CN113125734A - 一种直接竞争elisa法快速检测afb1的方法及其试剂盒 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种直接竞争ELISA法快速检测AFB1的方法及其试剂盒，属于黄曲霉素B1检测领域。本发明成功制备了抗原和单克隆抗体，并建立了直接竞争ELISA法，该方法能检测木薯粉和木薯制品如木薯饼干、木薯蛋糕、木薯粉条、木薯面条等样品中的AFB1，也能检测其他粮食样本中的AFB1。该方法具有灵敏度高、操作简单、快速、准确、可批量检测样本等特点，易于被企业和基层检测人员掌握和应用。该检测方法为食品中AFB1污染筛查提供快速检测技术，为食品的加工利用和产业化推广提供理论依据和技术支撑。

Description

一种直接竞争ELISA法快速检测AFB1的方法及其试剂盒
技术领域
本发明涉及黄曲霉素B1检测领域，具体涉及一种直接竞争ELISA法快速检测AFB1的方法及其试剂盒。
背景技术
黄曲霉毒素(Aflatoxins)是黄曲霉菌及曲霉寄生菌族类产生的一类结构类似物的总称，在各种粮食、食品、和饲料中广泛存在，且理化性质稳定，现有的农业技术和食品加工工艺无法避免和消除污染。其中黄曲霉毒素B1(Aflatoxin B1,AFB1)毒性和“三致”(致癌、致畸、致突变)均居首位。欧盟规定AFB1含量不得高于2μg/kg，我国国家标准规定粮食中AFB1含量不得超过5μg/kg，特殊膳食用食品不得超过0.5μg/kg(GB 2761-2017)。
木薯是一种重要的块根粮食作物，世界木薯全部产量的65％左右用于人类食物。中国是世界木薯第一进口大国，我国现行国家标准GB 5009.22-2016第五法中AFB1在薯干中的检出限是5μg/kg。因此，制备抗原和单克隆抗体，利用ELISA抗原抗体特异性结合的免疫学检测原理，建立高灵敏度的检测方法检测木薯粉及其制品中AFB1，对木薯粉及其食品制品的推广和木薯食用化利用有重要的意义。
检测AFB1含量的方法主要是液相色谱法、液相色谱-串联质谱法等仪器方法和ELISA、免疫层析试纸条等快速检测方法。仪器方法虽然灵敏、准确，但仪器昂贵，耗时长等，不能满足基层对大量样本的筛查。ELISA利用抗原抗体特异性结合的原理，具有灵敏度高、通量大、耗时短、成本低等优点，被广泛应用于源头监测和成规模的样本筛查。如蒋佳伊等(2020)用ELISA检测中药中AFB1，线性范围0.05～0.58μg/kg，检测限达1.69μg/kg，与UHPLC-MS/MS检测结果符合良好；真菌毒素污染广泛，王国强等(2019)对来自不同省份的饲料及其原料检测发现所有样本都有被污染，同时被三种以上毒素污染的样本高达76.55％；在喀麦隆、坦桑尼亚、尼日利亚等有木薯中检测出AFB1的报道；虽然国内外己有AFB1的很多快速检测产品出现，但是目前黄曲酶素B1的酶联免疫分析方法的精密度较低，且没有针对木薯粉等粮食及其制品样品进行分析的方法。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的缺点，提供一种灵敏度高、操作简单、快速、准确的直接竞争ELISA法检测AFB1的方法；
本发明的另一目的在于提供一种直接竞争ELISA法快速检测AFB1的试剂盒。
本发明的目的通过以下技术方案来实现：一种直接竞争ELISA法快速检测AFB1的方法，它包括以下步骤：
S1、样本处理：将样本进行烘干粉碎，过筛后准确称取样本，每克样本用5ml 70％甲醇水溶液，加样本质量10％质量的氯化钠提取，若样本不含油脂，取上清液2倍稀释后检测，若样本含油脂，取上清液加入正己烷，所述上清液和正己烷的体积比为1:0.8，震荡离心后取下层上清液2倍稀释后检测；
