2 mg/mL)는 대조군으로 사용되었으며 micro-dispenser를 이용해 니트로 셀룰로오스 멤브레인에 도포하였다. 포획항체의 도포된 위치는 아래로부터 항-CRP 항체, 항-PCT 항체, 염소 유래 항-생쥐 항체이다. 그 후 멤브레인을 37℃에서 1시간 동안 건조시키고 사용할 때까지 건조 상자에 보관하였다. 중합체패드를 제작하기 위해 biotin이 결합된 항-PCT 항체(0.1 mg/mL)를 3% trehalose가 첨가된 100 mM PB 버퍼에 희석한 후 도포하고, 37℃에서 1시간 동안 건조시켰다. 생화학 반응을 수행하기 위해 lactate oxidase(LOX), horseradish peroxidase(HRP) 그리고 potassiumiodide로 구성되어 있는 효소-기질 혼합물을 생화학 분석용 반응층(셀룰로오스 크로마토그래피 페이퍼)에 도포하였다. 위에서 준비된 기능성 맴브레인들은 각 멤브레인들을 부분적으로 겹치게 하여 조립하였다.
실시예 6. 하이브리드 바이오센서 카트리지의 구성
하이브리드 바이오센서를 위한 플라스틱 카트리지(WLH 76 X 32 X 8 mm)는 투명 polycarbonate 재질의 상판과 하판으로 구성되어 있다(도 1 및 도 4 참조). 하판은 두 개의 채널로 형성되어 있다. 첫 번째 채널은, 세로 방향으로 유체의 흐름이 발생하는 반응스트립을 고정시켜 주는 수직방향으로 형성된 채널이다. 두 번째 채널은, 시료이송패드를 통해 HRP가 중합된 항-CRP항체와 SA-HRP 폴리머 및 발색기질을 공급할 수 있는 수평방향의 채널이다. 상판은 생화학 분석 및 면역 분석의 결과로 발생한 발색을 관찰할 수 있는 창이 존재하고, 샘플과 기질 용액을 공급할 수 있는 주입구가 존재한다. 조립된 생화학-면역 동시 분석용 하이브리드 멤브레인 반응스트립은 세로흐름 채널 내에 배치하였고, 교차흐름(cross-flow)를 유도할 수 있는 흡수패드(13 x 10.5 mm, 17 CHR)를 수직채널 내에 함께 배치하였다. 그 후 접착 없이 바닥판과 상판을 조인트를 통해 단단히 결합시키고, 사용할 때까지 실온의 건조기 내에 보관하였다.
실시예 7. Hybrid EOC 측정용 스마트폰 플라스틱 홀더의 제작
스마트폰(WLH is 150.2 x 76.1 x 9.4mm, G-pro, LG electronics)에 맞는 플라스틱 홀더를 만들기 위해, 드로잉 프로그램(SolidworksTM, version 2012)을 이용하여 hybrid EOC 카트리지(WLH is 170 x 40 x 43 mm)가 삽입될 수 있는 플라스틱 홀더를 설계하였다. 그 후 ABS 수지를 재료로 하는 3D-pinter(MakerBot Replicator 2)를 이용하여 플라스틱 홀더를 제작하였다. Hybrid EOC 카트리지에 일정량의 빛을 제공하기 위해 AA 사이즈의 배터리를 사용하는 백색 LED 조명을 플라스틱 홀더 내부에 장착하였다.
실시예 8. 젖산 분석 조건 확립
젖산 분석을 위한 최적 조건을 확립하기 위해 LOX, HRP, 그리고 potassium iodide의 양을 반응 시간에 따라 조정하였다. 효소 복합체(LOX, HRP)와 발색기질(potassium iodide)의 농도를 각각 200 - 1500 units/mL 그리고 0.6 - 1.8 M 농도로 변화시키며 관찰하였다. 최적의 반응 시간은 35 분까지 테스트하여 조정하였다. 이러한 양적 변수들의 측정은 레이저 패터닝된 셀룰로오스 크로마토그래피 페이퍼에 0.5% BSA와 1% trehalose로 희석된 효소 복합체(0.3 μL)와 발색기질(0.3 μL)을 37℃에서 1시간 동안 건조하여 수행하였다. 효소-기질의 생화학 반응에 의해 생성된 신호는 스마트폰에 설치된 이미지 분석기를 통해 정량적으로 분석되었다.
