CN103134928A

CN103134928A - 一种检测呕吐毒素的试剂盒

Info

Publication number: CN103134928A
Application number: CN 201110381285
Authority: CN
Inventors: 赵春城; 赵黎明; 王晓东; 单金莲; 钱汝文
Original assignee: Wuxi Xresearch Product Design and Research Co Ltd
Current assignee: Wuxi Xresearch Product Design and Research Co Ltd
Priority date: 2011-11-26
Filing date: 2011-11-26
Publication date: 2013-06-05

Abstract

本发明涉及生物技术领域，具体为一种检测呕吐毒素的试剂盒。一种检测呕吐毒素的试剂盒，包括盒体和盒内的一块24孔DON包被反应板，一个反应盖板，14瓶试剂和放试剂的下凹瓶位，一个冰袋，一个框架，一份说明书，一包吸水纸，2支一次性滴管和一份质检报告，其特征在于：包被反应板是采用24孔试剂板作为固相载体，14瓶试剂分别6瓶DON标准品溶液、酶标二抗、DON抗体、抗体稀释缓冲液、样品稀释液、浓缩洗涤液、底物液、显色液、终止液，下凹瓶位共16个。本发明的试剂盒，操作简便易行，造价低廉，具有特异性高、灵敏度高、精确度高等特点，能够现场监控且适合大量样本筛查，将在呕吐毒素的检测中发挥重要作用。

Description

一种检测呕吐毒素的试剂盒

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体为一种检测呕吐毒素的试剂盒。

背景技术

呕吐毒素(简称DON)属于单端孢霉烯族化合物，主要由禾谷镰刀菌（Fusarium graminearum) 和黄色镰刀菌（Fusarium culmorum.)产生，因其能引起动物呕吐，故又称呕吐毒素 (Vomitoxin)。单端孢霉烯族毒素共有150多种，是一类强有力的免疫抑制剂，所引起的典型症状是采食量降低，所以这类毒素又叫饲料拒食毒素。DON是其中最重要的一种毒素。

呕吐毒素多分布于小麦、大麦、玉米等谷物籽实中，具有很强的细胞毒性，对原核细胞、真核细胞、植物细胞、肿瘤细胞等均具有明显的毒性作用。另外，呕吐毒素还可以作用于骨髓造血干细胞引起细胞毒性作用。因此，该毒素对人和动物的健康都带来了很大的危险。

目前测定呕吐毒素的主要方法有薄层层析法（TLC)、高效液相色谱法（HPLC)、气相色谱法（GC)。随着人们对食品质量和健康水平要求的提高，发展并推广简便、快速、灵敏、适用于样品实地检测的方法势在必行。

发明内容

本发明的目的在于提供一种检测呕吐毒素的试剂盒。

本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：一种检测呕吐毒素的试剂盒，包括盒体和盒内的一块24孔DON包被反应板，一个反应盖板，14瓶试剂和放试剂的下凹瓶位，一个冰袋，一个框架，一份说明书，一包吸水纸，2支一次性滴管和一份质检报告，其特征在于：包被反应板是采用24孔试剂板作为固相载体，14瓶试剂分别6瓶DON标准品溶液、酶标二抗、DON抗体、抗体稀释缓冲液、样品稀释液、浓缩洗涤液、底物液、显色液、终止液，下凹瓶位共16个。

盒体是硬纸盒；24孔的DON包被反应板，放于真空铝箔袋内；框架为白色48孔塑料框架，框架孔大小与DON包被反应板微孔大小相配；反应盖板是塑料硬盖，大小与框架大小相配；DON标准品溶液均用黑色帽的棕色玻璃瓶，酶标二抗用绿色帽的棕色玻璃瓶，DON抗体用白色帽的白色PE塑料瓶，抗体稀释缓冲液用绿色帽的白色PE塑料瓶，样品稀释液用兰色帽的白色PE塑料瓶，浓缩洗涤液用白色帽的白色PE塑料瓶，底物液用蓝色帽的白色PE塑料瓶，显色液用黑色帽的黑色PE塑料瓶，终止液用黄色帽的白色PE塑料瓶；下凹瓶位由塑料泡沫制成。

本发明的有益效果是：本发明的试剂盒，操作简便易行，造价低廉，具有特异性高、灵敏度高、精确度高等特点，能够现场监控且适合大量样本筛查，将在呕吐毒素的检测中发挥重要作用。