S2、建立标准曲线：选取0.05ng/ml抑制率50％以上、OD450值最接近2.0的AFB1抗体和AFB1-HRP酶标抗原稀释倍数作为效价，将标准品浓度倍比稀释进行竞争ELISA，以AFB1标准品浓度的对数值为横坐标，以吸光度值的logit值为纵坐标，建立ELISA标准曲线，获得线性回归方程和相关系数；
S3、检测：测定稀释后上清液的OD450并计算吸光度值的logit值，从建立的标准曲线中得出样本的AFB1含量。
进一步地，步骤S2中所述的AFB1抗体采用以下方法制备：
S21、制备抗原：合成黄曲霉素B1肟化物AFB1.O，将AFB1.O与载体蛋白BSA、OVA和HRP分别进行偶联；
S22、制备抗体：用AFB1-BSA作为免疫原皮下多点注射免疫Balb/C小鼠，AFB1-OVA作为包被原用间接竞争ELISA检测效价和抑制率，挑选效价5.0×104以上、对AFB1标准品20ng/mL抑制率50％以上的小鼠脾细胞与SP2/0细胞融合，将阳性杂交瘤细胞克隆至阳性单克隆率为100％，小鼠体内诱生腹水即为制备的单克隆抗体。
进一步地，步骤S21中用碳化二亚胺法将AFB1.O与载体蛋白BSA、OVA和HRP分别进行偶联，偶联后的产物在pH值7.2的PBS中透析48h。
进一步地，步骤S2中所述线性回归方程为y＝-3.074x-4.3066，其中R2值为0.9979。
进一步地，所述方法的检测限为0.2～4.8μg/kg
进一步地，所述AFB1来源于木薯、玉米、大豆或花生及其制品。
一种直接竞争ELISA法快速检测AFB1的试剂盒，采用上述的直接竞争ELISA法快速检测AFB1的方法。
本发明具有以下优点：本发明成功制备了抗原和单克隆抗体，并建立了直接竞争ELISA法，该方法能检测木薯粉和木薯制品如木薯饼干、木薯蛋糕、木薯粉条、木薯面条等样品中的AFB1，也能检测其他粮食样本中的AFB1。该方法具有灵敏度高、操作简单、快速、准确、可批量检测样本等特点，易于被企业和基层检测人员掌握和应用。该检测方法为食品中AFB1污染筛查提供快速检测技术，为食品的加工利用和产业化推广提供理论依据和技术支撑。
附图说明
图1为AFB1·O质谱鉴定结果图；
图2为AFB1·O质谱鉴定结果图；
图3为不同ELISA方法IC50差异图；
图4为不同处理方法对样本中AFB1添加回收率的影响图；
图5为不同浓度甲醇水溶液作为标准品稀释液对样本回收率的影响图；
图6为木薯食品原料添加回收率图；
图7为木薯糕点添加回收率。
具体实施方式
下面结合附图及实施例对本发明做进一步的描述，本发明的保护范围不局限于以下所述：
实验材料：标准品黄曲霉毒素B1(AFB1)、黄曲霉毒素B2(AFB2)、黄曲霉毒素G1(AFG1)、黄曲霉毒素G2(AFG2)、黄曲霉毒素M1(AFM1)、黄曲霉毒素M2(AFM2)、赭曲霉毒素A(OTA)、呕吐毒素(DON)、玉米赤霉烯酮(ZEN)、牛血清白蛋白(BSA)、卵清蛋白(OVA)为天津阿尔塔公司产品；AFB1 ELISA试剂盒购自河北伊莱莎生物技术有限公司；AFB1-BSA抗原、AFB1抗体购自海南亿康生物科技有限公司；小鼠抗体亚型鉴定试剂盒、辣根过氧化物酶(HRP)购自Sigma公司；氯化钠、甲醇等化学试剂购自国药集团化学试剂有限公司；Balb/C小鼠购自汕头大学医学中心；木薯全粉(Whole Cassava Flour,WCF)、木薯淀粉(Cassava Starch,CS)、木薯粉(Cassava Flour,CF)、木薯干片(Dried Cassava Chips,DCC)、木薯面条(Cassava Noodle,CN)、木薯粉条(Casssava Starch Noodles,CSN)、木薯粉酥饼(CassavaFlour Shortbread,CFS)、木薯蔓越莓饼干(Cassava Cranberry Cookies,CCC)、木薯蛋糕(Cassava cake,CC)样品参照《木薯及其食品加工技术》制作(张振文、李开绵，2019)，木薯由国家薯类加工技术研发分中心提供；玉米、大豆等为市场购买。Multiskan FC酶标仪(美国Thermo公司)；DT5-2B离心机(北京时代北利公司)；AWL-0501-B纯化仪(美国爱科浦公司)；SRY-150生化培养箱(宁波赛福公司)；MCO-18AC二氧化碳培养箱(日本三洋公司)；BDS200倒置显微镜(奥特光学公司)。