도 1의 '단일 유체흐름 스트립'모델을 이용하여, 효소 복합체의 최적 농도를 600 unit/mL로 결정할 수 있었다. 효소 복합체의 농도가 낮거나 높을 경우 신호세기가 감소되거나 비특이 신호가 발생될 수 있다. 또한, 효소 복합체의 최적 농도에서 발색신호를 조절하는 다른 인자로서 발색기질인 potassium iodide 최적 농도를 1.2 M로 결정할 수 있었다(도8 참조). 이와 같은 최적 조건 하에서, 젖산 분석의 최적 반응시간은 반응 개시 후 25분인 것으로 나타났다(도 11 참조). 최적조건을 바탕으로 젖산농도 변화에 대한 하이브리드 바이오센서의 농도응답을 구한 결과, 농도 변화에 비례한 신호를 측정하여 농도응답 곡선을 구하였고, 로짓-로그(logit-log) 전환을 통해 그래프를 선형화할 수 있었다(도 12 참조).
실시예 9. CRP 및 PCT 면역분석 조건 확립
패혈증 진단용 두 단백질 마커 즉, CRP 및 PCT에 대한 각 단일 면역분석 시 그 분석성능을 시험하였다. 각 표준물질(30 mg/mL CRP 및 10 νg/mL PCT)을 인간 혈청으로 연속 희석하여 CRP에 대해 0.01 - 500 νg/mL 그리고 PCT에 대해 0.01 - 10 νg/mL 농도 범위로 표준 시료를 제조하였다. 각 시료(100 νL)를 바이오센서 카트리지의 시료첨가 패드에 첨가한 후 15분 간 수직흐름을 유지하였다. 그 후, CRP에 대해 HRP-중합 항-CRP 항체(0.025 νg/mL) 혹은 PCT에 대해 streptavidin-poly HRP20(0.066 ng/mL)을 0.5% casein 및 0.1% tween이 함유된 PBS(Casein-PBS-Tw; 200 νL) 용액에 용해시켰고, 즉시 카트리지의 가로흐름 기질용액 주입구에 첨가하였다. 가로흐름을 5분 간 유지한 후, HRP 효소기질 용액(200 νL)을 공급하였고 5분 간 추가 반응시간을 유지하였다.
하이브리드 바이오센서를 이용한 CRP와 PCT에 대한 각 면역분석 최적조건 하에서 바이오센서의 농도응답을 구한 결과, CRP의 경우, 임상 농도범위(0.1-100 νg/mL)에서 농도에 비례한 신호가 발생되는 것을 알 수 있었다(도 13 참조). 또한, 로짓-로그(logit-log) 전환을 통해 그래프를 선형화할 수 있었는데, 이를 통해 개발된 하이브리드 바이오센서는 CRP의 임상분석에 사용될 수 있는 것으로 나타났다. PCT의 경우에도, 위와 같은 방법을 통해 PCT의 농도응답 범위는 패혈증에서의 PCT 마커 임상농도 범위인 0.1 - 10 ng/mL 농도범위를 포함하였으므로 개발된 하이브리드 바이오센서는 PCT의 임상분석에 사용될 수 있는 것으로 나타났다(도 14 참조).
