CN114965996B - 基于金纳米双锥体刻蚀的脱氧雪腐镰刀菌烯醇竞争免疫检测试剂及方法 - Google Patents

基于金纳米双锥体刻蚀的脱氧雪腐镰刀菌烯醇竞争免疫检测试剂及方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种基于金纳米双锥体刻蚀的脱氧雪腐镰刀菌烯醇竞争免疫检测试剂及方法，所述试剂包括DON抗体修饰磁珠、HRP修饰DON抗原、TMB/H2O2显色底物、以及Au NBPs。本发明提供的基于金纳米双锥体刻蚀的脱氧雪腐镰刀菌烯醇竞争免疫检测方法以金纳米双锥体作为刻蚀基底，构建了一种高灵敏度、高色彩分辨率的等离子体比色方法，可用于粮油原料中呕吐毒素的可视化检测。

Description

基于金纳米双锥体刻蚀的脱氧雪腐镰刀菌烯醇竞争免疫检测 试剂及方法
技术领域
本发明涉及生物检测技术领域，具体涉及一种基于金纳米双锥体刻蚀的脱氧雪腐镰刀菌烯醇竞争免疫检测试剂及方法。
背景技术
脱氧雪腐镰刀菌烯醇(deoxynivalenol，DON)是一种由禾谷镰刀菌和黄色镰刀菌产生的真菌毒素，广泛存在于受污染的小麦、玉米等粮食作物中。人和动物误食脱氧雪腐镰刀菌烯醇污染的粮食或饲料后，会出现厌食、呕吐、发烧、腹泻等不良症状，严重时会造成死亡，因此脱氧雪腐镰刀菌烯醇又被俗称为呕吐毒素。呕吐毒素性质稳定，在加工过程中很难被破坏和除去，是粮食生产加工过程中的重要安全隐患，对人类健康产生严重威胁。因此，对农作物生长过程中的呕吐毒素污染进行早期检测，并对粮食收储过程中的污染情况进行动态监测，是预防食品污染的有效途径，对于保护人体免受真菌毒素侵害具有重要意义。呕吐毒素的高灵敏度和特异性分析方法研究是当今世界食品安全面临的新挑战，发展高灵敏、高分辨、耗时短的真菌毒素快速检测方法，受到研究人员的广泛关注。
目前，呕吐毒素的检测方法主要包括薄层色谱法(TLC)、气相色谱法(GC)、高效液相色谱法(HPLC)、酶联免疫吸附法(ELISA)和胶体金免疫层析法(GICA)等。其中GC、HPLC等仪器检测方法具有较高的灵敏度和准确性，但需要依赖昂贵的大型仪器和具备专业基础的技术人员，检测和维护成本较高，因此，难以满足现场样品快速筛查的需求。而ELISA、GICA等快速检测方法具有简便快捷、稳定性好、操作简单、不需要大型仪器、不受检测地点以及人员限制等优点，但灵敏度不及仪器检测方法。比色法是一种可视化检测方法，可以通过裸眼观察反应体系的颜色变化实现目标物的定性和半定量分析，具有操作简单、反应快速、检测结果直观、无需使用昂贵的大型仪器等优点，有希望成为真菌毒素现场快速筛查的重要手段。传统的比色法仅能呈现单一的体系颜色强度变化，但人眼对单一颜色的深浅分辨能力较差，因此难以实现真正的现场可视化检测。而相比于光密度的变化，光谱峰的移动所呈现的多种颜色变化更易被裸眼分辨。因此，本研究发展了一种高灵敏、高分辨的呕吐毒素多色可视化检测新方法，以推进食品中呕吐毒素的现场大规模快速筛查。
金纳米材料由于其独特的光学特性使其在生物技术、电子、光学器件、传感器和催化等领域具有广泛的应用潜力。近年来，基于金属纳米颗粒的比色法被广泛应用于现场检测和可视化检测，其中金纳米双锥体(gold nanobipyramids,Au NBPs)拥有两个尖锐的顶端，因此，具有更强的电磁场增强，更窄的等离子体线性宽度，以及更高的折射指数灵敏度，其微观形貌更容易发生变化。
综上，亟待研发一种基于金纳米双锥体刻蚀的脱氧雪腐镰刀菌烯醇竞争免疫检测的新试剂及方法。
发明内容
为此，本发明提供基于金纳米双锥体刻蚀的脱氧雪腐镰刀菌烯醇竞争免疫检测试剂及方法。
为了实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