附图说明

图1是本发明的外观示意图。

具体实施方式

一、试剂盒的组成

1、呕吐毒素标准品溶液

呕吐毒素标准品溶液6瓶，浓度分别为0ug/L、12.5 ug/L、25ug/L、50u g/L、100u g/ L 和200ug/L。

2、底物液显色液

底物液为2%过氧化脲溶液，显色液为1 %四甲基联苯胺溶液（TMB)。

3、终止液

终止液为2mol/L硫酸。

4、浓缩洗涤液

浓缩洗涤液为将0.5mL吐温20和0.01g叠氮钠加入1000mL pH7.4 0.01M磷酸盐缓冲液得到的溶液。

5、抗体稀释缓冲液

缓冲液为0.04mol/L pH7.3的磷酸盐缓冲液。

6、包被有包被原的酶标板

包被有DON-OVA的酶标板。

7、酶标二抗

辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠二抗冻干品。

8、一抗

抗DON单克隆抗体冻干品。

二、应用试剂盒进行检测的方法

1、样品前处理

(1)谷物和饲料

准确称取5g粉碎均匀的样品于三角瓶中，加入25ml 10% (体积百分含量）甲醇水溶液，超声波振荡5min。以定性滤纸快速过滤，取1毫升滤液加入3毫升的样品稀释液 (将样品浓缩液20倍稀释），充分混匀，取50ml用于检测。

(2)啤酒、麦芽汁

取一定量的啤酒样品，搅拌，除去过量的气体，静置后进麦芽汁样品直接进行检测。

2、用试剂盒对样品进行检测

实验准备：

用2.0 mL抗体稀释缓冲液将1支DON抗体（冻干品）溶解，配制的工作液够24孔板使用。

用4.0mL抗体稀释缓冲液将1支酶标二抗（冻干品）溶解，配制的工作液够24孔板使用。

浓缩洗涤液用蒸馏水稀释20倍使用。

2、标准品孔加入50ul DON标准溶液(0，12.5，25，50，100，200ppb)，样品孔加入50ul样品提取液。

3、每孔都加入50ul 抗DON抗体工作液。37℃，恒温孵育60min。

4、每孔加入250ul左右洗涤液，放置1min，甩掉后拍干。重复洗涤反应孔3次。

5、每孔都加入100ul 酶标二抗工作液。37℃，恒温反应30min。

6、每孔加入250ul左右洗涤液，放置1min，甩掉后拍干。重复洗涤反应孔4次。

7、各加入50ul 底物液和50 ul显色液，恒温孵育箱中37℃显色10-15min。

8、加入50ul 停止液。用酶标仪(450nm)进行定量测定。(在加入停止液后15min内完成)。

3、检测结果分析

用得的每个浓度的标准品溶液的吸光度平均值（B)除以第一个标准品溶液（0 标准）的吸光度值（B_q)再乘以100%，得到百分吸光度值（百分吸光度值（％） = (B/ B₀)X100%)_o以呕吐毒素标准品浓度（Pg/L）为X轴，百分吸光度值为Y轴，绘制标准曲线图（见图1)。用同样的办法计算样品溶液的百分吸光度值，相对应每一个样品的浓度，则可从标准曲线上读出样本中呕吐毒素的含量。

检测结果的分析也可以采用回归方程法，计算出样品溶液浓度。检测结果的分析还可以利用计算机专业软件，此法更便于大量样品的快速分析，整个检测过程只需较短时间，1.5h内即可以完成。

最后应当说明的是：以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对其限制；尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细的说明，所属领域的普通技术人员应当理解：依然可以对本发明的具体实施方式进行修改或者对部分技术特征进行等同替换；而不脱离本发明技术方案的精神，其均应涵盖在本发明请求保护的技术方案范围当中。

Claims

1.一种检测呕吐毒素的试剂盒，包括盒体和盒内的一块24孔DON包被反应板，一个反应盖板，14瓶试剂和放试剂的下凹瓶位，一个冰袋，一个框架，一份说明书，一包吸水纸，2支一次性滴管和一份质检报告，其特征在于：包被反应板是采用24孔试剂板作为固相载体，14瓶试剂分别6瓶DON标准品溶液、酶标二抗、DON抗体、抗体稀释缓冲液、样品稀释液、浓缩洗涤液、底物液、显色液、终止液，下凹瓶位共16个。

2.根据权利要求1所述的一种检测呕吐毒素的试剂盒，其特征在于：盒体是硬纸盒；24孔的DON包被反应板，放于真空铝箔袋内；框架为白色48孔塑料框架，框架孔大小与DON包被反应板微孔大小相配；反应盖板是塑料硬盖，大小与框架大小相配；DON标准品溶液均用黑色帽的棕色玻璃瓶，酶标二抗用绿色帽的棕色玻璃瓶，DON抗体用白色帽的白色PE塑料瓶，抗体稀释缓冲液用绿色帽的白色PE塑料瓶，样品稀释液用兰色帽的白色PE塑料瓶，浓缩洗涤液用白色帽的白色PE塑料瓶，底物液用蓝色帽的白色PE塑料瓶，显色液用黑色帽的黑色PE塑料瓶，终止液用黄色帽的白色PE塑料瓶；下凹瓶位由塑料泡沫制成。