CN105203750B - 一种酶联免疫分析定量方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种酶联免疫分析定量方法，包括如下步骤：（1）向包被有目标捕获抗体的酶标板中加入能与之特异性结合的待测物质；（2）向所述的酶标板中加入酶标记的检测抗体；（3）向所述酶标板中加入显色液进行显色反应后，加入终止液终止反应；（4）将所得到的反应液中加入金纳米棒溶液，反应完成后，使用数码相机记录下溶液的颜色。（5）将所测定的溶液颜色与标准比色卡对比，计算得到相应目标物的浓度。该方法具有操作简单、适用性广、反应快速、能够产生多种色彩的颜色变化等优点，可对目标物进行可视化定量分析。

Description

一种酶联免疫分析定量方法
技术领域
本发明涉及一种酶联免疫分析定量方法，属于分析化学和纳米技术领域。
背景技术
近年来，各种传染性疾病（如SARS，禽流感病毒，埃博拉病毒等）在全球范围内频繁地爆发，已经严重影响到人们的正常生活，也得到了世界各国政府和人民的广泛关注。而及早地诊断发现这些传染性病毒，隔离患者，不仅有利于患者及时接受相应的治疗，更有利于防止疾病在人群中大规模传播。目前常用的检测方法有：放射免疫分析、酶联免疫吸附测定、电化学分析方法等。这些方法都需要运用到大型仪器辅助，设备较昂贵、成本高、操作复杂、费时。而且往往都需要受过专门培训的技术人员才会使用，难以在基层医疗单位普及推广，更不适合于人群的肿瘤筛查。
可视化检测因为可提供肉眼识别的信号，不需要大型仪器辅助，适用于实时、现场检测等优点受到了广泛关注。传统的可视化酶联免疫吸附法，通常只能产生一种颜色变化，当目标物浓度加大时，溶液颜色随之加深。我们知道，人类肉眼对颜色的变化比较敏感，但对于同一种颜色的深浅变化并不敏感，因此传统的ELISA通常只能通过肉眼对目标物进行定性分析，若需要对目标物进行定量测定通常需要借助一些大型仪器比如酶标仪才能实现。
金属纳米粒子有着强的依赖距离的光学性质以及高的消光系数，其中，金纳米粒子是最常用的一种金属纳米颗粒，它的消光系数很高，比有机颜料高出3-5个数量级，同时，它还有具有依赖距离的光学特性，分散的金纳米颗粒呈红色，而聚集在一起时呈蓝色或紫色。因此金纳米颗粒经常被用于构建比色法传感器。
然而，传统的可视化酶联免疫吸附法仅具有无色到有色的单一颜色变化，纳米金颜色变化仅有两到三种，只能进行半定量分析，无法真正做到对目标物的定量分析检测。因此，申请人进行了专项研究，找到了一种能产生多种颜色变化的特异性识别元件，并运用于目标物的定量分析检测。
发明内容
本发明针对现有仪器操作复杂、价格昂贵，传统可视化酶联免疫吸附法显色单一、定量效果差等问题，提出一种快速、灵敏、多色彩可视化定量检测分析方法。
为了实现上述目的，本发明所述的一种酶联免疫分析定量方法，利用3,3',5,5'-四甲基联苯胺(TMB)与H2O2在辣根过氧化物酶(HRP)催化作用下，加入酸终止反应后所得到的产物（TMB2+）与金纳米棒混合所产生的显色差异，从而表现出溶液颜色和紫外吸收光谱图特征随目标物浓度变化，能够用于目标物的可视化定量测定。
一种酶联免疫分析定量方法包括以下步骤：
（1）向包被有目标捕获抗体的酶标板中加入能与之特异性结合的待测物质；
（2）向步骤（1）中加入酶标记的100 μL检测抗体反应1~2 h；
（3）向步骤（2）中加入100 μL显色液进行显色反应10~40 min，加入50 μL终止液终止反应；
（4）向步骤（3）所得到的反应液中加入150 μL 0.69 mM金纳米棒溶液，混匀反应2~5 min后，使用数码相机记录下溶液的颜色；
（5）将步骤（4）所测定的溶液颜色与标准比色卡对比，计算得到相应目标物的浓度。
步骤（1）、（2）中的捕获抗体、检测抗体均为ELISA检测方法中所涉及的抗原和抗体；与目标物结合方式为改良的双抗夹心法。
步骤（1）中所测定的待测物质中，需要有至少一个已知浓度的目标物标准品。