本发明提供一种基于金纳米双锥体刻蚀的脱氧雪腐镰刀菌烯醇竞争免疫检测试剂，所述试剂包括DON抗体修饰磁珠、HRP修饰DON抗原、TMB/H2O2显色底物、以及Au NBPs。
本发明的一个实施例中，所述试剂还包括盐酸、CTAB、PBS和PBST缓冲液。
本发明的一个实施例中，所述Au NBP纵向平均长度为77±3nm，横向平均长度为24±1nm。
本发明的一个实施例中，所述检测试剂检测DON的线性范围在0-2000ng/mL。
本发明的一个实施例中，所述检测试剂检测DON的检出限为57.93ng/mL。
本发明还提供所述的基于金纳米双锥体刻蚀的脱氧雪腐镰刀菌烯醇竞争免疫检测试剂的制备方法，所述方法包括以下步骤：
制备Au NBPs；
用所述DON抗体修饰磁珠、HRP修饰DON抗原、TMB/H2O2显色底物、以及Au NBPs检测不同浓度的DON标准溶液，建立Au NBPs纵向等离子体吸收峰波长与DON浓度的线性方程。
本发明的一个实施例中，所述线性方程为y＝0.0299x+583.8，(R2＝0.997)，其中，y为Au NBPs的纵向等离子体吸收峰波长λ，x为DON浓度值(ng/mL)。
本发明的一个实施例中，所述方法还包括向所述Au NBPs中加入浓度为0.02-0.14mol L-1的CTAB。
本发明的一个实施例中，所述Au NBPs溶液的制备过程为：
将CTAC、HAuCl4和HNO3混和均匀，获得混合溶液；
将NaBH4加入所述混合溶液中，待溶液的颜色由浅黄色变为红棕色，向所述混合物中再加入柠檬酸，75-80℃搅拌混合，得到Au种子液；
将CTAB、HAuCl4和AgNO3混合均匀后，加入8-羟基喹啉，得到浅黄色混合溶液；
向所述浅黄色混合溶液中，加入所述种子液100-200μL，再加入8-羟基喹啉静置反应，获得含Au NBPs的胶体分散液。
本发明的多色可视化DON检测的原理如图2所示，检测系统以磁性微粒为靶标识别和转移的基底，以辣根过氧化物酶(HRP)修饰的DON抗原为催化剂，以Au NBPs为比色刻蚀基底。DON特异性抗体通过氨基和羧基化学反应固定在磁性微粒表面，当目标溶液中存在DON时，磁珠上的抗体将特异性捕获DON，此时HRP修饰的DON抗原将不能和磁珠上的抗体结合；当目标溶液中不存在DON时，HRP修饰的抗原将与磁珠上修饰的DON抗体发生特异性结合，使磁珠具有HRP催化活性。HRP将催化H2O2与TMB之间的氧化反应，生成的产物TMB2+可作为一种氧化剂刻蚀Au NBPs，其微观形貌的变化伴随着胶体溶液的颜色变化，由此可实现裸眼可视化检测；此外，也可根据Au NBPs的局域等离子体吸收峰波长进行准确定量。
本发明具有如下优点：
本发明提供的基于金纳米双锥体刻蚀的脱氧雪腐镰刀菌烯醇竞争免疫检测方法以金纳米双锥体作为刻蚀基底，构建了一种高灵敏度、高色彩分辨率的等离子体比色方法，可用于粮油原料中脱氧雪腐镰刀菌烯醇的可视化检测。
本发明的方法将辣根过氧化物酶(HRP)催化3,3',5,5'-四甲基联苯胺(TMB)和双氧水(H2O2)的氧化反应与免疫抗体对呕吐毒素的特异性识别相结合，通过催化反应产物TMB2+对金纳米双锥体的氧化刻蚀使胶体溶液的局域等离子体吸收峰位置发生移动，从而使其产生丰富的颜色变化，检测结果可通过裸眼进行识别。另外，HRP修饰的DON捕获抗体修饰在磁性微球表面，可通过磁分离的方式避免待测样品中其他物质的干扰，提高了方法的特异性。
本发明的检测方法的整个过程可以在真菌毒素全自动净化仪上完成，操作较为简单、自动化程度较高。
附图说明
