KR20040092652A - 변형된 직접경합 효소면역측정법을 이용한 세포주선별방법, 이로부터 얻어진 오크라톡신 ａ에 특이적인모노클로날 항체를 생산하는 융합세포주, 모노클로날 항체및 이러한 모노클로날 항체를 이용한 오크라톡신 ａ의검출 방법 - Google Patents

변형된 직접경합 효소면역측정법을 이용한 세포주선별방법, 이로부터 얻어진 오크라톡신 ａ에 특이적인모노클로날 항체를 생산하는 융합세포주, 모노클로날 항체및 이러한 모노클로날 항체를 이용한 오크라톡신 ａ의검출 방법 Download PDF

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KR20040092652A
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Abstract

본 발명은 변형된 직접경합 효소면역측정법을 이용한 세포주 선별방법, 상기 방법에 의해 얻어진 오크라톡신 A에 특이적인 모노클로날 항체를 생산하는 융합세포주, 모노클로날 항체 및 이러한 모노클로날 항체를 이용한 오크라톡신 A의 검출 방법에 관한 것으로, 선별하고자하는 세포가 분비하는 특이항체와 결합가능한 항체코팅용액을 마이크로타이터플레이트상에 코팅한 다음, 선별하고자하는 세포의 배양 상등액을 첨가하여 상기 세포가 분비하는 특이항체를 마이크로타이터플레이트상에 고정시킨 후, 상기 특이항체의 항원을 포함하는 검출대상물질과 검출대상물질-발색반응효소 접합체를 첨가한 다음 발색반응을 통하여 상기 세포가 분비하는 항체의 검출대상물질에 대한 결합 여부 및 경합능력을 판단하는 것을 특징으로 하는, 변형된 직접경합 효소면역측정법을 이용한 세포주 선별방법이 제공된다.
또한, 상기 방법으로 얻어진 오크라톡신 A(OTA)를 특이적으로 인지하는 모노클로날 항체를 생산하는 융합세포주, 상기 융합세포주로 부터 생산된 모노클로날 항체, 및 이를 이용하여 직접경합 효소면역측정법 또는 면역크로마토그래피 시험을 통해 오크라톡신 A를 검출하는 방법이 제공된다.
본 발명에 의하면 농산물이나 식품에 오염될 수 있는 곰팡이독소의 일종인 오크라톡신 A를 신속·간편하고도 정밀하게 검출할 수 있다.

Description

변형된 직접경합 효소면역측정법을 이용한 세포주 선별방법, 이로부터 얻어진 오크라톡신 Ａ에 특이적인 모노클로날 항체를 생산하는 융합세포주, 모노클로날 항체 및 이러한 모노클로날 항체를 이용한 오크라톡신 Ａ의 검출 방법{Method of Cell Line Selection using Modified Competitive Direct ELISA, Hybridoma Producing Monoclonal Antibody against Ochratoxin A therefrom, Monoclonal Antibody and Method for Detecting Ochratoxin A Using the Monoclonal Antibody}
본 발명은 변형된 직접경합 효소면역측정법을 이용한 세포주 선별방법, 이로부터 얻어진 오크라톡신 A에 특이적인 모노클로날 항체를 생산하는 융합세포주, 모노클로날 항체 및 이러한 모노클로날 항체를 이용한 오크라톡신 A의 검출 방법에 관한 것이다.
오크라톡신 A(Ochratoxin A(OTA))는 주로 아스퍼질러스 페니실리움(Aspergillus Penicillium) 속 등에 의해서 생산되는 2차대사산물인 전분이 많은 곡물에서 자주 검출되는 곰팡이독소(mycotoxin)로서 신장독, 간장독, 발암성, 면역억제 등의 작용이 있다. OTA를 생산하는 곰팡이가 농산물이나 식품 중에 오염되어 OTA를 생산하고 이러한 농산물을 먹인 가축이나 식품을 인간이 다시 섭취하였을때 OTA 전이에 의한 진균독소증의 가능성을 상당히 내포하고 있다. 또한 우리 나라 전통발효식품인 대두 발효식품 중에서 분리한 곰팡이를 배양하였을 때, 그 중의 일부가 OTA를 생산한다는 보고가 있다. 이러한 사실은 우리 나라 농산물도 OTA에 의해 오염되었을 가능성을 예측할 수 있게 한다.
현재 유럽(EU)에서는 OTA 검출 발생빈도가 높아 관심을 많이 가지고 있지만, 우리 나라에서는 OTA의 규제에 대한 특별한 규정이 없는 실정이다. 유럽의 경우 여러 가지 농산물 및 식품에서 OTA의 발생 빈도 및 함량에 대한 연구가 많이 이루어지고 있다.
한편, 수입개방에 따라 농산물의 수입량이 최근 급격히 증가하고 있으며, 이들 중에 오염된 곰팡이독소는 식품안전성의 면에서 감시를 요한다. 기존의 분석방법으로는 많은 시료중에서 곰팡이독소를 검출하는데 현실적으로 장비, 인력 등의 면에서 제약이 따르므로 이를 효율적으로 분석하기 위해서는 효소면역측정법(enzyme-linked immunosorbent assay: ELISA)의 도입이 절실히 요구된다. ELISA는 항원·항체 반응의 면역기법을 이용함으로써, 감도가 뛰어나고 신속·간편하면서 경제적인 분석법으로 개발되어 점차 널리 실용화되어가고 있는 실정이다. 이 분석법은 일회에 수백 개의 시료를 동시에 분석할 수 있어, 특히 시료의 수가 많은 농산물 등의 분석에 매우 효율적이다. 이미 항 OTA 모노클로날항체와 이를 생산하는 융합세포주가 확보되어 있고, 이를 이용한 상업적인 검출 키트가 외국에서는 생산 판매되고 있으나, 이를 이용할 경우 고액의 외화가 소요될 것으로 예상된다.