实施例1：一种直接竞争ELISA法快速检测AFB1的方法，它包括以下步骤：
S1、样本处理：将样本木薯、玉米、大豆及花生进行烘干粉碎，过筛后准确称取样本，每克样本用5ml 70％甲醇水溶液，加样本质量10％质量的氯化钠提取，将木薯取上清液2倍稀释后检测，玉米、大豆和花生各取上清液1mL加入正己烷0.8mL，震荡离心后取下层上清液2倍稀释后检测；
S2、建立标准曲线：选取0.05ng/ml抑制率50％以上、OD450值最接近2.0的AFB1抗体和AFB1-HRP酶标抗原稀释倍数作为效价，将标准品浓度倍比稀释进行竞争ELISA，以AFB1标准品浓度的对数值为横坐标，以吸光度值的logit值为纵坐标，建立ELISA标准曲线，获得线性回归方程和相关系数；所述线性回归方程为y＝-3.074x-4.3066，其中R2值为0.9979；
其中，所述的AFB1抗体采用以下方法制备：
S21、制备抗原：合成黄曲霉素B1肟化物AFB1.O，偶联用碳化二亚胺法将AFB1.O与载体蛋白BSA、OVA和HRP分别进行偶联，偶联后的产物在pH值7.2的PBS中透析48h；
S22、制备抗体：用AFB1-BSA作为免疫原皮下多点注射免疫Balb/C小鼠，AFB1-OVA作为包被原用间接竞争ELISA检测效价和抑制率，挑选效价5.0×104以上、对AFB1标准品20ng/mL抑制率50％以上的小鼠脾细胞与SP2/0细胞融合，将阳性杂交瘤细胞克隆至阳性单克隆率为100％，小鼠体内诱生腹水即为制备的单克隆抗体。
S3、检测：测定稀释后上清液的OD450并计算吸光度值的logit值，从建立的标准曲线中得出样本的AFB1含量，其中木薯的为0.38μg/kg、玉米的为0.62μg/kg、大豆的为0.51μg/kg、花生的为0.42μg/kg。
实施例2：黄曲霉毒素B1抗原抗体的制备及鉴定
2.1黄曲霉毒素B1抗原的制备及鉴定
偶联物制备：参考邓娟(2016)、孙清(2017)的方法合成黄曲霉毒素B1肟化物(AFB1.O)，经质谱扫描鉴定正确。然后用碳化二亚胺法(DCC法)将AFB1.O与载体蛋白BSA、OVA和HRP分别进行偶联，然后在PH值7.2的PBS中透析48小时，分装保存于-20℃。
偶联物鉴定：取偶联产物AFB1-BSA、AFB1-OVA、AFB1-HRP和阴性对照BSA、OVA、HRP，跟购买的AFB1-BSA抗原作为抗原包被于酶标板，同时包被PBS作为空白对照，以购买的AFB1抗体作为一抗、HRP标记的羊抗兔IgG作为二抗进行间接ELISA鉴定偶联效果。
2.1.1半抗原的鉴定
将AFB1肟化生成半抗原AFB1·O如图1所示，AFB1的分子量是321，偶联间隔臂羧甲基羟胺后，半抗原的分子量是385，半抗原做质谱鉴定，正离子峰为386，结构正确。经质谱分析有AFB1·O单体峰存在，且AFB1特征峰消失，证明该物质合成成功。
2.1.2偶联产物的ELISA鉴定
用间接ELISA鉴定载体蛋白和半抗原的偶联效果，购买的偶联抗原AFB1-BSA和偶联产物AFB1-BSA、AFB1-OVA、AFB1-HRP的OD450，跟作为阴性对照的BSA、OVA、HRP和空白对照PBS相比，远大于2.1倍，确定偶联成功。
2.2黄曲霉毒素B1单克隆抗体制备