为了更清楚地说明本发明的实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。显而易见地，下面描述中的附图仅仅是示例性的，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图引伸获得其它的实施附图。
本说明书所绘示的结构、比例、大小等，均仅用以配合说明书所揭示的内容，以供熟悉此技术的人士了解与阅读，并非用以限定本发明可实施的限定条件，故不具技术上的实质意义，任何结构的修饰、比例关系的改变或大小的调整，在不影响本发明所能产生的功效及所能达成的目的下，均应仍落在本发明所揭示的技术内容得能涵盖的范围内。
图1为本发明实施例提供的DON检测流程图；
图2为本发明实施例提供的DON检测可行性实验验证结果图；
图3为本发明实施例制备的金纳米双锥体的表征图，其中，A：Au种子液紫外-可见吸收光谱和光学图像；B：Au NBPs紫外-可见吸收光谱、光学图像和透射电子显微图像；C：使用不同体积Au种子液时Au NBPs紫外-可见吸收光谱；D：Au种子液体积与Au NBPs纵向等离子体吸收波长的关系；
图4为本发明实施例提供的DON检测可视化检测验证结果图；A：Au NBPs加入前(a)和加入后(b)产物溶液的光学图像；B：不同HRP浓度下Au NBPs的等离子体吸收光谱图；C：AuNBPs纵向等离子体吸收峰位移量与HRP浓度关系图；
图5为本发明实施例提供的不同催化反应时间下反应产物的吸光度；
图6为本发明实施例提供的CTAB浓度与Au NBPs的等离子体吸收光谱及吸收峰位移量关系图，其中，A：CTAB不同浓度条件下Au NBPs的等离子体吸收光谱图；B：CTAB不同浓度条件下Au NBPs的纵向等离子体吸收峰位移量。
图7为本发明实施例提供的Au NBPs刻蚀反应时间验证结果图。
图8为本发明实施例提供的DON检测可行性实验结果图；其中，A：各实验条件下试剂加入表及Au NBPs溶胶的光学照片；B：产物溶胶的等离子体吸收光谱图，C：产物溶胶的等离子体吸收峰位移量；
图9为本发明实施例提供的不同浓度DON下，Au NBPs的透射电镜图，DON浓度分别为A：0ng/mL，B：500ng/mL，C：1000ng/mL，D:2000ng/mL；插图为对应的胶体溶液光学照片；
图10为本发明实施例提供的等离子体吸收峰位移量与DON浓度之间的线性关系图；其中，A：DON浓度为0-2000ng/mL条件下对应Au NBPs胶体溶液的光学照片；B：对应的等离子体吸收光谱图；C：等离子体吸收峰波长与DON浓度之间的线性关系；
图11为本发明实施例提供的不同种类真菌毒素作用下Au NBPs的纵向等离子体吸收峰位移量。
具体实施方式
以下由特定的具体实施例说明本发明的实施方式，熟悉此技术的人士可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点及功效，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1、Au NBPs的制备
本实施例提供的金纳米双锥体(Au nanobipyramids,Au NBPs)的合成方法，其包括以下步骤：
步骤一、金种子液的合成
向25mL圆底烧瓶中加入95mmol/L十六烷基三甲基氯化铵(CTAC)，0.5mmol/LHAuCl4和250mmol/L HNO3，混合均匀，得到混合溶液。
将5mol/L NaBH4储备液用冰水稀释至50mmol/L，在强烈搅拌下向混合物中快速加入50mmol/L NaBH4储备液，待混合物溶液颜色由浅黄色变为红棕色，敞口搅拌1min除去产生的H2，再加入1.0mol/L的柠檬酸，快速转移至75-80℃油浴中，缓慢搅拌90min，获得金种子液，将种子液降至室温后，保存备用。
步骤二、金纳米双锥体Au NBPs的合成