이에 대응하여 국내에서는 항 OTA 폴리클로날 항체(polyclonal antibody)를 이용한 ELISA 검출법이 개발되어 있는 상태이다. 그러나 폴리클로날 항체를 이용한 ELISA 검출법의 경우 검출 정확도가 저하되는 문제점이 있어 이러한 단점을 극복하기 위해서는 영구적 사용이 가능하며, 검출감도의 재현성이 뛰어난 고감도의 항 OTA 모노클로날항체의 생산이 요구된다.
또한 저분자 물질인 OTA를 인식하는 항체를 생산하는 융합세포주(hybridoma)를 선별하기 위하여 기존에 실행되고 있는 간접 효소면역측정법(indirect ELISA)은단순하다는 장점을 가지고 있지만 재현성 있는 결과를 도출하기 어렵고 후보 융합세포주들을 최종적으로 선별하기까지 배양하거나 동결보관해야 하기 때문에 시간과 작업이 많이 요구되는 단점도 있고, 담체단백질과 교차반응성도 고려해야 하는 어려움이 있었다.
일반적으로 알려진 간접효소면역측정법은 첫 단계로 항원(분석대상물질)이 되는 물질을 바닥에 코팅하고 세포배양 상등액을 첨가하여 상등액에 존재하는 항체가 항원물질과 결합하게 되고, 항원물질과 결합하는 항체를 인식하는 다른 항체-효소접합체를 이용하여 발색을 통하여 원하는 항체를 생산하는 세포주인지 확인한다. 하지만 이 선별방법은 실험의 단순성에 비해 많은 단점을 지니고 있다. 첫째로 검출대상 물질을 정량적으로 분석하기 위해서는 직접경합 효소면역측정법이나 간접경합 효소면역측정법이 사용되는데, 직접경합 효소면역측정법 각각 검출대상물질(예 : OTA)과 검출대상물질-효소접합체(예 : OTA-HRP)에 대한 경합반응이, 그리고 간접경합 효소면역측정법에서는 생산된 단클론항체가 코팅된 검출대상물질(OTA-BSA)과 검출대상물질(OTA)과 경합반응이 잘 일어나는 항체를 생산하는 융합세포주를 선별해야 하나 간접 효소면역측정법은 항체의 경합능력을 확인하는 단계가 없기 때문에 최종적으로 생산되는 항체가 검출대상물질에 대한 경합능력을 갖추고 있다고 보장할 수 없다. 둘째로, 간접효소면역측정법은 검출대상물질이 단백질과 같은 분자량이 큰 물질인 경우가 적합하고 할수 있다. 왜냐하면 분자량이 큰 물질이 효소면역측정법 이용시 코팅이 용이하기 때문이다. 그러나 저분자물질(예, OTA 등 곰팡이 독소, 마약류)은 코팅이 잘 되지 않기 때문에 간접효소면역측정법을 사용하기에 적합하지 않다. 검출대상물질이 OTA인 경우, 만일 간접 효소면역측정법을 이용한다면 OTA를 직접 코팅할 수 없고, 분자량이 큰 BSA(bovine serum albumine) 나 OVA(ovalbumine) 등과 같은 단백질 즉 코팅이 가능한 물질이 검출대상물질(OTA)과 결합되어 있는 물질(예: OTA-BSA, OTA-OVA conjugate 등)을 코팅해야 한다. 이후 세포배양 상등액을 반응시키면 OTA를 인식하는 항체도 결합할 수 있지만 담채단백질(BSA, OVA 등)을 인식하는 부분의 항체, 그리고 OTA와 담채단백질(BSA, OVA 등)의 사이를 인식하는 항체도 존재할 수 있고, 이것들이 2차 항체(발색을 위한 항체 : 이 실험에서는 항 마우스 항체-HRP)에 의해 발색이 일어나게 된다. 따라서 OTA와 담채단백질 사이를 인식하는 항체와 담채단백질을 인식하는 항체를 생산하는 융합세포주를 선별하게 되어, 결국 분석물질(OTA)만을 검출하는 실험에서 사용할 수 없는 세포주를 선발하게되는 결점이 있다.
이러한 문제를 극복하기 위하여 본 발명자들은 Hack 등이 발표한 방법(1987)을 좀더 구체화하고 발전시켜 변형된 직접경합 효소면역측정법(modified competitive direct ELISA: cdELISA) 조건을 확립하고, 이 방법에 따라 검출감도가 우수한 항 OTA 모노클로날항체를 생산할 수 있는 새로운 융합세포주를 개발하였으며, 또한 국내외적으로 OTA 검출에 시도되지 않았던 면역크로마토그래피 시험을 이용하여 마약검출방법과 유사한 경합저해 방식의 신속한 OTA 검출법을 개발하였다.