步骤（1）、（2）中包括用洗涤液进行洗涤的步骤；所述的洗涤液为ELISA检测常用洗涤液。
步骤（2）中的酶标记的检测抗体为辣根过氧化酶（HRP）标记的抗体；所述的辣根过氧化酶标记的抗体能够与待测物特异性结合。
步骤（2）中的酶联免疫孵化时间为1~2 h，优选1 h。
步骤（3）中的显色液为TMB/H2O2显色液，反应时间为10~40 min,优选30 min。
步骤（3）中的终止液为HCl溶液，其中盐酸的浓度为1~4 M，优选2 M。
步骤（4）中的金纳米棒溶液的制备方法为种子介导合成法，金纳米棒溶液的长径比为2~10之间。
步骤（5）中的标准比色卡的建立方法为：在含有9 mU/mL的辣根过氧化物酶（HRP）的2 ml TMB/H2O2显色液中酶促反应5 min，加入1 ml 2 M HCl溶液终止反应，所得到的产物TMB2+，用紫外分光光度计测定TMB2+的浓度，其中TMB2+的摩尔吸光系数ε= 5.9 ×104 M-1 cm-1，均等稀释所得的产物TMB2+，得到不同浓度的TMB2+溶液并与步骤（4）中的金纳米棒反应2 min后，用数码相机记录下此时溶液的颜色，得到已知不同浓度的TMB2+数值所对应的不同颜色的溶液，并且具有良好的线性关系。
步骤（5）中的标准比色卡，溶液的颜色实际上是跟生成的TMB2+具有良好的线性关系的，当金纳米棒的用量固定时，标准比色卡所对应的TMB2+的浓度值是一定的，不受温度和反应时间的影响，因此具有良好的通用性和稳定性。
步骤（5）中的所测定的目标物的颜色与标准比色卡对比，首先挑选所测定的目标物的颜色与标准比色卡最为接近的颜色，此颜色所对应的TMB2+浓度作为选定值，若所测定的目标物的颜色在标准比色卡中两个颜色之间，则取两个颜色所对应的TMB2+浓度的平均值作为选定值。
步骤（5）中目标物浓度计算公式为：
其中Cr(CEA)为未知样品浓度，Cs(CEA)为标准品浓度，Cr(TMB2+)为未知样品与标准比色卡对比之后所得到的TMB2+的浓度，Cs(TMB2+)为标准品与标准比色卡对比所得到的TMB2+的浓度。
本发明的有益效果：
（1）纳米金棒的制备方法比较成熟，而且材料的LSPR峰在600~900 nm连续可调，这一范围是理想的光学传感区域；
（2）以HRP作为信标分子的修饰方法，已经实现商业化，该产品方便易得，并且目前大多数ELISA检验方法中所使用的信号标记物大多是HRP;
（3）TMB/H2O2显色液因其无致癌性、稳定性好等优点，已经广泛地运用到ELISA检验方法中；
（4）ELISA方法是较为经典的生物样品检测方法，具有普遍的适用性，易于实现；
（5）本发明实现了多种颜色（红棕色、灰色、绿色、蓝色、紫色、粉红色、无色、黄色等）变化，解决了传统比色方法中颜色变化单一的缺点，能够实现对目标物的定量检测，并且反应时间快，效果好；
（6）本发明适用于目前大部分商业上已有的以HRP为信号标记物的ELISA检测试剂盒。
附图说明
图1为金纳米棒与不同浓度的TMB2+反应所得到的标准比色卡；其中TMB2+浓度依次为a1~a6: 0, 7.27, 14.5, 21.8, 29.1, 36.3 μM（溶液颜色分别为：红棕色，淡红棕色，棕灰色，灰色，灰绿色，绿色）; b1~b6: 43.6, 50.9, 58.1, 65.4, 72.7, 79.9 μM（溶液颜色分别为：深蓝绿色，蓝绿色，蓝色，蓝紫色，蓝紫红色，紫色）；c1~c6: 87.2, 94.5, 102, 109, 116, 124 μM（溶液颜色分别为：紫红色，浅紫红色，粉红色，淡粉红色，淡粉红色偏白，淡粉红色偏无色）； d1~d6: 131, 138, 145, 153, 160, 167 μM（无色，浅黄色，浅黄色逐渐加深等）。