向100mL圆底烧瓶中加入47mmoL/L十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)，10mmol/LHAuCl4，10mmol/L AgNO3溶液，混合均匀后加入0.4mol/L 8-羟基喹啉，溶液由金黄色变为浅黄色混合溶液。
在快速搅拌的条件下，向上述浅黄色混合溶液中加入100-200μL步骤一制备的种子液，并将反应溶液置于45℃下，静置15min，再次加入0.4mol/L的8-羟基喹啉，继续45℃下生长15min，而后在30℃下静置4h，得到的Au NBPs于8000rpm/min下离心10min，弃去上层溶液，下层沉积物重新分散于0.1％CTAC(含有1mmol/L HNO3)中，此洗涤过程重复2次，最后将Au NBPs分散于0.05％CTAB中，并置于4℃下保存备用。本步骤中，可通过改变金纳米双锥体种子液的加入体积可以合成不同长径比的Au NBPs。
如图3所示，本实施例采用种子生长法制备Au NBPs，并进行紫外吸收光谱和透射电镜表征。图3中A，种子液的紫外吸收峰在518nm处。图3中B的紫外吸收光谱图中，Au NBPs的纵向等离子体吸收峰和横向等离子体吸收峰分别在803nm和520nm处，前者的强度是后者的5.4倍，表明Au NBPs产率较高；图3中B，透射电镜图中，Au NBPs的单分散性良好，纵向平均长度为77±3nm，横向平均长度为24±1nm，形貌呈对称的五面体结构。图3中C和图3中D展示了使用不同体积金纳米双锥体种子液时，所制备Au NBPs的紫外吸收光谱图和纵向等离子吸收峰波长，随着金纳米双锥体种子液体积的逐渐增加，Au NBPs的纵向等离子体吸收峰逐渐蓝移，通过调整金纳米双锥体种子液用量可以按需制备不同长径比的Au NBPs。
实施例2、金纳米双锥体刻蚀的脱氧雪腐镰刀菌烯醇竞争免疫检测条件优化
本实施例对HRP催化底物的反应时间、CTAB的浓度、金纳米双锥体Au NBP的刻蚀反应时间均对DON检测产生影响，通过以下试验对条件进行优化，优化过程均进行3次平行实验。
1、HRP催化氧化反应刻蚀Au NBPs
在酶标板中，选择10个孔，分别加入显色底物TMB/H2O2和不同浓度的HRP，其中，HRP的终浓度分别为0-10mU/mL，室温下反应10min后，加入2mol/L盐酸终止反应，在酶标仪上测量催化反应产物的吸光度，考察HRP催化反应的线性范围。
随后分别加入Au NBPs胶体分散液(Abs＝1.5)，室温下反应10min，测量酶标仪上每孔中，反应产物的等离子体吸收光谱，考察Au NBPs纵向等离子体吸收峰位移情况，记录Au NBPs胶体分散液的颜色变化。
以辣根过氧化物酶催化H2O2和TMB之间的氧化反应，生成不同浓度的TMB2+。如图4中A(a)，反应体系中的HRP终浓度在0-10.0mU/mL范围内时，随着HRP浓度逐渐增大，产物TMB2+呈现由浅至深的黄色；如图4中A(b)，在反应产物中加入等量的Au NBPs溶胶时，混合溶液呈现由红色逐渐过渡到灰色、灰绿色、蓝绿色、蓝色、墨蓝色、蓝紫色、紫色、粉紫色和粉色的丰富颜色变化。如图4中B-C中，Au NBPs的等离子体吸收光谱及位移量显示，Au NBPs的纵向等离子体吸收峰随着HRP浓度的增大而逐渐蓝移，证明由TMB2+刻蚀Au NBPs可产生多色可视变化。
2、HRP催化TMB/H2O2底物的反应时间
在酶标板中，选择7个孔，分别加入显色底物TMB/H2O2和10mU/mL HRP，分别反应1-12min，在酶标仪上进行反应动力学监测，记录反应产物的吸光度值。