이에 본 발명의 목적은 검출감도가 우수한 특이항체를 생산하는 세포주를 선별하는 새로운 방법을 제공하고자 한다.
본 발명의 다른 목적은 검출감도가 우수한 항 OTA 모노클로날항체를 생산할 수 있는 새로운 융합세포주를 제공하고자 한다.
본 발명의 다른 목적은 상기 융합세포주로 부터 생산된 모노클로날 항체를 제공하고자 한다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 융합세포주로 부터 생산된 모노클로날항체를 이용하여 신속·간편하고도 정밀하게 오크라톡신 A를 검출할 수 있는 방법을 제공하고자 한다.
도 1 - 변형된 직접경합 효소면역측정법으로 항 OTA 모노클로날항체를 생산하는 융합세포주를 선별하는 공정도
도 2 - 변형된 직접경합 효소면역측정법으로 항 OTA 모노클로날항체를 생산하는 융합세포주를 선별하는 결과도
도 3 - 선발된 융합세포주를 이용한 변형된 직접경합 효소면역측정법에 있어서의 사용된 코팅용액 종류별 비교실험 결과도
도 4 - 직접경합 효소면역측정법으로 OTA를 검출하는 공정도
도 5 - 직접경합 효소면역측정법으로 OTA를 정량으로 분석하는 표준곡선 결과도
도 6 - 면역크로마토그래피 시험으로 OTA를 검출하는 공정도(음성반응)
도 7 - 면역크로마토그래피 시험으로 OTA를 검출하는 공정도(양성반응)
도 8 - 면역크로마토그래피 시험으로 여러 농도에서의 OTA 검출 결과도
본 발명의 제 1견지에 의하면, 선별하고자하는 세포가 분비하는 특이항체와 결합가능한 항체고정용액을 마이크로타이터플레이트상에 코팅한 다음, 선별하고자 하는 세포의 배양 상등액을 첨가하여 상기 세포가 분비하는 특이항체를 마이크로타이터플레이트상에 고정시킨 후, 상기 특이항체의 항원을 포함하는 검출대상물질과 검출대상물질-발색반응효소 접합체를 첨가한 다음 발색반응을 통하여 상기 세포가 분비하는 항체의 검출대상물질에 대한 결합 여부 및 경합능력을 판단하는 것을 특징으로 하는, 변형된 직접경합 효소면역측정법을 이용한 세포주 선별방법이 제공된다.
본 발명의 제 2견지에 의하면, 오크라톡신 A(Ochratoxin A(OTA))를 특이적으로 인지하는 모노클로날항체를 생산하는 융합세포주((CYJOTA-C7G25) 기탁번호:KCLRF-BP-00077)가 제공된다.
본 발명의 제 3견지에 의하면, 상기 융합세포주(CYJOTA-C7G25)를 생쥐의 복수에 주사한 후 분리하여 정제한 모노클로날 항체가 제공된다.
본 발명의 제 4견지에 의하면, 상기 모노클로날항체를 이용하여 직접경합 효소면역측정법을 통해 검출하는 것을 특징으로 하는 오크라톡신 A 검출 방법이 제공된다.
본 발명의 제 5견지에 의하면, 상기 모노클로날항체를 이용하여 면역크로마토그래피 시험을 통해 검출하는 것을 특징으로 하는 오크라톡신 A 검출 방법이 제공된다.
이하 본 발명에 대하여 상세히 설명한다.
본 발명자들은 특이항체를 생산하는 세포주를 선별하는데 있어서 일반적으로 알려진 간접 효소면역측정법이나 직접경합 효소면역측정법을 이용하는 것보다 본 발명에 따른 변형된 직접경합 효소면역측정법을 이용하는 경우 보다 더 검출감도가 우수한 특이항체를 생산하는 세포주를 선별할 수 있음을 발견하였다.
본 발명의 변형된 직접경합 효소면역측정법은 우선, 선별하고자하는 세포가 분비하는 특이항체를 고정(결합)할 수 있는 항체고정용액을 마이크로타이터플레이트상에 코팅한다. 즉, 선별하고자하는 세포의 배양상등액에 존재하는 항체(예를들어, 마우스 IgG)만을 결합하는 항체(예를들어, 항 마우스 IgG Fc 특이항체, 즉 마우스 면역글로블린의 Fc 부분만을 인식하는 항체)를 코팅한다. 이때 상기 항체고정용액으로는 단백질 A, 단백질 G, 단백질 A/G 또는 항 마우스 면역글로블린이 사용될 수 있다.
이후 세포배양 상등액을 가하여 상등액 중에 존재하는 세포주들로부터 분비된 항체를 상기 마이크로타이터플레이트상에 고정시킨다. 그 이후 검출대상물질(예, 오크라톡신 A(OTA)와 같은 곰팡이 독소)과 검출대상물질-발색반응효소(예를들어, OTA-HRP(Horse radish peroxidase))을 첨가해주고 발색반응을 통하여 세포주들이 분비하는 항체의 검출대상물질에 대한 인식(결합) 여부와 경합능력을 판단한다. 이때 사용되는 검출대상물질은 곰팡이 독소와 같은 미생물 독소일 수 있으며, 예를들어 오크라톡신 A일 수 있다. 또한, 상기 발색반응효소는 HRP(Horse radish peroxidase, 양고추냉이 퍼옥시다제) 또는 ALP(alkaline phosphotase, 알칼라인 포스포타제) 등이 이용될 수 있다.