图2为金纳米棒与不同浓度的TMB2+反应的紫外图及线性图；其中TMB2+浓度依次为0, 7.27, 14.5, 21.8, 29.1, 36.3, 43.6, 50.9, 58.1, 65.4, 72.7, 79.9μM（图右侧箭头），87.2, 94.5, 102, 109, 116, 124, 131 μM（图中间箭头），138, 145, 153, 160, 167 μM（图左侧箭头）。其中a为不同浓度的TMB2+与金纳米棒反应后的紫外图；b为不同浓度的TMB2+与金纳米棒的纵向等离子吸收峰位置的线性图；c为不同浓度的TMB2+与金纳米棒在λ= 527 nm处吸光度的线性图；d为不同浓度的TMB2+在λ = 450 nm处吸光度的线性图。
图3为金纳米棒与不同浓度的TMB2+反应所得到的TEM图与粒径分布图。其中溶液颜色a为红棕色，b为棕灰色，c为灰色，d为蓝色，e为蓝紫色，f为淡粉红色。
图4为标准实际样品与未知样品检测的比色图。标准品各个孔的颜色为紫红色，所对应的实际样品浓度为40 ng/ml，所对应的TMB2+浓度为90.9 μM。
具体实施方式
实施例1：金纳米棒的合成
首先将5 mL 0.2 M的CTAB加入到15mL的玻璃瓶中，再加入0.25 mL 0.01 M HAuCl4和4.75 mL的水，剧烈搅拌混匀。再往此溶液中添加0.6 mL新制冷冻的0.01 M NaBH4，最后产物为棕黄色纳米金核溶液。快速混匀2 min，在室温下静置10 min以上备用。将CTAB加入到250 mL的圆底烧瓶中，并加入42.2 mL的去离子水，然后加入600 μL 0.01 M AgNO3和5 mL的HAuCl4溶液。剧烈振荡此溶液20 s后，加入5.5 mL 0.01 M抗坏血酸。最后往混合液中加入200 μL的上述纳米金核溶液，上下倒置混匀10 s，室温下静置24 h。所得到的金纳米棒溶液为红棕色，其TEM图见图2a。
实施例2：标准比色卡的建立
在室温下，将含有9 mU/mL的辣根过氧化物酶（HRP）的2 ml TMB/H2O2显色液（购自Aladdin-阿拉丁试剂（上海）有限公司，货号：T117926）中，酶促反应5 min，加入1 ml 1 M HCl溶液终止反应，所得到的产物TMB2+，用紫外分光光度计测定TMB2+的浓度，其中TMB2+的摩尔吸光系数ε= 5.9 × 104 M-1 cm-1，计算得TMB2+浓度为167 μM。将所得到的TMB2+溶液均等稀释，溶液的体积为150 μL，其浓度值分别为0、7.27、14.5、21.8、29.1、36.3、43.6、50.9、 58.1、65.4、72.7、79.9、87.2、94.5、102、109、116、124、131、138、 145、153、160、167 μM。取100 μL上述合成的金纳米棒溶液，加入所稀释得到的TMB2+中，在摇床上面充分混合反应2min后，用数码相机记录下此时溶液的颜色，得到不同浓度的TMB2+所对应不同的颜色的溶液的比色图，如图1所示。为了进一步验证本发明的可行性，将所得到的溶液用酶标仪扫描紫外可见吸收光谱。从图2中可以观察到金纳米棒的纵向等离子吸收峰、横向等离子吸收峰在不同浓度的TMB2+溶液中具有很好的线性关系。为了进一步验证该反应的机理，通过扫描TEM，可以发现金纳米棒的长径比随着TMB2+溶液的浓度的增大而逐渐的变小，溶液的颜色也相应的发生改变，如图3所示。
实施例3：实际样品检测
本发明的ELISA检测是在传统ELISA检测的基础上引入了纳米金棒，从而达到多色可视化检测的目的。本发明以采用商业化的癌胚抗原定量检测试剂盒（郑州博赛生物技术股份有限公司，货号：BCW1101003）为例，加以改进，具体的操作步骤如下：
（1）吸取50 μL 40 ng/ml 的CEA标准品（平行三次），50 μL的待测物质，加入已经包被好捕获抗体的酶标条中；吸取100 μL HRP酶标记的二抗加入上述酶标条中，轻微振荡混合30 s，37 ℃孵育1 h，用洗涤液洗板3次，拍干；
（2）向每个反应孔内加入100 μL TMB/H2O2显色液，轻微振荡混合30 s，室温下反应30 min；