실시예 10. 동일 시료 내 CRP, PCT, 그리고 젖산 농도의 동시 분석
하이브리드 바이오센서를 포함하는 센서시스템을 이용하여 CRP, PCT, 그리고 젖산의 3가지 바이오마커에 대한 동시 분석을 수행하기 위해, 각각의 바이오마커에 대한 표준물질이 동일 인간혈청 시료 내 농도 별(PCT: 0.01-10 ng/mL; CRP: 0.1-500 νg/mL; 및 젖산: 9-144 mg/dL)로 포함되도록 제조하였다. 이들 3가지 바이오마커를 포함하는 시료 용액(100 μL)을 시료첨가 패드에 분주하였고 15분 동안 세로흐름을 유지하였다. 세로흐름 동안 생화학 분석용 반응층에서는 젖산 분석을 위한 효소-기질 반응이 수행되었고 그 농도에 따라 발색이 나타났다. 그 후 casein-PBS-Tw 용액에 희석된 HRP-중합 항-CRP 항체와 streptavidin-poly HRP20(0.066 ng/mL)을 가로흐름 기질용액 주입구에 분주하였고 5분 간 반응시켰다. 신호발색 발생을 위해 TMBM 기질(200 μL)을 다시 기질 주입구에 분주하였고, 5분 동안 발색 반응을 수행하였다.
세 가지 마커에 대한 농도응답 곡선을 분석한 결과, 신호는 각 마커 농도에 비례하여 증가하는 것으로 나타났고, 각 농도에 대한 신호세기는 각기 구별되었다(도 15 참조). 정량 분석을 위해 로그-로짓 변환을 통해 선형 그래프로 변환하였고, 이를 통해 하이브리드 바이오센서 시스템을 이용한 분석을 통해 미지 시료에 존재하는 세 가지 바이오마커 농도에 대한 정량분석이 동시에 가능한 것으로 나타났다.
이상 본 발명을 구체적인 실시예를 통하여 상세히 설명하였으나, 이는 본 발명을 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명은 이에 한정되지 않으며, 본 발명의 기술적 사상 내에서 당 분야의 통상의 지식을 가진 자에 의해 그 변형이나 개량이 가능함이 명백하다.
본 발명의 단순한 변형 내지 변경은 모두 본 발명의 영역에 속한 것으로 본 발명의 구체적인 보호 범위는 첨부된 특허청구범위에 의하여 명확해질 것이다.
1: 시료 10: 시료이송패드
20: 시료첨가패드 30: 시료흡수패드
40: 중합체패드 41: 탐지항체
43: 신호표지자 50: 면역반응부
51: 포획항체 60: 생화학반응부
70: 생화학반응패드 100: 반응스트립
200: 기질첨가패드 300: 기질흡수패드
400: 카트리지 410: 수용공간
420: 탐지창 430: 시료주입구
1000: 생화학-면역 하이브리드 바이오센서 2000: 스마트기기
3000: 스마트기기 홀더 3100: 슬롯
4000: 초점조절렌즈

Claims (12)

  1. 모세관 현상에 따라 시료를 이동시키는 세공성 멤브레인으로 형성된 반응스트립을 포함하되,
    상기 반응스트립은,
    소정의 길이를 갖고, 일단으로부터 타단 방향으로 상기 시료를 이송시키는 시료이송패드;
    외부에서 주입된 상기 시료를 흡수하는 시료첨가패드;
    상기 시료 내의 단백질 마커와 특이적으로 결합하는 탐지항체 및 상기 단백질 마커에 따라 면역반응 발색신호를 발생시키는 신호표지자를 포함하고, 상기 시료이송패드의 일단과 상기 시료첨가패드를 서로 연결하는 중합체패드;
    상기 단백질 마커와 특이적으로 결합하는 포획항체를 포함하고, 상기 시료이송패드 상(on)에 적어도 하나 이상 형성되는 면역반응부;
    생화학반응 발색신호를 발생시키는 발색기질 및 상기 시료 내의 생화학 마커로부터 상기 발색기질과 반응하는 반응물을 생성하는 적어도 하나 이상의 효소를 포함하고, 상기 시료이송패드와 공간적으로 분리되며, 상기 시료이송패드, 상기 시료첨가패드, 및 상기 중합체패드 중 적어도 어느 하나 이상으로부터 상기 시료를 공급받아, 상기 면역반응부에서의 반응과 독립적으로 반응하는 생화학반응부; 및
    상기 시료이송패드의 타단에 배치되고, 상기 시료이송패드를 따라 이송된 상기 시료를 흡수하는 시료흡수패드;
    를 포함하는 생화학-면역 하이브리드 바이오센서.