본 발명의 방법은 정제된 항체를 확보할 수 없는 세포주 선별 단계에서 배양세포 상등액의 항체를 고정시켜주는 역할을 하는 코팅물질(예를들어, 항 마우스 면역글로블린)을 이용하여 직접경합 효소면역측정법의 장점을 이용하는 방법이다. 일반적인 직접경합 효소면역분석법은 항체를 정제한 이후에 정제된 항체용액을 코팅하는 것으로부터 시작되는데, 세포주 선발과정에서는 세포배양 상등액만을 사용할 수 있으므로(정제된 항체는 세포주가 선발된 이후 진행되기때문) 직접경합 효소면역분석법을 이용할 수 없다. 하지만 세포배양액에 존재하는 항체를 고정(결합)시키는 용액(예 : 단백질 A, 단백질 G, 단백질 A/G, 항 마우스 면역글로블린(anti-mouse-IgG, anti-mouse-IgGAM, anti-mouse-IgG Fc specific 등)을 코팅하고, 이후 세포배양 상등액을 첨가하여 상등액에 존재하는 항체를 고정하여 결국 직접경합 효소면역분석법과 동일한 원리를 이용하게 된다. 즉 반응 첫 단계에서 정제된 항체를 코팅하는 것이 아니라 특정항체를 고정(결합)하는 특정물질용액을 코팅하는 단계가 추가된 것으로 볼 수 있다.
상술한 바와 같은 본 발명의 세포주 선별방법에 따라, 오크라톡신 A에 특이적인 항체를 생산하는 융합세포주를 선별하여 얻어졌으며, 이를 보다 자세히 설명하면 다음과 같다.
본 발명의 융합세포주는 오크라톡신 A-BSA 접합체(Ochratoxin A-Bovine serum albumine conjugate)를 완충액에 용해시키고, 프로인트 어쥬번트(Freund's adjuvent)로 유탁액을 제조하여 생쥐에 면역시킨 후, 골수종세포(Myeloma cell)와 세포 융합시키고, 생쥐의 면역글로블린의 Fc 부위를 인식하는 항체 또는 단백질 A/G(Protein A/G)를 마이크로타이터 플레이터에 코팅하고, 융합된 세포배양 상층액과 오크라톡신 A-HRP(Horse radish peroxidase) 접합체를 함께 반응시킨 후, 기질용액을 가하여 효소반응시키고, 450nm에서 흡광도를 측정하는 변형된 직접경합 효소면역측정법(modified competitive direct ELISA: cdELISA)을 이용하여 OTA에 특이적인 항체를 생산하는 융합세포주를 선별하여 얻어졌으며 이 융합세포주를CYJOTA-C7G25라 명명하고 한국세포주은행에 기탁하였다(기탁번호: KCLRF-BP-00077).
오크라톡신 A(이하 'OTA'라 칭함)에 대한 모노클로날 항체를 얻기 위한 실험은 Goding 등 (1996)의 방법을 변형하여 행한다. 골수종세포, 피더 셀(feeder cell), 융합세포의 배양에 사용한 배양 배지는 1×DMEM(Dulbeccos Modification of Eagles Medium), 소디움 파이루베이트(Sodium pyruvate), L-글루타메이트(L-glutamate), 소디움 바이카보네이트(Sodium bicarbonate), FBS(fetal bovine serum)이다.
OTA에 특이성이 있는 모노클로날 항체를 생산하기 위하여 생쥐가 바람직하다. 면역원으로 OTA-BSA 접합체(Ochratoxin A-Bovine serum albumine conjugate)가 사용될 수 있으며 이를 생쥐의 복강에 투여하여 면역시킨후, 최종면역 3일후에 생쥐의 비장과 임파절로부터 OTA에 대한 항체를 생성하는 임파구를 얻는다. 그 다음, 이를 골수종세포(Myeloma cell)와 세포 융합시킨다.
융합후 오크라톡신 A에 특이적인 모노클로날 항체를 생산하는 융합세포주의 선발은 변형된 직접경합 효소면역분석법으로 OTA에 특이적인 항체를 생산하는 융합세포를 선발하여 이루어진다.
이 때 융합세포주를 선발하기위한 직접경합 효소면역분석법은 다음과 같이 행하여질 수 있다.
마우스로부터 생산되는 면역글로블린의 Fc 부분을 특이적으로 인식하는 항체(anti-mouse IgG Fc specific antibody) 또는 단백질 A/G(Protein A/G)를 코팅용액에 2㎍/ml로 희석한 용액 100㎕를 마이크로플레이트 웰에 각각 분주하여 냉장고(4℃)에서 하룻밤 정치하여 코팅한다.
이것을 세정용액(PBST)으로 세번 세척한 다음 물기를 완전히 제거한다. 여기에 세정용액으로 배양 상등액을 50㎕씩 처리하여 1시간 동안 상온에서 반응시키고 다시 이것을 세정용액(PBST)으로 세 번 세척한 다음 물기를 완전히 제거한다. 그리고 일정 농도(일반적으로 약 1 ppm(= 1000 ppb))의 OTA 50㎕와 OTA-효소 접합체(OTA-HRP) 50㎕를 함께 첨가하여 약 1시간 동안 반응시킨 다음 세정용액으로 위와 같은 방법으로 세척하고 여기에 기질용액[0.01% 티엠비(3.3',5,5'-tetramethyl benzidine, dihydrochloride), 0.05% 포스페이트-씨트레이트 완충액(phosphate-citrate buffer, 0.05M), pH 5.0, 사용전 과산화수소를 최종농도 0.001%가 되도록 첨가]을 웰당 100㎕씩 넣고 30분간 방치하여 발색시킨 다음 반응정지액(2M 황산) 50㎕를 첨가하고 마이크로플레이트 리더로 파장 450nm에서 각 웰의 흡광도를 측정한다.