HRP终浓度为1.0mU/mL时，优化TMB/H2O2与HRP反应时间，在酶标板中，加入TMB/H2O2双组份显色液以及1.0mU/mL辣根过氧化物酶，在酶标仪中进行动力学检测，检测时间为1-12min，测得650nm处催化产物的吸光度值，如图5所示，催化反应在10min后达趋于平台期，选择催化反应10min为最佳反应时间。
3、Au NBPs刻蚀反应中的CTAB浓度
在酶标板中分别加入显色底物TMB/H2O2和10mU/mL HRP，室温下反应10min后，加入2mol/L的盐酸终止反应，随后加入CTAB含量不同的Au NBPs胶体分散液，使得混合溶液中CTAB终浓度分别为0-0.14mol/L，室温下继续反应10min，在酶标仪上测量刻蚀反应产物的等离子体吸收光谱。CTAB浓度对金纳米双锥体的刻蚀起着至关重要的作用，如图6中A所示，当CTAB的浓度从0.02M逐渐增加到0.06M，TMB2+位于452nm的特征吸收峰强度逐渐降低，同时Δλ值急剧增加，如图6中B所示。CTAB能够与金形成复合物，从而降低其氧化还原电位，促进蚀刻反应的发生。由于高浓度的CTAB增加了反应溶液的粘度，影响金纳米双锥体与刻蚀试剂的快速混合，随着CTAB的浓度的增加，Δλ有所降低，最佳的CTAB浓度为0.06mol L-1。
4、Au NBPs刻蚀反应时间
在酶标板中分别加入显色底物TMB/H2O2和10mU/mL HRP，室温下反应10min后，加入2mol/L盐酸终止反应。随后加入Au NBPs胶体分散液，分散液中CTAB终浓度为0.06mol/L，在酶标仪上进行反应动力学监测，时间为1-30min，记录Au NBPs的纵向等离子体吸收峰波长。为呈现多色可视化的颜色变化，优化TMB2+氧化刻蚀Au NBPs的反应时间，在酶标仪中进行动力学检测，反应时间为1-30min，以Au NBPs的等离子体吸收峰位置的变化Δλ作为Au NBPs形态变化的指标。
如图7所示，随着刻蚀反应时间的延长，Au NBPs纵向等离子体吸收峰位移逐渐增大，反应进行10min后，Au NBPs纵向等离子体吸收峰位移差达到80％，结合实际颜色变化选择10min为刻蚀反应最佳时间。
实施例3金纳米双锥体刻蚀的DON免疫检测检测的验证
本实施例设置6组对照实验，考察所设计的DON检测原理是否可行，检测流程在真菌毒素全自动净化仪上进行。
6组实验设置为6组：a组:Au NBPs；b组:Au NBPs+MBs-Ab；c组：Au NBPs+DON；d组:Au NBPs+MBs-Ab+DON；e组:Au NBPs+MBs-Ab+HRP-BSA-DON+DON；f组：Au NBPs+MBs-Ab+HRP-BSA-DON。
对各个条件下反应产物的等离子体吸收光谱进行测量，同时记录反应产物溶液的颜色变化。采用透射电子显微镜对反应后Au NBPs的形貌进行表征。
如图8中A，从颜色变化看，仅当Au NBPs和HRP修饰的DON抗原同时存在时，Au NBPs被刻蚀呈粉紫色；当Au NBPs和DON、HRP修饰抗原三者同时存在时，Au NBPs被刻蚀为蓝色，二者均可以被裸眼分辨。如图8中B-C，从光谱图和柱形图可知，HRP修饰抗原使Au NBPs产生显著的位移，而b、d两组中，由于磁珠对底物有微弱的催化反应能力，磁珠使得金锥产生轻微的位移，但不影响检测结果，结果表明：本发明的方法证明对DON的多色可视化检测的可行性，这样可通过反应产物的颜色可大致判断DON浓度范围。
实施例4、金纳米双锥体刻蚀的DON竞争免疫检测标准曲线建立
如图1所示，DON检测流程在真菌毒素全自动净化仪上进行，试剂条1-7孔位依次加入PBS、DON抗体修饰磁珠(MBs-Ab)(购买于北京东孚久恒仪器技术有限公司)、0.1％PBST、HRP修饰DON抗原(HRP-BSA-DON)(购买于无锡杰圣杰康生物科技有限公司)、3',3',5',5',-四甲基联苯胺TMB/H2O2显色底物、以及Au NBPs溶液，其中，DON抗体购于无锡创谱生物科技有限公司。