  2. 청구항 1에 있어서,
    상기 생화학반응부는
    적어도 하나 이상 형성되는 생화학-면역 하이브리드 바이오센서.
  3. 청구항 1에 있어서,
    상기 반응스트립은
    상기 시료이송패드, 상기 시료첨가패드, 및 상기 중합체패드 중 적어도 어느 하나 이상으로부터 외측으로 연장되고, 일면에 상기 생화학반응부가 배치되는 적어도 하나 이상의 생화학반응패드;
    를 더 포함하는 생화학-면역 하이브리드 바이오센서.
  4. 청구항 1에 있어서,
    상기 중합체패드는 상기 시료이송패드의 일단 상에 적층되고,
    상기 시료첨가패드는 상기 중합체패드 상에 적층되며,
    상기 시료흡수패드는 상기 시료이송패드의 타단 상에 적층되는 생화학-면역 하이브리드 바이오센서.
  5. 청구항 1에 있어서,
    상기 면역반응부는 다수 개이고,
    각각은 서로 다른 상기 단백질 마커와 일대일로 결합되도록, 서로 다른 상기 포획항체를 포함하는 생화학-면역 하이브리드 바이오센서.
  6. 청구항 1에 있어서,
    상기 단백질 마커는 C 반응성 단백질(C-reactive protein, CRP), 및 프로칼시토닌(procalcitonin, PRT)이고,
    상기 생화학 마커는 젖산이며,
    상기 효소는 락데이트 옥시다아제(lactate oxidase, LOX), 및 겨자무과산화효소(horseradish peroxidase, HRP)이고,
    상기 발색기질은 아이오딘화칼륨(potassium iodide)이며,
    폐혈증을 진단하는 생화학-면역 하이브리드 바이오센서.
  7. 청구항 1에 있어서,
    상기 시료이송패드의 일측에 인접하고, 외부에서 주입된 기질을 흡수하는 기질첨가패드; 및
    상기 시료이송패드의 타측에 인접하여, 상기 시료이송패드를 가로질러 이송되는 상기 기질을 흡수하는 기질흡수패드;
    를 더 포함하는 생화학-면역 하이브리드 바이오센서.
  8. 청구항 1에 있어서,
    내부에 상기 반응스트립이 배치되는 수용공간, 상기 면역반응부 및 상기 생화학반응부가 노출되도록 천공된 탐지창, 및 상기 시료첨가패드에 상기 시료를 주입할수록 천공된 시료주입구를 구비하는 카트리지;
    를 더 포함하는 생화학-면역 하이브리드 바이오센서.
  9. 청구항 1 내지 청구항 8 중 어느 한 항에 따른 생화학-면역 하이브리드 바이오센서;
    상기 면역반응부 또는 생화학반응부의 발색신호 이미지를 캡쳐할 수 있는 카메라가 내장된 스마트기기; 및
    상기 생화학-면역 하이브리드 바이오센서가 삽입되는 슬롯을 구비하고, 상기 스마트기기를 거치하는 스마트기기 홀더;
    를 포함하는 센서시스템.
  10. 청구항 9에 있어서,
    상기 스마트기기 홀더에 배치되어 광을 조사하는 광원;
    을 더 포함하는 센서시스템.
  11. 청구항 9에 있어서,
    이미지로 캡쳐된 상기 발색신호는 상기 스마트기기의 어플리케이션에 의해 디지털 데이터로 변환되는 센서시스템.
  12. 청구항 9에 있어서,
    상기 카메라와 상기 면역반응부 또는 생화학반응부 사이에 배치되어, 상기 카메라의 초점 거리를 조절하는 초점조절렌즈;
    를 더 포함하는 센서시스템.
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