이 후, 모노클로날 융합세포의 서브클로닝은 ELISA에 의하여 특이항체의 생성이 확인된 웰의 융합 세포를 한계 희석법(Harlow 등, 1988)에 의하여 3회 실시하여 앞에서 실시한 변형된 직접경합 효소면역측정법으로 OTA-효소 접합체(OTA-HRP)와 경합시킬 OTA의 양만 다양한 농도(0-1000ppb)로 반응시켜 모노클로날 융합세포를 최종적으로 선발한다.
선발된 모노클로날 융합세포를 대량 배양하여 회수하고 PBS 완충액으로 2회 세척한 후 동결건조하고, 일부 세포는 모노클로날 항체를 생산하기 위하여, 1주일전에 마우스 복강에 프리스테인 0.1-0.2ml을 주입한 BALB/c 마우스에 마리당 1~2×106cells의 융합 세포 클론을 0.5ml 복강 주사하고 약 2주일 후 복수액을 얻은 후 소디움 아자이드를 0.02% 되도록 첨가한 후 -70℃에 보관하면서 필요한 경우에 녹여 사용한다.
생산된 모노클로날항체(CYJOTA)는 IgG2a 서브클래스 타입으로서 고정화 티오필릭 흡착 크로마토그래피(thiophilic adsorption chromatography) 칼럼을 이용하여 정제하고 -20℃에 냉동 보관한다.
이와 같이 얻어진 오크라톡신 A에 특이적인 모노클로날항체(CYJOTA)는 직접경합 효소면역측정법 또는 면역크로마토그래피 시험법을 통해 OTA를 신속하게 검출하는데 이용된다.
일 방법으로, 상기 융합세포주(CYJOTA-C7G25)를 생쥐의 복수에 주사한 후, 분리하고 정제하여 얻은 모노클로날항체를 마이크로타이터 플레이트에 코팅하고, OTA가 함유되어 있는 용액과 이와 경합에 이용되는 OTA-HRP(Horse radish peroxidase(양고추냉이 퍼옥시다제)) 접합체를 함께 가하여 반응시킨 후, 기질용액을 가하여 효소반응 시키고, 450nm에서 흡광도를 측정하는 직접경합 효소면역측정법으로 OTA를 검출한다.
또한 다른 방법으로, 상기 융합세포주(CYJOTA-C7G25)를 생쥐의 복수에 주사한 후, 분리하고 정제하여 얻은 모노클로날항체를 이용하여 면역크로마토그래피 시험을 통해 OTA를 검출한다. 이때 상기 면역크로마토그래피 시험은 시험선(test line)과 비교선(control line)에 각각 OTA-BSA(Bovine serum albumine) 접합체 및 단백질 A/G(protein A/G)가 고정된 다공성 니트로셀룰로오스 멤브레인을 이용하여 행하는 것이 바람직하다.
이하 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명한다.
실시예 1(OTA에 특이적인 항체를 생산하는 융합세포주 선별)
1) 세포융합
면역은 생후 8주된 BALB/c 마우스에 구입된 OTA-BSA(Bovine serum albumin) 접합체(Sigma chemical company)를 멸균된 완충액 예를들어 프로인트 어쥬번트(Freud's adjuvant)와 1:1로 유탁액을 제조하여 마리당 250㎍을 복강에 투여하여 면역시켰다. 마우스 피더층(Mouse feeder layer)은 융합 1일전에 BALB/c 마우스 복강 세포를 96웰 마이크로플레이트의 배양 배지에 마리당 2판을 준비하였다. 골수종세포(Myeloma cell, SP2/0-Ag14)는 면역 BALB/c 마우스 한 마리당 75㎠ 플라스크(flask)에 세포를 준비하였는데, 융합 일주일전 즈음 동결된 세포를 꺼내어 배양 배지에 배양하고 융합 3일전에 계대한 후 융합 하루 전 배지를 교환해 주어 최적의 상태로 세포를 유지하였다.
꼬리에서 채혈한 혈액으로 OTA에 대한 항체의 생성여부를 확인하기위해 간접 비경합 효소면역측정법(ELISA)을 실시한 후 양성으로 확인되면 최종면역(boosting)3일 후에 생쥐의 비장과 임파절을 떼내어 100메쉬에서 주사기의 피스톤 고무를 이용하여 잘게 잘랐다.
차가운 배양 배지 10ml을 천천히 부어 찌꺼기(debris)가 없도록 임파구를 50ml 원뿔 튜브(conical tube)에 회수한 후 최종 부피가 40ml이 되게 배양 배지를 채워 놓아두었다. 80-90%의 단일층을 형성한 생육력(viability)이 양호(95%이상)한 골수종세포를 50ml 원뿔 튜브에 회수하고, 앞서 준비한 임파구와 함께 1,000rpm으로 10분간 원심 분리를 행하였다. 10ml의 따뜻한 배양 배지에 현탁한 후, 골수종세포와 임파구를 잘 섞은 다음 배양배지를 최종 부피가 40ml이 되게 채운 후 다시 한번 1,000rpm으로 10분간 원심분리하였다.