用免疫原皮下多点注射免疫Balb/C小鼠，用免疫前的小鼠血清作为阴性对照，小鼠血清梯度稀释，分别用间接竞争ELISA检测效价和黄曲霉毒素B1、B2、M1、M2、G1、G2标准品20ng/mL对抗原抗体结合抑制的情况，挑选效价高、抑制率(刘伟伟等，2011)高的鼠，加强免疫后取小鼠脾细胞与SP2/0融合，挑选抑制率高的阳性细胞克隆至阳性单克隆率为100％，小鼠体内诱生腹水，硫酸铵纯化后-20℃分装保存。
2.3黄曲霉毒素B1单克隆抗体效价、亚型的鉴定
梯度稀释包被抗原于酶标板，梯度稀释抗体，采用间接法检测抗体效价，选择阳性孔OD值1.8-2.1之间的最高稀释倍数为抗原抗体的效价；亚型的测定参照Sigma试剂盒说明书进行检测。
2.3.1小鼠血清效价、抑制的测定
5只鼠血清检测抑制率结果如表1所示，2#鼠和3#鼠的血清在20ng/mL的抑制率都超过50％，且对其他黄曲霉类标准品交叉率也相对其他鼠高，所以挑选对标准品抑制好的2#鼠和3#鼠进行细胞融合。
表1小鼠血清检测结果
Figure BDA0003027636150000051
2.3.2单抗的效价、亚型测定结果
融合后的杂交瘤细胞经过克隆筛选，得到9株阳性单克隆细胞，7株阳性单克隆细胞体外诱导法制备的腹水效价均达到106及以上，抗体亚型均为IgG1型。9株单克隆抗体对AFB1标准品的抑制率有差别，3F2抑制率最高，所以选细胞株3F2产生的抗体用作建立间接竞争ELISA方法，抗体检测结果如表2。
表2抗体纯化后测定结果
Figure BDA0003027636150000061
实施例3：竞争ELISA检测方法的建立
3.1黄曲霉毒素B1标准曲线的建立
采用竞争ELISA棋盘方阵测定效价，选取OD450最接近2.0的抗原、抗体、酶标抗原稀释倍数作为效价，将标准品浓度倍比稀释进行竞争ELISA，以标准品浓度的对数值为横坐标，以吸光度值的logit值为纵坐标，建立ELISA标准曲线，获得线性回归方程和相关系数。
如图3所示，建立间接竞争ELISA和直接竞争ELISA都随着反应时间越长，IC50明显降低。直接竞争法更灵敏，IC50更低，更稳定，加样方法也更简单，故选取直接竞争ELISA方法体系进行后续实验。以AFB1标准品浓度的对数值作为横坐标，以吸光度值的logit值为纵坐标绘制标准曲线，当标准品AFB1浓度在0.02-0.48ng/mL时有较好的线性关系，得到的标准方程为：y＝-3.074x-4.3066，其中R2值为0.9979，灵敏度为0.02ng/mL，IC50为0.047ng/mL。
3.2单克隆抗体的特异性测定
AFB1、AFB2、AFG1、AFG2、AFM1、AFM2、OTA、ZEN、DON、BSA分别作为标准品，采用已建立的ELISA曲线进行检测，分别计算IC50，以AFB1的IC50为标准，各标准品IC50与标准品AFB1的IC50比值即为交叉反应率，比值越大，交叉反应率越高。
将不同种类标准品带入建立的ELISA中检测，结果如表3所示，结果显示该单克隆抗体对AFB1抑制最好，依次是AFG1、AFB2、AFG2，对AFM1、AFM2、OTA、ZEN、DON和BSA的交叉反应率都小于1％，说明制备的AFB1单克隆抗体的特异性良好。
表3单克隆抗体特异性鉴定
Figure BDA0003027636150000071
3.3快速检测方法的稳定性测试
将上述包被好单克隆抗体的酶标板、HRP·AFB1酶标抗原工作液、不同浓度的标准品液体，分别分装置4℃冰箱和37℃保存，保存前和保存后第1d、3d、5d、7d、10d、15d分别对比保存在不同条件试剂盒的OD值和IC50变化，根据检测结果判定试剂盒储存稳定性。用不同批次制备的试剂盒，分别做多个批次内和批次间平行曲线检测其变异系数。
对比4℃和37℃保存不同时间条件的稳定性，经过ELISA检测，结果如表4所示，试剂盒空白值(B0)保存1周后下降了15％，10d下降23％，保存15d下降22％，但是IC50值未见明显变化。试剂盒在保存10d和15d OD值下降不明显，说明试剂盒在下降到一定程度后比较稳定。按照37℃保存1d相当于4℃保存一个半月的模型计算，在37℃保存7d稳定的试剂盒，理论上在4℃可以保存10个月左右，保存15d后IC50变化不大，只是OD值下降，不影响试剂盒的使用。经检测，批内差异和批间差异都小于8.5％，说明该检测产品稳定性良好。