（3）向每个反应孔内加入50 μL 2 M HCl 终止反应；
（4）将100 μL上述合成的金纳米棒同时加入每个反应孔中，轻微振荡混合均匀2 min，用数码相机记录下各孔颜色的变化。
对比标准比色卡，首先挑选所测定的目标物的颜色与标准比色卡最为接近的颜色，此颜色所对应的TMB2+浓度作为选定值，若所测定的目标物的颜色在标准比色卡中两个颜色之间，则取两个颜色所对应的TMB2+浓度的平均值作为选定值。
目标物浓度计算公式为：
其中Cr(CEA)为未知样品浓度，Cs(CEA)为标准品浓度，Cr(TMB2+)为未知样品与标准比色卡对比之后所得到的TMB2+的浓度，Cs(TMB2+)为标准品与标准比色卡对比所得到的TMB2+的浓度。
以图4为例，CEA标准品的浓度为40ng/ml，其所对应的颜色为紫色，与标准比色卡中c1~c2的颜色较为相近，其中c1~c2的TMB2+浓度平均数值为90.9 μM。实际样品中编号1的溶液颜色与a4相近，其中a4所对应的TMB2+浓度数值为21.8 μM。因此根据公式：
可计算得到实际样品中编号1的未知物的CEA含量为9.6 ng/ml。依次类推，可计算得其他待测样品的浓度。

Claims (8)

1.一种酶联免疫分析定量方法，其特征在于利用3,3',5,5'-四甲基联苯胺(TMB)与H2O2在辣根过氧化物酶(HRP)催化作用下，加入酸终止反应后所得到的产物TMB2+与金纳米棒混合所产生的显色差异，从而表现出溶液颜色和紫外吸收光谱图特征随目标物浓度变化，能够用于目标物的可视化定量测定。
2.根据权利要求1所述一种酶联免疫分析定量方法，其特征在于，所述方法具体包括以下步骤：
（1）向包被有目标捕获抗体的酶标板中加入能与之特异性结合的待测物质；
（2）向步骤（1）中加入酶标记的100 μL检测抗体反应1~2 h；
（3）向步骤（2）中加入100 μL显色液进行显色反应10~40 min，加入50μL终止液终止反应；
（4）向步骤（3）所得到的反应液中加入150 μL 0.69 mM金纳米棒溶液，混匀反应2~5 min后，使用数码相机记录下溶液的颜色；
（5）将步骤（4）所测定的溶液颜色与标准比色卡对比，计算得到相应目标物的浓度。
3.根据权利要求2所述的一种酶联免疫分析定量方法，其特征在于：步骤（1）、（2）中的捕获抗体、检测抗体均为ELISA检测方法中所涉及的抗原和抗体；与目标物结合方式为双抗夹心法。
4.根据权利要求2所述的一种酶联免疫分析定量方法，其特征在于：步骤（1）中所测定的待测物质中，需要有至少一个已知浓度的目标物标准品。
5.根据权利要求2所述的一种酶联免疫分析定量方法，其特征在于：步骤（1）、（2）中在加入反应液孵化结束之后，均需用洗涤液PBST洗涤2~4次，并用吸水纸拍干。
6.根据权利要求2所述的一种酶联免疫分析定量方法，其特征在于：步骤（2）中的酶标记的检测抗体为辣根过氧化酶（HRP）标记的抗体；所述的辣根过氧化酶标记的抗体能够与待测物特异性结合。
7.根据权利要求2所述的一种酶联免疫分析定量方法，其特征在于：步骤（3）中的显色液为TMB/H2O2显色液，终止液为HCl溶液，其中盐酸的浓度为1~4 M。
8.根据权利要求2所述的一种酶联免疫分析定量方法，其特征在于：步骤（5）中的标准比色卡的建立方法为：在含有9 mU/mL的辣根过氧化物酶（HRP）的2 ml TMB/H2O2显色液中酶促反应5 min，加入1 ml 2 M HCl溶液终止反应，所得到的产物TMB2+，用紫外分光光度计测定TMB2+的浓度，其中TMB2+的摩尔吸光系数ε= 5.9 × 104 M-1 cm-1，均等稀释所得的产物TMB2+，得到不同浓度的TMB2+溶液并与步骤（4）中的金纳米棒反应2 min后，用数码相机记录下此时溶液的颜色，得到已知不同浓度的TMB2+数值所对应的不同颜色的溶液，并且具有良好的线性关系。
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