배지를 가능한 한 남지 않게 버린 후, 침강된 세포를 원뿔 튜브의 밑면에 골고루 퍼지게 가볍게 손으로 쳐주었다. PEG 용액(50%) 0.6ml(PEG 1500), 배양 배지 0.5ml, 0.1M HCl 10㎕를 첨가하여 56℃에서 잘 섞은 후 이를 37℃에서 미리 배양한 것을 사용하였다.
PEG 용액을 파스퇴르 피펫을 이용하여 천천히 원뿔 튜브에 1ml을 넣은 후 파스퇴르피펫을 이용하여 1분간 부드럽게 섞었다. 여기에 따뜻한 배양배지를 1ml 첨가하고 1분간 다시 부드럽게 섞었다. 차례로 1ml, 2ml, 7ml의 배양배지를 넣은 후 1분간 천천히 파스퇴르 피펫으로 섞었다. 배지를 최종 부피가 40ml이 될 때까지 조심스럽게 채운 후 700rpm으로 10분간 원심분리하였다.
상등액을 버리고 융합된 세포를 100×HAT(L-glutamine, hypoxanthine, aminopterin, thymidine)를 1:100으로 따뜻한 배양배지에 희석한 것 30ml에 현탁하고 700rpm에서 10분간 원심 분리하여 상등액을 버리고 다시 HAT 첨가 배양배지 30ml을 넣어 현탁시켜 미리 준비한 피더층 플레이트(feeder layer plate)에 100㎕/웰(well)씩 분주하여 5% CO2배양기에 배양하였다. 융합 후 5일째에 HAT 첨가 배양배지를 100㎕씩 첨가해 주고 3일 간격으로 2회정도 마이크로플레이트 웰의 상등액을 100㎕ 버린후 100㎕의 HAT 첨가 배양배지로 교체하였다.
2) 융합세포주의 선발
융합세포주(Hybridoma)의 선발은 융합 후 10일이 되면 노랗게 변한 웰의 상등액을 채취해 변형된 직접경합 효소면역분석법으로 OTA에 특이적인 항체를 생산하는 융합세포를 선발하여 이루어졌다. 여기서 사용된 직접경합 효소면역분석법은 다음과 같이 행하여졌다.
마우스로부터 생산되는 면역글로블린의 Fc 부분을 특이적으로 인식하는 항체(anti-mouse IgG Fc specific antibody) 또는 단백질 A/G(Protein A/G)를 코팅 완충액(coating buffer: 0.05M carbonate-bicarbonate buffer, pH 9.6)에 2㎍/ml로 희석한 용액 100㎕를 마이크로플레이트 웰에 각각 분주하여 냉장고(4℃)에서 하룻밤 정치하여 코팅하였다.
그 다음, 이와 같이 코팅된 마이크로플레이트를 세정용액(PBST: phosphate buffered saline with Tween)으로 세 번 세정한 다음 물기를 완전히 제거하였다. 여기에, 앞서 얻어진 융합된 세포의 배양상등액을 50㎕씩 처리하여 1시간동안 상온에서 반응시키고 다시 이것을 세정용액(PBST)으로 세 번 세정한 다음 물기를 완전히 제거하였다. 그리고 여기에 0-1000 ppb 농도의 OTA 50㎕와 OTA-HRP 접합체 50㎕를 함께 첨가하여 1시간 동안 반응시킨 다음, 위와 같은 방법으로 세정용액으로 세정하고 여기에 기질용액[0.01% 티엠비(3,3', 5,5'-tetramethyl benzidine, dihydrochloride), 0.05% 포스페이트-씨트레이트 완충액(phosphate-citrate buffer, 0.05M), pH 5.0, 사용전 과산화수소를 최종농도 0.001%가 되도록 첨가]을 웰당 100㎕씩 넣고 30분간 방치하여 발색시킨 다음 반응정지액(2M 황산) 50㎕를 첨가하고 마이크로플레이트 리더(THERMOmaxTM, molecular device Co.)로 파장 450nm에서 각 웰의 흡광도를 측정하였다. 이러한 변형된 직접경합 효소면역분석법을 이용한 융합세포주의 선별방법을 도 1에 도식화하여 나타내었다.
도 1에 나타낸 바와 같이, 세포배양액에 존재하는 융합세포주가 분비하는 항체를 고정(결합)시키는 용액 즉, 항 마우스 면역글로블린(anti-mouse-IgG Fc specific)을 코팅하고 , 이후 세포배양 상등액을 첨가하여 상등액에 존재하는 항체를 고정한 이후 검출대상물질(OTA)의 인식여부를 확인키 위해 0 ppb 의 OTA 농도하에서 일정농도의 OTA-HRP만을 넣어 발색반응으로 확인하는 것과, OTA와 OTA-HRP와의 경합여부를 확인하기 위하여 OTA와 일정농도의 OTA-HRP를 함께 넣어 반응시킨이후 발색반응을 확인하였다.