表4ELISA试剂盒稳定性
Figure BDA0003027636150000072
Figure BDA0003027636150000081
3.4样本中标准品的添加回收实验与样本实测
参照谢珲等(2015)、宋卫得等(2016)所述方法进行优化。对木薯干片、木薯饼干、木薯粉条、木薯面条、木薯蛋糕、玉米、大豆等大块样本进行烘干粉碎，过80目筛。准确称取样本2g，分别对比10ml的60％～80％甲醇提取液、添加不同量NaCL、超纯水稀释不同稀释倍数处理、标准品缓冲液不同浓度等，检测样本的回收率。加入提取液后封口后强力振荡5min,3000r/min离心5min取上清分析。木薯饼干、木薯蛋糕等木薯食品样本含油脂，提取后取1mL上清，加入0.8mL正己烷，封口后强力震荡5min，3500r/min离心5min后取下层上清液检测。回收率越接近100％表示检测结果越准确。并把检测结果与外购AFB1 ELISA试剂盒进行结果比对，判断该方法的准确性。
3.4.1样本提取方法的确定
60％甲醇水提取后直接检测回收率为64％，70％、80％甲醇水提取后直接检测ELISA不显色，可能是过高的甲醇会影响抗原抗体结合所致。回收率随着甲醇溶液浓度升高而降低，80％甲醇水溶液最低；添加的氯化钠的量越多，回收率越高，但本底和假阳性也越高；相同的提取方法，回收率随着检测前稀释倍数增大而升高。为避免假阳性率，对比在60％、70％甲醇提取液中加入不同NaCL和标准品的量，分别10倍、15倍、25倍稀释。如图4所示，添加0.2g NaCl时，回收率也可达到100％左右，回收率随样本稀释倍数增大而升高，添加0.5ng/mL回收率高于2ng/mL，且70％甲醇提取液提取的样本0.5ng/mL、2ng/mL回收率差异更小，故优选70％甲醇水作为样本提取液。
3.4.2不同浓度甲醇水溶液作为标准品稀释液对样本回收率的影响
样品不同稀释倍数和不同浓度甲醇水溶液作为标准品稀释液对样本添价回收率的数据如图5所示，样本10倍稀释，35％甲醇作为标准品稀释液的添加回收率更接近100％；样本15倍稀释，30％甲醇作为标准品稀释液的添加回收率更接近100％，添加0.3g NaCl也得出同样的结果。为减少稀释带来的误差，选择样本10倍稀释、35％甲醇水溶液作为标准品稀释液。
3.4.3不同类型木薯样本回收率
不同类型样本10倍和15倍稀释后添加回收率图6结果表明，所有样本10倍稀释添加回收率都在81.5％～120％，添加0.5ng/mL回收率均高于2ng/mL，15倍稀释的回收率均高于10倍稀释，且部分回收率高于120％，容易造成假阳性，故选用70％甲醇水溶液加0.2g氯化钠提取，2倍稀释后检测，作为木薯食品原料的样本处理方法。该方法样本检测限范围为0.2～4.8μg/kg。
木薯饼干、木薯蛋糕等含油脂木薯食品对比10倍、15倍稀释后检测，添加回收率如图7所示，加大稀释倍数和提取过程中加氯化钠均可使回收率升高，10倍稀释后样本回收率90.8％～102.7％，选用70％甲醇水溶液提取后取上清1mL，加入0.8mL正己烷，震荡离心后取下层上清液2倍稀释后检测，作为木薯含油脂食品样本处理方法。该方法样本检测限范围为0.2～4.8μg/kg。
实施例4：样本实测