检测时，将待测样品加入试剂条1孔中，将试剂条放入真菌毒素全自动净化仪中，启动设定程序，自动完成样品稀释、DON捕获、磁珠转移、磁珠清洗、酶催化反应和Au NBP刻蚀反应。反应结束后，取出反应产物溶液，于酶标仪中测量等离子体吸收光谱，根据Au NBPs的纵向等离子体吸收峰波长对样品中的DON进行定量。
在试剂条1中1-7的孔中，分别加入不同浓度的DON标准溶液，在真菌毒素全自动净化仪上进行反应，反应结束后，取出产物溶液于酶标仪中测量等离子体吸收光谱，根据AuNBPs的纵向等离子体吸收峰波长绘制DON检测标准曲线，记录各浓度下Au NBPs胶体分散液的颜色变化。
本实施例还通过研究不同浓度DON条件下Au NBPs的透射电子显微图像，确定DON检测过程中，胶体溶液颜色变化和等离子体吸收峰移动与Au NBPs的形貌变化关系。如图9和图10所示，DON浓度分别为0ppb、500ppb、1000ppb和2000ppb时，由反应产物溶液的光学图像和等离子体吸收光谱可知，Au NBPs的纵向等离子体吸收峰波长随着DON浓度的增大而逐渐增大。从透射电镜图可知，当不存在DON时，Au NBPs被刻蚀至椭球形，由于刻蚀反应优先发生于Au NBPs的尖端，且随着DON浓度的逐渐增大，Au NBPs的纵向长度逐渐增加，而横向长度保持不变。结合透射电镜表征，确定了胶体溶液颜色变化和等离子体吸收峰移动是由于不同浓度DON条件下金纳米双锥体形貌发生变化引发的。
以建立的方法检测0-2000ng/mL浓度范围内的DON标准溶液，如图10所示，金纳米锥体的吸收峰位移值与DON浓度呈线性相关，反应产物呈现丰富的颜色变化，DON浓度达到1000ng/mL以上时，产物溶液呈蓝绿色，可与空白溶液有效区分，初步实现了DON的多色可视化检测。线性关系由图可知，线性方程y＝0.0299x+583.8，(R2＝0.997)，其中y为金纳米双锥体的纵向等离子体吸收峰波长(nm)，x为DON浓度值(ng/mL)，由LOD＝3σ/S(LOD为检出限，σ为空白样品均值标准偏差，S为线性回归方程斜率)计算可得，该方法的检出限为57.93ng/mL，可满足粮食样品中DON的检测需求。
表1中比较了本发明的方法与其他检测方法的检出限，本发明方法检出限与目前的其他快检方法相当，线性范围较宽，涵盖粮食中DON的限量浓度，整个检测过程可在真菌毒素全自动净化仪上完成，自动化程度高，无需步骤复杂的人工操作，检测过程用时较短，同时具有多色可视化检测的优势。
表1不同DON检测方法的比较
实施例5、金纳米双锥体刻蚀的DON竞争免疫检测的特异性
本是实施在试剂条1的各个孔中分别加入DON、AFB1、AFM1、ZEN和OTA的标准溶液，浓度均为1000ng/mL，放入真菌毒素全自动净化仪(Auto-Pure20C)中进行反应，记录不同种类真菌毒素条件下Au NBPs胶体分散液的等离子体吸收峰位置及颜色变化。
向反应体系分别加入1000ppb的不同种类真菌毒素溶液，以本发明检测方法的特异性，如图11所示，仅当DON存在时，反应产物发生显著的颜色变化，而相同浓度的AFB1、AFM1、ZEN和OTA对反应几乎不存在干扰，表明本发明方法对DON检测，其特异性良好。
实施例6、金纳米双锥体刻蚀的DON竞争免疫检测的质控样品
本实施例对自然污染的全麦粉和玉米粉中DON成分分析质控样品进行检测，准确称取样品5±0.005g，加入1g PEG 8000和20mL提取液(纯水)，于涡旋振荡器上振荡提取5min，随后在7000rpm条件下离心5min，取200μL上清液加入试剂条1孔位中，放入真菌毒素全自动净化仪中进行反应，对照DON检测标准曲线确定质控样品中的DON含量。