또한, 최종적으로 선택된 융합세포주 CYJOTA-C7G25의 측정결과를 도 2에 나타내었다. 도 2를 통하여 융합세포주 CYJOTA-C7G25가 10 ppb 이하의 OTA를 검출할 수 있는 OTA에 특이적인 고감도의 항체를 생산하는 융합세포주임을 알 수 있었다.
그리고, 코팅에 사용되는 단백질의 종류에 따른 결과를 CYJOTA-C7G25의 세포배양액을 이용 분석하여 도 3에 나타내었다. 도 3에 나타낸 바와 같이, 세포배양액에 존재하는 항체를 고정(결합)시키는 효과를 동일한 항체(이 경우 항-OTA 모노클로날항체)를 함유하고 있는 세포배양 상등액을 통해 비교해 본 결과, 모두 검출대상물질(OTA)에 대해 경합반응이 잘 나타나는 것으로 나타나 모두 변형된 직접경합 효소면역측정법에 이용할 수 있다는 것을 알 수 있었다.
실시예 2(OTA 검출을 위한 직접경합 효소면역측정)
실시예 1에서 선별된 융합세포주 CYJOTA-C7G25를 배양한 후 이를 마우스의 복수에 주사하여 분리 및 정제하여 얻은 정제된 모노클로날 항체(CYJOTA)를 준비하였다. 단클론항체를 생산하기 위하여, 세포융합주를 마우스에 주입하기 1 주일 전 프리스테인 0.1 ∼ 0.2 ㎖을 주입한 BALB/c 마우스 복강에 마리당 1 ∼ 2×106개의 융합세포주를 주사하고 10일 후 복수액을 얻고, 항체에 친화력을 가지고 있는 고정화된 티오필릭(T-gel) 컬럼키트를 이용하여 정제하고 인산완충용액에 투석하였다. 이후 이 정제 용액을 냉동하여 보관하였다. 이와 같이 얻어진 모노클로날 항체(CYJOTA)를 코팅 완충액(coating buffer: 0.05M carbonate-bicarbonate buffer, pH 9.6)에 2㎍/ml로 희석한 용액 100㎕를 마이크로플레이트 웰당 100㎕씩 넣고, 4℃에서 하룻밤 방치하여 코팅한 다음, 세정 완충액(0.01M phosphate buffered saline: 0.138M 염화나트륨, 0.00027M 염화칼륨, 0.05% Tween-20, pH7.4)150㎕로 3회 세정한 후, 여러 가지 농도의 표준 OTA용액(0~1000 ppb) 50㎕와 OTA-HRP 접합체 50㎕를 함께 첨가하여 1시간 동안 반응시킨 다음, 위와 같은 방법으로 세정하고 여기에 기질용액[0.01% 티엠비(3,3', 5,5'-tetramethl benzidine, dihydrochloride), 0.05% 포스페이트-씨트레이트 완충액(phosphate-citrate buffer, 0.05M), pH 5.0, 사용전 과산화수소를 최종농도 0.001%가 되도록 첨가]을 웰당 100㎕씩 첨가하고 30분간 방치하여 발색시킨 다음 반응정지액(2M 황산) 50㎕를 첨가하고 마이크로플레이트 리더(THERMOmaxTM, molecular device Co.)로 파장 450nm에서 각 웰의 흡광도를 측정하였다. 이러한 직접경합 효소면역분석법을 이용하여 OTA를 검출하는 방법을 도 4에 도식화하여 나타내었으며, 측정결과 얻어진 OTA에 대한 표준곡선을 도 5에 나타내었다.
도 5로부터, 0.1 ppb 이상 농도에서는 OTA가 존재하지 않을때보다 발색치가 떨어지기 시작하여 이 농도이상의 OTA를 정량적으로 분석할 수 있음을 알 수 있다.
또한 같은 방식으로 상기 모노클로날항체를 이용하여 오크라톡신 B(OTB), 아플라톡신 B1(AFB1), 푸모니신 B1(Fumonisin B1), BSA(Bovine serum albumine)에 대하여 측정하여 교차반응성을 분석하였다. OTA에 대한 IC50과 검출한계는 각각 1.2ng/ml 및 0.12ng/ml이었다. 교차반응성은 50% 저해율에 필요한 OTA의 양을 50% 저해율에 필요한 다른 화합물의 양으로 나눈 값에 100을 곱하여 얻는다. 그 결과를 표 1에 나타내었다. 모노클로날항체의 오크라톡신 B(OTB)에 대한 교차반응성은 31.7%이었으며, 그리고 아플라톡신 B1(AFB1), 푸모니신 B1(Fumonisin B1), BSA에 대한 교차반응성은 검출되지않았다.