用自建ELISA试剂盒和外购的试剂盒，对72待检样本进行初筛检测，结果如表5所示，其中自建方法共筛出8份污染样品，外购试剂盒未筛出阳性样本。所检测的36个木薯粉样本中，4个样本含有AFB1但没有超标，含量在0.32～0.75μg/kg。其中17个木薯粉样本敞口置于室温条件下长达20个月，检测结果和密封保存结果一致。木薯淀粉、木薯全粉、木薯干片、木薯粉条、木薯面条中没检出AFB1，部分存放最久的木薯粉和木薯干片长达5年之久仍然未检出AFB1。所检测的21个木薯糕点样品中17个样本已室温存放一年，只有4个检出含有AFB1，含量在0.41～0.54μg/kg。自建试剂盒检测区间为0.2～4.8μg/kg，外购试剂盒检测区间为2～50μg/kg，所有已检测出的阳性样本含量已低于外购试剂盒的检测范围，因此，该方法灵敏度优于外购试剂盒。
表5两检测方法对72份木薯样本检测结果比较
Figure BDA0003027636150000091
根据国家食品药品监督管理总局《食品快速检测方法评价技术规范》(食品快速检测方法评价技术规范，2017)中评价方法进行分析，结果表明，木薯粉及其制品卡方值为6.125，大于3.84，表示自建方法与外购试剂盒的阳性确认比率在95％的置信区间内有显著性差异；所有样本假阴性率均为0，假阳性率为11.1％，相对准确度为88.9％。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都涵盖在本发明的保护范围之内。

Claims (7)

1.一种直接竞争ELISA法快速检测AFB1的方法，其特征在于，它包括以下步骤：
S1、样本处理：将样本进行烘干粉碎，过筛后准确称取样本，每克样本用5ml 70％甲醇水溶液，加样本质量10％质量的氯化钠提取，若样本不含油脂，取上清液2倍稀释后检测，若样本含油脂，取上清液加入正己烷，所述上清液和正己烷的体积比为1:0.8，震荡离心后取下层上清液2倍稀释后检测；
S2、建立标准曲线：选取0.05ng/ml抑制率50％以上、OD450值最接近2.0的AFB1抗体和AFB1-HRP酶标抗原稀释倍数作为效价，将标准品浓度倍比稀释进行竞争ELISA，以AFB1标准品浓度的对数值为横坐标，以吸光度值的logit值为纵坐标，建立ELISA标准曲线，获得线性回归方程和相关系数；
S3、检测：测定稀释后上清液的OD450并计算吸光度值的logit值，从建立的标准曲线中得出样本的AFB1含量。
2.根据权利要求1所述的一种直接竞争ELISA法快速检测AFB1的方法，其特征在于，步骤S2中所述的AFB1抗体采用以下方法制备：
S21、制备抗原：合成黄曲霉素B1肟化物AFB1.O，将AFB1.O与载体蛋白BSA、OVA和HRP分别进行偶联；
S22、制备抗体：用AFB1-BSA作为免疫原皮下多点注射免疫Balb/C小鼠，AFB1-OVA作为包被原用间接竞争ELISA检测效价和抑制率，挑选效价5.0×104以上、对AFB1标准品20ng/mL抑制率50％以上的小鼠脾细胞与SP2/0细胞融合，将阳性杂交瘤细胞克隆至阳性单克隆率为100％，小鼠体内诱生腹水即为制备的单克隆抗体。
3.根据权利要求2所述的一种直接竞争ELISA法快速检测AFB1的方法，其特征在于，步骤S21中用碳化二亚胺法将AFB1.O与载体蛋白BSA、OVA和HRP分别进行偶联，偶联后的产物在pH值7.2的PBS中透析48h。
4.根据权利要求1所述的一种直接竞争ELISA法快速检测AFB1的方法，其特征在于，步骤S2中所述线性回归方程为y＝-3.074x-4.3066，其中R2值为0.9979。
5.根据权利要求1所述的一种快速检测AFB1的直接竞争ELISA法，其特征在于，所述方法的检测限为0.2～4.8μg/kg。
6.根据权利要求1所述的一种直接竞争ELISA法快速检测AFB1的方法，其特征在于，所述AFB1来源于木薯、玉米、大豆或花生及其制品。
7.一种直接竞争ELISA法快速检测AFB1的试剂盒，其特征在于，采用权利要求1-6中任意所述的直接竞争ELISA法快速检测AFB1的方法。
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