如表2所示，测定结果均在样品标准值及其扩展不确定度范围内，RSD小于12％，检测结果较为理想。
表2不同粮食基质呕吐毒素成分质控样品检测结果(n＝4)
本发明建立了一种基于金纳米双锥体刻蚀的多色可视化方法，可用于检测粮油原料中的脱氧雪腐镰刀菌烯醇含量。该方法将辣根过氧化物酶催化3,3',5,5'-四甲基联苯胺/双氧水的比色反应与免疫抗体对呕吐毒素的特异性识别相结合，以Au NBPs为刻蚀基底，经过TMB2+氧化刻蚀使Au NPBP纵向等离子体吸收峰蓝移，产生多色可视的颜色变化，检测结果可通过裸眼进行识别，操作过程简单快速，适用于基层大规模粮食样品的快速筛查。
基于金纳米双锥体刻蚀的DON竞争免疫检测方法具有较高的灵敏度和特异性，检测脱氧雪腐镰刀菌烯醇的线性范围在0-2000ng/mL，检出限为57.93ng/mL，其具有良好的市场应用前景。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施例对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
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Claims (3)

1.一种基于金纳米双锥体Au NBPs刻蚀的脱氧雪腐镰刀菌烯醇竞争免疫检测方法，其特征在于，
所述检测方法使用真菌毒素全自动净化仪和试剂条；
所述检测方法的检测流程在所述真菌毒素全自动净化仪上进行，所述试剂条1-7孔位依次加入PBS、脱氧雪腐镰刀菌烯醇抗体修饰磁珠、0.1％PBST、HRP修饰脱氧雪腐镰刀菌烯醇抗原、TMB和H2O2显色底物、以及含Au NBPs的胶体分散液；
所述Au NBPs纵向平均长度为77±3nm，横向平均长度为24±1nm；
所述含Au NBPs的胶体分散液的制备过程为：
将CTAB、HAuCl4和HNO3混和均匀，获得混合溶液；
将NaBH4加入所述混合溶液中，待溶液的颜色由浅黄色变为红棕色，向混合物中再加入柠檬酸，75-80℃搅拌混合，得到Au种子液；
将CTAB、HAuCl4和AgNO3混合均匀后，加入8-羟基喹啉，得到浅黄色混合溶液；
向所述浅黄色混合溶液中加入所述Au种子液100-200μL，再加入8-羟基喹啉静置反应，得到的Au NBPs经洗涤后分散于0.05％CTAB中，获得含Au NBPs的胶体分散液；
检测时，将待测样品加入所述试剂条1孔中，将所述试剂条放入所述真菌毒素全自动净化仪中，启动设定程序，自动完成样品稀释、脱氧雪腐镰刀菌烯醇捕获、磁珠转移、磁珠清洗、酶催化反应和Au NBPs刻蚀反应，反应结束后，取出反应产物溶液，于酶标仪中测量等离子体吸收光谱；
以建立的方法检测0-2000ng/mL浓度范围内的脱氧雪腐镰刀菌烯醇标准溶液，建立AuNBPs纵向等离子体吸收峰波长与脱氧雪腐镰刀菌烯醇浓度的线性方程，所述线性方程为y＝0.0299x+583.8，R2＝0.997，其中，y为Au NBPs的纵向等离子体吸收峰波长λ，单位nm，x为脱氧雪腐镰刀菌烯醇浓度值，单位ng/mL；
根据Au NBPs的纵向等离子体吸收峰波长对样品中的脱氧雪腐镰刀菌烯醇进行定量。
2.如权利要求1所述的基于金纳米双锥体Au NBPs刻蚀的脱氧雪腐镰刀菌烯醇竞争免疫检测方法，其特征在于，
所述检测方法检测脱氧雪腐镰刀菌烯醇的线性范围在0-2000ng/mL。
3.如权利要求1所述的基于金纳米双锥体Au NBPs刻蚀的脱氧雪腐镰刀菌烯醇竞争免疫检测方法，其特征在于，
所述检测方法检测脱氧雪腐镰刀菌烯醇的检出限为57.93ng/mL。
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