다른 화합물과의 교차반응성 결과
화합물 교차반응성(%)
오크라톡신 A 100.0
오크라톡신 B 31.7
아플라톡신 B1 검출되지않음
푸모니신 B1 검출되지않음
BSA 검출되지않음
실시예 3(OTA 검출을 위한 면역크로마토그래피 시험)
정제된 모노클로날항체 CYJOTA-C7G25를 골드콜로이드(gold colloid) 입자에 결합시켜 검출제(detector reagent: 항 OTA 모노클로날항체-골드 결합체)를 제조하였다. 이 때 골드콜로이드의 결합은 pH 7.0, 2mM 농도의 보랙스 완충제(borax buffer) 조건에서 시판(BBI사 영국)되는 직경이 20 nm인 골드콜로이드(520nm에서 흡광도 1.0)를 1㎖당, 증류수로 투석된 항 OTA 모노클로날항체를 10㎍을 상온에서 첨가해 자발적으로 결합시켜 이루어졌다. 제조된 검출제 50㎕를 마이크로플래이트 웰에 첨가하고, 여러 농도의 표준 OTA 용액(0~10000 ppb) 50㎕를 첨가한 이후, 여기에 검출지점(시험선:test line)과 비교지점(비교선: control line)에 각각 OTA-BSA 접합체 및 단백질 A/G(protein A/G)가 고정된 다공성 니트로셀룰로오스 멤브레인을 담궜다. 이후 시간이 지남에 따라 모세관 작용에 의해 형성되는 적색선에 의하여 OTA의 함유량을 분석하였다. 이의 원리를 도 6 및 7에 나타내었고, 그 결과를 도 8에 나타내었다. 음성반응인 경우(도 6)에는 항 OTA 모노클로날항체-골드 결합체가 시험선의 OTA 및 비교선의 단백질 A/G와 반응하여 2개의 적색선이 형성되며,양성반응인 경우(도 7)에는 항 OTA 모노클로날항체-골드 결합체가 이미 OTA와 결합된 상태이기 때문에 시험선의 OTA와는 반응하지않고 비교선의 단백질 A/G와 반응하여 1개의 적색선이 형성된다.
도 8에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 융합세포주(CYJOTA-C7G25)에서 얻은 모노클로날항체를 면역크로마토그래피 시험에 적용하여 매우 작은 양(최소 500ppb)의 오크라톡신 A도 검출할 수 있음을 확인할 수 있었다.
본 발명의 융합세포주를 이용하여 농산물이나 식품에 오염될 수 있는 일종의 곰팡이독소인 오크라톡신 A를 신속·간편하고도 정밀하게 검출할 수 있다.

Claims (11)

  1. 선별하고자하는 세포가 분비하는 특이항체와 결합가능한 항체고정용액을 마이크로타이터플레이트상에 코팅한 다음, 선별하고자 하는 세포의 배양 상등액을 첨가하여 상기 세포가 분비하는 특이항체를 마이크로타이터플레이트상에 고정시킨 후, 상기 특이항체의 항원을 포함하는 검출대상물질과 검출대상물질-발색반응효소 접합체를 첨가한 다음 발색반응을 통하여 상기 세포가 분비하는 항체의 검출대상물질에 대한 결합 여부 및 경합능력을 판단하는 것을 특징으로 하는, 변형된 직접경합 효소면역측정법을 이용한 세포주 선별방법.
  2. 제 1항에 있어서, 상기 검출대상물질은 미생물 독소인 것을 특징으로 하는 세포주 선별방법.
  3. 제 2항에 있어서, 상기 검출대상물질은 오크라톡신 A(Ochratoxin A(OTA))인 것을 특징으로 하는 세포주 선별방법.
  4. 제 1항에 있어서, 상기 항체고정용액은 단백질 A, 단백질 G, 단백질 A/G 및 항 마우스 면역글로블린으로 구성된 군으로부터 선택된 물질을 포함함을 특징으로 하는 세포주 선별방법.
  5. 제 1항에 있어서, 상기 발색반응효소는 HRP(Horse radish peroxidase, 양고추냉이 퍼옥시다제) 또는 ALP(alkaline phosphotase, 알칼라인 포스포타제)인 것을 특징으로 하는 세포주 선별방법.
  6. 제 1항의 세포주 선별방법에 의해 얻어지며, 오크라톡신 A(Ochratoxin A(OTA))를 특이적으로 인지하는 모노클로날 항체를 생산하는 융합세포주(CYJOTA-C7G25, 기탁번호: KCLRF-BP-00077).
  7. 제 6항의 융합세포주(CYJOTA-C7G25, 기탁번호:KCLRF-BP-00077)에 의해 생산되는 오크라톡신 A에 대한 모노클로날 항체(CYJOTA).
  8. 제 7항의 모노클로날 항체를 이용하여 직접경합 효소면역측정법(competitive direct ELISA: cdELISA)을 통해 검출하는 것을 특징으로 하는 오크라톡신 A 검출 방법.
  9. 제 8항에 있어서, 상기 직접경합 효소면역측정법은 상기 모노클로날 항체를 마이크로타이터 플레이트에 코팅하고, 오크라톡신 A가 함유되어 있는 용액과 이와 경합에 이용되는 OTA-효소 접합체를 함께 가하여 반응시킨 후, 기질용액을 가하여 효소반응 시키고, 450nm에서 흡광도를 측정하여 오크라톡신 A를 검출하는 것으로 이루어짐을 특징으로 하는 오크라톡신 A 검출 방법.
  10. 제 7항의 모노클로날 항체를 이용하여 면역크로마토그래피 시험을 통해 검출하는 것을 특징으로 하는 오크라톡신 A 검출 방법.
  11. 제 10항에 있어서, 상기 면역크로마토그래피 시험은 시험선(test line)과 비교선(control line)에 각각 OTA-BSA 접합체 및 단백질 A/G(protein A/G)가 고정된 다공성 니트로셀룰로오스 멤브레인을 이용하여 이루어짐을 특징으로 하는 오크라톡신 A 검출 방법.
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